I. ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS 1. Osmoprotectores. Un problema para la vida de todos los organismos en ambientes secos 0 salinos es mantener su contenido de agua; esto se realiza, por medio de la acumulacién de solutos. La acumulacién de solutos en el citoplasma debe ser no téxico (compatible) con respecto a los procesos metab6licos, es decir, no deben interferir en a estructura proteica o en la funcién euando se presentan en altas concentraciones (MeCue & Hanson, 1990), Muchos organismos desarrollaron complejos mecanismos para balancear su fuerza osmétiea con el medio ambiente que les rodea. En otras palabras, son capaces de prevenir la deshidratacién al tomar © sintetizar moléculas que actian como agentes de balance osmético (Le Rudulier, ef al., 1984). Entre estos compuesios osméticamente activos s¢ encuentran los polioles como sorbitol, manitol, arabito! © glicerol; aminodcides como prolina 0 el derivado glicina betaina; y los disacéridos sacarosa y trehalosa (Yancey, ef al., 1982), . Algunos compuestos consideradas osmolitos también se consideran osmoprotectores, entre ellos estan: el glicerol, la sacarosa y Ia trehalosa ya que juegan un papel clave en la estabilizacién estructural y funcional de membranas y proteinas en estado anhidro (Clegg, 1985). En particular la trehalosa tiene las mejores propiedades biofisicas y bioguimieas como osmoprotector (Clegg, 1985; Crowe, ef al., 1996).2. Trehalosa. 2.1, Estructura, La trehalosa (O-a-D-glucopiranosil-(161)-c-D-glucopiranosa) es un dimero de dos moléculas de glucosa unidas a tavés de sus grupos reductores figuras (1.A y B). Estos grupos reductores estan ausentes en la trehalosa, por lo que no toman parte en las reaceiones de Maillard, en las cuales el grupo reductor de los aziicares reacciona con el grupo amino de las proteinas causando oscurecimiento y cambio en el olor y sabor de los alimentos (Badui, 1981), 2.2. Funcién. Originalmente se pensé que la trehalose era un carbohidrato de reserva (De Virgilio, ¢¢ al., 1993; Ribeiro, er al., 1994; Hottiger. er 4al.,1997), pero en los iiltimos aftos se ha propuesto que actéa como protector de proteinas, contra el estrés fisico, tales como la desecacién (Romero, ef al., 1997; Cushman & Bohnert, 2000), calor (De Virgilio, er ai, 1990; Ribeiro, ef al., 1994), frio (Bonini, et al., 1995; Pan & Elbein, 1996) cambios osméticos (Kaasen, ev a/., 1994), y ante Ia presencia de metales pesados (Bell, ef al., 1992) Por otro Indo Ia trehalosa parece ser uno de los compucstos més eficientes en mantener a los lipidos en fase fluida en ausencia de agua, esto evita la separacién de fase, ruptura y disgregacién de las membranas. Al igual que los polioles, la trehalosa juega un papel importante en la estabilizacién estructural y funcional de las membranas y proteinas en estado anhidro (De Virgilio, ef al., 1994),@-D-Gle @-D-Gle Figura 1: Estructura Quimica de la Trehalosa. A) Modelo de Bolas y Varillas. B) Proyeccién de Haworth (Fuente: Mathews & van Hole, 1996).2.3 Hipotesis. El mecanismo por el cual 1a trehalosa estabiliza las moléculas y las hace tolerantes el estrés hidrico no esta completamente determinado, pero si se conoce el efecto protector sobre proteinas y membranas (Colaso, e al., 1992), En general, se piensa que la trehalosa reemplaza la capa de agua alrededor de las macromoléculas, previniendo los efectos dafinos durante la deshidratacién. Con respecto a las membranas, la trehalosa puede evitar la fase de transicién de Los lipidos en las membranas, por lo que estas permanecen en estado liquido-eristalino alin en ausencia de agua. Segiin esta hipétesis, esto previene Ja ruptura de la membrana durante