a BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR LABORATORIO No 5: EXTRACCION DE ARN 1. INTRODUCCION En los organismos celulares el ARN es la molécula encargada de dirigir la sintesis de proteinas, pues aunque el ADN es el que contiene /a informacién que determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para traducir esta informacién y producir las proteinas necesarias para el desarrollo y actividades de la célula. La mayor dificultad en la extraccién de! ARN es evitar la contaminacién con RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su funcién. Por lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-piro carbonato (DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificacién covalente 2. OBJETIVOS + Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extraccién de ARN * Adquirir conocimiento basico para el manejo y cuidado de ARN extraido + Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtencién de ARN 3. MARCO TEORICO La mayoria de protocolos para extraccién de ARN estan basados en el método descrito por Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este cido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenizacién de la muestra con el (los) reactivo (s) que contengan la solucién fenol-isotiocianato, donde este tiltimo se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las células y disuelve sus componentes, la adicién posterior de cloroformo separa la solucién en fase acuosa y organica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitacién el ARN. La metodologia que se va a utilizar en esta practica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencioné, igualmente el ADN y las proteinas pueden serrecuperados de la fase organica por precipitacién secuencia, asi con etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitacién adicional pueden recuperarse las proteinas de la fase organica Esta técnica permite obtener ARN a_ partir de pequefias cantidades de tejido y células en cultivo o suspensién de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Asi mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con precaucién esta libre de contaminacién con ADN y proteinas y finalmente puede ser utilizado en diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripcién reversa, ensayos de proteccién de RNAsas PCR y clonaje molecular 4, PRE-LABORATORIO 1. Durante la extraccién de ARN se emplea sales de guanidina 2Cudl es su funcién y que tipo de sales son las mas utilizadas? 2. .Cual es la funcién del dietilpirocarbonato (DEPC) durante la extraccién del ARN? 3. 2Por qué empleando el método de TRIzol se puede aislar simultaneamente ADN, ARN y proteinas? 4, {Se obtiene la misma cantidad de ARN que de ADN en la extraccién con TRIzol? 5. {Qué tipo de ARN se obtiene en este tipo de extraccién? 6. Porque se requiere agua milliQ, _ultrapura o tipo | en este procedimiento? 5, PRECAUCIONES Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulacién de! ARN para obtener la segunda cadena © cadena complementaria, por lo cual deben tenerse en cuenta los siguientes aspectos cuando se trabaja con ARN: - Siempre deben utilizarse guantes de ldtex, ya que la piel contiene algunas bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer. - Utilizar pipetas y micro pipetas estériles, reservadas para trabajo de ARN, evitando asi contaminaciones cruzadas. - Utilizar material tratado con inhibidores de RNAsas (libre de RNAsas) -El reactivo bromuro de etidio es altamente peligroso por lo que siempre deben utilizarse elementos de proteccién como guantes y gafas, evitando completamente el contacto con piel y ropa, asi como evitando inhalar el reactivo o los vapores de este. Otras precauciones son: - Utilizar siempre tubos de polipropileno = Utilizar material resistente al cloroformo y altas velocidades de centriftugacién - Equilibrar los tubos previos a la centriftugacion - Tapar o sellar correctamente los tubos durante la centrifugacién y durante la incubacién para evitar la evaporacién.6. MATERIALES Y REACTIVOS ‘Tubos Vacutainer con EDTA, heparina