METDDDS DE INVESTIGACIDN FITDPATOLDGICA Eduardo R. French Profesor Asociado Adjunto North Carolina State University, EE.UU. de N. A. Cientifico Principal y Jefe del Depto. de Patologia del Centro Internacional de la Papa, La Molina, Pera. Teddy T. Hebert Profesor Principal, Department of Plant Pathology, North Carolina State University, Raleigh, N. C. EE.UU. de N.A. INSTITUTO INTERAMERICANO DE CIENCIAS AGRICOLAS - n gos, Costa RicaMETDDDS DE INVESTIGACIDN FITDPATOLDGICA INSTITUTC INTERAMERICANO DE CIENCI"S SGRICOIAS DE LA OE* SERIE DF ° vor *A => EDUCATIVOS | i i | EJEMP.An o- Cuatesia NoLS_ |© Eduardo R. French y Teddy T. Hebert © Derechos reservados de esta edicién por el Instituto Interamericano de Cien- cias Agricolas. Prohibida la reproduccién total o parcial de esta obra sin el permiso del editor Por escrito. Levantamiento del texto: Zaida Sequeira Revisién de estilo gramatical: Matilde Piza K. Editora de la Serie: Matilde de la Cruz M. eae 7980" EDITORIAL ICA 1980 Serie: Libros y Materiales Educativos No. 43. Este libro fue publicado por el Instituto Interamericano de Ciencias Agricolas. Es parte de la Serie de Libros y Materiales Educativos, la cual cuenta con el apoyo financiero de la Fundacién Kellogg, y cuyo fin es contribuir a promover el desarrollo agricola del Continente Americano. Marzo, 1980 San José, Costa RicaCONTENIDO 1, LA INVESTIGACION DE LAS ENFERMEDADES DE CAPITULO LAS PLANTAS (1) Disciplinas cientificas responsables La investigacion Seman Observacién (2); ex] cidén (3); validez (Ss inétodo métodos légicos reconocidos 6). La literatura fitopato! Revisibn preliminar (6); Esterilizacion por calor (22); autoclave (23); operacién de autoclaves filtraci6n eléctricas (24); esterilizacién por 26); esterilizacién ultravio- leta (26); esterilizacién quimica (26). Exclusion de propfgulos dei ‘aire (27); contaminantes del hoxpedan edante (29); contaminantes de los utensilios (30); microorganismos del investiga- Bigt (30); transmision por insectos y por écaros (30) ). ak 3e w 21 22 27We Métodos de Investigacién Fitopatolégica CAPITULO 3. MEDIOS DE CULTIVO (33) Tipos de medios de cultivo ..........00cceeeeeeees Segan su consistencia (35); segin sus propiedades nutritivas especiales (36); medios utiles y comunes (36). Reaccién de medios . . Definicién de reaccién pH (3 9); (40); tampén d de citrato (40); tampon de fosfato (41). Mediciin del pH eee - Método colorimétrico (42); método potenciométrico (42); operaci6n del potenciédmetro “Coming model 7”. (44). Modificacién del pH . BIBLIOGRAFIA .... Estimacié6n visual (0) peso seco (51); “nitrogeno celular (51); medicién lineal de colonias (51); colonias bacte1 52); colonias fungosas (52). Métodos para organismos de division binaria Contaje directo (54); contaje por dilucién (54); volumen (54); densidad dptica (54). Valor relativo de los métodos de medicién . BIBLIOGRAFIA CAPITULO 5. EL MICROSCOPIO (57) Evoluci6n del microscopio . Microscopio compuesto . Reglas para el uso del microscopio (63); direcciones para obtener ilumi- nacién Koehler (64). Mediciones al microscopio . Determinacién de valores Campo oscuro . Contraste de fase . Otras adaptaciones . El microscopio electrénico BIBLIOGRAFIA 47 50 55 56 57 59 65 3SoagContenido vit Ph. No. CAPITULO 6. LA FOTOGRAFIA (71) Definiciones .. n Fotografia de red Historia de la fotografia 72 La cémara reflex . 14 La caja (75); el objetivo (’ Acercamiento y macrofot 78 tografia ee de campo (79); sensibilidad de la pelicula (81); el fotometro 82). Pesta de equipo fotogrifico ......... 0. eee ee eee eee 83 cauie mfnimo o inicial £4); © equipo adicional (84); la toma de detalles Sistemas para la microfotografia .... 2.0.0... csc e cece eee eee 88 Determinacién del tiempo de exposicién (90). Microfotograffa en blanco y negro . . 92 Microfotografia en colores 93 La toma de la microfotografia (95). BIBLIOGRAFIA ......... 0. e eee e cece e eect eee eee 96 CAPITULO 7. EL CULTIVO CONTROLADO DE LAS PLANTAS (97) Factores que deben controlarse 97 Estructuras de modificaci6n ambiental minima . . 97 Estructuras de ambiente controlado 100 oe (100); métodos de enfriamiento (103); cémaras climéticas 108) Suelos para enraizar «1... eee teen e tee ee eens 110 Otros ingredientes (111); almacenaje y mezclado (111). Desinfestacin de medios y vasijas .. 2.0... 6... cece eee eee eee ee 112 vasijas Pasteurizaci6n con vapor aireado (112); desinfestacién con vapor puro (114); equipos de vapor puro autogenerado (114); equipo de vapor con caldera (115); cémaras para tratar suelo en vasijas (11 10). Sistema de tratamiento in Situ... 0.1... e cc ccc cece eee tee eens 118 Desinfestacibn con fumigantes (118); aplicacién de bromuro de metilo (BM) al suelo in situ (119); ingredientes libres de patogenos (122); me- dios antibidticos (123). OMS 123 Semilla (1 Srganos vegetativos (124); enraizado de esquejes o estacas (124); identidad (125); riego a mantenimiento de niveles de hume- dad (126); calidad del agua (130); pricticas culturales para reducir la salinidad (131). Programaci6n del crecimiento .... 1.1... eee ee seer sees eee eee 132 Induccién de la germinacién (132); maximo de vegetacién (133); énfasis picpreductive (1 (133); descarte de plantas y suelos contaminados (133). on 1 7 |viii Métodos de Investigacién Fitopatologica Pig. No. CAPITULO 8. CAUSA MICROBIANA DE ENFERMEDAD (135) ‘Los hongos como fitopatégenos . . 135 Sin microorganismos no hay putrefaccién ni fermentaci6n . 135 ‘Los microorganismos agentes de contagio . 137 E| médico investigador (139); los postulados de Koch (140). Bacterias y “virus” como fitopatégenos 14) BIBLIOGRAFIA 141 CAPITULO 9. DIAGNOSIS DE ENFERMEDAD (142) Pasos de los diagnésticos . — de sintomas ‘ircunstancias particulares Causas abidticas (144); fa Sefias del patégeno ae de los pasos diagn6: I. Preparaciones microscépicas ee observar hongos II. Observacion de flujo cee OL. Cémara hameda IV. Inoculacién de tejidos sanos con material enfermo Correlaci6n bibliografica . . . BIBLIOGRAFIA CAPITULO 10. AISLAMIENTO DE FITOPATOGENOS (154) Consideraciones preliminares . . 154 Aislamiento y purificacién de bacterias 154 La suspensién de bacterias (155); la siembra de bacterias (155); incuba. cién (157); seleccién de colonias (157). 158 sién (162); obser- vacidn en cultivo: sobre portaobjeto (162); ejemplo de aislamiento (163). Porifscacion G@hongon: 3-2 164 Cultivos de punta de hifa (164); cultivos monospéricos (165); métodos de ubicar en placas (165); método de observar en capilares (166). Identificaci6n y prueba de patogenicidad BIBLIOGRAFIA 166 167 CAPITULO 11. INOCULO E INOCULACION (168) Mantenimiento de microorganismos Métodos de mantenimiento Transplante (168); cobertura cultivo en agua (169); congelamiento (170); Tiofiizacion (70).Contenido x ne Colecciones tipo internacionales . . 171 Incremento de inéculo . . 171 Incremento vegetativo . 172 Multiplicacién de bacterias (172); multiplicacién de hongos (172). Incremento reproductivO ..... 02... ee cece ete ee tee e eee ees 173 Efecto de la temperatura (173); efecto de la luz (173); efecto de la nutricién (174); efecto de la densidad de siembra (174); pat6genos obli- gados (174). Uniformizacién del inéculo . . 174 Calidad de inéculo . . . 175 Cantidad de inédculo 175 Volumen (175); contaje ( dad 6ptica (179). Inoculaci6n Incidencia provocada en el campo Patogenos del suelo (181); patogenos aéreos (181). Inoculaciones de campo .. 1... 1... esse eee eee eee eee tence 181 Patégenos subterrdneos (181); patégenos de follaje (182); patégenos vas- culares inoculados al tallo (182). 181 Inoculaciones en condiciones controladas ..........-..-.-+++-++ 183 oe (183); patégenos sttioatos (183); sapréfitos facultativos BIBLIOGRAFIA .... 2.0... 1c eee e eee eee eee e eee et eeeee 186 CAPITULO 12. LAS PERDIDAS QUE CAUSAN LAS ENFERMEDADES (187) Elefecto de las enfermedades 187 La necesidad de evaluar las pérdidas 187 Reducci6n de calidad .... 188 Reducci6n en rendimiento . 188 eae dafio-rendimiento . 189 Escalas diagraméticas de severidad (190); preparacién de escalas en por. centaje (191); grados numéricos (194); indice de intensidad (194); célcu- lo de reduccién en rendimiento (195). Encuestas de reduccién de rendimiento CAPITULO 13. EL CONTROL DE LAS ENFERMEDADES (198) El desarrollo de métodos de control . Control por practicas culturales Rotacién (199); sanidad (199); lugar y época de siembra (199); distancia de fuentes de indculo (200); distanciamiento y barreras entre plantas (200); tipo, frecuencia, magnitud y momento de Tiego (200); repelencia de vectores (201); control quimico (201); clases de productos (201); formulaciones (202); toxicidad (202); aplicacién al suelo (203); aplica- cién a la semilla (203); aplicacién a Organos aéreos (204); calibracién y dosis (204).x Métodos de Investigacion Fitopatolégica Ne Modos de aplicacin 0.0.6... cece cece e eee teen eens 205 Espolvoreo (205); rociado (206); nebulizacién (207); uso de humectan- tes-adherentes (207). Resistencia del hospedante . . . . + 207 Control biolégico ........ . 209 Control legislativo o reglamentado . 209 Cuarentenas internas (209); cuarentenas externas ‘Qid; cuarentenas ex- cluyentes y reguladoras (210); control por reglamento (211). BIBLIOGRAFIA ........ ese cece cece cece tee ec cceceee 21 CAPITULO 14. METODOS FITOVIROLOGICOS (212) Caracteristicas de los virus 212 Precauciones para reducir las contaminaciones . 214 Sintomas 215 218 : 219 Transmision por ciscuta ... 220 TransmisiOn por semilla . 221 Transmisién a través del suelo 222 Transmisi6n por insectos . . . 224 Cuantificaci6n de los virus . . . 229 Estimacié6n de la infectividad (229); punto final de ‘dilucién de antisuero (231); anisotropia de flujo (232); absorcién especifica de luz U.V. (233); otros métodos (234). BIBLIOGRAFIA .. - 235 Cone 15, TECNICAS FITOVIROLOGICAS ESPECIALIZADAS (2: Purificacion 236 Obtenci6n de alta concentracién - 236 Extracci6n ... - 236 Clarificacion - 237 Centrifugaci6n 238 Gradiente de densidad (238). Preparaci6n de rejillas (241); montaje de los Serologia Preparaci6n de antisueros (245); tipo: Relaciones serol6gicas entre los Virus ..... 0.2... eee eee eee eee 251 Fragmentacién de los virus filamentosos (254); usos especiales de reaccio- nes serolégicas (254).Contenido Identificacién de los virus... 1... +. ee eee eee eee Relaciones serolégicas (255); proteccién cruzada (256); respuesta a una resistencia monogénica (257); prueba de infeccién simultanea (257); pro- piedades e en jugo natural (258); gama de hospedantes (259); forma de ars 60); microscopia electronica (260). Dingnoaticn Tutinario Control de las enfermedades virdticas de las plantas Eliminaci6n de las fuentes de infeccién (261); prevencién de la disemina- cién (263); resistencia a los virus (265); otras consideraciones (266). BIBLIOGRAFIA .. CAPITULO 16. NORMAS PARA PUBLICAR INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (267) Tipos de publicaci6n cientifica . . Revisiones y monografias ..... Publicaciones sobre experimentacién Contenido de las secciones Titulo (268); autor (269); compendio y/o resumen (269); introduccién (270); revisién de literatura (270); materiales y métodos (271); resulta- dos (271); discusién (272); conclusiones (272); literatura citada (272); apéndice (272). Redacci6n del texto... Redacci6n Leche Citas en el texto . BIBLIOGRAFIA INDICE DE MATERIAS ......... 000 cece cece eee cece xiPROLOGO La ensefianza y el aprendizaje de la Fitopatologia sufren la desventaja de la escasez de publicaciones en el idioma espafiol, y los principales tratados son de las regiones templadas o basados en publicaciones de esas regiones. Algunos son traducciones de originales en otro idioma. Para satisfacer en parte este vacfo, el Dr. Luis Carlos Gonzélez publicé con el auspicio del IICA, el libro “Introducci6n a la Fitopatologia”, orientado al Bachi- ler universitario. La presente obra complementa la anterior; aqui se dan tos fundamentales sobre la investigacién a los estudiantes que han escogido Fitopatologfa como su disciplina de especializacion, para sus tesis de Ingenieros Agronomos 0 para sus estudios graduados. Siendo tari amplia la Fitopatologfa, esta obra enfatiza los patégenos fungosos, bacterianos y los virus, mis no la nematologia, porque existen tratados especifi- cos y recientes en espafiol. Trata también la filosofia de la investigacién y la manera de desarrollar un proyecto, desde la revision de literatura, a través de la variada mecanica de su ejecucién, hasta su culminacién en una publicacién. Nuestra experiencia en los paises tropicales y en el desarrollo de laboratorios con escasos recursos, nos han orientado a tratar los métodos rudimentarios pero adecuados que son factibles con equipo modesto, especialmente bajo condicio- nes tropicales, pero sin dejar de presentar las alternativas para quienes tienen laboratorios altamente especializados. Se ha tomado en cuenta, sobretodo, que los profesionales de América Latina deben abarcar toda la amplitud de la Fitopatologfa y cultivos muy diversos, por Jo que requieren pautas para iniciar todo tipo de investigacion, desde diagnosis y d6nde ubicar la informaci6n adicional hasta la publicaci6n de los resultados. No es factible en un libro cubrir todos los requisitos posibles de la metodolo- gta de la investigacin fitopatolégica, pero a través de estas paginas esperamos sentar las bases para un sdlido cimiento sobre el cual continuar edificando una carrera profesional con éxito y con menos esfuerzo, que si se tiene que recurrir a la informacién dispersa que existe en mas de un idioma. Contribuimos ademds con modificaciones a la metodologfa existente y con la que hemos desarrollado nosotros mismos y establecemos una terminologfa pro- pia del espafiol para los casos en que no existe una tradicional generalizada en nuestra region. Eduardo R. French y Teddy T. Hebert Diciembre, 1979AGRADECIMIENTOS Agradecemos la minuciosa revisién del manuscrito hecho por la Dra. Teresa Ames de Icochea, Jefe de la Seccién de Fitopatologia, de la Universidad Nacio- nal Agraria, La Molina, Por la revisién de algunos capttulos agradecemos a los colegas: G, de Abad, J. Abad, V. Beltrin, F. Frey, C. Fribourg, R. Jones, L. de Lindo, C Martin, R. Mont, M. Morales Bermudez, H. Pinedo, L, Salazar, F. Santillén y H. Torres, También hemos recibido el apoyo de nuestros centros de trabajo, el Centro Internacional de la Papa y North Carolina State University, en la mecanografia del texto y el uso de las instalaciones de comunicaciones o audiovisual, Resalta en especial la colaboracién de los Sres, Victor Madrid y Alberto Salazar, quienes Pasaron a tinta varios dibujos. Agradecemos al Instituto Interamericano de Ciencias Agricolas y a la Funda- cién Kellogg, su apoyo en la edicién del texto, lo cual ha hecho posible publicar este libro a un precio que estard al alcance de muchos mas colegas y alumnos. La mayor gratitud a nuestras esposas Delia y Nell por su ayuda, comprensién y aliento al realizar esta obra, Eduardo R. French y Teddy T. HebertCAPITULO 1 LA INVESTIGACION DE LAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS DISCIPLINAS CIENTIFICAS RESPONSABLES La fitopatologia es la disciplina cientifica biolégica que se ocupa del estudio de las enfermedades de las plantas. Debido a que algunas enfermedades son causadas por nematodos, organismos del Reino Animal, hay una creciente tendencia a separar esta especialidad y considerarla como una disciplina aparte. Algunos departamentos de entomologia han incorporado la nematologia como una especialidad; sin embargo, por la gran afinidad que hay entre la fitopatologia y la nematologia, es comdn encontrar investigadores que por su interés u obligaciones profesionales, abarcan estas dos especialidades. Aquellos que tienen conocimiento en ambas disciplinas, por lo general, son mejores profesionales, aunque sdlo tengan responsabilidad en una sola de estas areas, especialmente si trabajan en aspectos aplicados. LA INVESTIGACION FITOPATOLOGICA La investigacion fitopatolégica consiste en el examen sistematico y detallado de las enfermedades de las plantas y factores relacionados, con el objeto de adquirir nuevos conocimientos o profundizar en aquellos ya estudiados. La ciencia fitopatolégica es la acumulacién de dichos conocimientos. La investigacién cientifica comienza con la determinacién de un problema, y concluye con la publicacién de los resultados obtenidos. La determinacién de un problema es el resultado de una interaccién entre: a. los conocimientos previos del investigador, los cuales provienen principalmente de su educacién formal y profesional y de su experiencia en la investigaci6n; b. las observaciones que lo conducen a interesarse en un problema dado; y2 Métodos de Investigacién Fitopatolégica c. la capacidad de comunicaci6n, arte que incluye la habilidad de intercambiar ideas con colegas o de adquirirlas por medio de informaciones publicadas. Mediante el pensamiento activo o cientifico (se piensa acerca de las cosas, no solamente en ellas) y bas4ndose en los conocimientos adquiridos, se plantea el problema y se hacen las preguntas apropia- das para buscar los caminos que permitan encontrar las soluciones. Se establecen hipétesis, y se escoge aquella que explique el fendmeno o problema definido en la forma mas simple poniéndola luego a prueba mediante la investigacién, que puede ser por simple observacién o por experimentaci6n. Observacién La observacién permite determinar la relacién entre causa y efec- to, pero como a veces las interacciones de factores son complejas, no se pueden sacar conclusiones claras a priori. Experimentaci6én La experimentacion trata de aplicar causas independientes para determinar sus efectos. El experimento controlado consiste esencial- mente en tener dos grupos bajo observacién: TESTIGO y PRUEBA. Se varia el factor cuyo efecto se desea estudiar, o varios factores en disefios complejos y se usan métodos estadisticos con el objeto de analizar las diferencias en los resultados. Un buen experimento debe ser reproducible bajo condiciones defi- nidas y las observaciones deben ser de preferencia objetivas y no subjetivas. Observaciones objetivas: son aquellas con existencia propia, intrin- secas, evidentes y tangibles, i.e. realizadas por medicion, fotografia, etc. Observaciones subjetivas: son las que resultan de la interpretacion 0 juicio del investigador. Légica La interpretacién de los resultados requiere la aplicacién de la légica o ciencia que ensefia a pensar (deducir, meditar) con exactitud. Hay dos formas de pensamiento légico, el razonamiento deductivo y el razonamiento inductivo. Deduccién EI proceso de deduccién puede seguir dos rumbos: 1) partiendo de la generalizacién o principio general se infiere lo especifico, i.e. todasLa investigacion de las enfermedades de las plantas 3 las plantas requieren agua; los cactus son plantas; entonces los cactus requieren agua; 2) partiendo del efecto se infiere la causa, i.e. todas las buenas cosechas se obtienen cuando no se presenta la roya; la cosecha este afio ha sido buena; entonces este afio no hubo roya. Induccién El proceso de razonamiento inductivo se utiliza para analizar los datos. Los datos observados se clasifican e interpretan por medio de procesos mentales de discriminaci6n (distinguir lo nuevo o distinto de lo conocido) e identificacién (distinguir las similitudes y las dife- rencias). Los datos especificos se utilizan para establecer hipdtesis generales: i.e. las manchas foliares redondas las causa un hongo; las manchas foliares ovaladas son causadas por otro hongo; las manchas foliares angulares son producidas por un tercer hongo; entonces todas las manchas foliares son causadas por hongos. Se reconocen varios métodos de razonamiento inductivo, que se dan a continuaci6n: Método de concordancia. Si repetidamente se observa que un re- sultado tiene un antecedente igual, y solo ese antecedente se presenta repetidamente, cuando se produce ese resultado, ese antecedente es la causa del resultado. El ejemplo anterior es de este tipo asi como el siguiente: ie. en los lugares A, B, y C se observa septoriosis de la papa cuando hay alta humedad relativa el primer afio; en los lugares A, D, E se observa lo mismo el siguiente afio, pero en B y C el clima ha sido seco y no se presenta; el tercer afio se presenta la septoriosis en A, B, y E donde el clima ha sido hamedo, pero no en C y D donde ha sido seco. En este caso hay concordancia entre alta humedad e incidencia de septoriosis en papa. Método de residuos. Si las partes de un efecto complejo se pueden explicar en base a