la hidratacién, por eso la trehalosa preserva la viabilidad celular. Con respect a proteinas, la trehalosa inhibe la desnaturalizacién de proteinas porque evita la exclusion de agua en la superficie de las mismas cuando las células estén en estado hidratado. Se ha demostrado que la trehalosa inbibe Ia agregacién de proteinas durante el estrés por calor y preserva la estructura de la proteina en estado seco, probablemente porque la trehalosa reemplaza a as moléculas de agua contribuyendo a el mantenimiento adecuado de la estructura proteica (Guo, ef af., 2000). Ademés, la trebalosa tiene una ‘alta transicién vitrea a la temperatura y causa la formacién de un estado vitreo estable (Colago, er al, 1992; Guo, et al., 2000), proporcionando mayor flexibilidad y estabilidad quimica comparada con otros aziicares (Romero, ef al., 1997), 2.4. Presencia de Trehalosa en Organismos. La trehalosa se encuentra ampliamente distribuida en la naturaleza, se encuentra en diversos organismos teles como hongos, pequefosinvertebrados (Crowe & Crowe, 2000), levaduras (Vandercammen, et al, 1989; De Virgilio, er al., 1993), bacterias (Kato, ef al., 1996) y plantas (Adams, ev al., 1990; Zentella, ef al., 1999; Nuccio, ef al., 1999). 2.4.1. Presencia de Trehalosa en Plantas. Trehalosa es un aziicar poco comin en plantas vasculares superiores, donde la sacarosa presenta una funcién andloga a la de trehalosa (Romero, ef al., 1997). Sin embargo se encuentra en algunas plantas vasculares menores (Drennan, ef al., 1993). La trehalosa se acumula en las lamadas plantas de resurreccién que son tolerantes ante Ia deshidratacién completa, Estas plantas tienen la caracteristica de volver a la vida al ser hidratadas nuevamente (Goddijn, ef al, 1997). Myrothannus flabellifolius y Selaginella epidephylta son plantas de resurreccién (Weisburd, 1988). El genera Selaginella produce al menos tres veces més trehalosa que ls flabellifolins (Drennon, e1 al., 1993). Selaginella lepidophylla entea en dormancia durante periodos de sequla y revive cuando el agua esta disponible. Durante perfodos de sequia extrema los niveles de trehalosa en las hojas aleanzan hasta un 20% de su peso seco (Zentella, e1 al, 1999). En Selaginelta lepidophytla la trehalosa constituye el 80% de los carbohidratos solubles, por lo que esta planta es uno de los organismos con més alto contenido de trehalosa Esta planta puede ser criopreservada en nitrégeno liquide descongelarse revive normalmente, como también sobrevive al vacio al extreme, calor hasta 100°C 0 altas dosis de radiacién ionizante sin suftir dato (Gadd, et al., 1987; Zentella, e1 al., 1999), Selaginelta lepidophylta forma una roseta (macolla), con r s sélo en Ia base, de 1.4 a 1.8 mm de ancho y 1.7 a 2.1 mm de largo. Seencuentra ampliamente distribuida en México (BC., Chih., Coah., NL., SLP., Tam., Zac., Sin., Dgo., Nay., Mor., Edo. de Méx., Pue., Oax.) y sur de Estados Unidos. Normalmente cree de 1380 2 1840 m de altitud, en afloramientos de roca ignea expuesta y menos frecuente en taludes de tierra, en forma expuesta 0 sombreada. La vegetacién donde se encuentra es en bosque tropical cadicifolio, bosque mixto con enebro ¢ incluso en encinares en la Cuenca del Balsas (Abundiz-Bonilla y Tejero-Diez, 1990). Esta especie y Selaginella pallescens pueden llegar a tener igual forma biolégica y aparentemente conviven en el mismo tipo de habitat La diltima se distingue de S. lepidophylla por el color verde olivo y el envés de la planta que se torna rojizo al envejecer, ademas de la textura coridcea y la forma de sus hojas. Tanto S. lepidophyila y 8. pallescens se uusan indistintamente como diurético, en dolencias del rifén y contra lileeras (Abundiz-Bonilla & Tejero-Diez, 1990). 