Vi Sinh

VỆ SINH CÁ NHÂN VÀ NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC
1. Khi làm việc trong phòng thí nghiệm vi sinh học phải tuyệt đối vệ sinh, tôn
trọng tính ngăn nắp và trật tự của phòng thí nghiệm.
2. Mỗi cá nhân, mỗi nhóm làm thí nghiệm với dụng cụ riêng, không được mượn
dụng cụ của các nhóm khác. Nếu thiếu phải hỏi cán bộ PTN hoặc GVHD, không được tự
động sử dụng dụng cụ của người khác.
3. Phải mặc áo bluose.
4. Không nói chuyện, không ăn uống, không hút thuốc lá, không đi lại lộn xộn
trong PTN.
5. Không để các vật phẩm, canh trường vi sinh vật hoặc môi trường nuôi cấy vi
sinh vật gây bẩn ra bàn ghế, sách vở hoặc quần áo. Trường hợp gây bẩn phải vệ sinh ngay.
6. Sau khi làm xong, phải vệ sinh nơi làm việc của mình, vệ sinh các dụng cụ,
máy móc thí nghiệm. Rửa tay sạch và lấy cồn sát khuẩn trước khi ra khỏi PTN.
7. Khi tiến hành thí nghiệm phải có sổ ghi chép các công việc thí nghiệm. Trong
sổ ghi chép các điều kiện liên quan đến bài thí nghiệm. Phải ghi chép đầy đủ, cẩn thận, rõ
ràng.
HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN MSSV

………………………………………... ……………………
Giáo trình Thực hành Vi sinh vật kỹ thuật Môi trường
BÀI 1: CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ

KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG
1. CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM

1.1. Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc
Phòng thí nghiệm vi sinh phải được vệ sinh trước và sau khi sử dụng.
Dụng cụ thiết bị được khử trùng hay vệ sinh sạch sẽ và sắp sếp ngăn nắp.
Bề mặt làm việc phải được tiệt trùng bằng cồn 700.
1.2. Máy móc, dụng cụ trong phòng thí nghiệm:
Dụng cụ bằng thuỷ tinh hoặc kim loại:
- Các dụng cụ đựng môi trường dinh dưỡng phải được khử khuẩn tuyệt đối trước khi
sử dụng. Sau khi sử dụng xong phải rửa sạch và khử khuẩn lại, sấy khô, bao gói và để vào
nơi quy định.
- Các máy móc, thiết bị cần có độ chính xác cao (cân phân tích, buồng đếm…) càng
cần phải chú ý vệ sinh trong và sau khi tiến hành thí nghiệm
Có hai phương pháp tiệt trùng: nhiệt khô hoặc nhiệt ẩm.
*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170 -1800C
*Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: Được thực hiện trong thiết bị tiệt trùng áp
suất 1atm, 1210C trong thời gian 20-30 phút.
Dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt: Tiệt trùng bằng nhiệt ẩm.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: Thường được tiệt trùng trong thiết bị tiệt trùng ở
1210C, 20-30 phút.
Đối với những thành phần của môi trường dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao
không thể sử dụng phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt trong thiết bị tiệt trùng. Trong những
trường hợp đó cần sử dụng màng lọc vi khuẩn để tiệt trùng.
1
2. KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ
duy trì thế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường.
Có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; Có độ pH thích hợp; Có độ nhớt nhất định; Không
chứa các yếu tố độc hại; Hoàn toàn vô trùng.
Làm môi trường để thực hiện việc phân lập, nhân giống, giữ giống vi sinh vật, đồng
thời để nuôi cấy và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của chúng.
2.1. Nguyên tắc
Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinh
dưỡng của từng loại sinh vật.
Đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vật.
Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinh
vật.
2.2. Pha môi trường
Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tự
hướng dẫn trong tài liệu.
+ Môi trường lỏng: Cân, đong các chất rồi cho hoà tan vào nước.
+ Môi trường đặc: Cân agar và hoá chất cho vào bình tam giác hay becher rồi hoà
tan trong nước, đun trên bếp hay hấp trong autoclave.
2.3. Chuẩn bị môi trường
a. Thạch nghiêng
Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường đặc 1/3 đến 1/4 ống nghiệm.
Để ống thạch ở vị trí nghiêng thích hợp cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn.
Vị trí đầu trên của mặt nghiêng không vượt quá 2/3 chiều cao ống nghiệm.
Không để thạch chạm vào nút bông, khi làm nghiêng tốt, mặt thạch nghiêng bằng
phẳng, không bị đứt, chiều dài vừa phải, không ngắn quá, dài quá.
b. Thạch đứng
Cho vào ống nghiệm với một lượng môi trường chiếm 1/2 đến 2/3 ống nghiệm.
Thạch nguội sẽ đông lại và ta sẽ có ống thạch đứng.
2
Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường chiếm 1/2 - 1/3 bình.
c. Làm thạch hộp petri
Đun thạch chảy lỏng, để nguội đến 50-600C.
Tay phải cầm bình (hoặc ống) môi trường đã chảy lỏng, giữ hơi nghiêng, dùng tay
trái xoay và rút nút bông ra, vô khuẩn miệng bình (hoặc miệng ống trên đèn cồn).
Dùng tay trái hé mở nắp hộp vừa phải và nhanh tay rót vào hộp một lượng môi
trường thích hợp.
Nhanh chóng đậy nắp hộp lại, xoay tròn hộp từ từ trên bàn để thạch dàn thành một
lớp đều trên đáy hộp. Không xoay mạnh làm thạch bắn tung lên.
Hé mở nắp hộp và để yên cho đến lúc thạch đặc lại hoàn toàn.
Đậy nắp lại, lật ngược hộp cho đáy lên trên.
Hộp thạch đổ tốt, mặt thạch phải đều, bằng phẳng, lớp thạch không dày quá hoặc
mỏng quá (thường khoảng 2mm).
Hình 1: Một số dạng môi trường trong ống nghiê ̣m và đĩa petri
3
Số môi trường chưa dùng đến phải bảo quản ở chỗ mát, nhiệt độ từ 0 - 5 0C, không để
môi trường bị khô, bị tác dụng của ánh sáng.
Dù môi trường mới chuẩn bị hay đã bảo quản lâu, trước khi đem dùng đều phải kiểm
tra sự vô khuẩn. Muốn vậy, ta để môi trường trong tủ ấm có nhiệt độ từ 37 - 38 0C trong 2 –
3 ngày lấy ra quan sát và loại bỏ những ống (hoặc bình) môi trường có vi sinh vật phát triển
(bị đục hoặc có khuẩn lạc).
2.4. Điều chỉnh độ pH của môi trường:
Điều chỉnh độ pH của môi trường dùng HCl 10% hay NaCl 10%.
Ngoài ra có một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3...
Lập nhãn môi trường vừa thực hiện:
Tên môi trường: ....................................................
Khử trùng: ngày ......... tháng ........... năm ............
3. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG
3.1. Dụng cụ
Dụng cụ Số lượng Đơn vị

Đèn cồn 6 Cái
Đĩa petri 60 Cái
Ống nghiê ̣m 60 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái
Becher 100ml 12 Cái
3.2. Hóa chất và môi trường

Agar 30g
Môi trường tổng hợp PCA (plate count agar) 23.5g
Cồn 960 2 lít
Nước cất 5 lít
4. THỰC HÀNH
Pha cồn 700
Đổ môi trường thạch ống nghiệm và đĩa petri
4
Chuẩn bị môi trường PCA (plate count agar)

Viết báo cáo
5. CHUẨN BỊ
Mẫu nước: sinh hoạt và nước thải
Mẫu đất
5
HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 1

1. Số liêụ báo cáo
ỐNG NGHIỆM ỐNG NGHIỆM ỐNG NGHIỆM
…………………. …………………….. …………………..
ĐẠT
KHÔNG
ĐĨA PETRI ĐĨA PETRI ĐĨA PETRI

…………………. …………………….. …………………..
ĐẠT
KHÔNG
ĐĨA PETRI (PCA) ĐĨA PETRI (PCA) ĐĨA PETRI (PCA)

…………………. …………………….. …………………..
ĐẠT
KHÔNG
Nhận xét kết quả:

.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2. Câu hỏi ôn bài:

2.1. Tại sao phải vô trùng? Các phương pháp vô trùng và tiệt trùng?
6
2.2. Tại sao lại mở nắp đĩa petri khi chuẩn bị môi trường thạch? Tại sao phải điều chỉnh
độ pH?
2.3. Có mấy dạng môi trường thạch ống nghiệm? Nêu các đặc trưng cho từng loại môi
trường?
3. Yêu cầu bài học
- Nắm vững nội dung bài học
- Lập báo cáo kết quả và nhận xét
- Trả lời câu hỏi
7
BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ

Xác định hay định lượng vi sinh vật là xác định số lượng cá thể tồn tại trong một đơn
vị vật phẩm hoặc canh trường. Để định lượng, cần phải thao tác đúng quy cách một số vấn
đề như: lấy mẫu, pha loãng mẫu…
1. PHƯƠNG PHÁP LẤY MẪU
Để đánh giá chính xác số lượng vi sinh vật, yêu cầu đầu tiên là mẫu phải được lấy và
bảo quả đúng kỹ thuật.
Tùy theo yêu cầu nghiên cứu, đối tượng nghiên cứu và các chỉ tiêu sinh học cần phân
tích mà khối lượng mẫu cũng như quy cách lấy mẫu (số lượng, vị trí, thời gian…) khác
nhau.Tuy nhiên, việc lấy mẫu cần tuân theo những yêu cầu sau:
- Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải vô trùng: đẩm bảo độ thuần khiết, tránh tạp
nhiễm … đảm bảo độ chính xác của kết quả phân tích.
- Dụng cụ lấy mẫu và chứa mẫu phải sạch, không độc hại với vi sinh vật, tránh làm
chết hoặc ức chế vi sinh vật trong vận chuyển và bảo quản.
- Các yêu cầu về khối lượng và tính đặc thù của mẫu:
+ Đủ khối lượng theo yêu cầu phân tich
+ Đúng nơi quy định và vào thời điểm phù hợp với yêu cầu nghiên cứu
+ Mẫu trung bình và điển hình
- Bảo quản: mẫu lấy xong phân tích ngay. Nhiệt độ thường không để mẫu quá 30 phút.
Nếu lấy mẫu xa, cần có thiết bị phân tích hiện trường hoặc bảo quản ở nhiệt độ thấp (0-5 0C),
thời gian bảo quản không quá 24 giờ.
- Các yêu cầu khác: mẫu cần được dán nhãn và ghi rõ
+ Mã số của mẫu
+ Loại và mục đích lấy mẫu
+ Tên và chức năng của người lấy mẫu
+Yêu cầu phân tích
2. PHA LOÃNG MẪU
5.1. Chuẩn bị mẫu
Yêu cầu của việc lấy mẫu:
- Lấy mẫu có tính chất đại diện.
- Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ để phân tích các đặc tính lý, hoá, sinh học.
8
- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.

- Lấy mẫu xong phải phân tích ngay và không được để quá 24h.
- Ghi nhật ký của mẫu và nơi thu mẫu.
5.2. Pha loãng mẫu :
- Chuẩn bị một bình chứa mẫu cần phân tích
- Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng
- Một số pipet vô trùng.
- Pha loãng mẫu cần phải thực hiện trong tủ cấy hoặc phòng vô trùng
a. Mẫu ở trạng thái lỏng :
Pha loãng mẫu theo dãy thập phân 1/10 (10-1), 1/100 (10-2), 1/1000 (10-3),… 10-n
Hình 2.1: Phương pháp pha loãng mẫu nước theo dãy thập phân
b. Nếu mẫu nghiên cứu ở trạng thái đặc (như đất, lương thực, thực phẩm)
Môi trường đất nhìn chung rất thuận lợi cho nhiều nhóm vi sinh vật phát triển. Hệ vi
sinh vật đất rất đa dạng gồm vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn… Số lượng vi sinh vật phụ thuộc vào
hàm lượng chất hữu cơ, tính chất cơ lý cũng như độ ẩm của đất, số lượng cá thể thường rất
lớn.
Các bước tiến hành:
9
- Lấy mẫu đất: mẫu đất mang phân tích có tính đại diện nên số lượng mẫu tùy theo
yêu cầu nghiên cứu khác nhau. Mẫu đất lấy từ 10-20g cho mỗi vị trí, lấy 4 mẫu của 4 góc
vuông và 1 mẫu ở tâm, độ sâu nhất định và mẫu phải được trộn đều trước khi sử dụng.
- Chuẩn bị dụng cụ:
Một bình tam giác 250 ml chứa 90ml nước cất vô trùng
Một số ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng
Một số pipet vô trùng.
- Pha loãng mẫu: cân 10 g đất (hoặc mẫu) cho vào bình tam giác chứa 90ml nước cất
vô trùng. Lắc 10 phút, để lắng 30 giây rồi tiếp tục pha loãng mẫu như trạng thái lỏng.
Tuỳ theo sự ước đoán số lượng vi sinh vật trong mẫu mà pha loãng nhiều hay ít.
Hình 2.2: Phương pháp pha loãng mẫu đă ̣c theo dãy thập phân
10
6. KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA
Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩa

Dùng pipet đã vô khuẩn lấy 0,1 ml dịch huyền phù cho vào mỗi đĩa thạch (tương
đương với 2 giọt dịch).
Số tế bào cấy trên bề mặt thạch phải được dàn đều và khoảng 25-300 CFU (coliform
unit: đơn vị khuẩn lạc).
Sử dụng que cấy gạt bằng thuỷ tinh để dàn đều các tế bào trên bề mặt thạch, que gạt
thuỷ tinh được vô khuẩn bằng cách nhúng vào trong cồn, đốt cháy phần cồn còn lại trên que
cấy trên ngọn lửa đèn cồn. Làm nguội que cấy bằng cách nhẹ nó vào bề mặt thạch, rồi dàn
đều lượng chất lỏng chứa tế bào trên đó.
Lớp chất lỏng trên thạch càng mỏng, sự hấp thu xảy ra càng nhanh.
Đặt các đĩa thạch vừa cấy vào tủ ấm cài ở nhiệt độ 300C và ủ trong 48 giờ.
Kết quả:
Số khuẩn lạc (CFU) x Độ pha loãng
CFU/g = -------------------------------------------------
Thể tích mẫu (ml)
7. THỰC HÀNH
7.1. Dụng cụ
Tên Số lượng Đơn vị
11
Đèn cồn 6 Cái

Đĩa petri 60 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái
Que trang 6 Cái
Ống nghiệm 30 Cái
Môi trường Plate count agar (PCA) tổng hợp 23,5g hay môi trường thành phần
gồm: Trypton, 5.0g; Yeast extract, 2.5g; Glucose, 1.0g; Agar,15g.
Cân chính xác khối lượng môi trường cho vào becher 1,5 lít và thêm vào 1 lít
nước cất. Đun nóng hỗn hợp đến khi tan đều rồi cho vào erlen 1,5 lít đem hấp khử trùng.
Lưu ý, trong khi đun môi trường cần phải khuấy thường xuyên để môi trường không bị
lắng và khét.
Sau đó, hấp khử trùng ở 1210C, 1atm và thời gian 30 phút.
Chuẩn bị:
Cồn 960 2 lít
NaCl tinh khiết 10g
7.3. Thực hành
- Pha nước muối sinh lý 0,9%
- Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất)
- Đổ đĩa.
- Trải đĩa
Đọc kết quả và viết báo cáo
12

1 2 3
Nồng độ pha loãng ………………….. …………………… …………………….
ĐẠT
Số khuẩn lạc
KHÔNG

.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2.1. Tại sao phải pha loãng mẫu? Các bước pha loãng mẫu?
2.2. Vi sinh vật hiếu khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi
khuẩn hiếu khí?
2.3. Tại sao phải khử trùng hay sát trùng toàn bộ: môi trường, dụng cụ, tay… trong quá
trình thao tác? Ý nghĩa việc khử trùng và sát trùng?
13
BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ
1. KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