antecedentes conocidos, la parte no explicable tiene su causa en otros antecedentes no conocidos: ie. un hongo F aislado de un cultivar A crece mejor in vitro a temperatura “alta” que a “baja”. Inoculado a los cultivares A y Ba temperaturas alta y baja, utilizando en ambos casos suelo natural- mente infestado y suelo esterilizado e infestado artificialmente con el hongo, resulta lo siguiente: A temperatura alta el cultivar A es susceptible en ambos suelos, pero el cultivar B es susceptible en suelo naturalmente infestado y resistente en suelo artificialmente infestado; pero a temperatura baja, ambos cultivares se comportan como resistentes en ambos suelos. Los casos de resistencia a temperatura baja se explican por el desarrollo pobre del hongo a esa temperatura. A alta temperatura la4 Métodos de Investigacién Fitopatologica susceptibilidad de A en ambos suelos es concordante con el efecto de la temperatura, pero la resistencia de B en suelo artificialmente infes- tado (que ha propiciado la enfermedad en A) sugiere que este cultivar sea resistente. Entonces la sugceptibilidad de B en suelo naturalmente infestado implica la existencia de antecedentes o factores desconoci- dos que vencen la resistencia (nematodos que causan heridas u otro hongo que inicia la infeccién). Método de diferencia. Si se obtiene o se deja de obtener un resul- tado cuando todos sus antegedentes son iguales excepto uno, enton- ces ese antacedente diferente as la causa del resultado diferente: ice. Se aisla Pseudomongs sojanacearum raza | de tomate marchito. Se inoculan suspensiones uniformadas de la bacteria a plantas de tomate las cuales se marchitan répidamente y mueren al cabo de 6 dias. Al repetirse la pmeba, se utiliza indculo fresco repicado de un cultivo de mantenimiento; la marchitez es tan lenta que las plantas no Ilegan a morir. Una tercesa prueba con todos los factores iguales da como resultado la ausencia de sintomas. El tinico factor que po- dria haber variado por no haberse controlado seria la virulencia del cultivo de mantenimiento. Al observar un estriado de ese cultivo desarrollado sobre medio tetrazolio, se observa que en efecto, las colgnias son todas del tipq de mutantes avirulentas, lo cual explicaria la diferencia en ¢1 resultado. Combinaci6n de concordancia y diferencia. Como no todos los antecedentes son siempre faciles de determinar, hay casos en que una aparente concordancia tiene excepciones. Al combinar los métodos de concordancia y diferencia se postulan las diferencias que puedan ser Ja cqusa de esos resultados que son las excepciones. Si se pueden controlar las condiciones que intervienen en la hipdtesis, se pueden determinar las causas: ie. De seis campos de frijol, la roya se presenta en cinco bajo condiciones de alta humedad. Se observa que todos los campos estan a poca distancia entre si, que los suelos son similares, el distancia- miento es igual, el control de las malezas es bueno en todos, pero que el campo sin roya presenta distinto color de flor. Se postula entonces que el campo en el que no se presenté la roya esté sembrado.con una variedad de frijol que es resistente. Variagion concomitante. Cambios cuantitativos en un antecedente producen cambios cuantitativos en un consecuente (resultado), en- tonces el antecedente y el consecuente tienen relacién reciproca. ie. La esclerotiniasis de frijol se investiga a distintas temperaturas: a baja temperatura el hongo no es patogénico, a temperatura interme- dia es de poca agresividad y a alta temperatura es muy agresivo. Se concluye que la actividad del caysante aumenta con el aumento de temperatura.La investigacién de las enfermedades de lat plantts’ = S. Validez La conclusién légica de un resultado puede set valida, sin set co- rrecta. Si af formular una hipdtesis se dejaron de considetar factdres esenciales, el resultado puede no ser cotrecto o cierto, aun ténieado validez deritro de las consideraciones dadas. Uno de los ejemplos anteriores tiene conclusion légica y validla,‘pero no cierta {las mrah- chas foliares pueden ser causadas por Sttos agetites ajenos 4 los hon-» gos). Métodos légicos reconocidos De los métodos légicos utilizados en la fitopatologia, el més re nombrado es el que se refiere a “hos ‘postuladds de Koch” (ver Cdpf- © tulo 9). ‘ ‘ LA LITERATURA FITOPATOLOGICA El paso preliminar para todo ttabajb de investigacién fitopatolo- gica es la revision dela literatura publichda. Esta puede ser superficial 0 exhaustiva, segin las exigencias del ¢aso. Para comprobar la caysade -? una enfermedad, o sea aplicar los’ postulados de Koth, basta ubiéar un trabajo donde se indiquen claramente las ‘condiciones nécesarias de inoculacién e incubacién. En ¢aso$ no tan sithples quizé sta nece- * sario leer varios trabajos para tan sblo détermmar en qué forma sé puede aislar el organismo causal. : Be Segin la orientacién que el investigadbr desee dar’ a su ttabajo, debe prepatar una lista de los temas qUe le interesan, los cuates debe utilizar sistem4ticamente al revisar la fitetatura ¢ ir catalogarido la informacién adquitida. Esto es egencial pata hacer un trabajo com- , pleto. Algunos de los temas dé intetés en la revisién de la literatura * sobre una enfermedad pueden set: c- a. La enfermedad: nombres comunes, sintomatologia (morfolé- gita, histologica). : i b. El patégeno: taxonomfa, nomenclatura binomial; distribuicion geografica; 4mbito de hospéddntes {cultivat del hospedante prin- cipal, otras especies); reprodaccién sexual y asextial; distmina- « cién; germinacién de propdgulos; longevidad del ‘inécelo; estu- dios genéticos; vatiacién y varlabifidad; patogentvidad; métodos de aislamiento, multiplicaci6n, fruétificacidn, ¢ inoculacion. c. Epifitologia: penetracién y coloh{zatién.:del hospedante; in- fluencja del ambiente (temperatuta, nutritién del hogpedante,- humedad relativa, etc.). ‘ X6 Métodos de Investigacion Fitopatolégica d. Control: resistencia del hospedante; herencia de la resistencia; control quimico; sanidad; rotaci6n; control biolégico. Revisién preliminar El primer lugar donde se debe buscar informacién es en los libros, monografias y boletines que tratan de enfermedades especificas, o de enfermedades que afectan determinados cultivos o grupos de culti- vos. De ahi la importancia de tener una buena biblioteca personal 0 departamental, o acceso a una biblioteca principal. Es igualmente importante saber usar la biblioteca y conocer los principales libros de fitopatologfa. Los departamentos de fitopatologia por lo comin mantienen fi- cheros donde se catalogan citas bibliograficas de enfermedades y cul tivos. Esta es una fuente ideal para ubicar informaci6n facilmente disponible, puesto que se basa en las revistas o separatas que se reciben. Las bibliotecas indican la disponibilidad de-libros, revistas, boleti- nes, etc., los cuales estén catalogados bajo las categor{fas de autor, titulo, y tema, aunque generalmente no puedan considerar la multi- plicidad de titulos o temas que puedan contener. Los catdlogos inclu- yen tarjetas de referencia y tarjetas de llamada (las cuales sugieren otros titulos, autores y temas relacionados). Revisién exhaustiva Una revision exhaustiva, que puede o no ser necesaria, comienza por Review of Applied Mycology (desde 1971, Review of Plant Pathology) que es una compilacién de resGmenes de todos los traba- jos fitopatologicos que aparecen en publicaciones renombradas y constantes en todos los idiomas y traducidas al inglés (idioma cienti- fico moderno, sin cuyo conocimiento el investigador esta en desven- taja). Esta publicacién data desde 1922. Desde 1967 se publica la revista Abstracts of Mycology. El forma- to del primer afio de publicacién no fue apropiado y desde 1968 se ha convertido en excelente compendio para el microbidlogo (a pesar de su nombre restrictivo). Abarca bien la literatura fitopatoldgica, y es de uso facil. Esta revista publica los resimenes de interés para el microbiédlogo, que aparecen en los Biological Abstracts (con su com- plemento B.A.S.I.C) y Bioresearch Index (publicados por Biosciences Information Service of Biological Abstracts, de EE.UU. de N. A.). A continuacién se presentan algunas de las principales publicacio- nes fitopatolégicas periddicas o de interés para el fitopatdlogo. Casi todas cuentan con un indice anual tematico y de autores. En cada revista generalmente aparecen datos sobre subcripciones; de lo con- trario se pueden consultar listas como “‘Ulrich’s International Peri- odicals Directory” en una biblioteca.La investigacion de las enfermedades de las plantas Fs Revistas compendiadoras REView of PLANT PATHOLogy* (1922-) Mensual. Antes REView of APPLied MYCOLogy (hasta 1970). Commonwealth Mycologycal Institute, Kew, Surrey, Inglaterra. Indice acumulativo de los primeros 40 afios que indica los volamenes de interés: Plant Host-Pathogen Index to Vols. 1-40 (1922-1961) of the Review of Applied Mycology, 1968. Abstracts of Mycology y otros compendios de BIOSIS. BioSciences Information Service of Biological Abstracts, 2100 Arch Street, Philadelphia, Pennsylvania 19102, EE. UU. de N.A. BIOSIS publica Biological Abstracts, BASIC, Bioresearch Index y Abstracts of Mycology. Se trata primero a este tltimo por ser el mas especifico para esta disciplina. ABSTRacts of MYCOLogy (1967) Mensual. Comprende compendios clasificados en indice tematico (Cross Index), indice sistematico (Biosystematic Index), autor, y por el sis- tema alfabético de palabras claves de los titulos (Subject Index) se- gan el sistema permutado de B.A.S.I.C. Indice acumulativo anual. Los nimeros de clave que acompafian a los titulos permutados en el indice temético llevan dos nimeros prefijos. Los nameros prefijos bajos (64-, 65-, 66-, etc) representan las citas y restamenes del Biologi- cal Abstracts, los cuales se reproducen en la seccion “Abstracts” de la revista. Para los nimeros con prefijos altos (78-, 79-, etc.) no apare- cen resmenes sino sdlo los titulos completos y la referencia biblio- grafica (provenientes del Bioresearch Index) en la seccién que sigue a los ‘‘abstracts” y se titula “Additional Bibliographic Citations”. Cada volumen incluye unas 9.000 referencias de unas 1.400 revistas. Se dan a continuacién dos pares de ejemplos escogidos del uso del indice temdtico (“Subject Index”) permutado segan aparece en Abstracts of Mycology (y en el B.A.S.LC. de donde es seleccionada la informacién). Las palabras subrayadas (aunque no lo estén en el original) son las que aparecen en orden alfabético en la permutacion de los titulos que se ubican por el namero en el extremo derecho. SARIUM STUB DIEBACKIN CARNATION CULTIVARS DIANTHUS-CAR 63-041251 (*). Las letras mayiisculas indican la abreviacién correcta de éste y de otros titulos que siguen: ie. Rev. Plant Pathol.. 8 Métodos de Investigacién Fitopatolégica NATIALSUSCEPTIBILITY TO FUSARIUM STUB DIEBACK IN CARNATION 63-041251 HYBRID RESISTANCE TO PHYTOPHTHORIOSIS 9 PHYTOPHTHORA 77-099921 ATION OF INTERSPECIFIC POTATO HYBRID RESISTANT TO PHYT 77-099921 Se puede observar como la bisqueda bajo el nombre comin del cultivo afectado o el nombre de la enfermedad Ileva al mismo resulta- do, la clave numérica del “‘Abstract” o de la cita que se ubica en la seccién respectiva, con los formatos que se aprecian a continuaci6n: 41251, STACH, R. W., R.K. HORST, P.E. NELSON AND R. W. LANGHANS (Dept. Plant Pathol. N.D. State Univ., Fargo, N.D., USA.) Differential susceptibility to Fusarium stub dieback in carnation cultivars. J AM SOC HORTIC SCI 101 (6):654-657. 1976. Sixty-three cultivars of carnation...... ee ORDENA LENINA AKAD S-KH NAUK IM V LENINA RRRRERERREREREARRERAREERERAREE ERA AREER AEE RER AREER EEE 77-099921 LEBEDEVA N A LEBEDEVA V A AN EXPRESS METHOD OF DETERMINATION OF INTERSPECIFIC POTATO HYBRID RESISTANCE TO PHY TOPHTHORIOSIS PHY TOPHTHORA PAGE 19-20 Para informacién sobre otros tipos de indices, ver a continuacién la explicacién sobre Biological Abstracts. BIOLogial ABSTRacts (1926). Se inicié bajo el nombre de Botanical Abstracts en 1913). Periodicidad quincenal. Como su nombre lo indica, abarca todas las ciencias biolégicas, y también afines. La informaci6n fitopatolégica aparece bajo “Phytopathology” segan el tipo de agente causal, como sigue: “Diseases caused by Fungi. Diseases caused by Bacteria (ver también General and systematic Bacteriology). Diseases caused by Phanerogams. Diseases caused by Animal Parasites. Virus Diseases (Ver también Virology, General).La investigacin de las enfermedades de las plantas 9 Nonparasitic Diseases. Parasitism and Resistance. Disease Control. General and Miscellaneous”. El “Cross. Index” de cada nimero presenta bajo las categorias arriba nombradas, los nameros de todos los restimenes pertinentes. El “Author Index” permite localizar trabajos de autores cuyo progreso se quiere seguir. El “Biosystematic Index” de acceso rapido y resa- menes sobre organismos segin su categoria taxondmica esta subdivi- dido de acuerdo al tipo de estudio (i.e. “cytology”). B.A.S.I.C. (1963-). La forma més efectiva y rapida de ubicar trabajos especificos es usar el complemento de Biological Abstracts (B.A.), el Biological Abstracts Subjects in Context (B.A.S.I.C.), que es un indice alfabético permutado preparado por computadora, que se publica desde 1963 con la misma frecuencia que el B. A. En el B.A.S.LC. aparecen los titulos de los trabajos y el ndmero correspondiente del resumen: cada titulo aparece alfabéticamente bajo sus palabras claves entre las palabras anteriores y posteriores hasta completar el espacio (y cuando es apropiado se le agregan palabras importantes que no aparecen en el titulo), como ya fue ilustrado para Abstracts of Mycology. BIORESearch INDEX (1965-). Mensual. Contiene una compilacién de titulos de trabajos no incluidos en el B.A., cada uno con su cita bibliografica. Tiene indice por tema, autor, y titulo permutado (estilo B.A.S.I.C.). VIROLogy ABSTRacts (1970-). Mensual. Informaci6n retrieval Ltd., Londres. Suscripcionesen las Américas: CCM Information Corpo- ration, 909 Third Avenue, New York, N.Y. 10022. HELMINTHOLogical ABSTRacts (1932-). Trimestral. SERies B: PLANT NEMATOLOGY. Commonwealth Agricultural Bureaux, Famham Royal, Slough SL2 3BN, Inglaterra. MICROBIOLogy ABSTRacts (1970-). Mensual. La misma direccién que Virology Abstracts. TROPical ABSTRacts (1946-). Mensual. Desde 1975, ABSTRacts of TROPical AGRiculture. Department of Agricultural Research, Royal Tropical Institute, 63 Mauritakade, Amsterdam-0, Holanda. Trata sobre agricultura tropical y subtropical. Se publicaba en holandés; en inglés desde 1953. Incluye listas de libros, indice acumulativo anual por autor, tema y distribucién geografi fica. FORESTRY ABSTRacts (1939-). Trimestral. La misma direccién que Helminthol. Abstr.10 Métodos de Investigacién Fitopatolégica TOBACCO ABSTRacts (1957-). Mensual. D.H.Hill Library, North Carolina State University, Raleigh, 27607, EE.UU. de N.A. Indice anual por autor y tema. CHEMICAL ABSTRacts (1907-) Semanal + 2(54 p. a.) Indice acu- mulativo Vol. 1-55 (1907-61). Chemical Abstracts Service, Ohio State Univ., Columbus 43210, EE.UU. de N.A. DISSertation ABSTRacts INTernational (1938-) Mensual. Section B: Sciences and Engineering (1938-51, Microfilin Abstracts; 1952-68, Dissertation Abstracts; en dos secciones desde 1969). Compendios de tesis doctorales, principalmente de EE.UU. de N.A. hasta 1968, otros paises después). ae Microfilms, Inc., Ann Arbor, Michigan 48106, EE.UU. le N.A. AGRINDEX- Sistema Internacional de Informacion sobre Ciencias y Tecnologia Agricolas (1975-). FAO, NN.UU., Via delle Terma di Caracalla, Roma. Indices 0 catélogos BlOLogical and AGRicultural INDEX (1916-). Mensual. Antes AGRicultural INDEX (hasta 1964) H.W. Wilson Co., New York, N.Y. BIBLIOGRaphy of AGRiculture (1948-). .S. Department of Agriculture, Beltsville, Maryland, 20705, EE.UU. de N.A. BIBLIOGRaphy of SYSTematic MYCOLogy (1950-). Commonwealth Mycologycal Institute, Kew, Surrey, Inglaterra. ROYAL SOCiety CATALOGue of SClentific PAPERS 1800-1900. The Royal Society of London. Un indice de los autores de trabajos cientificos de revistas y tran- sacciones de sociedades. Complementado por “Catalogue of Scientific Papers, 1800-1900. Subject Index (indice tem4tico) co- menzado en 1908. Continuado en el siguiente catélogo. INTermational CATALOGue of SClentific LITerature. 1900-1914. Royal Society of London. Sec. L, Biologia general; Sec. M, Boté- nica; Sec. R-Bacteriologia. Reimpreso por Johnson Reprint Corp., 111 Fifth Ave., New York, N.Y. 10003. DICTIONARY CATALOG of the NATional AGRicultural LIBRary, 1962-1965. 73 Vols., 1967-1970. Reproduce las fichas de biblio- teca. Rowman and Littlefield, Inc., 84 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10011. BIBLIOGRaphie der PFLANZENSCHUTZ LITeratur. (1920-) Paul Parey, Lindenstr. 44-47, Berlin, Alemania Occidental “Bibliografia de la proteccién de las plantas”. Publicacion erratica.La investigacién de las enfermedades de las plantas i PUBLICACIONES PERIODICAS ACTA PHYTOPATHOLogica (1966-) Trimestral. Academiae Scientiaram Hungaricae; Kultura Co., Budapest 62, P.O.B. 149, Hungria. Publica principalmente en inglés. ADVANCES in VIRUS RESearch (1953-) Anual. Academic Press, 111 Fifth Avenue, New York, N.Y: 10003. AMerican POTATO Journal (1924-) Mensual. The Potato Association of America, Rutgers College of Agriculture. New Brunswick, N.J. 08903, EE.UU. de N.A. ANNales de I’ INSTitut PHYTOPATHOLogique BENAKI (1935-) Irregular. Atenas, Grecia. Publica en varios idiomas. ANNales de PHY TOPATHOLogie (1969-) Trimestral. Service des Publications de I’ INRA, Route Saint-Cyr, 78- Ver- sailles, Francia. abso Annales des Epiphyties (1912-) Series C, Phytopathologie ANNals of APPLied BIOLogy (1914-) 6 nos. (2 Vols.) p. a. Association of Applied Biologists (Britanico) Cambridge University Press, 200 Euston Rd., London NWI 2DB Inglaterra (32 East 57th St., New York, N.Y. 10022). ANNals of the PHY TOPATHOLogical SOCiety of JAPAN(1935-) 5 p.a. National Institute of Agricultural Sciences, Nishigahara, Kita-Ku, Tokyo, Japon. ANNUal REView of PHYTOPATHOLogy (1963-) Anual. Annual Reviews, Inc., Palo Alto, California, 94306, EE.UU. de N.A. Publica revisiones bibliograficas solicitadas a autoridades mundiales sobre temas de toda indole fitopatolégica. C.M.L DESCRiptions of PATHogenic FUNGI and BACTeria (1964-) C.M.I. DESCRiptions of PLANT VIRUSES (1970-) Descripciones de los respectivos patégenos con citas bibliograficas principales. C.M.I. DISTRIBution MAPS of PLANT DISeases (1942-) Commonwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, Inglaterra. COMUNICaciones, INSTituto NACional de INVestigaciones AGRA- Rias. SERie PROTeccion VEGetal: Espafia. FITOPATOLOGIA (1966-) Semestral. Publica en espafiol, portugués e inglés, con resimenes en dos idiomas. Incluye los res’menes de reuniones fitopatoldgicas latinoamericanas. Asociacién Latinoame- ticana de Fitopatologia. Apartado 5969, Lima, Pera. INDIAN PHYTOPATHOLogy (1948-) Trimestral. The Indian Phytopathological Society, Indian Agricultural Re- search Institute, New Delhi — 12, India.12 Métodos de Investigacion Fitopatolégica Journal of AGRicultural RESearch (1913-1949) Quincenal. United States Department of Agriculture, Beltsville, Maryland 20705, EE. UU. de N. A. Journal of APPLied BACTERIOLogy (1916-) Mensual (4 Vols. p. a.) American Society for Microbiology, 4715 Cordell Ave., Bethesda, Maryland 20014, EE.UU., de N.A. Antes: Journal of BACTE- RIOLogy. The Journal of GENERAL MICROBIOLogy (1947-) 15 p.a. (No. Vols. variable). The Society for General Microbiology, Cambridge, Univ. Press (ver Ann. Appl. Biol.) The Journal of GENERAL VIROLogy (1967-). Aprox. mensual. Cambridge Univ. Press. (ver Ann. Appl. Biol.) Journal of NEMATOLOGY (1969-) Trimestral. The Society of Nematologists, 2120 Camden Road, Orlando, Flo- rida 32803, EE. UU. de N.A. MYCROBIOLogia ESPafiola (1947) Trimestral. Revista del Instituto “Jaime Ferran” de microbiologia y de la Sociedad Espafiola de Microbiologia. Calle de Joaquin Costa, 32. Madrid-6, Espafia. MYCOLOGIA (1909-) Bimestral Mycological Society of America, The New York Botanical Garden, Bronx, New York, N.Y. 10458. Mycologia Index Vol. 1-58 (1909-1966). Donte et MICOLogia APPLicata (1938-) 12 + supl. (3 ols.) p.a. Dr. W. Junk, Publishers, The Hague (La Haya), Holanda. NEMATOLOGICA (1956-) Trimestral E.J, Brill, Leiden, Holanda. NETHerlands Journal of PLANT PATHOLogy (1890-) Bimestral Antes: Tijdscrift over Plantenziekten. Netherlands Society of Plant Pathology, Wageningen, Holanda. Pest Articles and News