47

РОЗДІЛ 2

ОБ’ЄКТИ, УМОВИ І МЕТОДИ ПРОВЕДЕННЯ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об’єктами дослідження були 12 сортів Camellia japonica з родини Theaceae

D.Don. Вихідний матеріал було отримано у вигляді 3-4-річних укорінених живців
та сіянців в 1972-1973 рр. із Батумського ботанічного саду (Грузія) і в 1986 р. з
Сухумського дендропарку (Грузія) та радгоспу “Южные культури” (Адлєр,
Росія). В дослідженнях використовувались різновікові рослини.
Експериментальна робота виконувалась у оранжереях та лабораторіях
відділу тропічних і субтропічних рослин Національного ботанічного саду
ім. М.М. Гришка НАН України у період з 1998 по 2002 роки у м.Києві.
Київ знаходиться на 57°52’ північної широти; висота над рівнем моря 142
метри; клімат – помірно континентальний; середньорічна температура повітря
+7,2°С; середній мінімум температур – 3,6°С; середній максимум +11,6°С;
середня тривалість безморозного періоду 182 доби; середньорічна кількість опадів
610 мм; відносна вологість повітря 78%; максимальна тривалість дня 17 год. 37
хв.; мінімальна – 6 год. 57 хв. [60].
У процесі виконання роботи були проведені лабораторні і вегетаційні
експерименти, а також дослідження з використанням комп’ютерних систем
одерження, обробки і накопичення інформації.
Рослини вирощувались в умовах пасивного (у оранжереї) і активного (у
кліматичній камері) експерименту при температурному режимі в межах від +6°С
до +35°С в залежності від сезону, і відносній вологості повітря 65-90%. Вологість
ґрунтових субстратів підтримували на рівні 30-75% від повної вологоємкості.
Рослини культивували у оранжереях при світловому режимі з листопада по
січень – 1,6 клк, у лютому-квітні – 2,4-4,0 клк, у травні-серпні – 7,4-7,6 клк, у
вересні-жовтні – 5,0-2,7 клк. З квітня по вересень проводили притінку скляних
покрівель оранжерей на 40-50%.
Камелії вирощувалися у керамічному, пластмасовому та дерев’яному посуді
діаметром від 5 до 40 см, на субстратах такого складу: верховий торф, хвоя сосни
 48

(1:1); верховий торф, хвоя сосни (2:1); верховий торф, хвоя сосни, пісок (2:2:1);
верховий торф, хвоя сосни, пісок, опад ліщини (1:1:1:1).
При догляді за рослинами застосовували загальноприйняті методики [46].
Полив проводили декарбонізованою водопровідною водою. Декарбонізацію
здійснювали шляхом додавання у відстояну воду 20 мл щавлевої кислоти на 1 м³
води, доводячи pH з 7,0-7,3 до 5,5-6,0. Контроль кислотності здійснювали
іонометром ЭВ-74.
Фенологічні спостереження проводили на 150 рослинах з урахуванням
біологічних ритмів C. japonica за класичними методиками – “Методика
фенологических наблюдений в ботанических садах СССР” [79], Г.Ф.Лакіна [71] та
Б.І.Іваненко [52].
Спостереження над модельними рослинами проводились протягом чотирьох
років. В період проростання, інтенсивного росту і цвітіння щоденно, в інший час –
щотижня. Спостереження та аналіз включали такі етапи: облік біометричних
показників, визначення етапів органогенезу, опис та замальовку об’єктів.
Для характеристики морфологічних особливостей C. japonica ми
використовували термінологію представлену у “Атлас по описательной
морфологии высших растений” [2, 3, 119, 120, 121] та роботу Р.Е.Лєвіної [72].
При дослідженні біології розвитку та визначенні етапів органогенезу ми
дотримувалися методики розробленої в лабораторії біології розвитку МДУ ім.
М.В.Ломоносова [69]. Дослідження початкових етапів онтогенезу проводили на
свіжому матеріалі методом спостереження за розвитком бруньок, препарованих
під бінокулярним мікроскопом МБС-9. Аналіз розвитку бруньок здійснювали
кожні 3-5 днів у період інтенсивного росту і 1 раз на два тижні у інший час.
Документальне фіксування проводили шляхом описів, фотографування
(фотоапарат “Зеніт ЕТ”) та замальовок.
Ритм плодоношення досліджували за методикою Лєвіної Р.Е. [73].
Для анатомічних дослідженнь використовували зрілі диференційовані листки
з середнього ярусу рослин, шматочки листкових пластинок з середини листків
площиною 1х2мм на 1мм від краю листкової пластинки, які фіксували 5%
 49