2.4.2. Presencia de Trehalosa en Animales. Se ha reportado que el disacdrido trehalosa protege los tejidos de animales durante la desecacién y el congelamiento (Nishinoto,.er al., 1996a). La trehalosa esta presente en insectos, en los cuales este disacérido es una fuente de energia movil (Kato ef al., 1996). Sin embargo, existen pocos reportes sobre la presencia de trehalosa en células de animales superiores. La trehalosa se encuentra también en invertebrados tales como los 20s como Artemia salina nematodos como Dituylenchus dipsu, crus (Colao, er al., 1992), asi como otros organismos primitivos que sobreviven a periodos de severa sequia. Estos organismos primitivos son capaces de sobrevivir ain cuando I cantidad de agua en su cuerpo esmenor a 2% en peso. Estos organismos tienen la habilidad de permanecer en animacién suspendida cuando estén en estado seco y revivir al entrar en contacto con el agua. A este fenémeno se le llama anhidrobiosis. Las eriaturas anhidrobiéticas sobreviven ademds de 1a sequia, al calor y frio extremo, vacio extremo y altas dosis de radiacién ionizante (Weisburd, 1988). 2.4.3. Presencia de Trehalosa en Bacterias. En la literatura existen varios reportes sobre Ia presencia de trohalosa_ en bactei 5. Las arquebacterias termofilieas, Swljo/abus acidocaldorts y Sulfolobus solfataricus sintetizan y acumulan trehalose Se ha relacionado la trehalosa con la termoestabilidad de las dos arquebacterias (Kato, ef al., 1996 Nakada, ef al., 1996). En Micobacteria y Coribacteria, 1a trehalosa es un componente estructural de Ia pared celular donde es acilada con varios cides grasos para formar trehalosa micoleda, u otros glicolipidos relacionados que pueden estar unidos a los peptidoglicenos de ta pared celular (Pan & Elbein, et al., 1996) En Pimelobacter, se considera que la trehalosa sintetizada es esencial para evitar la accién hidrolitien cuando se incrementa Ia temperatura (Nishimoto, er af.,1996a; Nishimoto, er a/., 1996b). En este mismo caso se encuentra también Neurospora crassa (Bonini, et al., 1993). Escherichia coli es capaz de usar trehalosa como fuente de carbono (Hengge-Aronis, ef al., 1991), pero puede sintetizar y acumular trehalosa como osmoprotector en respuesta al estrés osmético cuando el osmolito glicina betaina o el precursor colina no se encuentra presente en las células (McDougal, ef a/., 1993).10 2.4.4. Presencia de Trehalosa en Levaduras. Estudios del metabolismo de trehalosa en Hansenula polymorpha, la relacionan con la adaptacién de esta levadura al crecimicnto a altas temperaturas (48°C), por lo que se sugiere que la trehalosa tiene un papel protector contra el estrés por calor (Reinders, et al., 1999). En Schizosaccharomyces pombe la acumulacién de trehalosa se considera importante para 1a adquisieién de termotolerancia al calor (De Virgilio, er al, 1990; Ribeiro, er al, 1994). A su vez en Saccharomyces cerevisiae se ha observado una correlacién entre Ja acumulacion de trehalosa y Ia adquisicién de termotolerancia al frfo, al calor y al estrés Romero, ef al., 1997). La acumulacién de agua (De Virgilio, er al., 1993: de trehalosa en Saccharomyces cerevisiae ocurre durante periodos de crecimiento reducidos, por ejemplo durante déficit de nitrdgeno, fostoro, © sulfure. Por lo que se ha reportado que en esta levadura la trehalosa representa hasta un 23% de su peso seco (Hottiger, ef al., 1997). Se ha observado que las levaduras al acumular tehalosa incrementan su resistencia ala deshidratacién (Gadd et al., 1987) 2.5 Usos Comerciales de Trehalosa. . El uso comercial de la trehalosa abarca a la industria alimenticia, utilizéndose @ la