Summaries (1961-) Center for Overseas Pest Research, College House, Wrights Lane, Londres, W855J, Inglaterra. PHYSIOLogical PLANT PATHOLogy (1971-) Trimestral Academic Press, 111 Fifth Avenue, New York, N.Y. 10003 PHYTHOPATHOLogia MEDITERranea (1962-) Cuatrimestral. Unione Fitopatologica Mediterranea Edizione Agricole, Via Emilia Levante 31, 2 40139 Bologna, Italia. PHYTOPATHOLogische Zeitschrift (1929-) Mensual Paul Parey, Lindenstrasse 44-47, Berlin 71, Alemania Occidental Publica resimenes y algunos trabajos en inglés. PHYTOPATHOLOGY (191 1-) Mensual American Phytopathological Society, 3340 Pilot Knob Road, St. Paul, Minnesota 55121, EE.UU. de N.A. Cumulative Index, Vols. 31-40; 41-50.La investigacién de las enfermedades de las plantas 13 PLANT DISease REPorter (1916-) Mensual A.R.S. — C.R.D., United States Department of Agriculture, Beltsvi- lle, Maryland 20705, Susbcripcién: Superintendent of Documents U.S.G.P.O. Washington, D.C. 20402, EE.UU. de N.A. PLANT PATHOLogy (1952-) Trimestral Ministry of Agriculture, Fisheries and Food — Plant Pathology Laboratory, Harpenden, Herts., Inglaterra. PLANT PROTECtion BULLetin (1952-) Food and Agriculture Organization of the United Nations, Viadelle Terme di Caracalla, 00100, Roma, Italia. POTATO RESearch (1958-) Trimestral. Antes European Potato Journal. European Association for Potato Research, Postbus 20, Wageningen, The Netherlands. Holanda. REVue de MYCOLogie (1936-) Laboratoire de Cryptogamie du Museum National d’Historie Naturelle, Paris. REVue de PATHOLogie VEGetale et d’ENTOMOLogie AGRicole de FRANCE (1914-) Trimestral. Society de Pathologie Vegetale et d’Entomologie Agricole de France, Librairie Le Francois 91, Boulervard Saint-Germain, Paris Vle. RIVista di PATOLogia VEGetale (1892-) Trimestral Serie I Vol. 1-10 (1892-1902); Serie II, Vol. 1-33 (1905-1938) Serie III Vol. 1-4 (1961-1964); Serie IV Vol. 1, 1065 — Consiglio Nazionale delle Richerche, Casella Postale 99 27100 Pavia, Italia. TRANSactions of the BRITish MYCOLogical SOCiety (1896-) 6 na- Ca (2 Vol.) p.a. Cambridge University Press (ver Ann. Appl. iol.) TROMea AGRiculture (1924-) Bimestral. Imperial College of Tro- pical Agriculture, University of The West Indies, Trinidad. VIROLOGY (1955-) Mensual (varios Vols. p.a.) Academic Press, Inc., 111 Fifth Ave., New York, N.Y. 10003. Zeitschrift fiir PFLANZENKRANKHEITEN (PFLANZENPATHO- Logie) und PFLANZENSCHutz (1891-) Mensual o irregular Eugen Ulmer, Stuttgart, Alemania Occidental. Para quienes es esencial “estar al dia” sobre este tipo de literatura, hay un servicio semanal de la publicacién de los titulos del contenido (la relaci6én de los trabajos) de las publicaciones a medida que salen o con anticipacién a su publicacién. La publicacién es Current Con- tents/Agriculture, Biology & Environmental Sciences, iniciada en 1970 por el Institute for Scientific Information (325 Chestnut Street, Philadelphia, Pennsylvania 19106, EE.UU. de N.A.). Tiene indices por tema y autor (con su direccién postal). Presenta la ven- taja de que se pueden pedir separatas a los autores antes de que los articulos aparezcan en las revistas compendiadoras (si es que no se recibe esa revista).14 Métodos de Investigacibn Fitopatolégica LECTURA Y ANOTACIONES La revision de literatura debe ser sistematica, pasando de la revi- sién preliminar en la cual se formulan algunas ideas sobre el tipo de informacién que se desea buscar, a la lectura selectiva y haciendo las anotaciones apropiadas. Es recomendable tomar notas en fichas o tarjetas aunque sdlo se revisen un par de articulos. La acumulaci6n de tarjetas se hace mas Util con el paso de los afios. La forma de tomar notas requiere que se sigan ciertas normas o en su defecto, el lector se vera forzado a tener que leer un mismo artfculo repetidamente para encontrar un dato insignificante, como por ejemplo, 1a paginacién o iniciales del autor, etc. En la ficha se reservan dos tercios del margen superior izquierdo para la referencia bibliografica y la parte derecha restante para la lista de temas (ver el ejemplo que se da en la Fig. 1). La referencia debe ser completa segan las reglas estrictas de redaccion bibliografica (ver el Capitulo 16). La lista de temas dependeré de la amplitud de intere- ses del lector y podra limitarse a las necesidades inmediatas de la revision que realiza, o tener en cuenta todos sus intereses como fito- ee y estar supeditada a su sistema de archivar y seleccionar sus fichas. La toma de notas debe ser cuidadosa al resumir, citar y comentar. Al resumir un trabajo debe cuidarse de no cambiar el sentido de lo expuesto en la publicacion, ni de omitir partes importantes que luego den una impresién errénea. Las citas textuales deben indicarse entre comillas 0 preceder el texto con las palabras: textual, cita directa, SIC, 0 verbatim. Si se comenta sobre el trabajo, relacionandolo con otro o con experiencias personales, se procede con las iniciales del anotador o la palabra “comentario”. Al mencionar un trabajo citado por el autor del articulo, hay que identificar en lo posible el origen dei mismo y dar el nombre del autor citado, o la referencia completa que serviré para ampliar la revision de literatura. Si el lector adquiere la costumbre de pedir separatas a los autores, o de sacar copias de los articulos, debe reservar la esquina superior derecha de la tarjeta para el codigo de separatas (C.S.); este procedi- miento se recomienda porque aunque se tomen notas, los trabajos mas importantes se deben tener a mano para su repetida evaluacién y consulta. Las principales revistas fitopatolégicas e instituciones facili tan separatas a los autores, y éstos las distribuyen a quienes le solici- ten copia de sus articulos. El fitopatélogo debe tener a mano una tarjeta o carta mimeogra- fiada que facilite el pedido de separatas, y debe tratar de contribuir a la familia fitopatolégica con separatas de sus propios trabajos. Un ejemplo de una tarjeta tradicional para este propdsito se da en la Fig. 2 (la direccién y timbrado van en la otra cara).La investigacion de las enfermedades de las plantas IS ‘Tecane,J¢.,H, 0, Thurion y Gaver, 1066, Marcitrients ‘beer (mako) coud por Peudomons slanecearum Ineinto (Colombiana Agropecuario 1: 37.46 ‘Alec pldtao cachaco y hart (aves babilae y Mm, persosocs) -eracariios de opine lo larg davai fo Magdlana”. (Enfermedad conccidedande 1964, poo hasta shora confundida con la antracnosi causa por Glosouperi musanim {clean a Cordon, 1963, La anracnose dl pldtano “echeco" an ol Tella. Turvabe 13: 88-66). (Enfermedad el moke fue determined por E. Burtamares, 198, Incculeron volendcese: tomete Lycaperscum esculntum L. var. Margie, pape Solanum tuberomien L.ver. Alte y ‘Sumapar, y abaco Mictina tabacum L. ver. Hable 38. Usron spendin bectariane splice sls de 24,30, 1 je el pce hacia aba, tnceuteron pitanecacheco inectande el seudotll. | Todas ts eapecies inocula fusron smeaptibes, el abaco sie ligaramante, Fig. 1. Ejemplo del contenido de una ficha de notas sobre un articulo cientifico. Estimado Colega: Dear Sir: Encontrando de sumo interés su publicacién: Iam very interested in your publication: Les agradeceria si fuera posible me enviara. . . . copia (s) I will be grateful should you be able to send me... . . copy (ies) atentamente, yours truly Nombre del solicitante |“ " """” Direccion Calles o Apartado Postal Ciudad y Pais Fig. 2. Tarjeta postal de solicitud de separatas.16 Métodos de Investigacién Fitopatolégica Fichas de notas Las fichas deben ser de tamafio uniforme para ficheros 0 archivos y de un tamafio lo suficiente grande para permitir anotaciones exten- sas que abarquen ambas caras. Todo detalle que se requiera apuntar, depende de la disponibilidad del original (tiempo para tomar notas vs. tiempo para revisar el original cuando se requiera). La acumula- cién de fichas a través de los afios hace dificil ubicar todas las fichas que se deseen consultar, atin en el caso de que éstas estén catalogadas © clasificadas. Ademds, para que una clasificacion sea util debe ser miltiple (considerando agente causal, cultivo, autor, etc.) y esto re- quiere mucho espacio y trabajo. Este problema se resuelve utilizando fichas con margen perforado, las cuales se pueden clasificar por me- dio de cédigos marginales (margenes dentados que eliminan o abren perforaciones) en miles de categorias faciles de ubicar, entresacar y escoger. Estas fichas tienen de 4 a 5 perforaciones (posiciones )por pulgada del margen, y el nimero de perforaciones puede ser hasta de tres por posicién (en profundidad). Una esquina esta cortada diagonalmente para asegurar un alineamiento preciso. El mecanismo de entresacado se basa en la apertura de posiciones a partir de un codigo marginal. Para escoger fichas marcadas en una cierta posicién, se inserta una aguja especial en la perforacién correspondiente de un conjunto de fichas y al levantarlas caen las que tienen esa perforacion abierta. Segin el sistema del codigo se requieren uno o mas pases de la aguja para terminar con sOlo las fichas deseadas. Sistemas de cédigo Los cédigos basados en una sola perforacién por posicion, que son los sistemas mds adecuados para las necesidades de la gran mayoria de los fitopatdlogos son de dos tipos: cédigo directo (numérico) y cédigo de campo (numérico 0 alfabético). Cédigo directo: cada perforacién esta representada por un nimero al cual se le asigna una categoria. Cédigo numérico de campo: cada una de las posiciones de un campo de cuatro tiene asignado los valores — 7, 4, 2, y 1. Abriendo una o dos de estas posiciones en distintas combinaciones se consigue cualquier nimero del | al 9: 1;2;2 + 1;4;4+1;4+2;7;7+1;7+ 2. Si se utiliza una serie de campos para que cada uno represente un namero del sistema decimal, con sdlo dos campos se pueden expresar nameros hasta 99, con tres hasta 999, y asi sucesivamente. Cédigo alfabético de campo: usando los valores antes asignados a un campo de cuatro, se pueden conseguir combinaciones de estos ndameros por encima de 9, hasta 14:7 +2 + 1;7+4;7+4+1;7+4 + 2;7 + 4+ 2+ 1. Si se ampliara el campo a cinco perforaciones yLa investigacion de las enfermedades de las plantas 17 se asignara un valor de 15 a la quinta posicién, las combinaciones llegarian hasta 29. Puesto que es més practico utilizar un alfabeto abreviado se sugiere proceder en la forma siguiente: Marque con una letra maydscula del abecedario una quinta posi- cin para cada campo de cuatro que se desee utilizar para designar letras. Utilice las combinaciones que den ndmeros de 1 a 13. El namero 14 estaré representado por la quinta posicién (A) y el 1, el namero 15 por la Ay el 2... el 26 por la Ay los nameros 7, 4, 2. De esta manera el alfabeto* estaré representado en la forma siguiente: la 15)0=A,2_ 22) V=A,7,2 2b 16) p=A,2,1 23) w=A,7,2,1 3) ¢ 17) q=A,4 24) x=A,7,4 4) 4 18) r=A,4,1 25) y=A,7,4,1 S)e 19) s=A,4,2 26) z=A,7,4,2 6) f 20) t=A,7 Nes 21) u=A,7,1 El uso de la ficha con codigo Teniendo en cuenta las distintas formas de codificar los margenes de una tarjeta se ha disefiado un ejemplo (Fig. 3), de la utilidad que podria dar un fitopatélogo a una ficha de disefio general y simple de tamafio 5 x 8 pulgadas (12,7 x 20,1 cm) con 4 perforaciones por pulgada con estas posiciones numeradas consecutivamente y agrupa- das también por campos de cuatro con los valores 1, 2, 4 y 7 (Unisort Analysis Card, form Y9 Burroughs Corporation — Todd Div. — L. Hadley). A partir de la esquina superior derecha cortada, la numeracién comienza por el margen superior de derecha a izquierda. Las primeras ocho posiciones se reservan para “Categorias Principales” inicial- mente tipo de agente causal: hongo, bacteria, virus, nematodo, abid- tico, otros, y quedan dos abiertas para uso futuro. Las posiciones 9 a 29 se designan para “‘Categorias Secundarias”: genética, fisiologia del parasitismo, potencial de indculo, método de inoculacién, efecto de temperatura, efecto de luz, efecto de pH, efecto de humedad, efecto de fertilizacion, etc. La perforacién de la esquina (como la de las otras dos esquinas) se reserva para uso en alineamiento de las tarjetas. Debajo de esta hay otra perforacion sin numeraciOn que se deja en reserva. El margen izquierdo se utiliza para identificar cultivos. Los prime- ros dos campos (perforaciones No. 30-37) se usan para un codigo directo de categorias (agrupaciones) algo arbitrarias de cultivos, los (*) -Las cuatro letras que faltan se representaran as{: fi =n; ch =c, h; 1=1, 1; m =r, r.18 Métodos de Investigacién Fitopatolégica (CODIGO DIRECTO: nimeroe 14.37 Pye ye | Heme [= earns [| ‘SOAULIND 30 saNOKVENYOY ‘CODIGO ALFABETICO DE CAMPO: Now. 78060 ‘©O01G0 NUMERICO DE (CAMPO: Now 38848 = 1-100 Fig. 3. Ficha para tomar notas mostrando el cédigo de clasificacién en base al cual se hardin las perforaciones marginales. cuales se presentan en el Cuadro 1. Los dos campos inferiores se utilizan en cédigo numérico de campo para numerar en campos deci- males hasta 99. Anterior a la perforacién esquinera queda una perfo- racién (No. 46) fuera de campo, la cual se reserva para el caso de que se desee que ésta represente 100 y permita elevar el mdximo a 199. Esta numeraci6n se utilizar4 para numerar los cultivos dentro de cada una de las categorfas. La Gnica categoria que podria pasar de 100 seria “otros” si por ejemplo, se incluyen alli especies utilizadas como indicadores 0 diferenciales, en tal caso la perforacién No. 46 podria tener la funcién exclusiva de distinguir éstas, si se las comienza a numerar con 101. En una misma ficha se pueden marcar todas las categorias que se desee, pero sdlo un cddigo numérico, por lo cual se indica s6lo el cultivo o la especie sobre la que trata principalmente la publicaci6n. El margen inferior se utiliza para determinar exactamente la “‘cau- sa principal de la enfermedad”. Como éstas ya se han definido bajo categorias principales queda por indicar la clasificacién taxonémica de par4sitos u otra causa. Esto se hace con cuatro letras; las dos primeras indican las dos primeras letras del Género de un organismo, o de una causa como FRio, o las letras que representan un elemento; la tercera letra sera la primera de la especie o un calificativo de la causa principal, e.g. Helada; la cuarta s6lo se usard cuando se conside- re necesario separar razas, forma specialis, variantes, variedades, etc.,La investigaci6n de las enfermedades de las plantas 19 CUADRO No. 1. Agrupaciones de cultivos bajo un namero de Cédi- go directo (C.D.) y numeracién por cédigo de campo (C.C.) de las plantas en estas agrupaciones, segin el cddigo dado en la Fig. 3. CD. CC AGRUPACION Y CULTIVos C.D. C.C. AGRUPACION Y CULTIVOS 30 TUBEROSAS Y RAICES FRUTALES (Cont.) 1 Papa, Solanum tuberosum 7 Higuera, Ficus carica 2 Camote, Ipomoea batatas 8 Mango, Mangifera indica 3. Yuca, Manihot esculenta 9 Olivo, Olea europea 4° Zanahoria, Daucus carota 10 Membrillo, Cydonia oblonga 5 Beterraga, Beta vulgaris 11 Papayo, Carica papaya 12 Pecano, Carya pecan i — 13. Datilero, Phoenix dactilifera 1 Lino, Linu usitatsimum 1S Giuclo, Pune domenica 2 Coben, Corchonss conan 16 Fresa, Fragaria chiloensis 3 Algod6n, Gossypium sp. 32 GRAMINEAS = Lestat eccleard 7 ite, Lycopersicot 1 Cafia, Saccharum officinarum Tomate, Lycopersicon 2 Maiz, Zea mays 2° Cebolla, ajo, Allium sp. 3. Trigo, Triticum sp. 3 Esparrago, Asparragus 4 Amoz, Oryza sativa “officinalis 5 Avena, Avena sativa imi i & Sets em toe oe 7 Sorgo, Sorghum vulgare 6 Lechuga, Lactuca sativa 33 LEGUMINOSAS 7 Apio, Apium graveolens 1 Alfalfa, Medicago sativa - — 2 Frijol, Phaseolus vulgaris 1 Clavel, Dianthus caryophyllus ’ ride eee foe 2 Rosal, Rosa sp. : i, Arachis hypogaea ia, Dahlia variabil A reper 3 Dalia, Dahlia variabilis 6 Habe, Vicia faba 37 OTROS 34 FRUTALES 1 Cafeto, Coffea arabica . 2+ Caucho, Hevea brasiliensis 1 Citricos, Citrus sp. 3. Tabaco, Nicotiana tabacum 2. Manzano, Malus communis 4° Té, Thea sinensis 3 Melocotonero, Prunus persica 5 Quinua, Chenopodium quinoa 4° Banano y plitano, Musa sp. 101 Chenopodium amaranticolor 5 Palto, Persea americana 102 Physais floridana 6 Vid, Vitis vinifera 103“ “ Datura stramonium y se utilizaran nameros o la primera letra, segin se indique en la codificacién. El primer campo del margen inferior, junto con la per- foracién sin namero entre este campo y la perforacién esquinera, codifica la primera letra del Género. El segundo campo complemen- tado por la posicién siguiente (No. 55) permite indicar la segunda20 Métodos de Investigacién Fitopatolégica letra del Género. La posicién No. 56 indica cuando existe mds de una causa de enfermedad. La posicién No. 57 indica cuando el binomio taxondmico tiene sinénimos o hay duda en la identificacion. La posi- cién No. 58 junto con el campo adyacente codifica la primera letra de la especie. El campo que le sigue (Nos. 63-66) y la posicién que sigue a este (No. 67) indican clasificacion subespecifica por nimero o letra segin se establezca. Las posiciones restantes quedan en reserva para cualquier necesidad que se pueda presentar en el futuro, mas categorias secundarias, mas cultivos, etc. Podrian utilizarse para indi- car el afio de publicacién o la década de la misma. El margen derecho se utiliza para el cédigo del autor. El campo inferior y los dos sucesivos se usan para indicar la primera y segunda letra del apellido y la primera inicial. Estos campos de cuatro perfo- raciones llevan de complemento para poder codificar letras, respecti- vamente a la primera, segunda y tercera (Nos. 88, 89, 90) perforacién del cuarto campo. La Ultima perforacién (No. 91) se usa para indicar cuando hay mas de un autor. Para cada situacion se debe disefiar un sistema apropiado a los requisitos del cientifico o de la unidad de investigacién. Por ejemplo, si se trabaja exclusivamente con un cultivo, ya no seria necesario codificar para agrupaciones de cultivos, sino que se ampliarian los nameros usados en cédigo directo para subdividir la categoria “hongos” en “hongos foliares”, ‘“‘hongos radiculares”, etc. o para ampliar adn més, se podria establecer un codigo numérico de campo de 1 a 99 (de dos campos) para los hongos si son numerosos, pero un cédigo de un sdlo campo para las bacterias si éstas fueran pocas. BIBLIOGRAFIA ANONIMO. Royal McBee. Keysort; for the bibliographer. Port Chester, N.Y. Form S-422R60 s.f. 4 p. CASEY, R.S. Punched Cards; their application to service and industry. 2nd ed. New York, Reinhold, 1958 CZABATOR, F.J. The use of McBee “Keysort” cards in regeneration literature search. U.S. Forest Service, 1958. 15 p. (Mimeo). GARCIA DE SERRANO, I. Manual para la preparacién de informes y tesis. San Juan, Puerto Rico, Departamento de Hacienda, 1961. 259 p. PETERSON, M.S. Scientific thinking and scientific writing. New York, Reinhold, 1961. 