глутаральдегідом на фосфатному буфері, рН 7,2 [102]. Аналіз поверхні листка та

поперечних зрізів здійснювали за допомогою світлооптичного мікроскопу – NY-1
та електронного скануючого мікроскопу РЕММА-102 (SELMI). Термічне
напилення об’єктів здійснювали у вакуумі вуглецем та міддю. Кількісні виміри
проведені з використанням окуляр-мікрометра. Для виготовлення постійних
препаратів застосовували методику З.П.Паушевої [89].
Для визначення насіннєвої продуктивності користувалися методикою М.С.
Зоріной, С.П.Кабанова [51].
Дослідження вегетативного розмноження проводили згідно методичних
рекомендацій Е.В.Білик [10] та Б.С.Єрмакова [43]. Для встановлення оптимальних
термінів живцювання його проводили з лютого по вересень. Для живцювання
використовували верхню і середню частину однорічних пагонів. Живці нарізали
довжиною 8-12 см з двома непошкодженими листками. Живці висаджували у
торфо-піщаний субстрат під кутом 45º, заглиблюючи на ½ їх довжини.
Дослідження проводилося у опалюваних оранжереях при температурі +18-26ºС і
вологості повітря 75-95 %.
Живцювання проводили з використанням стимуляторів ризогенезу різної
природи: ІМК; 2,4-Д; фталева к-та; ДГ – синтезовані сполуки ауксин-
цитокінінової дії, створених на основі похідних ди-тетра гідротіофендіоксиду та
піридину науково-дослідним центром “АКСО” Інституту біоорганічної хімії і
нафтохімії.
Роботи по насіннєвому та клональному розмноженню в культурі in vitro
проводили в лабораторії культури ізольованих тканин.
Для проведення робіт в асептичних умовах (висів насіння, стерилізація,
виділення експлантів, субкультивування) використовували ламінарний бокс
(КПГ-1), у якому безперервно циркулює потік стерильного повітря.
Для культивування ізольованих тканин і насіння використовували кімнату,
обладнану металевими стелажами зі скляними полицями і освітленням
люмінесцентними лампами. В культуральній кімнаті підтримували постійну
 50

температуру +22-27ºС, відносну вологість повітря 70%, фотоперіод 16 годин,

освітленість 8-10 тис. люкс.
Насіння пророщували в колбах Ерленмєйера на 250 мл, а експланти у
біологічних пробірках.
Поживні середовища готували на дистильованій воді суворо за прописом.
Агаг-агар зважували і розплавляли окремо у половинному об’ємі води. pH
поживного середовища визначали на електричному потенціометрі, потім
розливали у колби і стерилізували в автоклаві під тиском у 0,75 атм. (120 ºС)
протягом 20-25 хвилин. Різні модифікації поживних середовищ отримували
додаючи до них 2,4-Д (діхлорфеноксіоцтову кислоту), аденін, БАП
(бензиламінопурин), ІОК (індолілоцтова кислота), НОК (нафтилоцтова кислота),
зеатин, кінетин, ІМК (індолілмасляна кислота), m-інозит (мезоінозит), біотин,
гліцин у різних концентраціях та співвідношеннях. Пересадку ізольованих тканин
та субкультивування рослин-регенерантів проводили кожні 3-4 тижні. Для
нейтралізації негативної дії фенольних сполук, які виділяються у поживне
середовище експлантами камелії, до нього додавали активоване вугілля (0,5-1,0
г/л).
Склад поживних середовищ, які були використані при насіннєвому та
клональному мікророзмноженні C. japonica, наведено у табл. 2.1.
Усі допоміжні матеріали – вату, мішечки, серветки з фільтрованого паперу,
на яких проводили виділення експлантів, стакани, чашки Петрі та колби з водою
стерилізували 1 годину в автоклаві під тиском в 2 атмосфери.
Для стерилізації насіння C. japonica використовували такий режим: насіння
клали у мішечки з марлі і витримували у 10%-му розчині хлорного вапна (20 хв.) і
у 15%-му перекису водню (15 хв.).
Для стерилізації експлантів (листків, шматочків кори, відрізків пагонів з
пазушними бруньками) їх розміщували послідовно у 70º-й етанол (1 хв.), 3%-й
фамосепт (15 хв.), 20%-й розчин хлорного вапна (15 хв.) та 15%-й перекис водню
(15 хв.). Після кожної стерилізуючої речовини промивали у стерильній воді.
 51

