MÉTODOS

Patients
The characteristics of a subset of the patients used in the present study are described
in Cuscó et al. [18]. Briefly, a total of 148 Spanish patients (88 children followed in the
neurology clinic and 60 institutionalized adults) with a confirmed diagnosis of one of
the categories of ASD listed in the Diagnosis and Statistical Manual of Mental
Diseases (DSM-IV) were included in the study. All patients were studied using the
Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R) instrument to define a specific category
of ASD and the Wechsler Intelligence Scale for Children (WISC) or the Wechsler Adult
Intelligence Scale (WAIS), allowing us to measure general, verbal and performance
IQ, as well as analysis of multiple factorial components of cognitive functioning. The
Leiter International Performance Scale-Revised (Leiter-R) and the Raven Progressive
Matrices (RPM) were used for non-verbal patients. All patients had an extensive
evaluation by neurologists and clinical geneticists along with an intensive laboratory
workup including standard karyotyping, fragile-X molecular testing and subtelomeric
and targeted Multiplex Ligation-Dependent Probe amplification (MLPA) assays
(homemade panel designed to detect genomic duplications/deletions of specific
regions associated with ASD and mental retardation: 1p36, 1q21.1, 2q37, 7q11.23,
15q11.2, 15q13.3, 16p11.2, 17p11.2, 22q11.2 and 22q13.3), molecular karyotyping by
microarray comparative genomic hybridization in 2/3 of cases, as well as metabolic
and brain imaging studies in cases where clinically indicated. Individuals with genetic
or structural anomalies potentially causative of ASD were excluded from the study.
Table Table11 summarizes some of the medical and demographic features of the final
148 idiopathic ASD patients in the present study.

Table 1. Medical history and demographic data of ASD patients

Control group
Two different control group samples were used in the present study. A control group of
DNA samples from 137 (population control) individuals matched for population
ancestry (Spanish anonymous blood donors) were collected and analysed for the
presumed pathogenic mutations. The second control group, referred as CG2, as used
in Salas et al. [19], consisted of 616 healthy Spanish individuals. The two control
groups were combined (n = 753) for the case-control association study involving the
polymorphisms which define the main European hgs.

DNA extraction
Genomic DNA was extracted from blood samples using a salting-out method and
employing the Puregene DNA Purification Kit (Gentra Systems; Minneapolis; USA).

Ethical approval
All subjects participated after written informed consent was obtained from their
families or other legal caregivers. The DNA extracts were submitted to the laboratory
in Santiago de Compostela for genotyping. In addition, this study was approved by the
Ethical committee of the University of Santiago de Compostela and conformed to the
Spanish Law for Biomedical Research (Law 14/2007- 3rd July).

Automatic sequencing
The mtDNA hypervariable region I (HVS-I) segment was sequenced in forward and
reverse directions and were previously reported in Álvarez-Iglesias et al. [20].

Genotyping of mtDNA variants

The following 25 well-known pathogenic mutations in mitochondrial disorders were
genotyped in all of the patients: 3243A > G, 3460G > A, 3697G > A, 3946G > A, 3949T
> C, 7445A > G, 7445A > C, 8993T > G, 8993T > C, 9176T > C, 9176T > G, 10158T >
C, 10191T > C, 10663T > C, 11777C > A, 11778G > A, 11832G > A, 12706T > C,
13513G > A, 13514A > G, 14459G > A, 14482C > A, 14482C > G, 14484T > C, and
14487T > C. Genotyping was carried out using the minisequencing assay reported in
Álvarez-Iglesias et al. [21].

In addition, the six mtDNA mutations reported by Weissman et al. [12] as being
probable (3397A > G, 4295A > G) or unclear (3394T > C, 10394C > T, 11809T > C
and 11984T > C) pathogenic mutations were also genotyped (see their Table four). A
new minisequencing assay was designed ad hoc, following the methodology reported
before [21,22].

The hg status of several mtDNA profiles cannot be inferred solely from control region
data. We therefore genotyped the mtSNPs defining the main branches of the
European mtDNA phylogeny, as done in the study by Quintáns et al. [23]. These
polymorphisms were used for a case-control association study.