215 p.CAPITULO 2 LAVADO, ESTERILIZACION Y ASEPSIA LAVADO El lavado o la limpieza de la cristaleria no debe descuidarse, porque puede ser la fuente de problemas, por ejemplo, residuos m{fni- mos de ciertos detergentes resultan bactericidas; por lo tanto, para trabajos de precision es necesario comenzar con utensilios de vidrio bien lavados. Para trabajos dificiles deben hacerse uno o mas enjua- gues con agua destilada a todo lavado. En algunos lugares esto debe hacerse rutinariamente si el agua contiene exceso de carbonatos. Cuando el vidrio es dificil de limpiar se usa una solucién especial para su limpieza. Uso de soluci6n limpiadora Segiin las necesidades, la limpieza se puede hacer con una solucién limpiadora normal o fuerte, la cual debe usarse con cautela y tener mucho cuidado durante su preparacién porque es muy peligrosa (explosiva si no se siguen bien las instrucciones). CUADRO No. 2. Composicién de soluciones para la limpieza de cristaleria. INGREDIENTES SOLUCIONES LIMPIADORAS Fuerte Normal Agua 300 cm? 1000cm? Dicromato de potasio 60g 60g Acido sulférico 460 cm® 60 cm?22 Métodos de Investigacién Fitopatologica Procedimiento: se disuelve el dicromato de potasio en agua, se agrega el dcido sulfdrico lentamente y se enfria la mezcla pues la reaccion que ocurre produce gran calentamiento. Se debe agregar el 4cido poco a poco y de manera que baje por la pared interna de la vasija. Cada vez que se agrega el acido, se agita la vasija para incorpo- rarlo a la solucién anterior y se va enfriando simultaneamente el exterior de la vasija en un chorro de agua fria; la solucién se agrega a las vasijas que van a limpiarse, y se dejan en ellas el tiempo necesario. Esta solucién se vuelve a usar repetidamente, hasta que su accién quede anulada. ESTERILIZACION Para trabajar con microorganismos es requisito indispensable man- tenerlos en estado de cultivo puro, para lo cual el procedimiento aséptico es esencial. El primer paso para conseguir este propdsito es la esterilizaci6n de la cristalerfa y de los medios de cultivo. La esterilizaci6n es la eliminacién por muerte o separacién de todo organismo viviente de un material. Esto se consigue por medio de calor, filtracién, u otros métodos fisicos 0 quimicos. Los métodos més comunes incluyen el uso de calor, en sus formas de calor seco o de calor hamedo. Esterilizaci6n por calor Homo o estufa. El calor seco de la estufa eléctrica u horno (el horno de una cocina a gas es adecuado) es Util para la esterilizacién de la cristaleria y se usa cominmente para esterilizar las placas Petri. Si se esterilizan frascos u otros recipientes abiertos, que deben taponar- se con algodén o cubrirse con algin otro material, debe tenerse cuida- do de que la temperatura no pase de 180°C para evitar que el algo- dén se queme. Las temperaturas de 160 a 180°C por 90 a 120 minutos son eficaces si se deja espacio suficiente para que circule el aire caliente alrededor de todos los materiales. Esterilizador Arnold. Se ha determinado que el calor himedo es. més dafiino a los microorganismos porque el agua induce una coagu- lacién més rapida de las proteinas. El esterilizador Arnold trabaja con vapor de agua, el cual circula por rendijas desde la base donde se hierve el agua hacia toda la cAmara de esterilizaci6n y por la pared doble de ésta. Se utiliza para la esterilizacion descontinuada o Tyndaliza- cién. En 1877, John Tyndall publicd un trabajo en el cual demostr6 que podfa esterilizar una infusibn de heno calentaéndola en tubos pequefios a intervalos de 12 horas por un perfodo total de cuatro minutos (dos veces por minuto y cuatro veces por medio minuto), pero no cuando lo hizo una sola vez durante diez minutos. En la actualidad se esterilizan medios como gelatina, leche, o cualquier otraLavado, esterilizacién y asepsia 23 sustancia que contenga materiales labiles al calor, aplicando calor de vapor (100°C) durante 20-30 minutos y en tres dias sucesivos. Este método es inapropiado cuando se trata de medios que no contienen elementos que aseguren una nutricién adecuada para los organismos contaminantes, ya que éstos sobreviven si el medio no induce el crecimiento o germinacién de esporas de bacterias y quizd de otros propagulos resistentes. Autoclave Los esterilizadores a presibn de vapor de agua o autoclaves, son artefactos manufacturados principalmente para uso de los hospitales. Hay modelos més simples y mucho mas econémicos que se asemejan a una olla de presin. A continuacién se describen los tipos més comunes y el principio de su funcionamiento. AUTOCLAVE PORTATIL VERTICAL: consta de un recipiente de aluminio similar a una olla de presibn de aproximadamente 35 cm de di4metro y 30 cm de altura. La tapa es separada y se adhiere por medio de armellas al borde superior del recipiente, y est4 provista de un manémetro y una valvula de seguridad. El agua destilada se coloca en el fondo hasta un nivel inferior al soporte de la base, sobre el que se coloca una olla en el interior, dentro de la cual se insertan las vasijas que se van a esterilizar. Segin el tipo y el volumen de los frascos que se utilicen, se pueden esterilizar unos 3 6 4 litros de medio. La fuente de calor, que puede ser una hornilla a gas o eléc- trica, regula la presién. Si esta fuente de calor es intensa, la esteriliza- cién es mds répida que en el modelo siguiente. AUTOCLAVE PORTATIL VERTICAL ELECTRICO: este mode- lo es como el anterior, excepto que la fuente de calor es una resis- tencia eléctrica cuyo funcionamiento se controla termostaticamente. Tiene la ventaja de requerir menos supervision. AUTOCLAVE VERTICAL ALTA: es similar a la autoclave verti- cal portatil, pero su altura permite la esterilizacion de objetos de mayor tamafio y de una cantidad mayor de objetos, porque cuenta con un sistema de bandejas superpuestas. Hay modelos eléctricos 0 a gas con control termostatico, pero éstos tienen el inconveniente de Ae de llenar y vaciar (especialmente cuando estan ain calien- tes). AUTOCLAVE HORIZONTAL PORTATIL: este tipo disefiado para la esterilizacién de jeringas y agujas de uso médico, es de menor volumen y de mucho mayor costo que la autoclave portatil vertical. Algunos modelos son automaticos y de acabado lujoso apropiado para un consultorio médico. No son apropiados para un laboratorio de investigacion.24 Métodos de Investigaci6n Fitopatolégica AUTOCLAVE HORIZONTAL: las autoclaves horizontales gran- des constan de un cilindro horizontal de pared simple o doble, con una compuerta de cierre hermético que tolera presiones de vapor de agua de por lo menos 30 Ibs/pulg?. Su efectividad se basa en el hecho de que a mayor presién, mayor es la temperatura de ebullicién del agua. Tienen una caldera propia o conexién a vapor de agua de una central. Cuando la presién aumenta a dos atmésferas (15 Ibs) la tem- peratura llega a 121,6°C; no hay organismo que tolere esta tempera- tura por 15 minutos. E] tiempo es el factor que permite que el calor penetre y se absorba. Este método es excelente para esterilizar me- dios en frascos, pero si el volumen es mayor de un litro, debera aumentarse el tiempo de operacién. Debe observarse que la tempera- tura Iegue a 121°C, lo cual no sucede con presin de 15 Ibs sila evacuacion del aire inicialmente encerrado es inadecuado. Si se esterilizan placas en autoclave, es conveniente envolverlas de tres en tres, en papel periédico, para que no se contaminen después y para facilitar su manipulacién. Tanto en este caso como cuando se trata de pipetas dentro de cilindros, deberan esterilizarse por unos 40 minutos. Los medios en botellones no deben ocupar més de tres cuartas partes, para permitir una ligera ebullicién sin derramarse. Las tapas de rosca de botellones medicinales deben ir ligeramente sueltas. Si se usan frascos Erlenmeyer se deben taponar con algod6n, para permitir la entrada del vapor. Se recomienda cubrir el algod6n con una bolsita de papel invertida para evitar que se humedezca excesiva- mente. Los medios entubados deben colocarse en canastillas de malla metilica, con los tubos algo separados para que el calor penetre uniformemente. Se debe dejar espacio adecuado entre los articulos que se van a esterilizar para que el vapor tenga libre acceso. A continuacién se dan las instrucciones para el uso de una autoclave horizontal semiauto- miatica: Operacién de autoclaves eléctricas a. se coloca el material que se va a esterilizar y se cierra la com- puerta con presién leve; b. se abre la Ilave de agua “A” (ver Fig. 4) y se agrega agua destila- da por el embudo hasta que alcance (sin sobrepasar) la marca de nivel en el tubo indicador de vidrio. Luego se cierra; . la lave del sifon “‘B” debe permanecer siempre abierta; . se abre ligeramente la lave de purga “C”; . se enciende. Se prendera una luz indicadora roja; mean . cuando la presién comienza a subir, se cierra més la llavede purga hasta que escape un minimo de vapor;Lavado, esterilizacién y asepsia 25 Fig. 4. Autoclave horizontal eléctrica cuya operacién se explica en el texto. Las Iaves mencionadas en las instrucciones de operacién son: (A) 3 (B) sifon (trap); (C) purga (vent); y (D) manivela de presion (Pressure control). g. se calibra (si ain no lo est) el control de presién “D”, a 15 Ibs en el manémetro; h. cuando la temperatura Ilegue a 121°C, se calcula el tiempo de esterilizacion (15 minutos para liquidos en vasijas de volumen no mayor de 1 litro, 30-40 minutos para cristaleria); i. se apaga después del tiempo deseado y se deja que baje la pre- sién a cero antes de abrir lentamente la puerta. La rapidez a que baje la presibn dependera de la apertura de la lave de purga. Para liquidos debe ser unos 15 minutos. Después de esterilizar es preferible enfriar ligeramente el contenido de la autoclave. Deje la puerta entreabierta antes de sacar los objetos26 Métodos de Investigacién Fitopatologica estériles y asi evita peligros al operador y la rotura de la cristaleria por cambios bruscos de temperatura. Los tubos con medio para hacer inclinados deben colocarse reclinados en la posicién adecuada para su solidificacién; esto se consigue recostandolos sobre otros tubos, tu- berfa, vara de madera o en un armaz6n construido especialmente para este propésito. Para trabajos que no necesitan exactitud puede inclinarse la canastilla donde se esterilizaron los tubos. Los medios estériles para vertir en placas se dejan enfriar y se vierten cuando la temperatura esté a unos 40-45°C (temperatura apenas tolerable por la piel). Si son varios frascos, conviene colocarlos en bafio-maria a temperatura controlada, de donde se sacaran uno a uno, siempre a la temperatura deseada. Los medios esterilizados y solidificados se pue- den guardar a temperatura ambiente y derretirse en agua hirviendo o esterilizador Arnold cuando se requieren. Esterilizacién por filtracion En el Instituto Pasteur se desarrollaron métodos de esterilizacion por filtracién; sin embargo, Iwanowsky en 1892, demostré que estos filtros no eran adecuados para algunos agentes causales de enferme- dad, los que se legaron a llamar virus (mosaico del tabaco en ese caso. La filtracién se utiliza especialmente cuando se desea preservar intactas las proteinas que tienen la propiedad de desnaturalizarse (labiles a temperaturas de esterilizacién. Los filtros més usados son de porcelana (Chamberland), tierra diatomacea (Berkefeld o Man- dler), vidrio desmenuzado, asbestos (Seitz), membranas de celulosa, y oe Como auxiliar para el proceso de filtraci6n se utiliza vacfo 0 presién. Esterilizacion ultravioleta Los rayos de luz ultra violeta (U. V.) son letales para los organis- mos, por lo que se pueden utilizar lamparas U. V. para esterilizar medios; pero como estos rayos tienen poca penetracién a través de vidrio o de un espesor grande de medio, s6lo son utiles para trabajos especiales. Se pueden utilizar, por ejemplo, para esterilizar bolsitas de plastico que se van a emplear para el envio de cultivos, o para esterili- zar medio de poco grosor preparado en bolsas de plastico selladas. Se debe instalar la limpara U. V. dentro de una caja para que los rayos no causen dafio al operador y de manera que quede a unos 10 cm del material que se desea esterilizar. Esterilizaci6n quimica La esterilizacién con 6xido de propileno (propylene oxide) es atil para esterilizar tejidos de plantas sin destrozarlos y para medios cuan-Lavado, esterilizacién y asepsia 27 do se carece de otros métodos. Para esterilizar placas con medio de agar,se prepara el medio y se vierte en las placas, las que una vez tapadas se ponen dentro de una campana preparada para que selle bien. Se agrega un vaso conunos 10cm’ de oxido de propileno por cada 30 placas y se deja por 24 horas. Después de sacar las placas se dejan otras 24 horas antes de usarlas. Este producto quimico es muy volatil y muy venenoso para el hombre. Es aconsejable guardarlo refrigerado (y mejor atin en una refrigeradora especial antiexplosiva, o sea sin contactos eléctricos en su interior). ASEPSIA La asepsia consiste en la aplicacién de un conjunto de procedi- mientos para eliminar o reducir la contaminaci6n por microorganis- mos sin el empleo de antisépticos. Conjuntamente con la aplicacién de métodos asépticos se utiliza esterilizacién, desinfestantes, medios selectivos y técnicas especiales segin el tipo de microorganismo, con el fin de establecer y mantener cultivos puros de fitopatégenos. La asepsia consiste en la exclusién de los propagulos de microorga- nismos contaminantes que provienen del aire, del material vegetal del cual se aislan los fitopatégenos, de los utensilios, manos o ropa del que realiza las tareas y de aquellos microorganismos transportados y diseminados por Acaros, insectos, etc. Exclusi6n de propagulos del aire En el aire flotan prop4gulos de muchos microorganismos, sean fitopatégenos, patdgenos del hombre, saprofitos, etc. que pueden interferir con el trabajo de aislamiento, transplante o inoculacién que se deseen realizar, los que se depositan sobre las superficies de tra- bajo, utensilios, etc., y pueden ingresar a las vasijas que utiliza el investigador. Con el fin de evitar la contaminaci6n por microorganis- mos se puede usar una o varias combinaciones de los métodos si- guientes: a. Trabajo en el ambiente de laboratorio. Se trabaja sentado frente a un meson de piedra pulida, de material sintético duro, o recu- bierto con un vidrio; se debe escoger el sitio con menor corrien- te de aire y alejado de las zonas de circulacién de otras personas. Se limpia la superficie de la zona de trabajo con una gasa estéril hdmeda o impregnada de alcohol etilico 70% o hipoclorito de sodio (0 calcio) al 1%. Cuando no se pueden evitar las corrientes de aire conviene extender una gasa mojada en hipoclorito de calcio al 0,5% y trabajar sobre ésta, cuya funcion es adherir a su superficie los prop4gulos de microorganismos que hacen contac- to al acercarse con la corriente de aire (especialmente la que genera el mechero, cuyo efecto es considerable).- 28 Métodos de Investigacion Fitopatolégica b. Camara contra las corrientes de aire. Si las condiciones descritas en el punto anterior producen contaminaciones excesivas, la construcciOn de una camara que interfiera las corrientes de aire es un gasto minimo que ayuda a solucionar el problema. La camara consta de tres lados (fondo y costados), es de un mate- tial rigido no poroso y la parte superior que tiene inclinacién hacia adelante es de un vidrio que permite la iluminaci6n con la luz del ambiente (se recomienda una luz fluorescente en la parte superior). La cara frontal es abierta y de 20 cm o mis de altura para permitir el movimiento libre de las manos. c, Cémara aséptica. La camara aséptica para usar sobre un meson puede adquirirse de fabrica o mandarse a hacer. Los modelos de cajon cerrado, excepto en el frente donde hay huecos para ma- nos (a veces con mangas) y que tienen un plano inclinado de vidrio, son incémodos y presentan poca o ninguna ventaja sobre los descritos en los puntos anteriores, El uso de luz U. V. no proporciona ventaja alguna si se toman las medidas recomenda- das en el punto a. Los modelos de aire forzado y filtrado son los més ventajosos porque el aire pasa a través de un filtro que elimina hasta los microorganismos mas pequefios. Estos filtros tienen que cambiarse (o limpiarse segin el tipo) cada 3 meses cuando el uso es intensivo. La cortina de aire que sale por el frente impide el ingreso de contaminantes y elimina el calor del mechero. El frente abierto presenta una zona amplia de trabajo libre de obst4culos (Fig. 5). Lo esencial es que la base (el meson o vidrio superpuesto) se lave después de usarse para evitar que quede alguna substancia que sirva de medio de cultivo a micro- organismos y no se deben dejar cultivos en el interior. d. La habitacién aséptica. La habitacion “‘aséptica” (camara o cuarto de inoculacién) puede ser un Area de 1,5 — 2 m? con s6lo un meson de piedra pulida, una puerta de ingreso con una rendija en la parte inferior para ventilaciOn y de ser posible con un sistema de ingreso de aire forzado filtrado en la parte supe- rior. Es costumbre colocar una luz ultra violeta (U.V.) para matar los microorganismos durante los perfodos en que no se usa la camara. Este tipo de camara es costosa, el disefio y mante- nimiento del sistema de aire forzado y filtrado presentan proble- mas por no existir equipos comerciales para este fin, y el usario sufre la incomodidad del calor que genera el mechero que usa en su interior. Fallas en el disefio o equipo convierten en indtil una instalacién costosa como es una camara incorporada en el plano de construcci6én de un edificio. Si se deja de usar para este fin, se le puede dar otro uso o queda como espacio e inversion inatil. A menudo, ésta es la situacién que se observa en los laboratorios de fitopatologia.Lavado, esterilizacion y asepsia 29 Fig. 5. Cémara aséptica “Microvoid” (Air Control Inc.). Comentario sobre el mechero de gas. El fitopatélogo novato casi siempre tiene un mechero de gas prendido a su mayor intensidad cuando trabaja. Pone al rojo vivo todas sus herramientas (causando dafio a los cromados) y crea corrientes de aire que transportan mu- chos contaminantes. Cuando lo usa en una c4mara aséptica de inocu- laci6én, invariablemente causa la rajadura del vidrio. La alternativa de usar un mechero de alcohol es buena cuando se realizan disecciones para el aislamiento de patégenos. Cuando se usa un ansa que se debe poner al rojo vivo, se recomienda usar un mechero de gas pequefio o del tipo que tiene un piloto y prende la llama grande al presionar. Contaminantes del hospedante La planta hospedante de un patogeno siempre tiene otros microor- ganismos sobre su superficie y en su interior, aspecto que se trata en otros capitulos. Cabe sefialar aqui en términos generales, los métodos tiles para evitarlos o disminuir su efecto (generalmente antes de proceder a la desinfeccién y siembra): a. Lavar en agua potable corriente y aerada cuando el material esté muy sucio. b. Lavar en agua con detergente cuando es material dificil de mojar.30 Métodos de Investigacién Fitopatolégica c. Introducir en alcohol etilico 70% para romper la tensién super- ficial y remojar luego en otro desinfectante. d. Hacer uso de la dilucién de propagulos del patogeno para elimi- nar contaminantes que estan en proporcién mfnima (en otras palabras, no preocuparse de eliminar al contaminante, sino di- luirlo). Contaminantes de los utensilios Para evitar la contaminacién de las herramientas que se usan para cortar los tejidos afectados es necesario que la superficie de los mis- mos no sea una fuente constante de microorganismos. Se deben lavar y desinfectar los érganos que se van a disectar. Los utensilios como pinzas, bisturis y agujas de diseccién, deben colocarse periddica- mente en alcohol etilico 70% por la parte que hace contacto con los tejidos, luego sacarse y flamearse (para esto se mantiene prendido un mechero de alcohol). Para el caso de transferencias de porciones de un cultivo para transplante o preparacién de indédculo, se usa una ansa hecha con alambre de resistencia eléctrica. Se pueden adquirir ansas hechas, pero no son siempre del agrado del investigador. El alambre de resis- tencia se fabrica en distintos grosores. Para transferencias de suspen- siones de bacterias o esporas el més conveniente es el alambre delga- do para ansas aro y el grueso para darle forma de espatula o bisturi, que se presta para cortar trozos de hongo en su medio de cultivo (se trabaja el alambre en frio aplastando con golpes de martillo sobre metal liso). Estos alambres resisten el calor de una llama de mechero a gas; se esterilizan y limpian entre cada operaci6n llevandolos al rojo vivo e incineran asi a los microorganismos y al medio adherido. Se enfrian con relativa rapidez, pero si se desea hacer un trabajo rapido, conviene alternar dos de éstos, y dejar enfriar a uno cada vez. Microorganismos del investigador El investigador es portador de microorganismos en la superficie de su piel, su ropa, etc., por lo tanto, debe tomar ciertas precauciones. Se recomienda arrollarse las mangas largas o usar un guardapolvo limpio sobre la ropa de calle, lavarse las manos con agua y jabén y secarlas con una toalla de papel, de tela de uso Gnico o con un secador eléctrico. Estas precauciones son especialmente necesarias si antes ha estado en el campo o trabajando con plantas en macetas 0 haciendo otro trabajo de este tipo. Transmisi6n por insectos y por 4caros Por lo general los insectos son problemas menores y transitorios en el laboratorio. Segan la localidad, los adultos jévenes de algunosLavado, esterilizacién y asepsia 31 insectos voladores son atraidos al laboratorio en cierta época del afio y pueden ingresar a las placas Petri si se las deja sobre las mesas de trabajo. Las placas Petri presentan mds oportunidades para el ingreso de Acaros e insectos cuando se han deformado por esterilizacién en hornos o estufas a temperaturas excesivamente altas, por lo cual es importante regular bien la temperatura de esterilizacion por calor seco. Los Acaros pueden introducirse en plantas, suelo, materia organica, etc. Se introducen a las placas Petri y tubos con tapones no herméti- cos y al pasar de unos a otros contaminan los cultivos puros. Por ser los acaros un serio problema en casi todo laboratorio si no se toman medidas preventivas drasticas o de control, se