o citrato Reactivo TRIzol (Gibco) Eppendorf estériles de 1.5 mL Micro pipetas Puntas estériles Centrifuga y micro centrifuga Guantes ‘Agua desionizada estéril Cloroformo Agua libre de ARNasas Isopropanol Etanol al 75% en agua libre se RNAsas 7. PREPARACION DE REACTIVOS NaCl al 0.9% -Agua libre de RNAsas ‘(mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estéril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente), Esto debe hacerse en cabina de extraccién y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y almacenar a temperatura ambiente - Etanol al 75% 100mL de agua libre de RNAsas Etanol grado biologia molecular Mezclar cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en un frasco estéril hasta homogenizar completamente No autoclavar y almacenar a temperatura ambiente. 8. PROCEDIMIENTO. Esta practica se realizara en dos clases. En la primera se recolectara la muestra a partir de sangre total se obtendran Células Mononucleares de Sangre Periférica(CMSP), mediante gradientes de centrifugacion Ficoll Hypaque y se dejara hasta el paso de homogenizacién TECNICA DE TRizol PARA EXTRACCION DE ARN |. HOMOGENIZACION 1. En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar el pellet de CMSP (obtenidas previo sometimiento de sangre total a gradiente de Ficoll-Hypaque) con 1 mL de reactivo TRIzol. Se deja incubando a -70 °C, hasta la préxima practica 2. Mezclar suavemente con micro pipeta. Il, FASE DE SEPARACION 3. Incubar la muestra homogenizada durante 15 minutos a temperatura ambiente, permitiendo asi la completa disociacién de los complejos de nucleoproteinas, 4. Adicional 200ul de cloroformo, tapar perfectamente el tubo 5, Agitar fuertemente durante 15 segundos 6. Incubar por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y en posicién vertical 7. Centrifugar las muestras a 14000rpm por 10 minutos preferiblemente a temperatura de 4 a 8°C 8. Luego de centrifugar, la mezcla se separa en una fase inferior roja, fase de fenol cloroformo, en una interfase y en una fase incolora superior, la cual contiene exclusivamente el ARN Il, FASE DE PRECIPITACION 9. Transferir la fase acuosa cuidadosamente a un tubo Eppendorf nuevo (aqui puede separarse igualmente la fase organica_ para __ posterior purificacién de ADN o proteinas) 10. Adicional 0.5 mL. de isopropanol para precipitar el ARN de la fase acuosa Homogenizar pellet de céluas blancas, con TRIzol Mezcare incubar ‘Adiclonarclorotorma Aglare incubar Separacion de fases Tomar la fase acuosa y ‘Adicionar isopropanol Descartar el sobrenadante Adicionar etanol al 75% al pele. Mezcler pet ome fy Eliminar et ‘sobronadante v Dejarsecara T” ambiente Adicionar agua libre de RNASaS y hhomegen.zar 11. Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posicién vertical 12. Centrifugar a 10000rpm (0 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a temperatura de 2a 8°C13. El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugacién como un pellet parecido a un gel. IV. FASE DE LAVADO 44, Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo 15. Adicionar 1 mL de etanol al 75% al pellet para lavarlo 46. Mezclar por agitacién 17. Centtifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2-8 °C 18. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante V. FASE DE DISOLUCION 19. Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una toalla de papel estéril 20. Adicionar 30ul de agua libre de ARNasas 21. Disolver el ARN por pipeteo suave, opcionalmente puede incubarse 10 minutos a 55-60°C para lograr una completa disolucién 9. POST-LABORATORIO 1. ZA qué factores puede deberse la obtencién de baja cantidad o pérdida total de! ARN extraido con esta metodologia? 2. .Qué otras técnicas comerciales existen para extraer ARN? 3. ZEl ARN obtenido aqui puede utiizarse directamente para realizar una determinacién especifica a través de PCR? {Por qué? 4. A partir de que otras muestras puede realizarse la extraccién de ARN y con qué objetivo se realiza en estas muestras la extraccién? 