Phân lập các vi sinh vật kị khí trên môi trường đặc ở đĩa petri.
Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khí
trong môi trường.
Để nguội môi trường còn 45 - 500C.
Hút 0,1 ml mẫu vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trục ống nghiệm.
Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa petri và đậy thật nhanh
nắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn không khí.
Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri.
Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí. Thoa
một lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắp
lại, hoặc dùng máy hút chân không. Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp.
Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,
dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng phương pháp xác định tổng vi khuẩn kị khí bằng ống
nghiệm đậy nút cao su nhưng môi trường nuôi cấy phải bổ sung đầy đủ glucose, trypticase,
yeast và một số các muối khoáng khác cho vi khuẩn phát triển, đặc biệt phải bổ sung các tác
nhân khử như cystein và Na2S vào môi trường.
Thao tác thực hiện:
Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C. Bổ sung vài giọt
Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường.
Cân 1g mẫu đất và pha loãng mẫu bằng nước cất vô trùng theo dãy thập phân liên
tiếp, tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp sao cho khuẩn lạc mọc trên đĩa khoảng 30 -
300. Không để mẫu trong nước pha loãng lâu hơn 30 phút.
Hút 1ml mẫu đã pha loãng vào ống nghiệm vô trùng.
14
Rót môi trường ở nhiệt độ 40-460C vào ống nghiệm có chứa mẫu. Rót môi trường
nhẹ nhàng tránh không tạo bọt khí và không để môi trường tràn ra ngoài.
Đậy ống nghiệm bằng nút cao su vô trùng. Chờ cho thạch đông cứng lại và đem ủ ở
nhiệt độ phòng.
Sau 3 ngày đếm các khuẩn lạc riêng rẽ quan sát được.
8. THỰC HÀNH
8.1. Dụng cụ
Đèn cồn 6 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái
Thành phần môi trường
NH4NO3 2g
KH2PO4 1g
NaCl 10g
MgSO4.7H20 3,3g
Glucose 1g
Pepton 5g
Cao men 0,5g
Agar 12g
Sau khi khử trùng ở 1210C trong 15 phút, môi trường có pH 7.0 – 7.2.
Cách pha hỗn hợp Na 2S + NaHCO3: Cân 0,75g Na2S và 0,3g NaHCO3 pha trong
30ml nước cất.
Môi trường sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C. Bổ sung vài
giọt Na2S + NaHCO3 để khử hết O2 trong môi trường.
- Cồn 960 2 lít
- Nước cất 5 lít
15
- NaCl tinh khiết 10g

8.3. Thực hành
- Pha loãng mẫu (mẫu nước và đất)
- Đổ ống nghiệm
Đọc kết quả và viết báo cáo
9. CHUẨN BỊ
Đổ môi trường PGA
16

1 2 3
Nồng độ pha loãng ………………….. …………………… …………………….
ĐẠT
KHÔNG

.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2.1. Tại sao phải sử dụng dung dịch Na2S + NaHCO3 ?
2.2. Vi sinh vật kỵ khí có ở đâu trong môi trường? ý nghĩa của việc xác định tổng vi
khuẩn kỵ khí?
2.3. Phân biệt sự khác nhau giữa vi khuẩn kỵ khí và hiếu khí?
2.4. Ý nghĩa việc xác định tổng vi khuẩn kỵ khí trong môi trường?
17
BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG VI NẤM

1. NGUYÊN TẮC
Nấm men và nấm mốc đều thuộc nhóm ưa mát, nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển
trong khoảng 20 – 280C, một số ít là ưa nóng và ưa lạnh. Vi nấm có khả năng sinh trưởng
trong vùng pH từ 2-9, nhưng pH thích hợp nhất nằm trong khoảng 4 – 6,5. Hầu hết vi nấm
đều thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc, một số có thể phát triển trong điều kiện kỵ khí.
Mật độ vi nấm trong mẫu được xác định dưới dạng tổng vi nấm bằng kỹ thuật pha
loãng, trải và đếm khuẩn lạc trên môi trường thích hợp.
10. THỰC HÀNH

10.1. Dụng cụ
Đèn cồn 6 Cái
Đĩa petri 60 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái

Thành phần môi trường:
Khoai tây 300g
Glucose 20g
Agar 15g
Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và
lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh
pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
Chuẩn bị:
- Cồn 700 2 lít
- Cồn 960 2 lít
18
- Nước muối sinh lý 1 lít

- Nước cất 5 lít
10.3. Thực hành
- Đổ môi trường
- Trải đĩa
Đọc kết quảvà viết báo cáo
11. CHUẨN BỊ
Chuẩn bị môi trường Lauryl Sulphate broth (LSB)
19

Nồng độ pha loãng 1 2 3
………………….. …………………… …………………….
ĐẠT
KHÔNG

.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2.1. Vi nấm là gì?
2.2. Phương pháp xác định tổng vi nấm?
2.3. Phân biê ̣t khuẩn lạc vi khuẩn và vi nấm?
20
BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

VÀ PHƯƠNG PHÁP MPN
1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

11.1. Đếm trên lam phết kính
Tiêu bản vi sinh vâ ̣t đã được nhuộm màu (nhuộm đơn).
Hình 5.1: Diện tích hình vuông phết kính

Sơ đồ: Di chuyển vật kính trong hình vuông phết kính, để đếm số VSV/1VT
a. Phết kính:
- Dùng lam sạch và bút chì mỡ (bút lông kim), kẻ một hình vuông S = 400 mm 2, ở
mặt trên lam. Mục đích không cho vi sinh vâ ̣t lan ra khỏi diện tích đếm.
- Hút 0.02-0.2 ml dung dịch pha loãng , nhỏ vào giữa hình vuông, ở mặt trên lam.
- Đốt que cấy, để nguội, dùng cạnh vòng cấy ở đầu que dàn đều giọt mẫu ra xung
quanh, vừa chạm vào cạnh hình vuông.
- Cố định tiêu bản, nhuộm đơn bằng thuốc nhuộm blue methylen.
- Nhỏ một giọt dầu soi, xem ở vật kính x100.
b. Cách đếm
- Đếm số tế bào VSV/ 1VT (VT: vi trường).
- Đếm hết tất cả từ 30 – 50 VT/ hình vuông phết kính. Theo sơ đồ hình vẽ.
c. Công thức tính
21
Trong đó:
X = Số VK đếm được trong một vi trường
400 = diện tích hình vuông phết kính, bằng 400mm2
0.0004 = diện tích của vi trường, πR2 = 0.0004 mm2
Số vi trường có được trong S: 4cm2
V = thể tích giọt VK phết kính

H = hệ số pha loãng mẫu
11.2. Đếm trong buồng đếm:
a. Cấu tạo buồng đếm.
- Buồng đếm là một phiến kính trong, dày, hình chữ nhật.
- Giữa là phần lõm phẳng, có kẻ một hoặc hai khung đếm gồm 400 ô nhỏ. Bên ngoài
có ghi tên loại buồng đếm, và ghi các thông số kỹ thuật như hình trên.
Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm
22
b. Cấu tạo khung đếm.
Hình 5.3 Cấu tạo khung đếm
Cấu tạo một khung đếm có:

- Trường hợp1: 1 khung có 16 ô lớn, 1 ô lớn có 25 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.
- Trường hợp 2: 1 khung có 25 ô lớn, 1 ô lớn có 16 ô nhỏ. Vậy 1 khung có 400 ô nhỏ.
- Diện tích 1 ô nhỏ là 1/400 mm2.
Vậy Vô nhỏ = 0.1 mm x 1/400 mm2 = 1/4000mm3.
c/ Cách tiến hành.
- Đặt lammen sạch phủ lên khung đếm.
- Dùng ống nhỏ giọt hút dung dịch nấm men đã pha loãng, bỏ đi vài giọt đầu, bơm
nhẹ vào rãnh buồng đếm, dung dịch thấm vào kẽ buồng đếm và lammen.
- Dung dịch chảy tràn từ từ vào các rãnh, lan tỏa lắp đầy khắp lammen, hơi
thừa một ít. Nếu bị bọt kẹt lại trong lammen thì phải làm lại.
- Đặt buồng đếm lên bàn kẹp của kính hiển vi, dùng kẹp cố định buồng đếm.
- Thao tác kính hiển vi, dùng vật kính x10 để điều chỉnh sơ bộ trước, sau đó dùng vật
kính x40 để đếm.
23
- Đếm số tế bào trong 5 ô lớn (4 ô ở cạnh, 1 ô ở giữa), đếm lần lượt từng ô nhỏ
trong 1 ô lớn. Trong tất cả các ô nhỏ cần đếm số tế bào nằm hẳn trong ô trước, sau đó đếm
số tế bào nằm ở cạnh phía trên và cạnh bên phải ô.
- Đếm tất cả 80 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 16 ô nhỏ).
- Hoặc đếm 125 ô nhỏ có trong 5 ô lớn (T/h: 1 ô lớn có 25 ô nhỏ).
d. Công thức tính.
Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3)