dan a continuacién algunas pautas: Control de 4caros. La introduccién de Acaros a los laboratorios debe evitarse por lo que deben seguirse estrictamente las siguientes reglas al introducir materiales que son probables fuentes de contami- naci6n: a. desinfestar los suelos a alta temperatura (seca o vapor) o fumi- garseles; b. desinfectar el material vegetal con hipoclorito de sodio o biclo- ruro de mercurio, flamearlo con alcohol o fumigarlo con un producto apropiado a las circunstancias de la investigacién; c. tomar precauciones de todo cultivo de microorganismos, espe- cialmente hongos, procedentes de otros laboratorios. Los Acaros son dificiles de eliminar porque se introducen en rinco- nes inaccesibles, incluyendo el material aislante en las paredes de las incubadoras. Se puede convivir con estos artrépodos mindsculos, cuando hay contaminaci6n, si se toman algunas de las medidas si- guientes: a. todas las superficies del laboratorio deben lavarse con detergen- te periédicamente; b. espolvorear los rincones y sitios de dificil acceso, incubadoras, debajo de los lavatorios, mesas de trabajo, etc., con polvo de silica gel (el cual causa la escarificacién de la cutina de las articu- laciones de los 4caros causando su disecacién); c. tratar con un acaricida el interior de incubadoras y otros am- bientes cerrados donde se guardan cultivos. Algunos acaricidas como el Kelthane (0,5%) reducen el crecimiento de los hongos. El Paradiclorobenceno colocado en forma de cristales en una32 Métodos de Investigacin Fitopatologica caja junto con cultivos contaminados, probablemente mate los Acaros, pero induce el crecimiento anormal y la mutacién en algunos hongos. El Vapona en tiras de resina es efectivo sin dafiar los hongos. Los Acaros, sin embargo, pueden desarrollar resistencia a estos acaricidas. Como los 4caros contaminantes no son solamente fitéfagos, los acaricidas desarrollados para proteger a las plantas no son efectivos contra todos los 4caros que contaminan a los hongos; d. subir la temperatura de las incubadoras 0 recintos cerrados a 60°C o més por varias horas hasta constatar que los acaros han muerto; e. el Kelthane y Cypro pueden agregarse a los cultivos o aplicarse a los tapones de algodén de los tubos de prueba usados para cultivar hongos con buenos resultados (Smith, 1967); . las temperaturas muy bajas de un refrigerador inhiben el movi- miento de los dcaros, por lo cual los cultivos refrigerados corren menor riesgo de ser contaminados por otros cultivos; g. el uso de tubos sellados impide el ingreso o salida en el caso de encontrar tubos contaminados de dcaros. El sellado es.adecuado en tubos con tapa de rosca, asi como meter los tapones de algod6n en cera derretida, pero la falta de aireacién puede aca- trear la muerte de los cultivos. Sellar con papel de cigarrillo fue un procedimiento popular durante muchos afios y actualmente se usa (Snyder y Hansen, 1946). Guardar grupos de tubos o placas en bolsas de polietileno o papel bien sellado los protege de la contaminacién, pero nuevamente se presenta el problema de la aireacién. BIBLIOGRAFIA COMMONWEALTH MYCOLOGICAL INSTITUTE. Plant pathologist’s pocketbook. Kew, Surrey, Inglaterra, 1968. 267 p. RIKER, A.J. y RIKER, R.S. Introduction to research on plant diseases. St. Louis, Mo., John S. Swift, 1936. 177 p. SALLE, A.J. Fundamental principles of bacteriology. Sth. ed. New York, McGraw Hill, 1961. 812 p. SMITH, R.S. Control of tarsonemid mites in fungal cultures. Mycologia 59:600-609. 1967. SNYDER, W.C. y HANSEN, H.N. Control of culture mites by cigarette paper ST, barriers. Mycologia 38:455-462. 1946, ‘ANIER, R.Y., DOUDOROFF, M. y ADELBERG, E.A. The microbial world. 2nd. ed. Englewood Cliffs, N.J., Prentice-Hall, 1963. 753 p.CAPITULO 3 MEDIOS DE CULTIVO DEFINICIONES Medio de cultivo es una sustancia o solucién que permite el creci- miento de uno o mas organismos. Cultivo es el producto del crecimiento de un. organismo o grupo de organismos, establecido con fines experimentales o industriales. Cultivo puro es el cultivo de un sdlo organismo y su progenie. Es un cultivo clonal de un organismo libre de todo contaminante. HISTORIA La primera informaci6n sobre el uso de cultivos fue “Nova Plan- tarum Genera”, publicado en 1929 por Pier Antonio Micheli, en Flo- rencia, quien logr6 establecer cultivos de hongos de los géneros Mucor, Botrytis y Aspergillus en el interior de melones, peras y membrillos, demostrando que se reproducen por medio de sus “‘semi- llas”. Inoculé también hojas muertas en el bosque con esporas de Agaricales (Stanier, 1963). A mediados del Siglo XIX, Oscar Brefeld observé el desarrollo de micelio a partir de una espora y concluyé que los cultivos puros por definicién debian iniciarse a partir de una sola célula. Brefeld y Anton de Bary, ambos famosos micélogos, optaron por el uso de cultivos puros (Walker, 1957). Pasteur en 1860 (Brock, 1965) publicé sobre el uso de un medio de cultivo liquido para levadura (10 g de sacarosa, 1 g de ceniza de levadura, 0,1 g tartrato de amonio dextrogiro), y un afio después demostr6é experimentalmente la nulidad del concepto de generacién espontanea (esterilizé y mantuvo estéril un medio de cultivo). Joseph Lister, un cirujano inglés, publicd en 1878 (Brock, 1965) un trabajo sobre la fermentacién lactea con lo cual comprobé que era una bacteria la causa de este fendmeno y consiguié cultivos puros por medio del proceso de dilucién. Asumi6 que de las bacterias que viera al microscopio, la que predominaba era la responsable. Con una mi- crojeringa ubicé en el campo de visién del microscopio una microgo-34 Métodos de Investigacién Fitopatolégica ta de’volumen calculado’y determiné el namero de células bacteria- nas por volumen de cultivo. Calculé la dilucién necesaria para conse- guir que una de cada dos transferencias con la microjeringa diera un cultivo originado de una sola célula bacteriana. Sus transferencias las hizo a copas previamente calentadas en un horno por dos horas, las cuales contenian leche hervida, y estaban tapadas con una fuente de vidrio invertida. Para mayor seguridad las mantuvo bajo campanas de vidrio. Cinco de diez transferencias resultaron en fermentacién, y comprobé que eran cultivos puros de una bacteria que denomin6 Bacterium lactis. El uso de medios sdlidos comenzé en Alemania con Schroeter quien en 1872 us6 papa, pan, pasta de almid6n, y clara de huevo para cultivar bacterias. El micélogo Brefeld (1881) utiliz6 gelatina para sus hongos (Stanier, 1963). Robert Koch, un médico aleman, comen- 26 trabajando con rodajas de papa estéril en vasijas de vidrio estériles, las cuales inoculaba con bacterias. Luego encontré ventajoso solidifi- car sus mejores medios liquidos con gelatina, vertiendo su prepara- cién sobre laminas de vidrio protegidas de la contaminacién por me- dio de una campana. Usando una aguja de platino inicié la practica de hacer estriados sobre el medio, para luego escoger los distintos tipos de colonias que se desarrollaban y establecer cultivos puros en tubos con medio solidificado en posicién inclinada. Modificé luego este procedimiento incorporando las bacterias al medio antes de ver- ter (Brock, 1965). La gelatina fue reemplazada en los laboratorios de Koch por agar, un agente solidificante que fue sugerido por la esposa de uno de sus colegas que habia vivido en el oriente donde se le usa en reposteria. Un paso gigantesco en la técnica de cultivos fue la innovacién de E. J. Petri quien trabajando con Koch disefié una placa de cultivo, cuyo uso describid en 1887, y que sigue usdndose sin modificacién en disefio hasta la fecha (Brock, 1965). AGENTES SOLIDIFICANTES Gelatina La gelatina es una sustancia derivada de huesos, ligamentos y piel de animales, por ebullicién en acido clorhidrico (HCl) diluido. — Propiedades: se derrite a 37°C cuando esta concentrado. Se solidi- fica a 25-30°C usando 10-12% en solucién y también se derrite a esa temperatura. Se descompone a 121° C y es digerida por los microorganismos. Agar. El agar, o agar-agar, es una gelatina vegetal, un polisacdrido_ que se extrae de algas por medio del dcido sulfarico diluido a una temperatura de 80°C. Se usa en Asia como comestible, La produc-Medios de cultivo 35 cién comercial se extrae de las siguientes especies: Gelidium corneum GQapén, E.U.A.); Gracillaria sp. (E.U.A.); Gigartina sp. (Gran Bre- tafia); Pterocladia sp. (Nueva Zelanda) (Ainsworth y Bisby, 1961). Propiedades: se derrite a 80-100°C. Tolera altas temperaturas de esterilizaci6n sin descomponerse. Se solidifica a 35-50°C y adquiere firmeza en medios de cultivo a concentraciones de 1,5 a 2,0%. Se hidroliza a pH 2 y pH 9. La hidr6lisis 0 digestién por microorga- nismos ocurre en muy pocos casos: su valor nutritivo es casi nulo y contiene algunos factores de crecimiento. Gelatina inorgAnica. La gelatina de silica es una gelatina inorganica que se puede usar para preparar medios definidos. Winogradsky la us6 alrededor de 1890 (Brock, 1965) para aislar bacterias nitrifi- cantes, TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO Segain su consistencia Lfquidos: los medios liquidos se usan principalmente en el incre- mento de bacterias, en las determinaciones de sus propiedades fisiolé- gicas, para el incremento masivo de bacterias y hongos con fines experimentales (generalmente bajo agitacion) y para estudios de cre- cimiento de microorganismos. Industrialmente tienen uso en la pre- paracién de productos accesorios al crecimiento de microorganismos, (4cidos organicos, antibidticos, etc.). Los medios liquidos son co- munmente aireados por agitacion. Sélidos: el uso principal de medios sdlidos es para el aislamiento de hongos y bacterias, y para su mantenimiento, Se prepara en fras- cos, placas Petri y tubos de prueba. Segan sus propiedades nutritivas Carentes de nutricién: Agua para el mantenimiento de bacterias en estado latente e inmu- table, o clamidosporas de Fusarium (el agua destilada en destiladores metilicos es a veces t6xica y letal para las bacterias; es preferible usar agua desmineralizada o agua potable no clorinada). Agar agua: para que el crecimiento sea el resultado de la nutricién que provee el tejido vegetal enfermo introducido del cual se desea aislar un microorganismo patdgeno. Nutritivos: Naturales: consisten Gnicamente de material vegetal natural, como tejidos vegetales asépticos (interiores de frutos, vainas, tubérculos,36 Métodos de Investigacion Fitopatolégica taices, etc.), tejidos vegetales esterilizados, y tejidos vegetales macera- dos y esterilizados. Complejos o semisintéticos: contienen sustancias naturales y tam- bién elementos sintéticos o definidos. Ejemplos de las sustancias na- turales son: extractos de animales (extracto de carne, gelatina); ex- tractos vegetales (caldo de Papa); y preparados vegetales (harina de maiz, hojuelas de avena, ““V-8”). Sintéticos o definidos: todo su contenido es quimicamente defini- ble, aunque generalmente son aceptables algunas impurezas (Cza- pek’s; Richard’s Solution). Medios especiales Diferenciales. Se denominan diferenciales a los medios que contie- nen sustancias (no necesariamente nutritivas) con un papel especial para identificar, seleccionar, o caracterizar microorganismos. Ejem- plo: medio tetrazolio, Bacteriost4ticos. Los medios bacteriostaticos son diferenciales, pero se establecen en una categoria aparte para resaltar su papel siendo muy importantes para aislar hongos. Se convierten en bacte- riostaticos casi todos los medios, agregando uno de los siguientes productos: Acido lactico 25 gotas/It, al medio enfriado. “Sulfato de estreptomicina, 200 p.p.m., al medio enfriado. Rosa de bengala 100-300 p.p.m. (esterilizable). Medios titiles y comunes AGAR AGUA (AA) o “doble A”. Util para aislar Actinomicetos y Ficomicetos. Agua* 1.000 cc Agar 10- 18g Preparacion: agréguele el agar al agua; caliéntelo hasta derretirlo. Distribdyalo y esterilicelo. Cuando se usa agar en polvo es mas simple ponerlo directamente en frascos con un embudo, agregarle el agua y esterilizarlo (segin el volumen de los frascos se utilizan alicuotas correspondientes. AGAR AGUA ACIDIFICADO (AAA) o “triple A”. Apropiado para aislar algunos hongos radiculares, vasculares y foliares. La acidez y la carencia de contenido nutritivo inhiben el crecimiento de bacte- rias. Los hongos se extienden en crecimiento ralo pero cominmente “répido” utilizando el tejido sembrado como fuente de nutricion. (*) El agua puede ser destilada, desionizada o potable (hervida para eliminar el cloro) para todos los medios segin las circunstancias del investigador y la precision deseada.Medios de cultivo 37 Preparaci6n: al AA agréguele 50 gotas de Acido lictico, 50% por litro, después de esterilizarlo. AGAR, PAPA AZUCAR (APA). Util para el crecimiento de la mayoria de los hongos cultivables, y para el aislamiento de éstos cuando no hay problema de contaminaci6n bacteriana. Trozos de papa pelada Aziicar (sacarosa) . Preparacién: hierva la papa en 500 cc de agua por 30 minutos, mientras derrite el agar en otros 500 cc. Filtre el caldo de papa con tamiz y gasa. Junte las dos preparaciones, agréguele y disuelva el azicar, y restituya el agua hasta completar 1000 cc. Distribtyalo y esterilicelo. Variantes de este medio incluyen el uso de papa sin pelar, caldo con considerable pulpa, y dextrosa en vez de aztcar de mesa o saca- rosa (el tradicional PDA o “potato dextrose agar”). La dextrosa tiene el inconveniente que se acaramela al esterilizar. AGAR PAPA SACAROSA ACIDIFICADO (APSA). Este medio, que inhibe la multiplicacién de las bacterias, es de uso generalizado para el aislamiento de hongos a partir de tejidos enfermos. Si se reduce a la mitad la cantidad de aztcar, generalmente se produce un crecimiento més ralo y facil de observar, y una esporulacién més rapida, factores que facilitan la identificacion de hongos. Preparaci6n: acidifique el medio APA como con AAA. CALDO PAPA AZUCAR (CPA). Medio propicio para el crecimien- 4 de hongos en agitacién, especialmente para algunas especies de ‘usarium. : Preparacién: Proceda como para APA, omitiendo el agar. AGAR V-8. Este medio es muy Util para la esporulacién de mu- chos hongos. El V-8 es un jugo enlatado por la Campbell Soup Co. que contiene extractos de tomate, zanahoria, apio, beterraga, perejil, lechuga, espi- naca y berro. Jugo V-838 Métodos de Investigacién Fitopatolégica Preparacién: agregue el V-8 al agua tibia, luego el carbonato y el agar. Caliente hasta derretir el agar. Distribayalo y esterilicelo. AGAR HARINA DE MAIZ. Util para el aislamiento y esporula- cién de algunas especies de Phytophthora, Harina de maiz................ Dextrosa (opcional). peers (opcional) . fae hasta completar . Preparacién: mantenga la harina de maiz en 500 cc de agua a unos 60°C por | hr. Obtenga un filtrado a través de muselina y agréguelo al agar ya derretido en otros 500 cc de agua. Comtinmente se agrega dextrosa o peptona, o ambos. Complete el volumen a 1000 cc de agua. Distribayalo y esterilicelo. Variantes de este medio son hervir media hora, la retencién del maiz y el uso de hasta 60 g del mismo. AGAR NUTRITIVO (AN). Se utiliza para el aislamiento de la mayoria de las bacterias, como medio en la identificaci6n y general- mente para su almacenaje. Preparaci6n: derrita el agar, disuelva los otros ingredientes y ajuste el volumen. Filtre, distribuya y esterilice. . CALDO NUTRITIVO. Se utiliza para el cultivo liquido de bacte- Tias. Difiere del agar nutritivo en que se omite el agar, y se puede incluir un carbohidrato (10 g de sacarosa o dextrosa). MEDIO TETRAZOLIO (TZ). Util para distinguir Pseudomonas solanacearum, sus razas y colonias avirulentas. También para Erwinia carotovora, y bacterias en general. Dextrosa .... 10g 10g lg ie 18 cc Agua hasta completar.... 1000 cc Preparaci6n: esterilice el medio indicado en alfcuotas de 200 cc. Prepare una solucién de 1% de 2, 3, 5,tripheny] tetrazolium chlorideMedios de cultivo 39 (TZ) en un frasco a prueba de luz y esterilicela por 8 minutos en autoclave. Guarde bajo refrigeraci6n. Se ha determinado que el uso de sdlo 2,5 g de dextrosa permite un mayor desarrollo de la raza de 3 de P, solanacearum, A cada alicuota (200 cc) de medio tetrazolio agregue por medios asépticos 1 cc de la solucién TZ después de su enfriamiento, paso previo al vaciado a placas Petri. La concentracién final de TZ es de 005%. OTROS MEDIOS. Para mayor informacién sobre medios, en la bibliografia que se presenta al final de este capitulo se da la pagina- cién correspondiente en las referencias pertinentes. Levine y Scho- enlein (1930) tratan exclusivamente sobre este tema. REACCION DE MEDIOS Definicién de reaccién La reaccién de una sustancia se define como su concentracién de iones de hidrégeno. Esta se mide con una escala algo arbitraria, cuyos ndmeros se aproximan al logaritmo del reciproco de la actividad de iones de hidrégeno y no exactamente al de la concentracién de éstos como fue definido (pH — logaritmo del reciproco de la concentra- cién de iones de hidrégeno). La escala de pH es de 0 a 14. El pH 7 corresponde a una solucion en la cual existe un equilibrio entre iones de hidrégeno (Ht) e hi- dréxido (OH ) en disociacién. A este estado de equilibrio se le deno- mina reaccion neutra. La actividad de H* en la solucion es | x 1077 Si esta actividad disminuye, la solucién es alcalina (de pH mayor de 7), y si aumenta es 4cida (pH menor de 7). Importancia del pH Los microorganismos toleran s6lo un cierto 4mbito de pH, y cre- cen mejor a ciertos niveles de reaccién. Un medio puede tener una reaccién adecuada para el crecimiento de un microrganismo, pero la propia actividad metabélica de este resulta en un cambio de pH hasta que su crecimiento se detiene. Segin la composicién del medio se acumulan Acidos o bases a niveles t6xicos o inhibidores de creci- miento. Distintos medios difieren en su capacidad de resistir estos cambios. Esta propiedad se denomina capacidad tampén o “buffer”. La capacidad tampén de un medio que contiene peptonas es conside- rable, pero es baja en medios en los cuales predominan los carbohi- dratos. Cuando un medio tiene poca capacidad tampén ésta se puede aumentar agregandole sales de dcidos y bases débiles (soluciones tampon).40 Métodos de Investigacién Fitopatolégica Soluciones tamp6n El tampén de fosfato es uno de los mds usados para dar mayor capacidad tampon a los medios. En el 4mbito més Gtil (pH 6, 4 a 7,2), no es toxico (a concentraciones moderadas) a los microorganis- mos, y es una fuente de fésforo, el que es un elemento nutritivo esencial. El tampon de fosfato consiste de mezclas de fosfatos dibdsicos y monobisicos, como por ejemplo, los de potasio o los de sodio. Si a una soluci6n de partes iguales de K, HPO, y KH, PO, (de pH 6,8) se agrega una cantidad pequefia de. un Acido fuerte, parte de la sal bdsica se convierte en dcida débil: K, HPO, + HC1Im> K H, PO, * KC Si en cambio se agrega un hidrdxido fuerte, ocurre lo inverso. KH, PO, + KOH————> K, HPO, * H, O La solucién tiene una capacidad tamp6n que le da resistencia a factores que tienden a cambiar su reaccién, y en un medio esto asegura un cierto grado de estabilidad. Cuando un cultivo produce mucha acidez, se puede agregar una reserva alcalina en la forma de carbonato de calcio. CO, + H'—> HCO, + Ht'—>H,CO,—>CO0,+H, 0 Existen muchas soluciones tampén ttiles para el ambito acido o neutro. No hay ninguna adecuada para el crecimiento de microorga- nismos a pH mayor de 7,2. Para mantener el pH fuera del 4mbito mds adecuado de una solv- cién tampon es necesario agregar asépticamente la cantidad apropia- da de Acidos o hidréxidos fuertes durante el crecimiento del microor- ganismo. La siguiente informacion sobre la preparacién de soluciones tam- p6n de distinta reaccién fue tomada de Gomori (1955): Tampén de citrato Soluciones madre: A) 0,1M 4cido citrico (21,01 g en 1000 cc) B) 0,1M citrato de sodio (29,41 g CsHsO, Na. 2H,O0en 1000 ce, Las siguientes cantidades de x cc de A + y cc de B diluidos a 100 cc dan los pH indicados:Medios de cultivo 41 x y= pl xt Y= pH 46,5 3,5 3,0 23,0 27,0 4,8 43,7 6,3 3,2 20,5 29,5 5,0 40,0 10,0 3,4 18,0 32,0 5,2 37,0 13,0 3,6 16,0 34,0 5,4 35,0 15,0 3,8 13,7 36,3 5,6 33,0 17,0 4,0 11,8 38,2 5,8 31,5 18,5 4,2 9,5 41,5 6,0 28,0 22,0 44 7,2 42,8 6,2 25,5 24,5 4,6 Tampén de fosfato Soluciones madre: A) 0,2M fosfato de sodio monobAsico (27,8 g en 1000 cc). B) 0,2M fosfato de sodio dibasico (53,65 g de Na, HPO,. 7H,O 6 71,7 g de Na, HPO,. 