OBTENCION DE ACIDO ACETICO POR FERMENTACION CONTINUA A PARTIR DE ALMIDON DE YUCA. ERNANDO ZAUSCHER V. uimnico, Universidad Nacional PhD. Universidad de California Profesor Asociado, UIS * JORGE CASTELLANOS ng, Quimien, US GUSTAVO DUARTE Ing, Quimmico, TH RESUMBN Elalmidén éeyuca (Manihot Bsculeta)sc soanctiGnhirolisisenrimatica obteniendo un rendirfcnto dei 828196. andtisia ‘stadistico dc Ta hidrGlisis permit plantar un modclo Tineal que representa uatemésameate ete proceso com tet vuarisoles que resllaron significativas al nivel del 959. La nidstisis sigue of modelo cinético propuesto por Miclnelis- Menten, Seprocedié enveguida a fermentat la ghicosa obtenide porbidrélissutlicando la Saccharomites.cerevisie comn hinetalin- dor pars chtenereLanol. Alu 30 hurasde ferentaridn se obeervG la mayor velocidad decreximiento celular (73710 Mo/ iL), La formacida del producto llega a su uayar velocidad a las 38 horns. Fl sustrate provenieate de la fermentacién, “alcolilica se vometi6 a la acctn bioeatalitica del Acetobacter Aceli para obtener feido-acético en forma continua nivel d= laboratoria, Se estudiaren y seleocionaron las uncjores condiciones de operacién y los mutientes més adecuados. Seubseré que la ufxiua velocidad dle erocinto celular a de 121213008 Meal. a cual se obtione a las 49 horas de proceso la velucidad espeiilica ce crecdslelo celular ex de 0.059 hr! [Hf cielo We iempa Gptimw ee de 17 horas, al cabo de ie evales se retira Acida ¥ se renvets cl sustrato para obtener uoA productive de 0.083 pf he Acido con una concentracin de’. g/100 nl, Sc caleularon fos valores experimeutes para fa ecusciGa de Michaelis Meaten, INTRODUCCION El objetivo de este estudio consiste ena produccién g nivel de laboratoriv de acide acético diluido a partir de almidén de yuea (Manihot eseulera), el cuul dehe someterse previamente a un proceso de hidrdlists enzimaitica con el fin de transformar fos polisuciridos en azicares fermenrables. Enscguida se efectua la etapa de fermen tavién alcohdlica, usando como biocalalizador la Saccharomives cerevisue y luego se procede a la oxidacion del alcohol formada por accién catalilica del Acetobacter aceti. Rev JON: BeeammnngaColomti) 12IE, fro 188 atPara cada una de estas etapas se hace una selecei6n de las variables 6ptimas de operacién y se lleva a cabo un estudio de las caracteristicas cindticas con el fin de mantener siempre el proceso bajo control y obtener el mayor endimienta posible. Datos estadisticos reportados por el DANE (9) sabre el comportamiento de la oferta de vinagre en el pais indican que la oferta satisface totalmente Ja demanda, por lo cual al disefiar una planta para obtener dcido acético glacial se hace nevesario incluit el raontaje de Ja planta para oblener vinagre con el fin de asegurar el surninistro constante de materia prima. MATERIALES ¥ METODOS. Para efectur la hidrélisis enzimética de Ja yuea se trabsjé con almidén comercial de yuca fresca, a la cual se le determing el contenido de almidén, fibray humedad segiin los procedimientos descritos en el AOAC (5). El almid6n se hidroliz6 utitizando las enzimas hidroliticas presentes en la malta cervecera, la cual se moli6 hasta grano fino.El proceso se efectud en un balén de tres bocas de 500 mE, con agitacidin mecénica, manta de ealentamiento-y termOmetro de control. Para mediciones de pHse usé-un potencidmetro digital marca Pracitronic, ‘La glucosa formada se analizé por el método de Lane-Bynon (5). El almidén hidrolizado se esterilizé en autoclave y sesometié a la fermentacién alcohstiea usando un reactor de 500 ml. de capacidad y levadura comercial conservada en medio liquide (Wort) o en medio sélido (Agar de Sabouraud). EI conteo de células se hizo por medio de Ja cimara de Nuebauery la medicién de etanol producido en un Cromatégrafo de gases marea Perkin Elmer modelo 900, equipado con una columna Halcomid M-18 con ‘Carbowax 600 soportado en tefl6n. Para la fermentaci6n acética se usaron dos reactores con capacidades de uno y dos litros, agitacién magnética, un dafio termostatado.y dos bombas para acuario para el sutninistro de aire estéril a través de un filtro relleno con Jana de vidrio. Las muestras de dcido acético se sometian a destilaciGn fraccionada y luego se analizaban en cl ‘Cromatdgrafo de Gases. Ei biocatalizador usado fué el.A. acet, el cual se aisI6 de un vinagre casero y se mantuvo en el medio de cultivo 66. Todo este material se esteriliz6 antes de cada experimento. La composicién por litro del medio de cultivo 66 fué la signiente: ; Gincosa: 3.0 g Carbonato de Calcio: 10.0 5 Extracto de Levaduta: 10.0 g RESULTADOS ¥ DISCUSION HIDROLISIS ENZIMATICA i andlisis de almidén de yuea comercial presents los siguientes resultados: “Halmidén +843; % humedad : 9.0; % fibra : 6.7 Inicialmente se ensayaron tres métodos de hidrolisis enzimética para el almid6n. En los dos primeros se utilizaron amilasas