4.000 = số qui đổi từ 1/4.000 mm3 thành 1 mm3.
1.000 = số qui đổi từ 1 mm3 thành 1ml (1ml = 1.000 mm3)
H = hệ số pha loãng (ví dụ: H = 10-2)
e. Chú ý:
- Phương pháp này chỉ sử dụng để quan sát những vi sinh vâ ̣t có kích thước lớn như
bào tử của nấm men và nấm mốc.
- Chỉ đếm được tổng số tế bào, không thể biết tế bào nào còn sống hay đã chết.
- Nên nhuô ̣m màu (methylene blue) để dễ quan sát và đếm chính xác.
- Nồng độ dịch huyền phù pha loãng sao cho mật độ trong mỗi ô nhỏ không quá 10
tế bào.
- Sử dụng xong phải rửa buồng đếm ngay và lau khô.
- Để đạt độ chính xác cao, thì số tế bào trung bình đếm được trong 1 ô nhỏ: 2.5 < a
<10.
11.3. Phương pháp trải đĩa
Tương tự thao tác trải đĩa, số lượng tế bào vi sinh vật được xác định qua khuẩn lạc.
Khuẩn lạc là các cá thể hay tế bào vi sinh vật được nuôi cấy trong các điều kiện môi trường
thích hợp, sau đó phân chia tạo thành nhiều cá thể hay quần thể vi sinh vật mà mắt thường
nhìn thấy được.
24
11.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Phương pháp MPN (phương pháp có số xác suất cao nhất; số tối khả) còn được gọi là
phương pháp pha loãng tới hạn hay phương pháp chuẩn độ.
Đây là phương pháp định lượng dựa trên kết quả định tính của một loạt thí nghiệm
được lặp lại ở một số độ pha loãng khác nhau. Thông thường, việc định lượng này được
thực hiện lặp lại 3 lần ở 3 độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, tổng cộng 3 x 3 = 9 ống nghiệm.
Dựa vào kết quả biểu kiến chứng minh sự tăng trưởng của vi sinh vật cần kiểm định
trong từng ống nghiệm (thường là các hiện tượng như sinh hơi, đổi màu, đục …), ghi nhận
số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng.
Sử dụng các số liệu này và dựa vào bảng Mac Crady suy ra mật độ vi sinh vật được
trình bày dưới dạng số MPN/100ml hay số MPN/1g mẫu. Độ chính xác của trị số MPN phụ
thuộc vào số lượng ống nghiệm lặp lại trong mỗi độ pha loãng.
Cụ thể là xác định số lượng Coliforms trong thực phẩm, nước uống, nước sinh hoạt
hoặc nước thải.
Thao tác:
25
Bước 1: Lấy mẫu và pha loãng mẫu đến 3 nồng độ liên tiếp thích hợp.
Bước 2: Mỗi độ pha loãng hút 3 lần, mỗi lần 1 ml cấy vào 3 ống nghiệm môi trường
Lauryl Sulphate broth (LSB). Hút 3 nồng độ liên tiếp, mỗi nồng độ 3 ống nghiệm.
Bước 3: Ủ ấm từ 35 – 370C, thời gian 24 - 48 giờ.
Bước 4: Ống dương tính là có bọt khí trong ống durham.
Bước 5: Tra bảng Mac Crady – loạt 3 ống nghiệm ở 3 nồng độ liên tiếp.
Bảng MPN/100ml tính theo lượng mẫu là 10 ml, 1ml và 0,1ml tương đương MPN/ml
của mẫu đã pha loãng 10-1, 10-2 và 10-3 dùng phân tích.
Kết quả tra bảng MPN/ml = kết quả tra bảng x f/10
( f độ pha loãng thấp nhất 10n)
Lưu ý: Các ống nghiệm có khả năng hiện diện của coliform là dương tính cả hai môi
trường LSB và BGBL.
12. THỰC HÀNH
12.1. Dụng cụ
Đèn cồn 6 Cái
Đĩa petri 20 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái
Môi trường LSB và BGBL
Cân chính xác khối lượng môi trường tổng hợp hay thành phần của từng môi trường.
đun nóng cho môi trường đồng nhất rồi phân phối vào các ống thí nghiệm có ống durham.
Lưu ý: lượng môi trường trong ống nghiệm phải cao hơn ống durham. Cần loại bỏ
các ống durham có bọt khí sau khi hấp khử trùng.
Hấp khử trùng môi trường ở 1210C, 1atm, 15 phút.
Chuẩn bị:
Cồn 960 2 lít
26

12.3. Thực hành
Mẫu nước: nước thải và nước sinh hoạt
Mẫu đất
Định lượng trực tiếp số lượng tế bào nấm men bằng buồng đếm hồng cầu.
Định lượng E.coli và Coliforms bằng phương pháp MPN.
Đọc kết quả
Viết báo cáo
13. CHUẨN BỊ
Violet Red Bile Agar (VRBA)
27

1.1. Kết quả quan sát trên buồng đếm hồng cầu:
…….. ………. ………..
Số tế bào
1.2. Kết quả đếm bằng phương pháp MPN

………………….. …………………… …………………….
ĐẠT
Tra bảng
………………….
KHÔNG

.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................

2.1. Nhược điểm của phương pháp điếm tế bào vi sinh vâ ̣t bằng buồng đếm hồng cầu là
gì?
2.2. Thao tác sử dụng kính hiển vi quan sát và đếm tế bào vi sinh vâ ̣t?
28
2.3. Tại sao phải sử dụng môi trường BGBL sau khi xác định bằng môi trường LSB?
29
BÀI 6: XÁC ĐỊNH E.COLI VÀ COLIFORM

1. TỔNG QUAN
Vi khuẩn Coli (Total coliform) tồn tại trong tự nhiên, trong phân người, phân gia súc,
trong nước, trong nước thải hay trong các vật phẩm có nguồn gốc khác nhau. Theo đặc tính
nuôi cấy, người ta chia chúng làm hai nhóm:
- Fecal Coli (Escherichia coli - E.coli) có nguồn gốc từ phân (người, động vật, cá..)
- Non fecal Coli (Bacterium coli) có nguồn gốc khác (đất, cây cỏ, nước thải…)
Vi khuẩn E.coli thuộc nhóm vi trùng đường ruột Enterobacteriaceae, chúng hiện
diện nhiều ở đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E.coli nhiễm vào đất,
nước… từ phân của động vật. Sự có mặt của chúng chứng tỏ nước bị nhiễm phân hoặc nước
thải sinh hoạt. Chúng sẽ gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi cho sự phát triển của chúng.
- Hình dạng: Vi khuẩn thuộc loại trực khuẩn gram âm, di động bằng tiêm mao quanh
tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không có độc lực không có
capsul. Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ) hai đầu tròn. Một số dòng có lông bám (pili).
- Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa: Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi. Nhiệt độ
thích hợp 370C nhưng có thể mọc trên 400C, pH 7,4.
- Trên môi trường VRBA tạo khuẩn lạc màu tím.
- E.coli gây bệnh truyền nhiễm tiêu chảy hay nhiễm trùng huyết trẻ sơ sinh… Ngoài
ra, nước thải nhiễm E.coli còn có thể nhiễm các vi sinh vật khác có trong đường ruột như vi
khuẩn tả (Vibrio choleras), vi khuẩn lỵ (Shigella), …
13.1. Dụng cụ
Đèn cồn 6 Cái
Đĩa petri 60 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái
Môi trường VRB
Cân môi trường tổng hợp hay thành phần sau đó thêm nước nước cất thích hợp rồi đun
nóng cho hòa tan các chất với nhau. Đổ môi trường thạch đĩa mà không cần phải hấp khử
trùng.
30
Chuẩn bị:
Cồn 700 1 lít
Cồn 960 2 lít
Nước muối sinh lý 1 lít
14. THỰC HÀNH
Mẫu nước và mẫu đất:
- Pha loãng mẫu theo dãy nồng đô ̣ thâ ̣p phân
- Chọn nồng đô ̣ thích hợp, lấy mô ̣t lượng mẫu vừa phải cho vào đĩa petri có chứa môi
trường VRB.
- Trải đĩa và đem ủ ở nhiê ̣t đô ̣ thích hợp, sau 24 giờ đọc kết quả.
Đọc kết quả:
Sau 24 giờ các khuẩn lạc đặc trưng là E.coli và Coliform có màu đỏ tía, đường kính
0.5mm hoặc hơn, đôi khi được bao quanh bởi một vùng hơi đỏ của mật kết tủa.
Viết báo cáo
15. CHUẨN BỊ
Môi trường NA
31