5. Consulte sobre inhibidores de nucleasas y su efecto durante la extraccién de ARN 10. BIBLIOGRAFIA - Bioquimica. Charlotte W Pratt Kathleen Comely 2 edicién. Manual moderno. 2012, pg 62 a 69 Current protocols Afios 2009-2017 + Almonacid, C Pinilla G. Introduccién al andlisis Bioquimico y a sus métodos de separacién. Universidad Colegio Mayor de Cundinamarca 2008 = Chomezynski P. and Sacchi, 1987, Anal Biochem. 162:156 - Chomezynski P. and Sacchi, 1993, Biotechniques. 15:532 - Sambrook, J. et al, 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2 nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York - David, L.G. dibner, M.D.& Battery, JF. Bassin methods in molecular biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986 - Catalogo de TRizol casa comercial GIBCO.41. AUTOEVALUACION. NUMERO DE LAPRACTICA, si LOGRO (Objetivos cumplidos) NO FORTALEZAS DEBILIDADES ‘SUGERENCIAS A DEBILIDAD CADAANEXO COMPLEMENTARIO AL LABORATORIO No. 4 OBTENCION DE ADNc 1. INTRODUCCION Cuando el ARN mensajero es obtenido, se puede llevar a cabo una amplia variedad de aplicaciones: elusién del ARNm, cuantificacién del ARNm y sintesis de ADNc (ADN complementario) el cual puede ser utilizado para: amplificacién, deteccién de la expresion de genes especificos o almacenaje de ADNc. Para obtener el ADNc se utiliza una técnica denominada RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction, Transcripcién Reversa - Reaccién en Cadena de la Polimerasa), que nos permite la amplificacién de una cantidad pequefia de moléculas de ARN (tanto ARNm como RNA total) con gran especificidad, mediante la Transcripcién reversa del RNA a ADNc, que es posteriormente amplificado. 2. OBJETIVOS + Identificar los reactivos, funcionamiento y orden de adicién de los reactivos necesarios en la obtencién de ADNc in Vitro. * Adquirir conocimiento basico para el manejo y funcionamiento de la obtencién de cadenas complementarias de ADN + Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtencién de ADNc 3. MARCO TEORICO Esta técnica permite obtener ADNc a partir de pequefias cantidades de ARN de origen humano, vegetal, animal o bacteriano. Asi mismo el ADNc obtenido por este método, si se realiza el procedimiento con precaucién, esta libre de contaminacién con DNAsas y proteinas. Ademas el ADN contaminante, tanto en las muestras, como en los reactivos, debe ser evitado con el fin de impedir la aparicion de productos inespecificos Hay dos partes bien diferenciadas en cualquier RT-PCR: la transcripcién reversa y la amplificacién, La transcripoién reversa, utilizando RNA total como ARNm, es la etapa clave en una RT-PCR. Existen varios factores que influencian la eficiencia del proceso, tales como: la enzima que va a llevar a cabo esta reaccién, la presencia de estructuras secundarias en el ARN, etcLas reverso transcriptasas virales, tales como M-MLV y AMV, han sido las enzimas de eleccién durante muchos afios. Estas enzimas, sin embargo, son termolabiles, y no pueden llevar a cabo la transcripcién reversa cuando existen estructuras secundarias en el ARN. En este caso, se suelen utilizar transcriptasas reversas termoestables, que pueden llevar a cabo la reaccién a 55-70°C, permitiendo la desnaturalizacién de las estructuras secundarias, y aumentando la eficiencia global de la reaccién. 4, PRECAUCIONES Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente durante el procedimiento de manipulacién de! ARN para obtener la segunda cadena © cadena complementaria, por lo cual debe utilizarse durante todo el procedimiento guantes de latex, ya que la piel contiene algunas bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer; utilizar todo el material necesario para el trabajo de ARN (pipetas, micro pipetas, entre otros) estéril y con inhibidores de RNAsas evitando asi contaminaciones cruzadas. Se deben tener en cuenta otras precauciones enunciadas en la practica de extraccion de ARN 5. PRE- LABORATORIO Dependiendo las condiciones experimentales puede darse la necesidad de usar ADNc, para lo cual se realiza primero la extraccién de ARN que més tarde serd sintetizado