12H,0 en 1000 cc). Las siguientes cantidades de x cc de A + y cc de B dan los pH indicados: x + y = pH x + y = pH 93,5 6,5 5,7 45,0 55,0 69 92,0 8,0 5,8 39,0 61,0 7,0 90,0 10,0 5,9 33,0 67,0 7,1 87,7 12,3 6,0 28,0 72,0 7,2 85,0 15,0 6,1 23,0 71,0 7,3 81,5 18,5 6,2 19,0 81,0 14 77,5 22,5 6,3 16,0 84,0 1,5 73,5 26,5 6,4 13,0 87,0 1,6 68,5 31,5 6,5 10,5 90,5 ad 62,5 37,5 6,6 8,5 91,5 7,8 56,5 43,5 6,7 7,0 93,0 19 51,0 49,0 6,8 5,3 94,7 8,0 Hacia los extremos del Ambito de cada combinacién de x e y se reduce la capacidad de resistir el cambio de pH para los hidr6xidos a los pH mis elevados y para los dcidos a los pH mas bajos. La efectivi- dad dependera del efecto que tenga el microorganismo sobre el me- dio en el cual se incorpora la solucién tampén: si libera dcidos o bases. MEDICION DEL pH Las soluciones tampén tienden a mantener un pH dado pero una vez incorporado éste a un medio, o si el medio ya tiene por su42 Métodos de Investigacion Fitopatologica naturaleza una gran capacidad tampon, el establecimiento del pH deseado se debe medir y titular el medio para conseguir el cambio requerido. Método colorimétrico La determinacién del pH por medios colorimétricos depende de las propiedades de algunos tintes indicadores (Acidos 0 bases débiles) que cambian de color al pasar a través de un ambito limitado de la escala de pH, al cual estén disociados en un 50%. En ese ambito limitado cada tono corresponde a un pH exacto. Usando colores estandar para valores dados de pH, se determina la reaccién de una solucién. Una desventaja de este método es que algunos medios son turbios o tienen coloracién propia. Existen indicadores con los cuales se puede cubrir el Ambito de reaccién desde ligeramente superior a pH | hasta por encima de pH 10. En este principio esté basado el uso de papeles indicadores que generalmente se adquiererr en forma de cintas enrolladas en envases dispensadores, cuyo rétulo indica el 4mbito de pH que abarca con una escala de colores. Se moja un trozo de este papel indicador en la solucién de pH desconocido y se compara el color al cual cambia, con la escala indicadora. La marca de papeles indicadores “Hydrion” (Micro Essential Labo- ratory, Brooklyn N.Y. E.U.A. 00010) ofrece el papel VIVID 3-9 que cubre ese ambito indicado de pH. Para ambitos cortos ofrece papeles de las siguientes especificaciones de 4mbito de pH: 0,0-1,5; 0,0-3,0; 1,0-2,5; 1,2-2,4; 1,4-2,8; 3,0-5,5; 3,4-4,8; 4,5-7,5; 4,8-6,7; 5,2-6,6; 5,6-6,8; 6,0-8,0; 6,8-8,4; 7,2-8,8; 8,0-9,5; 8,2-9,8; 9,0-10,0; 9,0-12,0; 9,2-10,6; 10,0-12,0; 10,2-12,0; 11,8-13,4; 12,5-14,0. Utilizando el papel de 4mbito 3-9 para aproximar el pH, y luego papeles de ambito corto, se puede precisar con exactitud el pH de una solucién. La precisién de los papeles indicadores aumenta con la mayor capacidad tampén de las soluciones. Conviene tener a mano papeles de los siguientes ambitos: 0,0-3,0; 3,0-5,5; 5,6-6,8; 6,8-8,4; 8,2-9,8; 3,0-9,0 (este Ultimo para una aproximacion inicial). Los investigadores que hacen mediciones con poca frecuencia, pre- fieren usar papeles indicadores que cuidar y mantener un potencié- metro en buenas condiciones. Método potenciométrico La determinacién de pH se hace con precisién usando un medidor de pH potenciométrico. Este aparato trabaja basicamente como una cuba electrolitica o bateria eléctrica. Puesto que el potencial eléctri- co que produce es debil, éste debe aumentarse por medio de un amplificador electrénico.Medios de cultivo 43 La medicién del potencial eléctrico de una solucién problema se determina por medio de dos electrodos que se instalan juntos en un soporte que se desliza por la barra vertical de una retorta que facilita la introduccion de las partes inferiores de los electrodos a las solucio- nes, El electrodo positivo o cdtodo de la “bateria” es el electrodo de vidrio 0 electrodo de pH y consiste en una membrana de vidrio especial que contiene una solucién de pH y potencial eléctrico fijo, a través de la cual se desarrollan potenciales eléctricos proporcionales al PH de la solucién exterior en la cual se le ubica. Este potencial ooo es de 59,16 MV por cada unidad de pH a temperatura de El electrodo negativo o electrodo de referencia es poroso en su extremo inferior y a través de él se produce la conexi6n eléctrica por el contacto de dos liquidos: la solucién problema en el exterior, y una solucién saturada de KCI en el interior. Esta solucién rodea el, anodo de calomel (Hg Cl, ). Los electrodos son delicados. Cuando no estén en uso, sus puntas deben permanecer mojadas ya sea en agua destilada o en solucién tampon. Para no dafiar sus extremos se recomienda poner una capa de algodén en el fondo del vaso o “beaker” que contiene el liquido. EI nivel del Ifquido debe mantenerse en observacién periddica. Si el liquido se enturbia, sedeben renovar y limpiar los electrodos como rutina de precaucién. Si se secan los electrodos, deben ponerse en agua por varias horas antes de usarlos. El reservorio del electrodo de referencia debe mantenerse Ileno de una solucién saturada de KCI (deben verse cristales), preferentemente preparada por el fabricante del aparato. La uni6n de fibra en la punta del electrodo de referencia puede acumular materias de las soluciones problema. Se puede limpiar hir- viendo la punta del electrodo en agua destilada 0 dcido nitrico dilui- do. El electrodo de vidrio puede acumular una capa proteica de los medios que contienen estas substancias, que se eliminan limpiéndolo con una solucién fuerte de detergente en agua. El aparato debe calibrarse cada vez que se utiliza, con soluciones tampén de pH conocido. Estas se pueden Preparar, pero es més con- veniente (y no sujeto a error) utilizar las preparaciones de los fabri- cantes de los aparatos. Hay soluciones de distintos pH, y se debe utilizar una de pH similar a la solucién problema. Las mediciones deben hacerse con las soluciones tampon y proble- ma a la misma temperatura. Para los aparatos que tienen compensa- cién para temperatura, éste se debe fijar. A continuacién se da la operacién de un potencidmetro representativo:44 Métodos de Investigacién Fitopatologica Operacién del potenciémetro “Corning Model 7” a. Enchifelo en corriente de 110 v. y coloque la Ilave funcional en alerta (STBY). b. Coloque ambos electrodos con sdélo sus puntas en una solucién tampon (buffer) de pH conocido y cercano al 4mbito de las muestras a medir. c. Determine la temperatura de la solucién tampon y registrela en el compensador manual de temperatura (Temp. °C). d. Coloque la llave funcional en posicién pH. e. Ajuste el control de calibracién hasta que el cuadrante registre el valor pH correspondiente al tampén a esa temperatura. Re- grese la Ilave funcional a STBY. f. Saque los electrodos del tamp6én deslizando el soporte hacia arriba. Enjuague con agua destilada, usando una piseta. Baje los electrodos a la solucién problema (compense por temperatura si es distinta). Observe el pH y registrelo. Regrese a STBY. roe . Repita este proceso de b a g para cada observacién. i. Después de usar, deje los electrodos sumergidos en agua desti- lada o tampén. Desenchufe el aparato. Para mayor informaci6n consulte el manual de instrucciones. Para mayor precisién en el trabajo deben seguirse las siguientes recomendaciones: 1) Cada vez que se pasa de la solucién tampén a una muestra problema, o de vuelta al tampén, enjudguense bien los electro- dos con agua destilada y séquense con un papel absorbente suave para evitar la introduccién de una solucién ajena. 2) Use soluciones tampén frescas. Nunca las regrese al frasco. Man- tenga estas soluciones bien taponadas. 3) Sumerja la totalidad de la porcién bulbosa del electrodo de vidrio en las soluciones a medir. Cuidese de que no toque el vidrio del vaso portamuestras. 4) Mantenga constantes las temperaturas de las soluciones y del agua destilada de enjuague.Medios de cultivo 45 MODIFICACION DEL pH Para modificar el pH de un medio una vez determinado éste, se utilizan soluciones de hidr6xido de sodio (NaOH) 0 acido clorhidrico (HC), el primero para alcalinizar (subir el pH) y el segundo para acidificar (bajar el pH). Se preparan soluciones normales de estos reactivos para aproximar el pH deseado, agregandolas gota a gota; este proceso se denomina titulacién. Para ajustar con exactitud el pH en las Ultimas adiciones se usan soluciones décimo o vigésimo norma- les (precauci6n: las concentraciones 1/20 N pueden ser colonizadas por hongos y deben guardarse bajo refrigeraci6n). Las soluciones normales se preparan en la siguiente forma: f uc — 1N de Na OH: 4,0 g/100 cc de agua destilada; Oo 1N de H Cl: 3, 65 g 0 8,6 cc de HCl concentrado comercial (de 36,5a 38%)/100 cc. Como el pH de un medio generalmente cambia con la esteriliza- cién, debe tomarse en cuenta el pH de la preparacién esterilizada. La modificacién del pH una vez esterilizado un medio presenta proble- mas de asepsia, por lo que generalmente se procede en una de las dos formas siguientes: a. Determine a qué pH debe estar un medio antes de esterilizarlo para que después de esterilizarlo tenga la reaccién deseada. b. Determine la cantidad de agente regulador del pH que debe agregarse después de la esterilizacion de un medio para que tenga la reaccién deseada y agregue éste asépticamente. Para trabajos en los cuales la exactitud no es importante, como para el aislamiento de hongos de material enfermo usando APSA, se acostumbra acidificar con Acido lactico (CH3 CHOH-COOH) agregan- do 50 gotas de Acido lactico 50%, por cada 1000 cc de medio. No se utiliza concentrado por lo corrosivo que es a la perilla de los goteros. El acido debe agregarse después de esterilizar y enfriar ligeramente, porque la acidez que resulta (pH aproximadamente 4,5) combinado con el calor de la esterilizacion causa hidrélisis del agar, y este ya no se solidifica bien.46 Métodos de Investigacion Fitopatologica BIBLIOGRAFIA AINSWORTH y BISBY’s DICTIONARY OF THE FUNGI. 2nd ed. Kew, Surrey, Commonwealth Mycological Institute, 1961. pp. 241-243 “Methods”. ALTMAN, J. Phytopathological Techniques. Laboratory Manual. Boulder, Colo- rado, Pruett Press, 1966. pp. 2-6. BROCK, T.D., ed. Milestones in Microbiology. Englewood Cliffs, N.J. Prentice Hall, 1965, 273 p. ECHANDI, E. Manual de laboratorio para fitopatologia general. Instituto In- teramericano de Ciencias Agricolas de la OEA, Serie de Textos y Materiales de Ensefianza no. 17. 1967. pp. 44-45. GOMORI, G. Preparation of buffers for use in enzyme studies. In Calowick, S.P. y Kaplan. N. O. eds. Methods of Enzymology. New York, Academic Press, 1955. pp. 138-146 (v. 1). LEVINE, M. y SCHOENLEIN, H. W. A compilation of culture media for the cultivation of microrganisms. Baltimore, Williams and Wilkings, 1930. 969 p. eres ad » y_ RIKER, RS. Introduction to research on plant diseases. St. is, Mo., John S. Swift, 1936. pp. 26-35. SALLE AJ. Fundamental principles of bacteriology. Sth ed. New York, McGraw Hill, 1961. 812 p. SOCIETY OF AMERICAN BACTERIOLOGISTS. Committee on Bacteriological Techniques. Manual of Microbiological Methods. New York, McGraw 1957. pp. 37-63. SOURCEBOOK COMMITTEE OF THE AMERICAN PHYTOPATHOLOGICAL SOCIETY. Sourcebook of Laboratory Exercises in Plant Pathology. San Fran- cisco, Londres. Freeman, 1967. pp. 366-371. STANIER, R.Y., et al. The microbial world. 2nd ed. Englewood Cliffs, N.J., Prentice Hall, 1963. 753 p. TUITE, J. Plant pathological methods; fungi and bacteria. Minneapolis, Burgess Publishing, 1969. pp. 12-80. WALKER, J.C. Plant Pathology. 2nd ed. New York, McGraw-Hill, 1957. 707 p.CAPITULO 4 MEDICION DEL CRECIMIENTO DE MICROORGANISMOS PROPOSITO La medicién del crecimiento de microorganismos es de interés al investigador para comparar el efecto de los varios factores ambienta- les que influyen sobre éste. Las técnicas de medici6n son utilizadas principalmente por los que estudian la fisiologia de los microorga- nismos. El estudio del crecimiento de patégenos directamente en el hospedante es muy complejo y es el campo de accién de los que estudian la fisiologia de la interaccién hospedante-parasito. De inte- rés para el fitopatélogo generalista o practico es hacer comparativos de crecimiento variando los factores que puedan ser de consideracién en el control de un patégeno. Por ejemplo, se estudia el efecto de los productos quimicos o de la temperatura sobre el crecimiento propor- cional de un patédgeno, variando sdlo la dosis de ese factor. Todo estudio de un factor que se varia para determinar su efecto debe interpretarse con cautela, buscando correlacién con observaciones de lo que sucede en la naturaleza; esto se debe a que el patogeno es uno de dos organismos que interaccionan y el hospedante puede hacer variar considerablemente el efecto de un factor ambiental sobre el organismo que lo parasita. Aqui se consideran los microorganismos cultivables entre las bacte- rias y los hongos. Las bacterias, por multiplicarse por fisién celular, presentan ciertas caracteristicas de crecimiento en cultivo que ocu- tren en forma general en todas las especies. Los hongos en cambio, son morfolégicamente muy diversos y abarcan desde organismos uni- celulares como las levaduras cuya multiplicacién por gemacién (“budding”) les da caracteristicas similares a las de las bacterias, hasta los hongos filamentosos cuyas hifas se pueden agrupar para formar estructuras complejas. Se complica algo més la figura cuando se considera que hay levaduras que bajo algunas condiciones presen- tan crecimiento filamentoso, y hay hongos normalmente filamen- tosos que pueden crecer como las levaduras (blastosporas del Fu- sarium en cultivo liquido agitado). Los actinomecetos pueden tener ambas caracteristicas: unicelulares y filamentosas.48 Métodos de Investigacién Fitopatolégica DEFINICION DE CRECIMIENTO El crecimiento (lat. crescere = hacerse mayor, aumentar) de micro- organismos es el incremento en masa celular y/o namero de células. Por lo general ambas formas de incremento ocurren simultaénea- mente. Este incremento puede representar el aumento en las cantida- des de protoplasma, inclusiones, o materia extracelular. Aunque nor- malmente se considera que el crecimiento es positivo por naturaleza (i.e. el anabolismo excede el catabolismo) es posible que sea negativo cuando la mortalidad de individuos en un cultivo es mayor que los que se forman; o la autdlisis de la parte vieja de una colonia es mds raépida que el desarrollo de la porcién joven. El crecimiento de las bacterias, levaduras y blastosporas de hongos cuando se inoculan en un medio liquido adecuado y bajo condiciones apropiadas, sigue un curso definido el cual esta representado en la curva tipica de desarrollo para organismos de multiplicacién por divi- sién binaria (Fig. 6). La primera fase (A-B) es de adaptacion, y su duracién depende del vigor del indéculo y de su procedencia. Si el indéculo proviene de un medio idéntico durante la fase logaritmica de crecimiento, puede que la fase de adaptacién no ocurra; pero si las condiciones son distintas o adversas, puede haber una disminucién del ndmero viable de propégulos. Después del periodo de adaptacién comienza la multiplicacién de los propaégulos, con la formacién de Pprotoplasma nuevo, Durante esta fase de aceleracién de crecimiento (B-C) el tiempo por generacién decrece progresivamente, hasta alcan- zar un ritmo constante de progresién geométrica o logaritmica,. la fase C-D. Eventualmente el consumo de nutrimentos disminuye su concentracién y se acumulan substancias metabdlicas txicas, facto- res que resultan en un incremento progresivo del tiempo por genera- cién, que se denomina fase de desaceleracién del crecimiento (D-E). La siguiente es la de estancamiento o maxima estacionaria (E-F) siendo este el estado del cultivo en el cual el nimero de propdgulos esté al méximo, y se mantiene asi al estar equilibrado el namero de muertes por el crecimiento de nuevas células. Eventualmente el na- mero de muertes o autélisis va siendo proporcionalmente mayor, dando como resultado la fase de decadencia o autdlisis (F-G). Esta curva de crecimiento esté basada en el namero de células vivas; si se observa el namero total de células, incluyendo las que pierden su Protoplasma, se vera éste ligeramente. mayor en la parte ascendente de la curva y mucho mayor en la parte horizontal, pudiéndose mante- ner a ese nivel mayor durante la fase de decadencia. El crecimiento de los hongos filamentosos es mas dificil de carac- terizar. En medio liquido agitado este puede ser similar al descrito para bacterias, excepto que la fase logaritmica es reemplazada por una fase aproximadamente lineal. Como el crecimiento es una fun- cién de las puntas de hifas y no de cada célula individual, el creci- miento en medio liquido agitado es globoso. En un medio liquidoMedicion del crecimiento de microorganismos 49 LOGARITMO DEL NUMERO DE PROPAGULOS TIEMPO ——»> Fig. 6. Curva tipica de crecimiento para organismos de multiplicacion por divi- sidn binaria: A-B: fase estacionaria o de adaptacion; B-C: fase de aceleraci6n del crecimiento; C—D: fase de incremento en progresién geométrica o logaritmica; D-—E: fase de desaceleracién; E-—F: fase de estancamiento o maxima estacionaria; F-G: fase de decadencia o autélisis. R A D I o DEFINIDO D ec osroo E ‘ c N 4 (Fase de 0 decadencia) N I A TIEMPO ——_ Fig. 6a. Curva de crecimiento de hongos en medio sdlido: tipos indefinido y definido.50 Métodos de Investigacién Fitopatologica estacionario se necesita que el hongo flote o le faltara oxigeno. Crece sobre la superficie con poca extensiédn dentro del medio, y varia considerablemente el crecimiento aéreo. Sobre medio sélido se obser- va el ritmo de avance del hongo, el cual es constante y uniforme para los de crecimiento indefinido o no estancable; cuando este creci- miento no es uniforme y se detiene, se denomina crecimiento defini- do o estancable. El ritmo de crecimiento puede variar cuando los factores ambientales no son propicios. El incremento promedio pue- de ir en descenso cuando la temperatura es mayor que la éptima, o puede aumentar cuando el inéculo original proviene de un cultivo a diferente temperatura. Las curvas de crecimiento en medios solidifi- on a agar, para los tipos definido o indefinido, se presentan en 1g. 6a, El inéculo debe provenir del mismo medio de cultivo bajo las mismas condiciones ambientales, para que no se presente una fase estacionaria o de adaptacién. Cuando se inocula con esporas, general- mente se presenta esta fase como periodo de incubacién antes de la germinacion. El crecimiento procede con cierta aceleracion hasta lle- gar a establecerse el ritmo de crecimiento intrinsico que es lineal, excepto cuando el crecimiento es en una serie de ondas cominmente acompafiadas de alternancia de micelio vegetativo y propagativo o esporulante. En el caso del tipo de crecimiento definido, se presentan las fases de desaceleracién, estancamiento, y a veces de decadencia. El estancamiento del crecimiento se debe muchas veces a la acumula- cién de metabolitos toxicos. METODOS UNIVERSALES DE MEDICION Ciertos métodos de medicién del crecimiento se adaptan tanto a los microorganismos filamentosos como a los unicelulares, por lo que se les llama universales. Estos incluyen la estimacién visual, el peso seco, el nitrégeno celular y la medici6n lineal. Estimaci6n visual La estimacién visual es subjetiva, pero esta desventaja se compensa en algunos casos. Por ejemplo, cuando se compara el crecimiento de un hongo en varios medios, éste puede avanzar rapido, ralo y superfi- cial en unos, pero lento, denso y profundo dentro del medio, ademas de tener micelio aéreo tupido, en otros. El investigador puede llegar a establecer un sistema de evaluacién preciso si inicialmente correla- ciona una apreciacién visual con observaciones objetivas, como peso seco. Se pueden realizar algo similar con colonias bacterianas o com- parar la turbidez de cultivos liquidos con un patron constante (i.e. una dilucién de leche en polvo).Medicién del crecimiento de microorganismos 51 Peso seco La determinacién de peso seco se considera el método més exacto para medir el crecimiento, pero tiene la desventaja que destruye al organismo y para realizar mediciones periddicas es necesario comen- zar con muchos cultivos. La metodologia usual es cultivar el microor- ganismo en medio liquido, separarlo por filtracién o centrifugaci6n y _ secarlo en un horno a 70-80°C. Generalmente se realizan los cultivos en medios liquidos con agitacién para que laaireacion sea adecuada. Los cultivos sin agitacién o estacionarios de hongos aerdbicos tie- nen crecimiento casi exclusivamente superficial. Debido a que mu- chas esporas y fragmentos de hongos utilizados