1 2 3
………………….. …………………… ……………………
.
ĐẠT
KHÔNG
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2.1. Coliform là gì? E.coli là gì? Tại sao phải nhận biết Coliform và E.coli?
2.2. Môi trường và điều kiện nuôi cấy Coliform? Các phương pháp xác định E.coli đã
học, ưu điểm và nhược điểm của mỗi phương pháp?
2.3. So sánh mẫu phân tích theo tiêu chuẩn Viê ̣t Nam (TCVN)?
32
BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP,

NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT
1. KHÁI NIỆM
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu và
đưa về dạng thuần khiết.
Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứng dụng vi sinh
vật.
Vi sinh vật ở dạng thuần khiết là giống vi sinh vật đươc tạo ra từ 1 tế bào ban đầu.
Nguyên tắc:
- Tách rời các tế bào vi sinh vật; Nuôi cấy các tế bào trên trong môi trường dinh
dưỡng đặc trưng để cho khuẩn lạc riêng rẽ, cách biệt nhau.
- Sau khi phân lập vài lần, từ khóm thuần cấy truyền sang ống môi trường thạch
nghiêng hay ống nghiệm canh để gia tăng số lượng vi sinh vật.
16. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT

16.1. Môi trường thạch đĩa
16.1.1.Kỹ thuật hộp ria
- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống.
- Ria các đường trên đĩa petri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc).
Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria
tiếp theo.
- Bao gói đĩa petri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm.
33
Hình 7.1: Kỹ thuật hộp ria
16.1.2. Kỹ thuật hộp trải

- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứa
giống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.
- Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 96 0, hơ qua ngọn lửa để khử trùng.
Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa.
Hình 7.2: Cách dàn vi sinh vật trên bề mặt môi trường bằng que gạt Drigalxki.
- Mở đĩa petri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri. Dùng đầu
thanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch. Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa một
34
vài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp
bề mặt môi trường.
- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ
ấm.
16.1.3. Kỹ thuật hộp đổ
- Dùng pipetman và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1ml dịch chứa giống
vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa petri.
- Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguội đến 45 - 55 0C vào đĩa
petri đã cấy mẫu.
- Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịch
giống được trộn đều trong môi trường cấy.
- Đậy nắp đĩa petri, để đông tự nhiên.
16.2. Phương pháp cấy truyền
16.2.1.Cấy truyền từ ống nghiệm này sang ống nghiệm khác
- Tay trái cầm 2 ống nghiệm: 1 ống giống và 1 ống môi trường
- Tay phải cầm que cấy và khử trùng bằng đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dây cấy
- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút bông vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nút ống
giống ra
- Khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm
- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ống
giống.
- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa ống vào môi
trường để thực hiện các thao tác cấy truyền.
- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông
- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong
Chú ý: Nếu ống giống là canh trường lỏng có vi sinh vật thì dùng pipet hút canh
trường thay que cấy.
35
16.2.2.Phương pháp cấy trên thạch nghiêng

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí.
+ Hoà giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm.
+ Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu: Hình chữ chi; Hình vòng
xoắn; Hình vạch ngang song song
Hình 7.3: Các kiểu cấy chuyền trong ống nghiệm
16.2.3.Phương pháp cấy trên thạch đứng

Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kị khí.
- Sử dụng que cấy hình kim
- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng
que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch
hình trụ, đâm sát đáy ống nghiệm và đâm
thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2
đường sát thành ống tuỳ yêu cầu.
- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng
để không gây nứt, vỡ môi trường
Hình 7.4: Kỹ thuật cấy trên thạch đứng
36
17. CÁC PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN VI SINH VẬT
17.1. Các phương pháp nuôi cấy
Kết quả của việc nuôi cấy: Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi
loại vi sinh vật:
- Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường.
- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên
vệt nổi trên mặt thạch trong hay trắng đục. Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy.
- Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kị khí phát triển ở đáy của cột môi
trường.
17.2. Các phương pháp bảo quản giống vi sinh vật
Phương pháp cấy truyền định kỳ lên môi trường mới: Phương pháp này áp dụng để
bảo quản tất cả các loại vi sinh vật.
Phương pháp giữ giống trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng: Đối với vi sinh vật
kị khí.
Đối với vi sinh vật hiếu khí:
+ Cung cấp thường xuyên và đầy đủ O2.
+ Lớp môi trường nuôi cấy có độ dày vừa phải
+ Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trong quá trình nuôi để cung cấp
thêm oxi cho vi sinh vật.
+ Nếu nuôi cấy trong môi trường có khối lượng lớn phải tiến hành sục khí thường
xuyên hay định kỳ.
Đối với vi sinh vật kị khí, để hạn chế sự tiếp xúc với oxi bằng cách:
+ Đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vaselin.
+ Cấy trích sâu vào môi trường đặc.
+ Nuôi cấy trong bình hút chân không.
+ Nuôi trong ống nghiệm đặc biệt sau khi rút hết không khí và hàn kín lại. Đun sôi
môi trường một thời gian để loại hết O2, để nguội 450C. Dùng ống hút cấy vi sinh vật vào
đáy ống nghiệm. Làm nguội thật nhanh rồi đổ vazơlin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với
O2 .
37
Phương pháp giữ giống trên đất, cát: Dùng để bảo quản các chủng tạo bào tử tiềm
sinh (hoặc bào tử vô tính) với thời gian bảo quản từ một đến nhiều năm.
Trên hạt: Dùng để bảo quản các chủng có dạng hình sợi sinh bào tử hoặc không. Thời
gian bảo quản có thể tới 1 năm.
Phương pháp đông khô: làm cho tế bào mất nước ở trạng thái tự do. Đồng thời làm
giảm, thậm chí làm ngừng hẳn quá trình phân chia của vi sinh vật. Thời gian bảo quản lên
tới vài chục năm.

17.3. Dụng cụ
Đèn cồn 6 Cái
Đĩa petri 60 Cái
Pipet 1ml 6 Cái
Pipet 10ml 6 Cái
Môi trường NA 2lít
Cồn 960 2 lít
18. THỰC HÀNH

Mẫu vi khuẩn đã nuôi cấy từ các bài trước được đem đi phân lâ ̣p.
Đọc kết quả:
Viết báo cáo
19. CHUẨN BỊ
Thuốc nhuô ̣m Gram
Cồn 960 và 700
38
1 2 3
………………….. …………………… ……………………
.
ĐẠT
KHÔNG
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2.1. Tại sao phải ria theo hình zic zắc?
2.2. Mục đích của viê ̣c phân lâ ̣p và bảo quản giống vi sinh vâ ̣t?
BÀI 8: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT

BẰNG KÍNH HIỂN VI
1. GIỚI THIỆU CÁC LOẠI KÍNH HIỂN VI.
19.1. Kính hiển vi nền đen.
Nguyên tắc: Ánh sáng thường chiếu từ dưới lên, qua rìa của tụ quang nền đen, chiếu
hắt vào xung quanh tiêu bản, những tia sáng này bị tiêu bản làm khúc xạ rồi đưa vào vật
39
kính. Tiêu bản được soi sáng rực trên nền đen, giống như trong phòng tối có một tia
sáng mạnh chiếu vào, giúp thấy rõ từng hạt bụi trong không khí bị tia sáng chiếu vào.
Chức năng: quan sát hình thái và đặc tính của một số vi khuẩn mà kính hiển vi
thường khó quan sát.
19.2. Kính hiển vi đổi pha.
Nguyên tắc: ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt
của tụ quang kính, vật kính và thị kính.
Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, các lớp màng.
19.3. Kính hiển vi huỳnh quang.
Nguyên tắc: chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộm màu bằng các
chất huỳnh quang. Trong tế bào, các cấu trúc khác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác
nhau.
Chức năng: quan sát và phân biệt cấu trúc tế bào vi sinh vật.
19.4. Kính hiển vi điện tử.
Nguyên tắc: chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ
phân giải cao, giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau.
Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tế bào.
19.5. Kính hiển vi quang học
19.5.1.Nguyên tắc
Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để
tạo năng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên. Hệ thống
phóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận: Vật kính (quay về phía vật quan sát)
và thị kính (quay về phía mắt nhìn). Mỗi bộ phận này là một hệ thống thấu kính hội tụ
phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vật kính một khoảng cách lớn hơn tiêu
cự của vật kính một chút. Ảnh thật đảo ngược A’B’ của vật sẽ thu được ở bên kia
vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính. Thị kính hoạt động như một kính lúp.
Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnh thật A’B’.
40
Hình 9.1: Nguyên tắc quang học của kính hiển vi.
19.5.2.Chức năng
Quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh trùng, tế bào động vật, thực vật.
19.5.3.Cấu tạo
Hình 9.2: Các bộ phận KHV quang học – dùng gương.
41
Hình 9.3: Các bộ phận KHV quang học- dùng đèn.

19.5.4. Cách sử dụng.
Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để
lau các bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính),
để kính ngay ngắn vừa với tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu
bản.
Bước 1: Lấy ánh sáng.
Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính.
Bước 3: Quan sát.
42
Hình 9.4: Hình vẽ và hình chụp kính hiển vi các vi nấm.
Staphylococcus spp. Streptococcus spp.
43
Bacillus spp. Lactobacillus subtilis.
E.coli : KHV X100 KHV ĐIỆN TỬ

Hình 9.5: Hình chụp kính hiển vi các vi khuẩn.
20. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU

20.1. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN TẠM THỜI
20.1.1. Cách làm tiêu bản giọt ép
- Dùng que cấy hoặc ống hút lấy giống vi sinh vật để làm vết bôi.
- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí.
Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống.
- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi.
20.1.2. Cách làm tiêu bản giọt treo
Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng di
động và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích
44
- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa.
- Bôi vaseline quanh phần lõm của phiến kính.
- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính.
- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi đặt lên
phần lõm của phiến kính.
20.1.3. Cách làm tiêu bản nhuộm màu
a. Nguyên tắc
Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm không hoặc ít độc với vi sinh vật và được
pha loãng ở nồng độ đảm bảo cho tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm
màu.
b. Cách nhuộm
+ Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính.
+ Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật với thuốc nhuộm.
+ Đậy lá kính lên giọt dịch.
+ Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40)
20.2. PHƯƠNG PHÁP LÀM TIÊU BẢN CỐ ĐỊNH
Nhuộm tế bào vi khuẩn dùng để phân biệt hình dáng tế bào vi khuẩn (cầu,
trực, xoắn) hay để phân biệt các thành phần riêng biệt trên một tế bào vi khuẩn.
Có 2 phương pháp nhuộm cơ bản:
- Nhuộm đơn: Dùng một loại thuốc nhuộm để quan sát hình dạng tế bào.
- Nhuộm kép: Dùng 2 thuốc nhuộm để phân biệt vi khuẩn G + và G-, phân biệt tế bào
dinh dưỡng và bào tử, hay phân biệt vi khuẩn lao với các vi khuẩn khác...
20.2.1. Nguyên tắc chung làm tiêu bản nhuộm
- Phết kính tiêu bản
Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn.
Dùng bút chì mỡ hoặc bút lông ghi tên mẫu, và vẽ vòng tròn ϕ khoảng 15mm, ở mặt
dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame.
Đốt nóng đỏ que cấy (trước và sau khi thao tác), mở nút bông, hơ nhanh miệng ống
nghiệm.
45
Trường hợp 1: mẫu nuôi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệng
ống nghiệm (vẫn giữ gần ngọn lửa), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vòng que cấy.
Lấy que cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bông, đậy nút bông lại. Phết canh khuẩn
trên vòng que cấy vào mặt trên lam, giữa vòng tròn, dàn đều ra xung quanh.
Trường hợp 2: mẫu nuôi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl
9‰ lên giữa vòng tròn (mặt trên lam). Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh
vòng tròn của đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên
lam, dàn mỏng và đều.
- Cố định mẫu
Mục đích giết chết vi khuẩn và làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame. Cố định mẫu
bằng cách để khô tự nhiên.
Chú ý:
Nếu cố định không tốt vi khuẩn sẽ trôi đi trong quá trình nhuộm.
Khi cố định mẫu, chỉ hơ nhanh chứ không đốt trên ngọn lửa.
Không được chạm vào thành khi đưa đầu que cấy vào và ra khỏi ống nghiệm vi
khuẩn.
46
Hình 9.6: Sơ đồ thứ tự phết kính.
20.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP NHUỘM.

20.3.1. Phương pháp nhuộm gram (Christian Gram):
a. Nguyên tắc:
Do sự khác biệt về cấu trúc vách tế bào nên trong quá trình nhuộm Gram, vi
khuẩn Gram [+] sẽ giữ được phức hợp tím Gentian-iode không bị tẩy màu bởi alcool,
trong khi vi khuẩn Gram [-] không giữ được phức hợp màu này, do vậy kết quả sau khi
nhuộm là vi khuẩn Gram [+] vẫn giữ được màu tím của gentian, còn vi khuẩn Gram [-] ăn
màu hồng của phẩm màu safranin hay fushin.
b. Thao tác:
- Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, trên thau nhựa.
- Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính.
47
- Nhỏ dung dịch Crystal violet thấm ướt hết giấy lọc. Để từ 1 – 2 phút (nếu vi khuẩn
lấy từ canh lỏng để 2 phút, lấy từ thạch dinh dưỡng để 1 phút). Rửa nước, thấm khô.
- Tẩy cồn 960 từ 15 – 30 giây (từ canh lỏng tẩy 15 giây, từ thạch dinh dưỡng tẩy 30
giây). Rửa nước, thấm khô. Tẩy cồn bằng cách để nghiêng tiêu bản, cho cồn chảy từ từ ở
mép trên phiến kính. Quan sát ở mép dưới cho đến khi giọt cồn vừa mất màu tím.
- Cố định màu tím bằng iodine là dung dịch lugol.
- Đặt miếng giấy lọc lên vết khuẩn, nhỏ dung dịch Fuschin kiềm loãng (hoặc Safranin
O), để 1 phút. Rửa nước, thấm khô.
- Quan sát bằng vật kính dầu, độ phóng đại 1.000 lần.
Vi khuẩn Gr+ bắt màu tím Crystal violet
Vi khuẩn Gr- bắt màu hồng Fuschin (Safranin O)
Hình 9.7: Sơ đồ thứ tự nhuộm Gram

c. Đọc kết quả:
- Quan sát phết nhuộm Gram qua kính hiển vi, dưới vật kính dầu, chúng ta sẽ thấy vi
khuẩn Gram [+] ăn màu tím, còn vi khuẩn Gram [-] ăn màu hồng.
- Khi trả lời một kết quả nhuộm Gram, phải trả lời các chi tiết sau:
+ Hình dáng vi khuẩn.
+ Cách sắp xếp các vi khuẩn.
+ Cách ăn màu của vi khuẩn, tức là vi khuẩn Gram [+] hay Gram [-].
48
20.3.2. Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen:

Dùng phân biệt vi khuẩn Lao với các vi khuẩn khác
Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phức
hợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh
(acid, alcool acid). Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi
khuẩn, có hai cách:
- Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đó carbolfuchsin thấm
qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương pháp nhuộm nóng
Ziehl Neelsen.
- Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi là phương pháp Kinyoun,
trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậm đặc, nhờ vậy khi phủ
dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu, carbolfuchsin vẫn có thể thấm
qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn.
20.3.3.Nhuộm bào tử
Một số vi khuẩn như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử. Bào tử
có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu được nhiệt và một số các hóa
chất mà thể sinh dưỡng không thể.
21. THỰC HÀNH