Таблиця 2.1.

Склад поживних середовищ, які були використані для насіннєвого та клонального

мікророзмноження Camellia japonica, мг/л

Піріка
Компоненти Кнудсона Мурасіге- Індукція Регенерація Укорінення
''C'' Скуга калусу пагонів пагонів
NH4NO3 – 1650 825 206 412
KNO3 – 1900 950 950 475
CaCl2·2H2O – 440 440 220 110
MgSO4·7H2O 250 370 370 185 42
KH2PO4 250 170 85 85 42
Ca(NO3) 2·4H2O 1000 – – – –
FeSO4·7H2O 25 27,8 27,8 27,8 27,8
(NH4) 2SO4 500 – – – –
MnSO4·4H2O 7,5 22,3 22,3 22,3 22,3
Na2 ЕДТА 37,3 37,3 37,3 37,3 37,3
H3BO3 – 6,2 6,2 6,2 6,2
ZnSO4·4H2O – 8,6 8,6 8,6 8,6
KI – 0,83 0,83 0,83 0,83
Na2MoO4·2H2O – 0,25 0,25 0,25 0,25
CuSO4·5H2O – 0,025 0,025 0,025 0,025
CoCl2·6H2O – 0,025 0,025 0,025 0,025
Нікотинова кислота – 0,5 0,5 0,5 0,5
Пірідоксин – 0,5 0,5 0,5 0,5
Тіамін – 0,4 0,4 0,4 0,4
m-інозит – 100 100 100 100
Гліцин – 2,0 2,0 2,0 2,0
2,4-D – – 2,0 – –
БАП – – 1,0 – –
Аденін 4,0 4,0 – 10,0 2,0
НОК – 2,0 – – –
ІОК – 5,0 – 1,0 –
ІМК – – – – 10,0
Глюкоза – – 30000 – 30000
Цукроза 20000 30000 – 20000 –
рH 4,8-5,2 5,5 5,8-6,0 5,8-6,0 5,8-6,0

Для індукції калусогенезу колби та пробірки з насінням або експлантами

поміщали у темряву в термостат при температурі +25-27ºС на один місяць.
 52

Інтенсивність світлового потоку вимірювалась за допомогою люксметра

Ю116.
Визначення вмісту елементів мінерального живлення у субстратах і аналіз
біогенних макро- і мікроелементів у рослинах проводили за методикою
Г.Я.Рінькіса [97].
Вміст фотосинтетичних пігментів визначали спекторофотометричним
методом з використанням спектрофотометра СФ-21 за методикою Починка [92].
Виміри здійснювали при довжині хвилі 440 (каротиноїди), 664 і 662 нм
(хлорофіли). Екстракцію пігментів проводили 90%-ним ацетоном. Вміст
фотосинтетичних пігментів виражали в міліграмах на 100г сирої речовини.
При роботі використовувався ряд словників [5, 11, 12, 100].
Математичну обробку результатів дослідів проводили за методиками
Г.Н.Зайцева [50], І.П.Ашмаріна [4]. Статистичні помилки в дослідах коливались в
межах 5%. В таблицях і рисунках наведені середні значення і стандартні
відхилення.