trehalosa como aditivo, en Ia industria agroalimentaria como parte integral de la planta y en la industria médica como conservador de la viabilidad de biomoléculas. SE.2.5.1. Uso de Trehalosa en la Industria Alimentaria. A principios de la iltima década, las companias Calgene (Davis, CA) y Quadrant Holdings (Cambrige, U.K.) fundaron Osmotica Foods que inicié el desarrollo de un ingrediente alimenticio y una serie de alimentos a base de un azicar llamado trehalosa (Kidd & Devorak, 1994) Este aditivo no es solamente otro aziicar, Ia trehalosa es capaz de mejorar la calidad y sabor de los alimentos secos y procesados manteniendo su sabor fresco (Kidd & Devorak, 1994) Investigaciones demostraron que al deshidratar huevos batidos en presencia de trehalosa, se produce un polvo inoloro de color amarillo- anaranjado que se almacend a temperatura ambiente. El producto que se obtuvo cuando se hidraté fue indistinguible del huevo fresco. Ademas, se secaron pures de platano, fresa, mango, manzana, aguacate y frambuesa con trehalosa, Cuando se reconstituyeron después de un almacenamiento prolongado, se recobré el color, sabor y aroma de los productos. Asi también, hierbas que se secaron después de sumergirse en una solucién de trehalosa presentaron buenos resultados de conservacién de sus propiedades organolépticas (Roser & Colago, 1993). Debido a lo anterior, se ha propuesto que los productos termninados que contengan trehalos seri superiores. en _caraeteristicas organolépticas que los productos terminados que carezean de ella como ingrediente (Kidd & Devorak, 1994). Esto implica ademds, que se podré prescindir de toda clase de conservadores y preservadores que aiin se usan en Ia industria de Ios alimentos, pero gue el consumidor rechaza por el efecto nocivo, posible o demosirado que representan para su salud. Mas ain, el hecho de que la trehalosa preserve activas las biomoléculas implica que los alimentos deshidratados que la contengan tendran un valor nutricional comparable al de los productos frescos, y mayor queaquellos alimentos deshidratados que carezcan de trehalosa (Roser, 1991). 2.8.2 Uso de Trehalosa en Ia Industria Agroalimentaria. La trehalosa tiene un uso potencial en la industria agroalimentaria donde Ia sintesis de trebalosa en plantas transgénicas permitira que estes puedan sobrevivir bajo condiciones limitantes de agua, exceso de calor, frio 0 salinidad. Lo eval redundard en un aumento en la productividad de Ia agricultura de temporal y en zonas éridas 0 semiéridas, més ain, dada la previsible escasez de agua a nivel mundial para las proximas décadas, la agricultura de ierigacién también se vera limitada. Bajo estas condiciones, la disminucién en el uso de agua no afectaria el rendimiento y productividad ée los cultivos que sinteticen trehalosa (Pilon-Smits, ef al., 1998). Adicionalmente, [as plantas 0 partes de ellas que sinteticen wehalosa podrin ser conservadas en estado deshidratade por largos periodos sin necesidad de refrigeracién y conservando las propiedades organolépticas que el consumidor demanda. Este aumento sin precedente en Ia vida de anaquel de los productos agrivolas, tendré una" fuerte repercusin en su mercado ya que disminuitén los costos de transporte y almacenamiento (Pilon-Smits, er al., 1998). 