Quan sát hình thái vi sinh vật được phân lâ ̣p và nuôi cấy từ các bài trước.
Vẽ lại hình đã quan sát
Viết báo cáo
49

1.1. Kết quả quan sát hình thái vi nấm trên kính hiển vi:
Mẫu vi sinh vật 1 2 3
…….. ………. ………..
Hình dạng
1.2. Kết quả quan sát hình thái vi khuẩn

Mẫu 1 2 3
………………….. …………………… …………………….
Hình dạng
Bắt màu ( …)

.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
.............................................................................................................................................
2.1. Trình bày thao tác sử dụng kính hiển vi quang học? nêu sự khác biệt khi thao tác
quan sát vi nấm và vi khuẩn, tại sao?
2.2. Tại sao phải nhuộm Gram khi quan sát vi khuẩn? Phân loại vi khuẩn bắt màu
nhuộm Gram?
2.3. Trình bày thao tác nhuộm Gram?
50

51
PHỤ LỤC
A. HÓA CHẤT.
1. Cồn – Ether Tỷ lệ về thể tích 3:1.

Đong 750 ml cồn 960 + 250 ml ether, ta được dung dịch cồn – ether tỷ lệ 3:1. Dung
dịch này dùng để tẩy sạch vật kính dầu, hoặc các dụng cụ dính dầu soi.
2. Cồn – acid (dùng để nhuộm Ziehl Neelsen )

Cách pha: Đong 97 ml cồn 960 + 3 ml acid HCl hoặc H2SO4 đậm đặc.
3. Dung dịch sunfo – cromic: K2Cr2O7 + H2SO4

Công thức:
K2Cr2O7 60g
H2SO4 đậm đặc 66ml
Nước 1000ml
Cách pha:
Cân 60g K2Cr2O7, hào vào 500ml nước. Thêm từ từ 66ml H2SO4 đậm đặc, cuối cùng
lại thêm 500ml nước nữa. Bicromate kali sẽ tác dụng với acid sulfuric và làm sinh ra acid
cromic. Chất này có tác dụng oxi hóa mạnh do đó có thể tẩy sạch các vết bẩn trên dụng cụ
thủy tinh.
Thời gian ngâm dụng cụ thủy tinh từ 1 – 2 ngày, xả thật kỹ bằng nước sạch, rửa bằng
savon bột, rồi rửa lại bằng nước sạch.
Dung dịch này có thể dùng nhiều lần cho đến khi dung dịch từ màu đỏ cam biến
thành màu lục đen thì bỏ đi.
Lưu ý: Dung dịch này rất độc. Do đó khi ngâm phải đậy kín, lúc rửa nên đeo khẩu
trang, mang găng cao su và kính bảo hiểm.
4. Cồn 700:
52
Dùng để sát khuẩn tay, bàn , ghế, tủ cấy,…

Cách pha: cồn 700 từ cồn 960. Vì không đòi hỏi chính xác, nên có thể áp dụng công
thức:
V1C1 = V2C2
5. Nước muối sinh lý 9‰ vô khuẩn:

Cân chính xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc có chứa 991ml nước cất (vừa đủ
1000ml ), dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Đem hấp vô khuẩn ở t 0 = 1210C, 1atm, 15 – 20
phút.
B. THUỐC NHUỘM.
1. Crystal violet (C25H30N3Cl . 9H2O = 570,11 ):
Công thức:
a) Crystal violet 0,4g
Cồn 960 10ml
b) Phenol 1g
Nước cất 100ml
Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau, khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc.
Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm này luôn bảo quản trong chai màu, tránh ánh sáng.
2. Lugol:
Công thức:
KI 2g
Iod tinh thể 1g
Nước cất 300ml
Cách pha: Hòa 2g KI vào 5ml nước cất, sau đó thêm 1g iod. Chờ cho iod tan hết mới
thêm nước vừa đủ 300ml.
3. Fuchsine kiềm ( C19H18N3Cl = 323,82 ):
53
Công thức:
a) Fuchsine kiềm 0,3g
Cồn 960 10ml
b) Phenol 5g
Nước cất 35ml
Cách pha:
Trộn dung dịch a và b với nhau, khuấy cho tan đều  đem lọc.
Bảo quản trong chai màu.
Trước khi dùng pha loãng 5 lần (dịch pha loãng không giữ được lâu còn dịch đặc có
thể giữ được trong nhiều tháng ).
4. Safranin O ( C20H19N4Cl = 350,80 ):

Công thức:
Safranin O ( dung dịch 2,5% trong cồn 960 ) 25ml
Nước cất 75ml
5. Methylene blue ( C37H27N2S2 = 799,80 ):

Công thức:
a) Methylen blue 3g
Cồn 96% 30ml
b) Dung dịch KOH 0.01% 1000ml
Cách pha: Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau  khuấy hoà tan đều  đem lọc.
54
MÔI TRƯỜNG
I. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NẤM MỐC VÀ NẤM MEN.

1. Môi trường Sabouraud: (để nuôi cấy nấm mốc và nấm men)
Công thức:
Pepton 20g
Mantose hay glucose 40g
Agar 18g
Nước cất vừa đủ 1000ml
( pH: 5,5 – 6,0 khử khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15- 20 phút).
2. Môi trường PGA
Thành phần môi trường PGA:
Khoai tây 300g
Glucose 20g
Agar 15g
Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và lọc lấy dịch lọc, sau đó
bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh pH đến 5,5 để ức chế
sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút
Môi trường PGA sau khi hấp khử trùng để nguội đến nhiệt độ 40-46 0C và đổ đĩa để
nguội.
II. MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ĐỐI VỚI VI KHUẨN.

1. Môi trường Nutrient Broth (NB):
Công thức:
Cao thịt 5g
Pepton bột 10g
NaCl 5g
Nước cất 1000ml ( pH: 7,4 – 7,6 ).
55
Cân 13g bột môi trường NB hòa vào 1000ml nước cất, khuấy đều. Đem hấp khử
trùng ở 1210C (1am)/ 15 – 20 phút.
2. Môi trường Nutrient Agar (NA):
Thành phần môi trường như môi trường NB nhưng có bổ sung 18g agar trong
1000ml môi trường.
Cân 13g bột môi trường NB + 18g agar hòa vào 1000ml nước cất, rồi khuấy đều.
Khử khuẩn trong nồi áp suất ở t0 = 1210C (1atm)/ 15 – 20 phút.
3. Môi trường thạch bán lỏng di động:
Công thức:
Nutrient broth 13g
Agar 5g
Nước cất 1000ml pH: 7,2
Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun
cách thủy cho agar hòa tan đều. Phân vào trong các ống nghiệm 16 x 120 mm, mỗi ống
khoảng 5ml. Đem hấp khử khuẩn ở 121 0C (1atm)/ 15 – 20 phút. Lấy ra để đứng cho môi
trường đông lại.
4. Môi trường Plate Count Agar (PCA):

Thành phần:
Trypton 5g
Yeast extract 2.5g
Glucose 1g
Agar 15g
Nước cất 1000ml
Pha chế: Đem các thành phần của môi trường trên hòa tan trong nước cất, rồi đun
cách thủy cho agar hòa tan đều. Đem hấp khử khuẩn ở 121 0C (1atm)/ 15 – 20 phút. Phân
phối vào các đĩa petri, mỗi đĩa dầy khoảng 10 - 20mm, Để nguô ̣i cho môi trường đông lại.
56
5. Môi trường Brilliant Green Bile Lactose Broth (BGBL)

Peptone 10g
Lactose 10g
Mâ ̣t bò 20g
Brilliant green 0,0133g
Nước cất 1000 ml
Hòa tan peptone va lactose vào trong 500ml nước cất, cho mâ ̣t bò vào trong khoảng
200ml và brilliant green vào trong khoảng 100ml nước cất. Trô ̣n đều 3 dung dịch và thêm
nước đủ 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiê ̣m có ống Durham 10ml môi
trường BGBL. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút.
6. Môi trường Lauryl Sulphate Broth (LSB)