como indéculo se hunden en medios liquidos, es necesario introducirlos con un inerte (afrecho), para que el inéculo flote y su crecimiento sea superficial; también se puede incluir una pequefia cantidad de agar, goma aré- biga, o alcohol polivinilico. El crecimiento de la mayoria de los hongos en medio liquido es anormal, por lo que es preferible cultivarlos en medios sdlidos. Es mejor usar gelatina si se puede mantener baja la temperatura de crecimiento (menos de 24°C) porque este solidificante se elimina facilmente con agua caliente. Cuando se usa agar es necesario fundir- lo en un esterilizador Arnold o autoclave sin presién y luego lavar el micelio con agua a punto de hervir. Aunque este tratamiento elimina ciertas sustancias, los comparativos realizados con el mismo trata- miento son exactos. Nitrégeno celular El nitrégeno es un elemento que se encuentra en proporciones que varian muy poco en los componentes del protoplasma de los micro- organismos. Por lo tanto, la determinaci6n de nitrégeno, por el méto- do micro-Kjeldahl, mide sdélo las células vivas. Es especialmente util para los hongos, puesto que por lo comin las partes viejas de las colonias tienen células huecas, desprovistas de protoplasma. Medicién lineal de colonias Todo microorganismo que crece uniformemente sobre medio s6li- do, se presta a la medici6n lineal, la cual se puede repetir a intervalos para establecer el ritmo de crecimiento. Hongos, levaduras y bacterias para este propésito pueden observarse en placas Petri, pero para los hongos filamentosos hay dos sistemas mds que presentan ventajas: los tubos de crecimiento proporcional y los tubos con dique.52 Métodos de Investigacién Fitopatolégica Colonias bacterianas . Las bacterias, por su rapida multiplicacién (fisibn hasta cada 20 minutos) sobre medio sdlido, pronto llegan a su fase estacionaria, por lo que deben realizarse las observaciones durante la fase _logaritmica. Las inoculaciones de las colonias se deben hacer a una dilucién cons- tante, que puede ser la que contenga un propagulo en el volumen aplicado, o sea, que den origen a una colonia en aproximadamente un 50% de los casos, o a un nimero mayor constante, segin el propésito del estudio. En el primero de estos casos, se requiere inoculaciones con volumen preciso; en el segundo, se pueden realizar muchas trans- ferencias rapidamente con un ansa de aro, pudiéndose inocular una placa en varios lugares. Para efectuar las mediciones con precision se debe usar un microscopio estereoscopico, con micrometro ocular pre- viamente calibrado. Colonias fungosas Los hongos crecen sdlo por la parte terminal de las hifas, y el micelio posterior envejece y muere. Las hifas terminales se ramifican segin las condiciones ambientales, especialmente las nutritivas. Lo que se mide es el avance del micelio. Es importante en toda determi- nacién de este avance, que se establezca el crecimiento intrinsico del hongo antes de marcar el comienzo de la extensién a medir; para esto se recomienda inocular la porcién del hongo procedente del borde de avance de una colonia que crece bajo condiciones idénticas a las de prueba: calidad y cantidad de medio, luz, temperatura, recipiente. Es especialmente importante en estudios de nutricién no introducir con el indéculo nutrimentos ajenos al medio en estudio. Si se usan discos de agar, éstos deben provenir de un medio idéntico. El uso de esporas libres de medio es una forma de eliminar este factor. A continuacién se explica el uso de tres tipos de recipientes que se utilizan para tomar mediciones lineales de colonias fungosas. Placas Petri. Para determinar el ritmo de crecimiento de un hongo sobre placas Petri, primero dibuje sobre el envés de la placa una cruz marcando el centro, con lapiz de cera o plumén de tinta indeleble. Identifique cada placa con un n&mero, y marque los cuatro radios con una letra. Inocule el centro del medio en la placa con el hongo que haya crecido bajo las mismas condiciones de estudio (i.e. si se estudia el efecto de cinco temperaturas el inéculo debe provenir de ellas); incube hasta que se observe un avance definitivo del hongo y marque el punto de avance sobre los cuatro radios marcados en la placa; en ese momento se da inicio al estudio de crecimiento. A intervalos apropiados de tiempo, marque y mida el incremento (Fig. 7). Las cifras de incremento le permitirén preparar una curva deMedicién del crecimiento de microorganismos 53 Fig. 7. Fondo de una placa con las marcas realizadas para observaciones de crecimiento: a, b, c y d, son los radios de medicién; A, representa el inéculo; B, el margen de crecimiento al inicio de las observaciones; C, D, E y F, son los miargenes del avance del hongo a intervalos iguales de tiempo. crecimiento. El ritmo promedio de crecimiento se calcula dividiendo el incremento total por el tiempo. Cada radio representa una observa- cién y se recomienda realizar unas 20 observaciones por condici6n en estudio (5 placas). Tubos de crecimiento. Los tubos de crecimiento proporcional “growth rate tubes”, (Ryan et al., 1943), se fabrican en tubos de Pyrex de 13 mm de didmetro interno y 40 cm de largo. Los 5 cm finales en ambos extremos se doblan hacia arriba a un angulo de 45 grados. Se llenan hasta la mitad con medio nutritivo y se taponan ambos extremos con algodén, para que exista una aireacién superior a la que ocurre en los tubos con dique de una sola abertura. El crecimiento se canaliza en una franja estrecha de medio, de unos 30 cm de largo, condicién muy superior al uso de placas o tubos dique, para estudios de crecimiento lineal.54 Métodos de Investigacién Fitopatolégica Tubos con dique. Los tubos con dique “dam tubes” (Scheffer, 1935) son tubos de prueba de 25 mm (1 pulgada) de didmetro, cerca de cuya abertura el vidrio est4 hundido transversalmente formando una elevacién o dique en el interior. Este dique permite la solidifica- cién del medio con el tubo en posicién horizontal y la formacién de una franja de profundidad y forma uniforme. Se inoculan al fondo del tubo. METODOS PARA ORGANISMOS DE DIVISION BINARIA Contaje directo El contaje directo se realiza tomando alicuotas de un medio liqui- do en agitacién en el cual se hace la multiplicacién del organismo en estudio. Se calcula el nimero de propagulos por mililitro, realizando el conteo al microscopio en camaras de contaje especiales segin el tamafio del organismo (véase la seccién uniformizacién de inéculo, enel Capitulo 11). Para contar sdlo células vivas es necesario distin- guirlas por tincién con un tinte vital. w Contaje por dilucién Se prepara una serie de dilucién con una alicuota de 1 cc del medio en el cual crece el organismo en agitacién. El método mas apropiado es la serie de dilucién con distribucién superficial que se presenta en el Capitulo 10. Cada tubo de 9 cc en la serie representa un factor de 107' y la transferencia final de 0,1 cc a las placas para su distribucién superficial agrega otro factor igual. Volumen El volumen de células que resulta de la multiplicacién en un tiem- po dado se observa después de centrifugar un volumen exacto en tubos de centrifugaci6n calibrados. Densidad éptica El grado de interrupcién o desviacién de haces luminosos por las células de microorganismos esta relacionado directamente con la con- centracién de éstos (la precisién es mayor cuanto mas esféricas sean). El aparato mds recomendable para estas observaciones es el colorime- tro-espectrofotémetro, cuyo uso se describe en la seccién “‘cantidad de inédculo” del Capitulo 11. Con el organismo en estudio se debe establecer una curva del ndmero de células 0 peso seco en relaci6n a la densidad dptica, para luego depender sdlo de las observaciones de densidad dptica.Medicién del crecimiento de microorganismos 5S VALOR RELATIVO DE LOS METODOS DE MEDICION El método de medicién del crecimiento proporcional a emplearse depende del propésito del investigador, y de las facilidades con que cuente. No hay reglas fijas sobre el mérito de uno u otro método ya que todos presentan ventajas y desventajas. Sin embargo, el peso seco es el mejor método para evaluar el crecimiento mientras un cultivo 0 colonia sea “joven”, es decir, mientras haya pocas células muertas. La determinaci6n de nitrégeno es una respuesta directa de las células vivas (con protoplasma). Para estudiar el efecto de la temperatura para los hongos filamentosos, los métodos de medicién lineal son buenos. Para los microorganismos de multiplicacién binaria el contaje es un buen método, pero muy lento, por lo que es més practico el uso de la densidad éptica o volumen, relacionado a contaje o peso seco. Como norma general, se da el valor relativo de los métodos considerados aqui en el Cuadro 3. Para otros métodos no considera- dos: medicién del consumo de un metabolito, acumulacién de un producto metabdélico, conteos proporcionales, debe consultarse la bi- bliografia. CUADRO No. 3. Valor relativo, en orden descendente, de los méto- dos usuales de medicién de crecimiento relativo de microorganismos segtin sea para hongos filamentosos o microorganismos de multiplica- cién binaria. HONGOS MICROORGANISMOS DE FILAMENTOSOS MULTIPLICACION BINARIA Peso seco Peso seco Nitrégeno celular Nitrégeno celular - Contaje a. dilucién - b. directo - Densidad dptica - Volumen Medici6n lineal Medici6n lineal a. placas Petri a. placas Petri b. tubos de crecimiento c. tubos dique - Estimacién visual Estimaci6n visual56 Métodos de Investigacién Fitopatologica BIBLIOGRAFIA COCHRANE, V.W, Physiology of fungi. New York, Wiley, 1958. 524 p. HAWKER, L.E. Physiology of fungi. London, University of London Press, 1950. 360 p. LILLY, V. G., y BARNETT, H.L. Physiology of the fungi. New York, McGraw Hill, 1951. 464 p. MANDELS, GR. Kinetics of fungal growth. In: Ainsworth, G.C., y Sussman, AS. The fungi; an advanced treatise. New York, Academic Press, 1965. pp. 599-612 (v.1). RYAN, F.J., et al. The tube method of measuring the growthrate of Neuros- pora. Am. J. Botany 30:784-799. 1943. SCHEFFER, T.C. A tube for culturing fungi. Science 82:467-468. 1935. WILSON, G.S. y MILES, A.A. Topley and Wilson’s principles of bacteriology an immunity. Baltimore, Williams and Wilkins, 1964. 1191 p. (V.1).CAPITULO 5 EL MICROSCOPIO EVOLUCION DEL MICROSCOPIO El desarrollo del microscopio fue posible gracias al descubrimiento de las propiedades de los lentes (del latin Jenticula — lenteja, por la forma doblemente convexa de los primeros lentes que usaron los romanos). El lente mds antiguo que se conoce, un plano convexo de roca cristalina, se encontré al excavar las ruinas de Ninive, capital de la antigua Asiria sobre el rio Tigris; se calcula su origen en més de 700 afios A.C. En el afio 65, el fildsofo romano Séneca anoté que una vasija esférica llena de agua ayuda a ver las cosas pequefias que cominmente escapan a la visién. Plinio el viejo, antes de morir a causa de su curiosidad cientifica durante la erupci6n del Vesubio en el afio 79, experimenté con las propiedades inflamantes de “‘lenticu- las” de vidrio. Después de muchos siglos de uso de las lupas se descubrié el teles- copio. Nicolas Copémico (1473-1543) fabricé un telescopio con el cual hizo las observaciones que lo llevaron en 1542 a la conclusién de que el sol es el centro del universo, y que existen otros universos. En pocos afios el telescopio sirvid de idea para la fabricacion de un microscopio compuesto. Esta idea fue original de Zacarias Janssen de Holanda mientras manipulaba un telescopio, viendo que al alargar el tubo, los objetos cercanos se agrandaban. En 1590 Janssen construy6 un microscopio compuesto de lente objetivo y lente ocular. Galileo construyé en 1610 un modelo de distancia regulable montado con un sistema de tornillo sobre tres pequefias patas, semejante a un taburete de piano (Fig. 8). Hasta entonces, los lentes se formaban en el extremo de una varilla de vidrio y se fundian con calor. Campini comenz6 una era de precision en la Optica al desarrollar el arte de pulir lentes, lo cual permitié la reproduccién de la curvatura deseada en los lentes. Segdn la “Royal Microscopical Society” de Inglaterra, se acredita a Robert Hook el descubrimiento del “veridico” microscopio com- puesto. Hook utiliz6 el ocular de doble lente del telescopio‘construi- do por el matemiatico-fisico holandés Christian Huyghens, conjunta-58 Métodos de Investigacién Fitopatologica Fig. 8. Dos de los primeros microscopios: arriba, el disefiado por Galileo en 1610; abajo, el de Van Leeuwenhoeck, medio siglo después (basado en: Mufioz y Charipper, 1943). mente con un lente de su microscopio simple. Con este microscopio describié el detalle microsc6épico de organismos (células de corcho, teliosporas de hongo) en un libro publicado en 1665. Cabe notar que Hook no reconocié las estructuras fungosas como de origen indepen- diente de] hospedante; recién en el periodo 1837-1854 Corda publicé en Praga los resultados de estudios de hongos con el microscopio compuesto (“‘Jcones fungorum hucusque cognitorum”). En la década siguiente a la publicacién de Hook, un servidor pabli- co holandés, Anthon Van Leeuwenhoek, comenzo a fabricar micros- copios como pasatiempo y aficién. Estos eran simples, con un lente de unos 3 mm de didmetro montado en una plancha sobre la cual un mecanismo de doble tornillo, terminado en una punta, facilitaba el acercamiento de objetos (Fig. 8). El lente era muy curvo lo cual daba un gran aumento y gracias a su inigualable y secreta habilidad como pulidor de lentes, tenia gran capacidad resolutiva. De los 550 micros- copios que construyé hasta su muerte en 1723, se conocen nueve. En el Museo de Utrecht hay uno cuya capacidad de aumento es 275x y poder de resolucién original 1 micra (con el uso ha disminuido a 1,4 micras). Un paso atras, de compuesto a simple, fue més que compen-El microscopio 59 sado por el arte del pulidor de lentes. Leeuwenhoek describié proto- zoarios (1674), bacterias (1676), espermas (1677), y nicleos de glébulos de sangre de pescado (1682); sus microscopios sirvieron para muchas otras observaciones y para despertar el interés cientifico por lo microscépico. Asi, por ejemplo, Needham en 1743, describid al nematodo Vibrio tritici (Anguina tritici). Stephen Gray puso al alcan- ce de todos un microscopio de su invencién: una gota de agua suspen- dida en un aro dio resultados sorprendentes. La inmersi6én del objetivo en agua fue innovacién de Amici en 1840. El uso de aceite de inmersién 4 afios después por John Dollard, permitio aumentos de mil didmetros (1000x); Dollard fabricé un objetivo de lente acromatico utilizando dos tipos de cristal: duro y blando. En 1846 Carl Zeiss fundé una empresa en Jena que se dedicd principalmente a la fabricacién de microscopios durante sus Primeros 50 afios. Otro gran empresario aleman fue Emst Leitz quién compro la fabrica éptica Kellner en 1856. Al afio siguiente, Leitz se asocid con un profesor de la Universidad de Jena, Ernst Abbe, quien disefid un “‘condensador” que concentraba los rayos de luz sobre el objeto, permitiendo asi la construccién de objetivos de mayor aumento, puesto que el factor limitante era la falta de iluminacion. En 1870 se comenzo la fabricacién de los primeros microscopios para investiga- cién biolégica. Abbe publicé la teoria de la formacién de imagenes en 1875, lo cual dio una base cientifica al arte dptico. En 1878 introdujo el sistema de inmersién homogénea con aceite, y en 1886 el objetivo apocromatico. Existia ya una base sdlida para la microsco- pia. MICROSCOPIO COMPUESTO Los microscopios anteriormente descritos, utilizaban la luz natural o de espectro visible; con el advenimiento del condensador, se incre- menté la intensidad de la luz utilizada. Ya que el microscopio com- puesto de campo claro es el tipo de microscopio de investigacién y ensefianza més usado, y el precursor de todos los demas, se trata primero y en mas detalle. Los componentes de un microscopio compuesto son de dos tipos, mecinicos y 6pticos. Los mecanicos se presentan en un prototipo moderno de microscopio de investigacién trinocular (binocular para la vision humana, tercer ocular para microfotografia) con iluminador incorporado en la base (Fig. 9). La Fig. 10 muestra la 6ptica para un microscopio monocular. El factor limitante de la 6ptica de un microscopio es el poder de resolucién del objetivo, cuya fabricacién requiere el mayor esmero. El poder de resoluci6n de un microscopio se define como la distancia minima entre dos puntos que el sistema dptico es capaz de represen- tar claramente. Este depende de la capacidad del lente frontal del60 Métodos de Investigacion Fitopatologica PLATINA CON MOVIE? ‘en CRUZ BOTONES OE ENFOOUL edo, micrombrien OTONES COAXIALES PARA DESPLAZAMIENTO DE PLATINA LEVA DE FILTRO GRIS ABATIBLE Fig. 9. Microscopio compuesto trinocular. objetivo para recibir la luz, o sea, del mayor dngulo de incidencia posible de la luz que emerge de la preparaciOn y penetra al objetivo. Como la luz al pasar entre los componentes dpticos de cristal de indice de refraccién (n) de 1,52, atraviesa aire de n = 1,0 entre el cubreobjeto de una preparaci6n y el lente frontal del objetivo, este Angulo se reduce bastante (Fig. 11). El aire pone un limite a las caracteristicas que se le pueden dar a un objetivo en cuanto al 4ngulo de incidencia de luz. La mitad de este Angulo (1), es el valor usado en la formula para calcular el valor numérico de esta capacidad de reci- bir la luz, la cual se conoce como apertura numérica (A.N.). Cuando n es el valor del indice de refraccién del medio entre el cubreobjeto y el lente frontal del objetivo: AN. = n(sen p)El microscopio 61 ovo imagen retinal pupila lente ocular OCULAR 7 \ lente de campo / \ \ / \ / \ / \ Distancia de 7 \ Proyeccién 250mm ‘ y \ \ i \ / \ / \ \ / : \ / ‘ / \ / OBJETIVO \ / (3 lentes ) ‘ / \ / PREPARACION . / \ / CONDENSAOOR \ / DE FOco sstérico . a VARIABLE dat ire IMAGEN VIRTUAL rayos: e luz Fig. 10. Optica de un microscopio compuesto monocular de campo claro.62 Métodos de Investigacién Fitopatologica VIDRIO n= 1,52 OBJETIVO 2 AIRE n= 1,00 CUBREOBJETO. PorTaoBJeT0 3/7 RAYOS DE LUZ Fig. 11. Refraccién de ondas de luz afectando el dngulo de incidencia de rayos de luz al objetivo. Los sistemas secos, o sean aquellos en los que el aire interrumpe la homogeneidad refractando los rayos de luz, permiten una A.N. maxi- ma tedrica de 1,00; sin embargo, en la practica no pueden ser mayo- res de 0,95. Desplazando el aire por un medio de n igual al cristal, como aceite de cedro u otros aceites sintéticos, se tiene un sistema de inmersién homogéneo, es decir, que n del lente frontal y n del fluido de inmersién son iguales, el cual permite utilizar objetivos de A.N. de hasta 1,4; una A.N. de 1,3 es considerada muy buena. El poder de resolucién, cuando d es la distancia minima de resolu- cién, se determina utilizando el valor A.N. y la longitud de onda (que para estos propdésitos se puede considerar como una constante), se- gan la formula: d = longitud de onda 2(AN.) Para aprovechar todo el poder de resolucién de un objetivo los demds componentes de un microscopio deben ser adecuados. Es im- portante que los oculares compensen cualquier aberracién Optica o cromética que no se pudo compensar en el objetivo mismo. El con- densador debe estar enfocado de acuerdo a la A.N. del objetivo, y el diafragma iris del condensador debe tener una apertura que permita que la incidencia de rayos de luz abarque el angulo requerido (para el sistema de inmersién se pone una gota de aceite entre el condensador y el portaobjeto). Se consigue iluminacién adecuada por el sistema de iluminacién critica, pero para mayor precisién se debe emplear laEl microscopio 63 iluminaci6n Koehler. La iluminacién critica emplea un filamento in- candescente cuyos rayos se dirigen en haces paralelos, reflejados por el espejo, hacia la preparacién, resultando una iluminaci6n dispareja. El uso de un filtro de vidrio deslustrado (esmerilado) es esencial para reducir esta deficiencia. La iluminacién Koehler emplea rayos conver- gentes que se enfocan en el plano del diafragma del condensador. Este método de iluminaci6én requiere varios pasos para su funciona- miento que se dan a continuaci6n, después de tratar algunas generali- dades. Reglas para el uso del microscopio a. Mantenga limpios el espejo y los lentes del microscopio: 1) elimine el polvo por medio de un soplete de aire o pincel fino; 2)frote sin presionar con papel de lente, usando éste una sola vez. b. Ubique y enfoque la preparaci6n en la platina a bajo aumento; pase a mayor aumento. No use el objetivo de inmersi6n excepto con preparaciones y cubreobjeto delgados, o preparaciones fija- das sobre el portaobjetos (sin cubreobjeto). 