Association study
A case-control association study was carried out between ASD patients (n = 148) and
controls (n = 753) for hg status, and individually for each mtSNP. Firstly, allele
frequencies between cases and controls were compared in order to assess individual
mtSNP associations using a one degree of freedom chi-square test (or Fisher's exact
test for cell counts below five). A nominal value of α = 0.05 was selected to assess the
significance of the association. Secondly, these same statistical tests were used to
carry out association analyses for hgs in cases and controls by comparing the
frequency of each hg versus the other hgs aggregated. A permutation test was
employed to address the issue of multiple testing (see footnote of Table 2).

Table 2. Pearson's chi-square test for cases versus controls of SNPs and most
frequent hgs

The statistical analyses were carried out using the statistical packages Stata v.8
(http://www.stata.com/) and R (http://www.r-project.org/).

Quanto software [24] was used for power calculations. See Salas et al. [19] for some
caveats.
RESULTADOS

Analysis of mtDNA mutations in ASD patients

Additional file 1: Table S1 shows the mtDNA control region sequences and the
minisequencing results of patients and a control group which consist of 137 healthy
individuals (see Materials and methods). All of these individuals and a second Spanish
control group consisting of 616 people were genotyped for a set of mtSNPs diagnostic
of the main mtDNA European hgs. All of this information put together indicated that the
patients were very representative of the frequency pattern of a typical Spanish
population [20,25]. Haplogroup H was the most common in the cases (40%) and
controls (44%), and H1 was its most prevalent sub-lineage (16% in the cases and
19% in the controls). Other well-known hgs were present, such as U (where K is
nested phylogenetically), J, T, V and W. However, a few non-European lineages were
observed in our patients. Although there were not coding region SNPs to assist hg
classification, some of these non-European mtDNAs can be clearly allocated to typical
East Asian lineages. However, given the fact that immigration from South America to
Spanish cosmopolitan cities (such as Barcelona) significantly increased during the last
decade, it is highly probably that these Asian lineages belonged to Native American
branches of the Asian phylogeny, i.e. hg A2, B2, C1 and D1 [26-28]. In addition, a few
individuals undoubtedly carried typical sub-Saharan lineages belonging to different L-
hgs (Additional file 1: Table S1)[29,30].

Additional file 1
Table S1. MtDNA control sequences and coding region mtSNP genotypes. Mutations
are referred to with respect to the rCRS. Transitions are omitted while transversions
are indicated as a suffix. A "+" indicates an insertion whereas "del" refers to a deletion.
See text for hg assignation criteria.

In addition, a total of 25 well-known pathogenic mtDNA mutations were

minisequenced in all patients and 137 controls. All patients were carriers of non-
pathogenic wild-type variants. We also genotyped the six mutations reported in
Weissman et al. [12] as being of probable pathogenicity or of uncertain pathogenic
significance; only 3397A > G was observed in one patient (AU010), while 3394T > C
was identified in two healthy controls. It is important to note that AU010 did not suffer
any mitochondrial disorder. Given the fact that the pathogenic status of these variants
is debatable, it was not surprising to detect similar frequencies in cases and controls.
Case-control association study

A case-control association study was carried out for 148 patients and 753 controls.
The mtSNPs genotyped represent well-known branches of the West European mtDNA
phylogeny. Pearson's chi-square or Fisher's exact tests were used to assess mtSNP
associations. The best P-value (Pearson's χ2 test, nominal P-value = 0.028) was
found for mtSNP 12705C > T, which lead from macro-hg N to R; this mtSNP
apparently increases the risk of suffering from ASD as indicated by the OR value (OR
= 1.82; 95% CI = 1.06-3.13); however, this significance was not maintained after
correcting for multiple hypotheses using a permutation test procedure (adjusted P-
value = 0.315) (Table (Table2),2), as done in previous studies[19,31].

The association test was only carried out on the most frequent hgs in order to
increase the probability of detecting any association. The frequency of mtSNPs and
hgs in Iberia is already known from empirical population studies [20]. The a priori
power to detect odds ratios as low as two for mtSNPs and hgs with frequencies higher
than 20% was about 96%; whereas a statistical power of 80% and OR = 1.5 can only
be obtained for the most frequent mtSNPs or hgs.