2.5.3. Uso de Trehalosa en la Industria Médiea. Otro uso potencial de trehalosa se encuentra en la industria médica, donde un estudio demuestra que Ia presencia de trehalosa en células de mamiferos les confiere Ia habilidad de mantenerse viables por dias en ausencia de agua (Guo, er a/., 2000). Encontrandose que les células de3 mamiferos pueden ser almacenadas en forma deshidratada, lo que implica el transporte y almacenamiento prolongade de células, tejidos y posiblemente Srganos. Este ultimo es importante debido a la urgente necesidad de transplantes de drgenos que se requieren hoy en dia (Guo, e7 ‘al, 2000) Los avances en Ia tecnologia de transferencia de genes y optimizacién de procesos de desecacién y almacenamiento darén como resultado el mejoramiento en la prolongacién del tiempo que viablemente Jas células puedan ser mantenidas en estado seco (Guo, ef al., 2000). Estos avances ya se han reportado, entre estos ejemplos se menciona el estudio del metabolisme de tehalosa @ nivel tanto bioquimico como genético en nematodos para poder diseflar una nueva droga en contra de helmintos (online.anv.edu.au), Ademés, se ha comprobado que al secar anticuerpos monoclonales en preseneia de trehalosa y ser hidratados después de almacenarse a temperatura ambiente durante varios aos les permite mantener aiin su actividad, Otras proteinas que han sido secadas con trehalosa son enzimas y factores de coagulacién sanguinea, teniendo similares resultados (Crowe, et al.,1996). Posterior a estos estudios, se trataron enzimas de restriccién que se utilizan en biologia molecular para Ja modificacidn de ADN Normalmente estas enzimas son almacenadas a -20°C y empacadas en glicerol. Los resultados demostraron que las enzimas conservaron actividad y estabilidad después de ser almacenadas a 37°C por 9 meses, 0 al ser expuestas a ciclos de bajas y altas temperaturas (20°C-37°C), En contraste las enzimas que no se trataron con trehalosa perdieron actividad y estabilidad, Azieares reductores como lactosa y maltosa, al igual qué el disacdrido no reductor sacarosa, presentaron resultados menos satisfactorios. En contraste, dextran asi como también monosacéridos y4 alcohol monosacéridos no fueron capaces de conservar Ia actividad, ni la estabilidad de dichas enzimas (Roser & Colago, 1993). Trehalose también se ha reportado como parte integral de un método para la recuperacién de a fiinciéa y preservacién de islotes pancreéticos humanos después de ser almacenados entre 5 y 9°C. Le recuperacién de ellos utilizando trehalosa fue de 94% contra 42% sin trchalosa, manifestando su funcionalidad como _eriopreservador. (www.insulin-free.org), ete 2.6. Restriccién de Trehalosa en su Uso Comercial. Comerciaimente la aplicacién de trehalosa en la conservacién de alimentos esta limitada, El alto precio de la trehalosa, combinado con las, cantidades requeridas para el proceso de secado de alimentos, reactivos y productos farmacéuticos, restringe su uso (Goddijn, er al., 1997). Esta limitacién esta dada porque la irehalosa se obtiene a partir de su sintesis en levaduras, teniendo un costo de 700 dils/Kg. En consecuencia la sintesis de altos niveles de trehalosa en plantas u otros orgenismos ‘ransformadores, representa potencialmente una fuente barata de trehalosa para la industria (Kidd & Devorak, 1994). : Adicionalmente se plantea Ia posibilidad de que una vez purificado el complejo que sintetiza la trehalosa, este puede ser cristalizado y utilizado como cristales cataliticos montades en columnas y usarse para produceién en gran escala de trehalosa (Kidd & Devorak, 1994) Una vez reducido el alto costo de trehalosa mediante el volumen de produceién, la trehalosa podré ser adoptada como parte de un proceso comercial de secado que combine las ventajés de ser barata con la de ser de répida deshidratacién, con Ia preservacién de las caracteristicas del jento fresco, expandiéndose la demanda de este disacérido a leche en15 polvo, bebidas de frutas, concentrados de jugos, sopas, jugos vegetales, ete, (Kidd & Devorak, 1994). 