a ADNc. Para ello, la ciencia se ha valido de un truco viral: los virus que no poseen ADN propio tienen que transformar su ARN a ADN dentro la célula huésped y para ello estan equipados con una ADN polimerasa especial, al igual que otras polimerasas es dependiente de ARN, esta se denomina transcriptasa reversa. La més conocida comercialmente es la MMLV (Molones Murine Leucemia Virus) que afiade nucledtidos al poli nucleétido naciente en direccién 5' —> 3', MMLV utiliza ARNm como molde, pero requiere de un cebador. Teniendo en cuenta el enunciado anterior. Responda las siguientes preguntas: 1. .Cual es la diferencia entre ADNc y ADN genémico? 2. gActualmente en el mercado se cuenta con otro tipo de retrotranscriptasas, mencione alguna de ellas? 4Cudles son las diferencias entre cada una de ellas? 3. La retrotranscriptasas utilizan ARNm como molde, pero requiere de un cebador. Los cebadores mas comunes son un oligo dT (TTTTTTTT), primers degenerados (generalmente hexameros) especificos anti sentido o sentido. ,En qué condiciones se deben emplear cada uno de ellos? 6. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS ARN obtenido con anterioridadMicro pipetas Puntas estériles Vortex. Centrifuga con rotor para tubos de 15ml y Micro centrifuga para viales de 1.5 ml Guantes Agua des ionizada estéril Tris Acetato EDTA SDS Bromuro de etidio ‘Agarosa Reactivos comerciales para transcripcién reversa Camara de electroforesis 7. PREPARACION DE REACTIVOS * Agua libre de RNAsas mL de Dietil pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estéril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizacién completa de! DEPC. con el agua (durante 12 horas aproximadamente), adicionando el DEPC en cabina de extraccién y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y Almacenar a temperatura ambiente 8, PROCEDIMIENTO * TECNICA DE ADNc DE PROMEGA Luego de la extraccién de ARN, cada muestra se procesa para la obtencién de cadena complementaria 0 ADNc por medio de una reaccién la cual contiene la enzima Transcriptasa Reversa MMLV-RT, buffer para la enzima, dNTPs, RNAsin y Random Primers u Oligo DT (Promega). El procedimiento utilizado es: 1. Enun tubo Eppendorf, colocar 10 ul de RNA (200ng aproximadamente) 2. Adicionar Sul de agua libre de RNAsas 6ul de buffer para RT, 1ul de RNAsin, 1.5ul de dNTP (mezcla de 10mM), 3 ul de Oligo DT o Random Primers y 1.5ul de enzima MMLV-RT. Incubar a 37°C durante 1 hora. EI ADNc obtenido se puede guardar a -20°C hasta su futuro uso. Puede observarse la calidad del ADNc visualizandolo en gel de agarosa al 1% preparado en buffer de corrido TAE (tris-acetato-EDTA) y tefiido con bromuro de etidio. gasEl corrido se hace a 100V durante 30 minutos aproximadamente 9, POST-LABORATORIO 1. 4Cémo actiia o funciona la MMLV-RT en la transcripcién reversa? 2. {Qué otras transcriptasas reversas existen, de que origen y que caracteristicas tienen? 3. cLa enzima para la transcripcién reversa en que paso del procedimiento deberia adicionarse y porque? 4, ZEI ADNc obtenido en que procedimiento o para que finalidades puede utilizarse? 5. {Qué inhibidores de RNAsas existen y cémo actuan? 10. BIBLIOGRAFIA -Revista Nature Protocols afios 2009- 2018 1.,Catalogos y fichas técnicas 2016 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad, Biologend, Bioline, Roche, etc. 2.Chomezynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156. 4. David, L.G, Dibner, M.D. & Battery, J.F, Basic methods in molecular biology. Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986. 2. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 3. Catdlogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de DNA. 4, Fundamentos moleculares en medicina. Femando Lizcano Losada Manual Modemno, Universidad de la Sabana, 2008. 5. Biologia molecular e ingenieria genetica, Texto lustrado de biologia molecular e ingenieria genetica Luque jose etl Primera edicion. 2001 41, AUTOEVALUACION, NUMERO DE TOGRO FORTALEZAS | DEBILIDADES ‘SUGERENCIAS LAPRACTICA | (Objetivos. A CADA ‘cumplidos) DEBILIDAD si No.