DISCUSIÓN

The brain is strongly dependent on the ATP production of the cell energy-producing
organelle, the mitochondrion. Therefore, adequate mitochondrial metabolism is
essential for normal brain functions. There is a large body of evidence involving
mitochondrial dysfunctions in ASD [6,32,33]. While some evidence points to candidate
nuclear DNA (nDNA) loci influencing mitochondrial functions [2,34,35], other evidence
seems to imply that mtDNA mutations are potential causes of ASD [11]. Although the
implication of nDNA factors has found relatively strong support, the presumable role of
the mtDNA genome is still weak. The present study aimed to provide more evidence to
support the role of mtDNA mutations or polymorphisms in ASD by screening one of
the largest cohort of patients analysed to date. We tried to screen the mtDNA of these
patients for a wide spectrum of mutations and polymorphisms in order to explore the
presumable roles of high penetrance mtDNA mutations or low penetrance common
polymorphisms in ASD.

We targeted 25 well-known high penetrance pathogenic mutations in the mtDNA

genome. All of these mutations are commonly responsible for a wide spectrum of
mitochondrion diseases. We did not observe any of these mutations, either in
homoplasmic or heteroplasmic conditions, in the patients or controls analysed in the
present study. It is therefore unlikely that well-known pathogenic mutations are
responsible for a significant proportion of ASD.

In addition, a set of six other mutations regarded as unclear or probable pathogenic by

Weissman et al. [12] were also targeted in our patients. We did not observe any of
these mutations in our patients or in a sample of healthy controls, with only anecdotic
exceptions. As inferred from the complete genome sequences available in GenBank
and the literature, several of these mutations are likely to be rare variants that
normally characterize mtDNA genomes in populations or even in some minor hgs (e.g.
10394C > T is the unique diagnostic site for H16, [20,36]). The fact that these variants
are non-synonymous or highly conserved in comparisons among species does not
guarantee their disease status [19]. Many of these variations are normally located at
the tips of the phylogenies in the mtDNA tree (see e.g. http://www.phylotree.org/),
although their rarity is often interpreted as indicative of their pathogenic condition by
many authors without any solid evidence [14,15,37]. The mere appearance of a
mutation in MITOMAP reporting it as pathogenic has been over-interpreted [16]. The
results of the present article indicate that it is unlikely that these mutations play an
important role in ASD.

We also carried out a case-control association study in ASD patients and we could not
find any evidence relating common polymorphisms to ASD. Although we did not detect
a statistical association between cases and controls, it is important to be aware of the
presence of non-European mtDNA lineages in cohorts of patients and controls
because these haplotypes could provide the basis for a false positive finding of
association (due to population stratification). Therefore, the mtDNA hg background as
analysed in the present study does not seem to be a risk or protection factor in ASD. A
type II error due to a lack of statistical power cannot be fully rule out, though this
possibility is more unlikely for the most frequent mtSNPs and hgs. Analysis of entire
mtDNA genomes could also provide new insights about the potential role (if any) of
other rare variants; however, very large sample sizes would be necessary to achieve
an suitable statistical power. Next-Generation Sequencing (NGS) could perhaps bring
the opportunity for large cohort of samples to be analyzed for entire mtDNA genomes;
unfortunately, the few recent attempts of NGS mtDNA genomes do not seem to hold
the necessary quality standards (Bandelt and Salas: Current Next Generation
Sequencing technology may not meet forensic standards, submitted) when evaluated
under a phylogenetic perspective [38,39]. The role of mtDNA gene dosage in ASD as
very recently assessed by Giulivi et al. [33] would also be a good target for future
replication. Therefore, although previous findings are in agreement with our results
[17], we consider that further studies are needed in order to definitely rule out any role
of mtDNA hgs in ASD.

As reviewed by Palmieri and Persico [32], regarding ASD, oxidative phosphorylation

(OXPHOS) in the mitochondrion requires at least 80 proteins, of which only 13 are
encoded by the mtDNA, while mitochondrial functioning has been estimated to need
the participation of approximately 1500 nuclear genes [40]. Any of these nuclear
genes or copy number variations (CNVs) could explain the mitochondrial defects
observed in a small minority of ASD patients [40].