2 . Siempre vuelva el objetivo de menor aumento a posicién de trabajo, antes de cambiar de preparaci6n o guardar el microcos- Pio. d. Limpie el lente frontal del objetivo de inmersién con papel de lente inmediatamente después de usarlo; quite el grueso del acei- te con una hoja; luego limpielo con una segunda hoja ligeramen- te mojada en xilol o bencina y por filtimo séquelo con una tercera hoja. No use cantidades excesivas de solvente porque puede disolver el cemento de los componentes de los lentes. Nunca debe usarse el alcohol, pues dafia las superficies enlacadas del instrumento. ° Use siempre el microscopio segan el principio de iluminaci6én Koehler para aprovechar asi al m4ximo su capacidad resolutiva, y evitar el dafio a la vista del microscopista. Son esenciales una buena lampara para microscopio con diafragma iris, y una bom- billa enfocable de filamento plano y de intensidad regulable, para aprovechar un microscopio a su maximo poder de resolu- cién. Si no se tiene todas las propiedades exigidas para esta iluminaci6én ideal, se deben aplicar los pasos del principio Koehler que el equipo permita. Para microscopios de luz incor- porada u otros sistemas simplificados de iluminaci6n, sdlo se siguen los pasos posibles. Todo cambio de lente, objetivo u ocular, requiere un reajuste de la iluminaci6n Koehler.64 Métodos de Investigacién Fitopatologica f. Mantenga siempre tapado o guardado el microscopio cuando no esté en uso. g. En sitios de excesiva humedad ambiental, guarde el microscopio bajo una campana de vidrio con un desecante como carbonato de calcio, o con un pequefio foco eléctrico que eleve la tempera- tura unos 5-10°C. Un deshumedecedor de ambiente protege to- do el equipo del laboratorio; el aire acondicionado también deshumedece. Direcciones para obtener iluminacién.Koehler a. Ubique la lampara a unos 25 cm del espejo del microscopio y quite todos los filtros de la lampara y del microscopio. b. Cierre el diafragma iris de campo de la lampara y del condensa- dor del microscopio. c. Ajuste la lampara para que enfoque sobre el centro del lado plano del espejo. d. Enfoque la lampara de manera que el filamento esté claramente definido sobre el diafragma del condensador del microscopio, visto a través del espejo, colocando la cabeza cerca de la lam- para. e. Ubique la preparacién sobre la platina y enfoque con el objetivo de bajo aumento (abriendo lo necesario el condensador del mi- croscopio). f. Ajuste el espejo hasta que quede centrado el punto luminoso. g. Desplace el condensador hasta encontrar enfocado el diafragma de campo (diafragma iris de la lampara). h. Reenfoque la lampara para asegurarse de que el centro brillante de un elemento de la lampara coincida con la minima abertura del diafragma del condensador. i. Abra el diafragma de campo hasta que éste desaparezca del campo visual. j. Quite el ocular y mirando a través del tubo del microscopio, abra el diafragma del condensador hasta que el circulo de luz Ilene casi la totalidad del lente superior del objetivo. Devuelva el ocular a su sitio.El microscopio 65 k. Regule la intensidad de luz por medio del transformador regula- ble o con filtros neutros grises. Use cristal deslustrado (vidrio esmerilado) sdlo con pequefios aumentos (objetivos de 10x o menor). 1. Repita los pasos e-j cuando cambie de objetivo u ocular. MEDICIONES AL MICROSCOPIO Para medir objetos que se observan en el campo visual de un microscopio (metrologia microscépica), se utiliza un micrémetro ocular. Este consiste en una placa de cristal con una escala grabada, que se monta sobre el diafragma de campo del ocular de manera que la escala queda enfocada por encontrarse en el plano de la imagen real intermedia. Es conveniente tener un ocular micrométrico con la placa perma- nentemente instalada, en especial si el microscopio es monocular; este reemplaza al ocular usual al hacer mediciones. Para mayor preci- sién se puede utilizar un tipo de ocular micrométrico que tiene una escala exterior adicional que indica centésimos de unidad en un tam- bor o tornillo. Cada vuelta completa del tambor desplaza un trazo perpendicular, un intervalo de la escala grabada que se observa en el interior del ocular. Debido a que los auméntos varian entre un microscopio y otro ain siendo de la misma serie y marca, las escalas de los micrémetros oculares no representan medidas convencionales, sino simples uni- dades. Para determinar la distancia lineal que representa cada unidad o sea el valor micrométrico, se deben hacer calibraciones para cada aumento de un microscopio, utilizando un micrometro de platina Gnicrémetro-objetivo). Los micrometros de platina son similares a una lamina portaobje- tos, y tienen grabadas escalas que representan medidas exactas y convencionales. Cominmente se utiliza un micrémetro de platina cuya escala métrica es de un milimetro (1000 micras), dividida en 10 unidades con 10 subdivisiones de 10 micras cada una (la mds pequefia unidad representada). Determinacién de valores micrométricos a. Coloque el micrémetro en el ocular del microscopio (0 substi- tuya un ocular por el ocular micrométrico). b. Enfoque la escala del micrémetro de platina a través del micros- copio. c Gire el ocular micrométrico hasta que las dos escalas estén para- lelas.66 Métodos de Investigacién Fitopatolégica d. Mueva el micrémetro de platina hasta que el comienzo (extremo izquierdo) de su escala coincida con el de la escala del micréme- tro ocular. e. Ubique la linea del micrémetro ocular mds distante del comien- zo de las escalas que coincide con una linea de la escala del micrémetro de platina, o calcule el.largo en micras, de la distan- cia representada en el micrémetro de platina, que corresponde al largo total del micrémetro ocular, o en caso de contar con tambor micrométrico, desplace el trazo perpendicular hasta que coincida con una linea distante del comienzo de la escala de la platina. Determine las unidades que éstas representan en ambas escalas. ad . Calcule el valor micrométrico (V.M.) en micras: Medida micrometro de platina, en micras VM. = Unidades micrémetro ocular g. Repita el calculo para cada objetivo, usando aceite para el obje- tivo de inmersion. h, Prepare una etiqueta con la informacién adquirida, la cual se adherira al microscopio: eg: Objetivo V.M. (micras) Ss 10x 16,70 ¥ 45x 3,70 8 93x 1,65 Medici6n Para medir objetos en el campo del microscopio, haga coincidir un extremo o divisién mayor de la escala del micrémetro ocular con un extremo del objeto a medir (se gira el ocular para poner la escala paralela al eje a medir). Cuente el ntmero de unidades que represen- ta. Multiplique este valor por el V.M. que corresponda al objetivo usado. La cifra resultante es la longitud en micras. Si se desean hacer mediciones tridimensionales, use el enfocador micrométrico (o tambor de enfoque de precisién) del microscopio, el cual tiene una escala marcada en micras 0 2 micras/unidad (véase las especificaciones del fabricante). Enfoque primero un plano y después otro, que representen los extremos superior e inferior del objeto.El microscopio 67 Para cada enfoque anote la lectura micrométrica; la diferencia repre- senta la dimensién vertical o de profundidad. La precision de estas mediciones no es tan buena como la de las hechas con micrometro ocular, por lo cual algunos fabricantes ofrecen un aditamento espe- cial més preciso, el micrmetro comparador. Cuando la medicién de objetos tales como esporas, es problemé- tica porque se mueven en el liquido de la preparacién, se pueden colocar en una gota de agar a 45°C sobre un portaobjeto calentado a unos 60°C, y se distribuye con otro portaobjeto. Se utiliza un cu- breobjeto con una pequefia cantidad de liquido para que no se for- men globos de aire. CAMPO OSCURO El microscopio de campo oscuro es un microscopio compuesto convencional con un condensador adaptado, o cambiado por otro. También es necesario adaptarle el objetivo de inmersién. El principio de microscopia de campo oscuro se basa en un condensador disefiado para formar un cono de luz anillado, cuyo dpice apenas llega a la preparacién, de manera que ning&n rayo de luz pasa directamente del condensador al objetivo (Fig. 12). Solamente se hacen visibles las Objeto en punto de con- vergencia de rayos de luz Condensador con interrup- tor de rayos directos al ob- jetivo Rayos de luz Fig. 12. Optica de campo oscuro (basado en el Folleto Mi 638s III. 56. Wild Heerbrug, S. A., Suiza).68 Métodos de Investigacién Fitopatolégica imdgenes de difraccién producidas por las superficies delimitadoras de los objetos cuyo indice de refraccién es diferente al del medio en que estén montados. Por lo tanto, los objetos aparecen iluminados sobre un fondo oscuro. Por esta raz6n, las bacterias pequefias, cuyos tamafios se encuentran en el limite del poder de resoluci6n del micros- copio de campo claro, se notan con facilidad por su luminosidad. Para trabajos simples como la determinacién de flujo bacteriano, que se realizan con el objetivo seco de mayor aumento (100x) o para observacién de hongos de poco contraste que no se tifien, es adecua- do adaptar el microscopio de campo claro, ubicando un disco de campo oscuro (diafragma central de campo oscuro) en el portafiltro del condensador. Este debe corresponder a la A.N. del objetivo y a las propiedades Opticas del condensador (no son intercambiables en- tre microscopios). Los trabajos de precision, como acentuar contornos estructurales, requieren el uso de un condensador especial, y es necesario que los objetivos de inmersién de A.N. mayor de 1,0 tengan un diafragma regulable, o se les inserte un dispositivo que reduzca su A.N. Cuando se usa el objetivo de inmersién el condensador de campo oscuro requiere el uso de aceite de inmersién entre el lente superior del condensador y el portaobjeto, el cual debe ser del grosor indicado por el fabricante: El centrado y enfoque del condensador, asi como el alineamiento y la calibracién de todos los componentes de la ilumi- naci6n, se detalla en las instrucciones que acompafian a estos instru- mentos. Algunos fabricantes ofrecen condensadores “universales” para campo claro, campo oscuro, y contraste de fase. CONTRASTE DE FASE La microscopia de contraste de fase es ain superior a la de campo oscuro para acentuar el contraste de las preparaciones. Este proceso éptico, como el anterior, no requiere de tincién o tratamiento alguno que interfiera con el metabolismo de los microorganismos, permite observar con facilidad las inclusiones celulares como nicleos in vivo, El principio de este proceso consiste en retardar la longitud de las ondas de luz que Pasan por el objeto de una preparacién en distintos grados que se aproximan a 1/4 lambda, Una capa modificadora de fase en el objetivo retarda uniformemente en un 1/4 lambda las ondas que no fueron afectadas por la preparacion. Las ondas quedan nuevamente en fase, pero las que pasan el objeto sufren cambios de amplitud de onda que ocasionan diferencias de intensidad de luz que se ven sobre el fondo uniformemente oscuro de las ondas uniforme- mente reducidas. Por un proceso algo mas complejo, el principio de contraste de fase puede dar una imagen positiva que se caracteriza porque la preparacién aparece rodeada por un lado oscuro interno y otro brillante externo.El microscopio 69 El sistema dptico de contraste de fase es més complejo que el de campo oscuro, y requiere un microscopio especial, o uno de campo claro especialmente adaptable. Se requieren objetivos especiales que contengan una placa o lamina de fase de forma anular; un juego de diafragma de condensador, también anulares, de distinto diaémetro para cada objetivo y un ocular telescépico especial para enfocar y alinear los anillos de condensador y objetivo. El medio en el cual se monta la preparacién influye en el contraste y debe escogerse un medio de indice de refraccién distinto al del objeto, e.g. glicerina de n= 1,47 que puede ser superior a balsamo de n= 1,53. OTRAS ADAPTACIONES El microscopio compuesto se ha adaptado para otras formas de iluminacién o formacién de imagenes. El sistema Optico de interfe- rencia de dos ondas es inferior al de fase en resolucién, aunque mejor en contraste para algunos propésitos. Con iluminacién polarizada se pueden observar sustancias © inclusiones celulares cristalinas. La ilu- minaci6n incidente, de dentro del objetivo, permite ver preparaciones iluminadas desde una direccién opuesta a la acostumbrada; es decir, el objeto refleja la luz que se utiliza para formar la imagen. La mé- croscopia de fluorescencia permite ver objetos fluorescentes, sean autofluorescentes o que absorban tintes fluorescentes especificos, los cuales irradian rayos visibles cuando reciben luz de onda ultravioleta. La microscopia infraroja emplea la fotografia para observar objetos altamente pigmentados, dificiles de penetrar y ver con luz visible, como los exoesqueletos quitinosos oscuros de algunos insectos. El Ultimo en mencionarse pero no en importancia, es el microscopio estereoscépico de diseccién, un microscopio compuesto de amplia distancia de trabajo entre el objetivo y la platina, y cuya Optica da una imagen sin inversién como la del microscopio de investigacién; puede tener varios objetivos en un tambor rotativo, o sistema teles- cépico variable Zoom. EL MICROSCOPIO ELECTRONICO La observaci6n de estructuras que requieren resolucién superior a la del microscopio de luz se hace posible con el microscopio electré- nae Su principio consiste en el uso de rayos de electrones en vez de juz. Existen dos tipos. El de transmisién de electrones a través de la preparacién que se usa para observar objetos pequefios enteros como los virus y bacterias o secciones muy delgadas (e.g. tejidos infec- tados). Los especimenes son generalmente sombreados 0 teflidos con un metal pesado, para incrementar el contraste. El microscopio elec- trénico de escandilado se usa para observar estructuras mds gruesas70 Métodos de Investigacion Fitopatologica (hongos, superficies de hojas, insectos, etc.). Se secan y sombrean los especimenes formdndose la imagen de los electrones que se reflejan en la superficie de las estructuras. El microscopio electrénico de transmisién posee varios lentes elec- tromagnéticos cuya funcién en iluminacién y en la formacién de la imagen es similar a las del condensador, el objetivo y el ocular del microscopio de luz. El condensador concentra el flujo de electrones sobre el objeto; el objetivo forma la primera imagen, que a su vez es aumentada por el lente intermediario; y por Ultimo, la unidad ocular est4 representada por uno 0 dos lentes proyectores que forman una imagen real y aumentada de la imagen intermediaria, sobre una pan- talla fluorescente. BIBLIOGRAFIA AMERICAN OPTICAL COMPANY. Series 10 Microstar advanced laboratory microscopes. Buffalo, N.Y., Reference Manual 10-101, 1967. 33p. . Introductions for A.O. Spencer darkfield illuminator. Buffalo, N.Y., Manual B 328-37. s.f. 8 p. EASTMAN KODAK COMPANY. Photography through the microscope, 4th. ed. Rochester, New York. Kodak Publication no. P-2, 1966. MUNOZ, F.J., y CHARIPPER, H.A. The microscope and its use. Brooklyn, New York, Chemical Publishing Co., 1943. 334 p. PARRIS, G.K. A chronology of plant pathology. Starkville, Miss., Johnson and Sons., 1968. 167 p. PURVIS, M.J., COLLIER, D.C. y WALLS, D. Laboratory techniques in botany. Altringocham, G.B., Butterworth & Co. 1966. 439 p. RUTHMANN, A. Methods in cell research. Tthaca, NY., Comell University Press, 1970. 368 p. STEHLI, G. The microscope and how to use it. New York, Sterling Publishing Co., 1960, 160 p. WILD, S.A. Equipos para campo oscuro. Heerbrugg, Suiza, Folleto Mi 638 s. 1956. 11 p. “Contraste de fases. Heerbrugg, Suiza, Folletos Mi 618 s. 1961. 15 p. — ‘La optica microscépica Wild. Heerbrugg, Suiza. Folleto Mi 6b 8 1961. 11 p. Metrologia microsc6pica. Heerbrugg, Suiza, Folleto Mi 625 s. 1962. 8p. La actualidad micrografica. Nuestras informaciones. Heerbrugg, Suiza, ~~ “Microskopion 12, 1967. 20 p.CAPITULO 6 LA FOTOGRAFIA DEFINICIONES La fotografia es el arte o procedimiento que consiste en fijar las imagenes de una camara oscura sobre una placa por medio de un proceso quimico sensible a la accién de la luz. La camara oscura es un aparato que se usa para reproducir los objetos exteriores en el fondo de una caja oscura. Una fotografia es la impresion de una imagen sobre una placa sensible a la accién de la luz, en una camara oscura, Desde el punto de vista de la relacién tamafio de negativo a tama- fio del objeto fotografiado, la fotografia puede ser de reducci6n, de tamafio real cuando la relacién es igual a 1, y de aumento. General- mente se fijan imagenes reducidas con la ayuda de objetivos que se acoplan directamente a la caja de una camara fotografica; dichos objetivos pueden ser gran angulares, normales, y telescépicos. La fotografia de acercamiento que utiliza aditamentos antepuestos o postpuestos a un objetivo, fija imagenes hasta de tamafio real o de 1x de aumento. Por métodos macrofotograficos y con el uso de adita- mentos adicionales, se consiguen aumentos hasta de unos 20x. Se consiguen aumentos ain mayores al fotografiar las imagenes proyec- tadas por el sistema 6ptico de un microscopio, y acoplando la caja de una camara. Este proceso se denomina microfotografia. En inglés se usa el término ‘‘photomicrography”, reservandose “micro- photography” para los procesos de archivo por reducci6n a positivos (“‘microphotographs’’), rollos negativos (“microfilm”) y fichas diapo- sitivas de multiples exposiciones (“microfiche”). Existe ahora el dile- ma de optar por seguir al liderazgo en estos campos, transliterando los términos y esperar a que la Academia Espafiola eventualmente acepte dicho uso cientifico, o el de crear otras palabras como minifo- tograffa (para “microphotography’’). Otra solucién seria reemplazar el término microfotografia por fotografia transmicroscépica, o sim- plemente fotografia a través del microscopio. En este tratado se em- pleara la siguiente terminologia:72 Métodos de Investigacién Fitopatologica Fotografia de reduccién Telesc6pica: fotografia a través de objetivos telescépicos que per- miten fotografiar objetos lejanos como si estuvieran cerca. Gran angular: fotografia a través de objetivos que reducen el angu- lo de incidencia de la imagen, abarcando asi un mayor campo o permitiendo un mayor acercamiento. Normal: fotografia con objetivos normales a través de los cuales incide una imagen semejante a la de la visibn humana a similar dis- tancia. Fotografia de acercamiento: fotografia normal con objetivos de enfoque cercano o con aditamentos que permiten fijar imagenes has- ta de tamafio real (1x). Fotografia de aumento Macrofotografia: fotografia de gran acercamiento que emplea ob- jetivos normales en combinacién con uno o més aditamentos que permite aumentos de 1x hasta alrededor de 20x. Microfotografia: proceso fotografico que fija las imagenes de obje- tos mintsculos captados por una camara acoplada a un microscopio. HISTORIA DE LA FOTOGRAFIA Nicéphore Niepce fue el inventor de la fotografia. En 1822 cul- miné sus investigaciones haciendo una reproduccién heliografica (fo- tograbado) con una especie de asfalto que se endurecia al recibir la luz; este formaba una capa sobre un vidrio que servia como placa en una c4mara oscura. Unos afios mds tarde Niepce reemplazé al vidrio por metal. Louis J.M. Daguerre comenz6 a trabajar en equipo con Niepce en 1829, realizando los descubrimientos que dieron su nombre al proce- so fotografico que se us6 durante tres décadas. El gobierno francés en 1839 dio a conocer este proceso a través de las Academias de Ciencia y Bellas Artes y seguidamente se publicéd un manual de instrucciones. El proceso de hacer un “‘daguerrotipo” consistia en pulir la super- ficie de una plancha de cobre plateado de 16 x 21 cm hasta conseguir un acabado similar al de un espejo. Entonces se colocaba en una caja sobre particulas de yodo que formaba yoduro de plata, que es sensi- tivo a la luz. Esta placa se exponia, en una cémara de cajén que recibia la luz a través de una abertura, en la cual Daguerre monté un lente frontal de telescopio. La imagen latente asi formada se revelaba con vapor de mercurio, el cual formaba una amalgama proporcional a la luz y sombra del tema retratado. Un lavado rapido en tiosulfato de sodio quitaba el yoduro de plata no afectado, y un lavado en agua completaba la operaci6n.