2.7. Digesta de Trehalosa. La hidrélisis de trehalosa es realizada por la enzima tehalasa (Kopp, ef al., 1996) la cual degrada la trehalosa en dos moléeulas de glucosa (Roser, 1991). Esta enzima se encuentra en microorganismos, plantas, tracto digestivo de animales (Kopp, ef al, 1993) y humanos (www.web.indstate.edu). Dado que una gama de alimentos gue se consumen cotidianamente tales como 1a miel de abeja, hongos, pan, vino y vinagre contienen trehalosa (Roser, 1991), contribuyendo con 1-2% al consumo de carbohidratos (www.physiology.uab.edu). Esto significa que la adicion de trehalosa a los alimentos no representa riesgo alguno para la salud de los consumidores. 3. Biosintesis de Trehalosa por el Complejo Trehalosa- 6-fosfato Sintasa/Fosfatasa (TPS/P). El estudio de la biosintesis de trehalosa se realizd en Saccharomyces cerevisiae, durante mucho tiempo. Empero, en los dltimos afios se han realizado una diversidad de investigaciones, en las cuales. se proponen diferentes sistemas enzimiticos de sintesis de trehalosa, Identificando diferentes enzimas en sus sistemas de acuerdo al origen de Ia especie en estudio. La biosintesis de trehalosa de mayor referencia, es la realizada en Ia levadura Saccharomyces cerevisiae, que consiste en dos pasos enzimiticos (figura 2), Primero, la trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS) condensa UDP-glucosa y glucosa-6-fosfato, para produeir trehalosa-6-/ Trehalosa-6-fosfato i + upp ‘Trel lucas feetaco fostalnta (TPS2) Trehalosa Figura 2. Ruta de Biosintesis de la Trehalosa 16” fosfato, Segundo, una fosfatasa especifies, trehalosa-6-fosfato fosfatasa (TPP) degrada el producto trehalosa-6-fosfato a trchalosa (Hottiger, ef al., 1997). En esta levadura las enzimas de sintesis de trehalosa forman un complejo con las dos actividades. fosfato En la levadura S. cerevisiae, el oligomero de Ie trehalosa- sintasa/fosfatasa se encuentra en el citoplasma y consta de tres fosfato subunidades; trehalosa-6-fosfato sintasa (TPS), trehalosa- fosfatasa (TPS2) y un polipéptido de posible funcién regulatorie (TPS3) con masas moleculares de 56 kDa, 100 kDe y 130 kDa, respectivamente (de Virgilio, ef af., 1993), Sin embargo otros estudios muestran que las masas moleculares son: $6 kDa, 102 kDa y 123 kDa, respectivamente (Bell, ef al,, 1992; Thevelein & Hohmann, 1995; Reinders, ef af.,1997) siendo atin este punto tema de discusién. La actividad de esta holoenzima tiene una regulacién compleja y ain poco entendida, En primer lugar, la subunidad TPS1 parece ser activada por desfosforilacion (Panek, ef ai., 1987). Por otro lado se ha sugerido que la incapacidad de la levadura de crecer en glucosa cuando se inactiva el gen de TPSI por mutacién, se debe al papel que juega la subunidad TPS! en regular Is entrada de glucosa a Ia célula (Thevelein & Hohmann, 1995; Hohmann, er af., 1996). Esta doble funcién para la TPS1, esto es la actividad de sintasa y de.sensor de glucosa, plantea un mecanismo de regulacién metab6lica donde pareciera estar involucrada una sintasa dependiente de AMPe como sefial para la desactivacién de la TPS1 (Panek, et ai., 1987; Thevelein & Hohmsnn, 1995) Los genes de ambas enzimas ya han sido aislados y secuenciados, tanto de bacterias como de levadura (Hengge-Aronis, er al., 1991 Londesborough & Vuorio, 1991; Bell, er al., 1992; De Virgilio, er af 1993). Recientemente se reporté el aislamiento y secuenciacién de la TPS de plantas de Selaginella lepidophyila (Zentella, et al., 1999). La8 delecién de los genes ot8A u otsB de £. coli, que codifican para la rchalosa fosfato sintasa y fosfatase, respectivamente, causa pérdida de la osmotolerancia y termotolerancia de la bacteria. Ademis, Ia transeripcién de estos genes se induce bajo estrés osmético y calérico (Hengge-Aronis, ‘et al., 1991; McDougall, er al., 1991). 