CONCLUSIONES

Although it is widely accepted that some forms of ASD appear concomitantly with the
impairment of mitochondrial energy metabolism, there are reasons to believe that the
cause of these mitochondrial disorders does not systematically rest on mutations or
variants in the mtDNA molecule. Pathogenic mtDNA mutations have been reported in
ASD patients, but this seems to be the exception rather than the rule. It is more likely
that the real causes of mitochondrial deficiencies in some ASD cases are due to the
intervention of several nuclear factors acting alone (additively or epistatically) or
through a complex interplay with mtDNA variants. For the time being, while the cause
for mitochondrion dysfunction in ASD remains unclear, there is no reason to indicate
systematic screening for mtDNA mutations in ASD patients unless a mitochondrion
disorder is suggested by a clear phenotype.
MÉTODOS

Los pacientes
Las características de un subgrupo de pacientes utilizados en el presente
estudio se describen en el Cusco y otros. [18]. En resumen, un total de 148
pacientes españoles (88 niños siguieron en la clínica de neurología y 60
adultos internados en instituciones) con un diagnóstico confirmado de una
de las categorías de la CIA que figuran en el Manual Diagnóstico y
Estadístico de Enfermedades Mentales (DSM-IV) se incluyeron en el
estudio. Todos los pacientes fueron estudiados con el diagnóstico de
autismo Entrevista-Revisada (ADI-R), instrumento para definir una categoría
específica de la CIA y la Escala de Inteligencia de Wechsler para niños
(WISC) o la Escala Wechsler de Inteligencia para Adultos (WAIS), lo que
nos permite medir la general, CI verbal y el rendimiento, así como el análisis
factorial de los múltiples componentes de la función cognitiva. El
rendimiento Leiter Internacional Scale-Revised (Leiter-R) y las matrices de
Raven Progresivo (RPM) se utiliza para los pacientes no verbal. Todos los
pacientes tenían una extensa evaluación por neurólogos y genetistas
clínicos, junto con un uso intensivo de análisis de laboratorio incluyendo el
cariotipo estándar, X frágil pruebas moleculares y Multiplex subtelomeric y
dirigida ligadura-dependiente de la sonda de amplificación (MLPA) ensayos
(panel casero diseñado para detectar duplicaciones genómicas /
eliminaciones de regiones específicas asociadas con los TEA y retraso
mental: 1p36, 1q21.1, 2q37, 7q11.23, 15q11.2, 15q13.3, 16p11.2, 17p11.2,
22q11.2 y 22q13.3), el cariotipo molecular por microarrays de hibridación
genómica comparada en 2 / 3 de los casos, así como estudios de imágenes
del metabolismo y el cerebro en los casos en que esté clínicamente
indicado. Los individuos con anomalías genéticas o estructurales
potencialmente causante de la CIA fueron excluidos del estudio. Tabla Tabla
11 resume algunas de las características médicas y demográficas de los
pacientes 148 final idiopática ASD en el presente estudio.

Tabla 1. Historia clínica y los datos demográficos de los pacientes con ASD

El grupo de control
Dos muestras diferentes del grupo control se utilizaron en el presente
estudio. Un grupo control de muestras de ADN de 137 (control de la
población) los individuos encontrados por la ascendencia de la población
(españoles anónimos donantes de sangre) se recogieron y analizaron las
mutaciones patógenas presume. El segundo grupo de control, conocido
como CG2, tal como se utiliza en Salas et al. [19], consistió en 616
individuos sanos españoles. Los dos grupos fueron combinados (n = 753)
para el estudio de casos y controles asociación que entrañe los
polimorfismos que definen el HGS europeas.

Extracción de ADN
ADN genómico fue extraído de muestras de sangre usando un método de
salado-out y empleando el kit de purificación de ADN Puregene (Sistemas
Gentra, Minneapolis, EE.UU.).

La aprobación ética
Todos los sujetos participaron después de escrito el consentimiento
informado se obtuvo de sus familiares u otros cuidadores legales. Los
extractos de ADN fueron enviadas al laboratorio en Santiago de Compostela
para el genotipado. Además, este estudio fue aprobado por el Comité de
Ética de la Universidad de Santiago de Compostela y se ajustaba a la
legislación española para la Investigación Biomédica (Ley 14/2007- 03 de
julio).

Secuenciación automática
La I ADNmt región hipervariable (HVS-I) del segmento fue secuenciado en
direcciones hacia adelante y hacia atrás y se había informado anteriormente
de Álvarez-Iglesias et al. [20].

Genotipado de variantes de ADN mitocondrial

Los siguientes 25 conocido mutaciones patógenas en las enfermedades
mitocondriales se genotipo en todos los pacientes: 3243A> G, 3460G> A,
3697G> A, 3946G> A, 3949T> C, 7445A> G, 7445A> C, 8993T> G , 8993T>
C, 9176T> C, 9176T> G, 10158T> C, 10191T> C, 10663T> C, 11777C> A,
11778G> A, 11832G> A, 12706T> C, 13513G> A, 13514A> G, 14459G > A,
14482C> A, 14482C> G, 14484T> C, y 14487T> C genotipo se llevó a cabo
utilizando el ensayo de minisecuenciación informó en Álvarez-Iglesias et al.
[21].