Tryptose 20g
Lactose 5g
Sodium chloride 5g
KH2PO4 2,75g
K2HPO4 2,75g
Lauryl sulphate 0,1g
Nước cất 1000ml
Hòa tan các chất vào 1000 ml, chỉnh pH khoảng 7,4. Rót vào ống nghiê ̣m có ống
Durham 10ml môi trường LSB. Hấp 1210C, 1atm trong 15 phút.
7. Môi trường Violet Red Bile Agar (VRB hoă ̣c VRBA)
Cao nấm men 3g
Peptone hoă ̣c gelysate 7g
NaCl 5g
Muối mâ ̣t 1,5g
Lactose 10g
Neutral red 0,03g
57
Crystal violet 0,002g

Agar 15g
Nước cất 1000ml
Hòa tan các thành phần trong nước, điều chỉnh pH 7,4. Đun sôi trong 2 phút, không
hấp khử trùng. Sử dụng vào môi trường đổ đĩa
8. Môi trường Potato Glucose Agar (PCA):
- Thành phần môi trường:
Khoai tây 300g
Glucose 20g
Agar 15g
Pha chế môi trường: Bổ sung khoảng 500ml nước máy vào khoai tây đun sôi kỹ và
lọc lấy dịch lọc, sau đó bổ sung đường và agar vào hấp khử trùng. Sử dụng acid lactic chỉnh
pH đến 5,5 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn. Khử trùng ở 1210C trong 15 phút.
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Trần Linh Thước (2005), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực
phẩm và mỹ phẩm, NXB Giáo dục.
2. Nguyễn Văn Minh, Dương Nhật Linh, Giáo trình THỰC TẬP VI SINH CƠ SỞ,
Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, Khoa Công nghệ sinh học.
3. Nguyễn Thị Sơn, Trần Lệ Minh, Tài liệu hướng dẫn thí nghiệm VI – HÓA SINH
ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ MÔI TRƯỜNG, NXB Bách Khoa Hà Nội.
4. Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, cây trồng.
59
BẢNG TRA MPN
BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 3 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ
PHA LOÃNG LIÊN TIẾP
Số lượng ống dương tính Số Số lượng ống dương tính Số

Số ml mẫu sử dụng MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng MPN/100ml
10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 - 2 0 0 9
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 2 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 0 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 -
BẢNG TRA MPN DÙNG CHO LOẠT 5 ỐNG NGHIỆM Ở 3 NỒNG ĐỘ

PHA LOÃNG LIÊN TIẾP
Số lượng ống dương tính Số Số lượng ống dương tính Số

Số ml mẫu sử dụng MPN/100ml Số ml mẫu sử dụng MPN/100ml
10 1 0,1 10 1 0,1
0 0 0 0 4 0 2 20
0 0 1 2 4 0 3 25
0 0 2 4 4 1 0 17
0 1 3 2 4 1 1 20
0 1 0 4 4 1 2 25
0 1 1 6 4 2 0 20
0 2 2 4 4 2 1 25
0 2 3 6 4 2 2 30
0 3 0 6 4 3 0 25
1 0 1 2 4 3 1 35
1 0 2 4 4 3 2 40
1 0 3 6 4 4 0 35
1 0 0 8 4 4 1 40
1 1 1 4 4 4 2 45
1 1 2 6 4 5 0 40
1 1 3 8 4 5 1 50
1 2 0 6 4 5 2 55
1 2 1 8 5 0 0 25
1 2 2 10 5 0 1 30
1 3 0 8 5 0 2 45
1 3 1 10 5 0 3 60
1 4 0 11 5 0 4 75
2 0 0 5 5 1 0 35
2 0 1 7 5 1 1 45
2 0 2 9 5 1 2 65
2 0 3 12 5 1 3 85
2 1 0 7 5 1 4 115
2 1 1 9 5 2 0 50
2 1 2 12 5 2 1 70
2 2 0 9 5 2 2 95
2 2 1 12 3 2 3 120
2 2 2 14 5 2 4 150
2 3 0 12 5 2 5 175
2 3 1 14 5 3 0 80
2 4 0 15 5 3 1 110
3 0 0 8 5 3 2 140
3 0 1 11 5 3 3 175
3 0 2 13 5 3 4 200
3 1 0 11 5 3 5 250
3 1 1 14 5 4 0 130
3 1 2 17 5 4 1 170
3 1 3 20 5 4 2 225
3 2 0 14 5 4 3 275
3 2 1 17 5 4 4 350
3 2 2 20 5 4 5 425
3 3 0 17 5 5 0 250
3 3 1 20 5 5 1 350
3 4 0 20 5 5 2 550
3 4 1 25 5 5 3 900
3 5 0 25 5 5 4 1600
4 0 0 13 5 5 5 1800
4 0 1 17 - - - -
HƯỚNG DẪN BÁO CÁO THÍ NGHIỆM

I. CÁCH LẤY MẪU
II. CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH
III. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
IV. KẾT QUẢ
NHẬT KÝ LÀM VIỆC

NGÀY MÔI SỐ KẾT QUẢ GHI CHÚ
TRƯỜNG LƯỢNG
GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
VƯU NGỌC DUNG

Vi Sinh

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

Vi Sinh

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

VỆ SINH CÁ NHÂN VÀ NGUYÊN TẮC LÀM VIỆC

HỌ VÀ TÊN SINH VIÊN MSSV

BÀI 1: CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM VÀ

1. CÁC QUY TẮC PHÒNG THÍ NGHIỆM

2. KỸ THUẬT PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG

Dụng cụ Số lượng Đơn vị

3.2. Hóa chất và môi trường

Chuẩn bị môi trường PCA (plate count agar)

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 1

ĐĨA PETRI ĐĨA PETRI ĐĨA PETRI

ĐĨA PETRI (PCA) ĐĨA PETRI (PCA) ĐĨA PETRI (PCA)

Nhận xét kết quả:

2. Câu hỏi ôn bài:

BÀI 2: ĐỊNH LƯỢNG TỔNG VI KHUẨN HIẾU KHÍ

- Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng.

6. KỸ THUẬT TRẢI ĐĨA

Hình 2.3: Minh họa kỹ thuật trải đĩa

Đèn cồn 6 Cái

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2

Nhận xét kết quả:

BÀI 3: XÁC ĐỊNH TỔNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

1. KỸ THUẬT ĐỔ MÔI TRƯỜNG VI KHUẨN KỴ KHÍ

- NaCl tinh khiết 10g

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 2

Nhận xét kết quả:

BÀI 4: XÁC ĐỊNH TỔNG VI NẤM

10. THỰC HÀNH

10.2. Hóa chất và môi trường

- Nước muối sinh lý 1 lít

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 4

Nhận xét kết quả:

BÀI 5: ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

1. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG VI SINH VẬT

Hình 5.1: Diện tích hình vuông phết kính

V = thể tích giọt VK phết kính

Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm

b. Cấu tạo khung đếm.

Hình 5.3 Cấu tạo khung đếm

Cấu tạo một khung đếm có:

Trong đó: a = số tế bào trung bình có trong 1 ô nhỏ (V = 1/ 4.000 mm3)

11.4. Phương pháp MPN (Most Probable Number)

Nước cất 5 lít

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 5

1.2. Kết quả đếm bằng phương pháp MPN

Nhận xét kết quả:

2. Câu hỏi ôn bài:

BÀI 6: XÁC ĐỊNH E.COLI VÀ COLIFORM

HƯỚNG DẪN VIẾT BÁO CÁO BÀI 6

BÀI 7: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP,

16. PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT

Hình 7.1: Kỹ thuật hộp ria

16.1.2. Kỹ thuật hộp trải

16.2.2.Phương pháp cấy trên thạch nghiêng

Hình 7.3: Các kiểu cấy chuyền trong ống nghiệm

16.2.3.Phương pháp cấy trên thạch đứng

Hình 7.4: Kỹ thuật cấy trên thạch đứng

3. DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ MÔI TRƯỜNG

18. THỰC HÀNH

BÀI 8: QUAN SÁT HÌNH THÁI VI SINH VẬT

Hình 9.2: Các bộ phận KHV quang học – dùng gương.

Hình 9.3: Các bộ phận KHV quang học- dùng đèn.

Hình 9.4: Hình vẽ và hình chụp kính hiển vi các vi nấm.

Staphylococcus spp. Streptococcus spp.