4, Efectores de la Actividad Enzimatica, La actividad de una enzima puede verse modificada por varios factores, entre ellos se encuentran: el pH, le temperatura, la fuerza ionics del medio ambiente, la presencia de iones y metales. Como parte de Ia carscterizacién de las enzimas, generalmente se determing la temperature y el pH optimo de Ta enzima, In estabilidad de Ia enzima @ pH. y se estudia el efecto que pueden tener ciertas sales y algunos metales sobre Ja actividad enzimatica, 4.1, pH. La ionizecién del agua y especificamente el producto iénico del agua constituye la base de la escala de pH, : La disolucién iGnice del agua es un proceso de equilibrie: #0 {H+ OW Dado que le concentracién del agua, en el agua pure, es muy elevada (55.5 M) y le concentracién de iones H” y OH’ es muy pequetia (1 x 107 M 225*C) Ia concentracién miolar del agua no cambie significativamente por su ligerisima ionizacién. La constante de equilibrio puede simplificarse a la expresién siguiente55.5Keq= [H"] [OH] ¥ el término $5.5 x Keg puede sustituirse por una constante “global” Kw. Hamada producto iénico del agua, Ky = (H'] [08] El valor Ky a 15°C es de 1 x 10". en una disolucién dcida la concentracién de H* es relstivamente elevade y la de Ol correspondiente baja; en una disolucién bésica la situscién se invierte El producto idnico del agua Ky, constituye la base para la escala de pH, que es un medio de designar la concentracién real de iones H” (y por tanto de iones OH) en cualquier disolucién acuosa en el intervalo de acidez de 1.0 M de Hy 1.0 M de OM. $.P.L. Sorense definio el término pH como pH = log 1/[H"] = -log [1°] En una disolucién neutra a 25°C OY) = [0H] =1x 107M El pH de tal disolucion es pH = log {1/1 x 107) = 7.0 El valor 7.0 es el que se asigna a una solucién neutea (no es deida ni bésica). Es importante notar que la eseala de pH es logaritmica, dos20 disoluciones que difieren en una unidad de pH significa que difieren 10 veces en concentracidn de iones H” (Lenhinger, et al., 1993). Una enzima generalmente tiene una actividad optima en un rango de pH muy pequeto. El pH éptimo de una enzima depende de una serie de pardmetros experimentales entre los cuales estén: tiempo de reaccién, temperatura, naturaleza y concentracién de los sustrstos, naturaleza y coneentracién del buffer, fuerza idnica del medio, pureza de la preparacién enzimdtica, ete, Todos estos parimetros deben ser controlados para poder hacer cualquier estudio del efecto del pH sobre la actividad de una enzima (figura 3) El pH tiene efecto sobre Ie estabilidad y sobre la union de los sustratos y Ia actividad catalitica de la enzima, El efecto del pH sobre la actividad catalitiea de una enzima se define como el efecto del pH sobre Ia ionizacién de los grupos prototrépicos involucrados en el sitio activo de la enzima. Estos grupos prototrépicos estan localizados en las eadenas laterales acidicas o basicas de los amin: jcidos que forman a la protefna, Dicha ionizacién se muestra en el siguiente esquema 1) Ka 4 KE KY Ay s eta SF ea BMsP Is t KE KY) BY EM+A q@a> EMSA SPP EMPFigura 3, Efecto del pH Sobre la Actividad de una Enzima. Campana de Bell clisica, este tipo de gréfica muestran dos grupos ionizables en el sitio activo de la enzima, los cuales influyen en la actividad (Fuente: Segel, 1974).2 En este esquema se definen las constantes de velocidad (K) y las constantes de velocidad de reaceién (t) de cada una de las formas en que se puede ionizar la enzima. El efecto del pH sobre la actividad enzimatiea se puede analizar de varias mancras, la més comtin es hacerlo a través