Además, los seis mutaciones en el ADNmt informó Weissman et al. [12]

como probable (3397A> G, 4295A> G) o poco claras (3394T> C, 10394C>
T, 11809T> C y 11984T> C) mutaciones patógenas fueron genotipo también
(ver su tabla de cuatro). Un ensayo minisecuenciación nueva fue diseñada
ad hoc, siguiendo la metodología informado antes [21,22].

El estado de hg de varios perfiles ADN mitocondrial no se puede deducir

exclusivamente de los datos de control de la región. Por lo tanto, el genotipo
mtSNPs la definición de las principales ramas de la filogenia del mtDNA
Europea, como se hizo en el estudio de Quintáns et al. [23]. Estos
polimorfismos se utilizaron para un estudio caso-control de la asociación.

Estudio de asociación
Un estudio de caso-control de la asociación se llevó a cabo entre los
pacientes ASD (n = 148) y controles (n = 753) para el estado de Hg, y de
forma individual para cada mtSNP. Primero, las frecuencias alélicas entre
los casos y los controles se compararon con el fin de evaluar las
asociaciones individuales mtSNP con un grado de libertad de chi-cuadrado
(o la prueba exacta de Fisher para el recuento de células por debajo de
cinco). El valor nominal de α = 0,05 fue seleccionado para evaluar la
importancia de la asociación. En segundo lugar, estas pruebas estadísticas
se utilizaron los mismos para llevar a cabo análisis de asociación de HGS
en los casos y controles, comparando la frecuencia de cada Hg en
comparación con el HGS otros agregados. Una prueba de permutación fue
empleado para tratar el tema de las múltiples pruebas (véase la nota de la
Tabla 2).

Tabla 2. Chi-cuadrado de Pearson para los casos frente a los controles de

SNPs y HGS más frecuentes

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el paquete estadístico Stata

versión 8 (http://www.stata.com/) e I (http://www.r-project.org/).

Quanto software [24] fue utilizado para los cálculos de poder. Ver Salas et
al. [19] de algunas advertencias.

RESULTADOS

El análisis de mutaciones en el ADNmt en pacientes ASD

Archivo adicional 1: Cuadro S1 muestra las secuencias de ADN mitocondrial
de control de la región y los resultados minisecuenciación de los pacientes y
un grupo control que consiste en 137 individuos sanos (ver Materiales y
métodos). Todas estas personas y un segundo grupo de control español que
consta de 616 personas fueron genotipo para un conjunto de mtSNPs de
diagnóstico de los principales HGS ADNmt europeo. Toda esta información
puesto que se indica junto a los pacientes eran muy representativa del
patrón de frecuencia de una población típica española [20,25]. Haplogrupo
H es el más común en los casos (40%) y controles (44%), y fue la más
frecuente H1 sub-linaje (16% en los casos y un 19% en los controles). Otros
conocidos HGS estuvieron presentes, como U (donde K es anidados
filogenéticamente), J, T, V y W. Sin embargo, algunos no europeos linajes
se han observado en nuestros pacientes. Aunque no hubo codificación de
SNPs región para ayudar a la clasificación hg, algunos de estos ADNmts no
europeos pueden ser claramente asignados a los linajes típicos de Asia
oriental. Sin embargo, dado el hecho de que la inmigración desde América
del Sur al español ciudades cosmopolitas (como Barcelona) se incrementó
significativamente durante la última década, es muy probable que estos
linajes asiáticos pertenecía a los nativos americanos ramas de la filogenia
de Asia, es decir, hg A2, B2, C1 y D1 [26-28]. Además, unos pocos
individuos, sin duda, lleva típica subsahariana que pertenecen a diferentes
linajes L-HGS (archivo adicional 1: Tabla S1) [29,30].

Archivo adicional 1
Tabla S1. El ADN mitocondrial secuencias de control y de codificación de los
genotipos mtSNP región. Las mutaciones se refiere con respecto a la rCRS.
Las transiciones se omite, mientras que transversions se indican como un
sufijo. A "+" indica una inserción, mientras que "del" se refiere a la
eliminación. Ver texto para los criterios de asignación de hg.

Además, un total de 25 conocidas mutaciones patogénicas del ADNmt se

minisequenced en todos los pacientes y los controles 137. Todos los
pacientes eran portadores de tipo salvaje no patógenos variantes. También
el genotipo seis mutaciones informó en Weissman et al. [12] como de
patogenicidad o de probable significado patogénico incierto, sólo 3397A> G
se observó en un paciente (AU010), mientras que 3394T> C fue identificado
en dos controles sanos. Es importante señalar que AU010 no sufrió ningún
trastorno mitocondrial. Teniendo en cuenta el hecho de que el estado de
patógenos de estas variantes es discutible, no es sorprendente para
detectar frecuencias similares en casos y controles.
De casos y controles estudio de asociación

Un estudio de caso-control de la asociación se llevó a cabo para 148

pacientes y controles 753. El genotipo mtSNPs representan conocido ramas
de la filogenia de Europa Occidental ADNmt. Prueba exacta de Pearson chi-
cuadrado o de Fisher se utilizaron para evaluar las asociaciones mtSNP.
Mejor el valor P (χ2 de Pearson, nominal P-valor = 0,028) se encontró para
mtSNP 12705C> T, que van de macro-hg N a R; este mtSNP al parecer
aumenta el riesgo de padecer TEA según lo indicado por el quirófano valor
(OR = 1,82, IC 95% = 1,06 a 3,13), sin embargo, este significado no se
mantuvo después de corregir por múltiples hipótesis utilizando un
procedimiento de prueba de permutación (ajustado P-valor = 0,315) (tabla
(Tabla 2), 2), realizado en estudios previos [19,31].

El test de asociación sólo se llevó a cabo en el HGS más frecuentes con el

fin de aumentar la probabilidad de detectar cualquier forma de asociación.
La frecuencia de mtSNPs y HGS en la Península Ibérica ya se sabe a partir
de estudios empíricos de la población [20]. El poder, a priori, para detectar
los odds ratios tan bajos como dos de mtSNPs y HGS con frecuencias
superiores a 20% se acerca al 96%, mientras que una potencia estadística
del 80% y OR = 1,5 sólo puede obtenerse de la mtSNPs más frecuentes o
HGS.

DISCUSIÓN

El cerebro depende en gran medida la producción de ATP de la célula que

producen energía organelo, la mitocondria. Por lo tanto, el metabolismo
mitocondrial adecuada es esencial para las funciones normales del cerebro.
Hay una gran cantidad de pruebas relacionadas con disfunciones
mitocondriales en TEA [6,32,33]. Mientras que algunos puntos de la
evidencia del ADN candidato nuclear (ADNn) loci que influyen en las
funciones mitocondriales [2,34,35], otra evidencia parece indicar que las
mutaciones del ADNmt es una causa posible de la CIA. [11] A pesar de la
implicación de factores ADNn ha encontrado apoyo relativamente fuerte, el
papel presumible del genoma del ADNmt es aún débil. El objetivo del
presente estudio proporcionan más evidencia para apoyar el papel de las
mutaciones o polimorfismos en el ADN mitocondrial ASD por la revisión de
una de las mayores cohortes de pacientes analizados hasta la fecha.
Hemos tratado de la pantalla del ADN mitocondrial de estos pacientes para
un amplio espectro de mutaciones y polimorfismos en el fin de explorar el
papel de la presumible alta penetrancia mutaciones o polimorfismos ADN
mitocondrial de baja penetrancia comunes en los TEA.