de Ta derivacién de la ecuacion de Michaelis-Menten donde la actividad de la enzima esta en funcién del pH. Existen varias ecuaciones dependiendo del efecto que se quiera analizar. Ya que el pH puede tener efecto sobre las especies libres 0 sobre los complejos. Para fines practicos podemos decir que el efecto del pH sobre la enzima se define por las siguientes ecuaciones: K EIOrVIE™) oy K=[E") OY (E7 Esto también lo podemos expresar en términos de velocidad maxima (Vmax) P= Fax fen Donde f‘ra es una funcién especifica del pH. Otra manera es a través de la ecuacién de Dixon-Webb La wal podemos ajustar los datos experimentales a la forma exponencial de la ecuacién: “Hl KOT Donde Kz y Ky son les constantes de disociacién de los grupos que ado estin ionizdndose y ¢ es el valor de pH experimentalmente deter (Withaker, 1972)4.11. pKa La gran mayorfa de las enzimas son proteinas, dichas proteinas estén formadas por aminodcidos. Estos aminodeidos estén en solucion pueden actuar como acidos (dador de electrones) 0 bien como bases (aceptor de electrones) por lo que se les considera anféteros, esto es, los aminodcidos son anfélitos. Generalmente le capacidad dicido bisica de los aminodcidos se basa en la estructura de sus grupos R ya que los exiremos amino y carboxilo estin formando parte del enlace peptidico. Dichos grupos pueden ionizarse como dcidos y bases débiles, por lo que su tendencia a disociarse viene dada por su constante de disociaeién esto es: K = )AT THA) Esta constante, K’, se conoce como constante de acidez cuando se esta disociando un Acido débil (como los aminodcides) y se expresa como K,. En bioguimica, generalmente se maneja el valor de pK, mas que el de K’ donde pK, es una transformacién logaritmica de (H’) pK, = log 1/K, = -log Ky Los valores de pk, son menos engorrosos que los de Ky, lo mismo que ocurre con los valores de pH (Lenbinger, er af.,1993), 4.1.2. pl. El pH al que una proteina muestra un mfnimo de solubilidad es su PH isoeléctrico, definido como aquel valor de pH al que la molécula no24 posee carga eléctrica y es incapaz de desplazarse en un campo eléetrico. Para una proteina determinada, el pH isoeléctrico variard un poco segin la composicién inica del medio, puesto que las proteinas pueden unirse a ciertos aniones o cationes. Cuando una disolucién de proteina se dializa a fondo frente agua destilada para eliminar todos los iones pequetos distintos de los H” y OH’, el pH de la disolucidn resultante se conoce como pH isoidnico, Este pH isoiénico es constante para cualquier proteina determinada, En bioquimica, el pl determinado por Isoelectroenfoque (IEF) es en realidad el pH isoiénico (Lenhinger, et al, 1993). 4.2. Fuerza Iénica. La fuerza iénica esta dada principalmente por las sales (concentracién y valencia) presentes en el buffer utilizado, Este pardmetro generalmente se mantiene constante cuando se determina el efecto de pH, temperatura, concentracin de enzima y sustratos, etc 4.3. Presencia de Sales y Metales. La actividad de muchas enzimas en presencia de altas se ve inhibida ( von Hippel & Scheleie, 1962) EI potasio es un ién que acumulan las plantas bajo condiciones de concentraciones de Na* sequia o salinidad; los reportes sobre el efecto de este ién sobre la actividad de enzimas mencionan que gencralmente no es inhibidor y en algunos casos es un activador de enzimas (Valenzuela-Soto & Muftoz- Clares, 1994). El calcio es un catién divalente que con frecuencia es un componente de las membranas celulares vegetales (Cramer, ef al., 1985).25 Por otra parte, el calcio puede regular Ia actividad de algunas enzimas y sea a través de le calmodulina o por si mismo como Ca™* (Voet & Voet, 1995).