Nos enfocamos en 25 mutaciones conocidas de alta penetrancia patógenos

en el genoma mitocondrial. Todas estas mutaciones son frecuentemente
responsables de un amplio espectro de las enfermedades de mitocondria.
No se observó ninguna de estas mutaciones, tanto en condiciones
homoplásmicas o heteroplásmica, en los pacientes o los controles
analizados en el presente estudio. Por tanto, es poco probable que la
conocida mutaciones patógenas son responsables de una proporción
significativa de la CIA.
Además, un conjunto de seis otras mutaciones consideradas como
patógenas claro o probable por Weissman et al. [12] también fueron objeto
de nuestros pacientes. No se observó ninguna de estas mutaciones en
nuestros pacientes o en una muestra de los controles sanos, con algunas
excepciones anecdóticas. Como se deduce de las secuencias genómicas
completas disponibles en el GenBank y la literatura, varias de estas
mutaciones son probablemente las variantes raras que normalmente
caracterizan genomas de ADN mitocondrial en poblaciones o incluso en
algunos HGS menores (pe 10394C> T es el único sitio para el diagnóstico
de H16, [20,36]). El hecho de que estas variantes no son sinónimos o
altamente conservadas en las comparaciones entre las especies no
garantiza su estado de salud [19]. Muchas de estas variaciones se
encuentran normalmente en las puntas de las filogenias en el árbol de
ADNmt (véase, por ejemplo http://www.phylotree.org/), a pesar de su rareza
es a menudo interpretado como indicativo de su condición patogénica por
muchos autores, sin sólidos pruebas [14,15,37]. La simple aparición de una
mutación en MITOMAP que la presentación de informes como patógenos ha
sido el exceso de interpretación [16]. Los resultados del presente artículo
indican que es poco probable que estas mutaciones juegan un papel
importante en la CIA.

También llevamos a cabo un estudio de asociación de casos y controles en

pacientes con CIA y no pudimos encontrar ninguna prueba relacionada
polimorfismos comunes a ASD. Aunque no se detectó una asociación
estadística entre casos y controles, es importante ser consciente de la
presencia de no europeos linajes del mtDNA en cohortes de pacientes y
controles, porque estos haplotipos podría servir de base para la
constatación de falsos positivos de la asociación (por a la estratificación de
la población). Por lo tanto, el fondo del ADNmt hg como se analiza en el
presente estudio no parece ser un riesgo o un factor de protección en los
TEA. Un error de tipo II, debido a la falta de poder estadístico no se puede
descartar completamente, aunque esta posibilidad es más improbable que
la mtSNPs más frecuentes y HGS. El análisis de toda la genomas de ADN
mitocondrial también podría proporcionar nuevos conocimientos sobre el
papel potencial (si existe) de otras variantes raras, no obstante, los tamaños
de muestra muy grande, sería necesario alcanzar un poder estadístico
adecuado. Secuenciación de próxima generación (NGS), tal vez podría traer
la oportunidad para la gran cohorte de muestras que serán analizadas para
todo el genoma mitocondrial, por desgracia, los pocos intentos recientes de
la NGS genomas de ADN mitocondrial no parecen tener los estándares de
calidad necesarios (Bandelt y Salas: actual tecnología de próxima
generación de secuencia no puede cumplir con las normas forense,
presentado) se evalúe en el punto de vista filogenético [38,39]. El papel de
la dosis génica de ADNmt en ASD como muy recientemente evaluados por
Giulivi et al. [33] También sería un buen objetivo para la replicación del
futuro. Por lo tanto, aunque los resultados anteriores están de acuerdo con
nuestros resultados [17], consideramos que se necesitan más estudios para
descartar definitivamente cualquier papel de ADNmt HGS en TEA.

Tal como fue revisado por Palmieri y Persico [32], en relación con ASD, la
fosforilación oxidativa (OXPHOS) en la mitocondria requiere al menos 80
proteínas, de los cuales sólo 13 están codificadas por el ADN mitocondrial,
mientras que el funcionamiento mitocondrial se ha estimado que necesita la
participación de aproximadamente 1500 genes nucleares [40]. Cualquiera
de estos genes nucleares o las variaciones del número de copias (CNV)
podría explicar los defectos mitocondriales observados en una pequeña
minoría de pacientes con CIA [40].

CONCLUSIONES

Aunque es ampliamente aceptado que algunas formas de la CIA aparecen

de forma concomitante con el deterioro del metabolismo energético
mitocondrial, hay razones para creer que la causa de estos trastornos
mitocondriales no se apoya de manera sistemática en las mutaciones o
variantes de la molécula de ADN mitocondrial. Mutaciones patogénicas del
ADNmt han sido reportados en pacientes con ASD, pero esto parece ser la
excepción y no la regla. Es más probable que las verdaderas causas de las
deficiencias mitocondriales en algunos casos, ASD se deben a la
intervención de varios factores nuclear por sí solo (aditiva o epistáticamente)
oa través de una compleja interacción con las variantes de ADN
mitocondrial. Por el momento, mientras que la causa de la disfunción
mitocondrial en el TEA no está claro, no hay ninguna razón para indicar la
detección sistemática de mutaciones en el ADNmt de los pacientes ASD
menos un trastorno de la mitocondria es sugerida por un fenotipo claro.