comerciales marca Novo, segin procedimientos descritos on Ja literatura, usando como sustratos harina de arroz (6) y almidon de arroz (6). Para el tercer método-se usé la malta cervecera de la cual ya se conocia su poder hidrolizante por estudios anteriores (4,9). Las resultados obtenidas con estos tres métodos se presentan en la Tabla 1., para Gempos de hidrélisis de 30 minutes, periods para el cual se obruvo el mejor rendimiento, Ey Re ON. Racnrmangs (Clea), 21447, jnto‘TABLA L Comparaci6n de los resultados obtenidos por tres métodos de hidr6lisis enzimAtica. Método. ‘Temperatra °C pH cooci¢a——_Hidratsie 1 0 0 10 2 80 iS 3 28 ca 50 Estos resultados indican que la hidrétisis efectuada con malta presenta un rendimiento notoriamente superior a ‘squellas efectuadas con enzimas comerciales, probablemente debido a que los dos primeros métodos fueron propuestos para utilizar las amilasas provenientes de] Bactlus subiilus, pero no las que estan presentes en la malta, En cambio elmétodo No3 fué desarrollado especiticamente para les enzimas proven entes de la malta. El procedimiento seguido en el método No 3se presenta en el Ancxo 1. Se escogid entonces este método para estudiar, mediante Ia técnica estadistica del diseio factorial (7), 10s efectos de las diferentes variables sobre el rendimiento de la hidrdiisis.Las variables independientes cstudiadas y sus respectivos valores minimoyy maximo fueron los siguientes: Concentracién del sustrato (68) 10.00% y 15.00% Relacion malta sustrato (M/S) 035% y 045% ‘Temperatura de hidrétisis (T) 60.0 y 700°C pH (pH) 52 y 56 La matriz de] disefto factorial y los resultados obtenidos al cabo de 30 minutos de hidrOlisis se presentan cn a Tabla 2. Los exporimentos se efectuaron por duplicado. TABLA 2, Matrizde disefio y resultados obtenidos cn la. hidrdlisis enzimatica oon malta. ExpNo —Codificacién ‘Variables 4% Reudimiento. ABCD 98 Ms = pit Promedio 1 - 10 4035 «0 52 1568 2 - 8 035 = 52 7442 3 - Wo as o 52 s2a1 4 - 8 045 a 52 7830 5 - 1 035 2 52 5860 6 1 035 m 2 $633 7 - 1 04s » 2 B78 8 = # 04s 2 52 7332 9 + 938 6 36 7359 10 + 15 oo 56 Tos un + 10 o 56 79.86 a + ao 56 620 3 + 10 20 36 $643 u + 0 36 6.8 15 + 1 945 20 86 ert 16 +S 04s 0 36 79.05 RewION,Fucarimane (Caleb), 1203149, 10 33Varianza caleulada = 2.2969 Las wurfables estan codificadas on ta siguiente forma: A= (%S-125)25; B= ((MS-C4N)I0.5); C= (T- 655; D= (pH-5.402 De acuerdo a los resultados abtenidos, e] mejor tendimiente se obtuve én el experiment No 3, bajo cuyas condiciones se realiz6 postesiormente cl andlisis cinétion de Ta hidratists. Se caleuld enseguida fa magnitud de los efectos de tas variables y sus interacciones utilizando el Algoritmo de “Yates (7). Fl objetivo de este andlisis es determinar cuales son los efectos significativos a un nivel de confianza del 954% y poder plantear asi wna ecuacién que defina matemdticamente el proceso y permita hacer predicciones. Resultaron significativas la concentracién det sustrata. (4S), la relaciGn enzima sustrato (M/S) y Ta interacciOn entre Ia relaci6n engima sustrato com la temperatura ((M/S)*T). Con estas datos se plantea cl siguiente modelo lineal para Ia hidrotisis enzimitica cou malta: % Rendimiento = 71.34 + 3.54*A - 4.08*B + 3.28°B*C En esta ecuaci6n solo intervienen las variables-significetivas, las cuales estén codificadas. Sus respectivos eveficientes corresponden a las magnitudes de sus efectos previamente calculados. El valor del término inde- pendiente (71.34) representa el promedio de los rendimientas obtenidos en la hidr6lisis. Ensoguida se restizd una experiencia adicional bajo [as condiciones det experiment No 3., con ef fin de determinar ¢] orden de reaccién y estudiar la cinética cnzimética. Se tomaron mucstras cada 5 minutos, se desactivaron calentando a 95°C en baio Marfa y se analiz6 su contenido de glacosa. Para conocer el orden de reacci6n, se supone inicialmente que puede ser uno, dos o tres y se calcula la constante de velocidad especifica k para cada orden, teniendo en cuenta las concentraciones de sustrato Sy producto P con respecto al tiempo t Valores de kaproximadamente eonstantes indicardn el orden cinético correcto. En la Tabla3.,se presentan los resultados de este estudio, TABLA 3. Orden de reaccion de fa hidr6lisis enzimética. t P s x rE ie ain el gat mt & 4 04 = - 5 oor 0.088, ons, as% 7687 19 oom 0036 oo 0595 sav 15 00s oss 0043 oma 12290 20 ong 0.038 9.036 0713 13530 25 0.057 0.0m 0039 0306 17.660 a0 0.059 oom 0.036 ont 1.260 35 0.060 0027 0.932 0.695 16.690 34 ‘Res 108, Bucange [Colo W041 AT, jnl 09K(n=1) en min" & (n=2) en ml.g?min* & (n=3) en ml? g*min De estas resultados se deduce que el orden de reaccién es uno para la hidrélisis enzimatica y ef valor de 1a constante k es de 0.0292 min, Este valor es el promedio de Jos valores hallados en estos experimentos. Con Ics mismos datos anteriores para P y S se efectué el andlisis cinétion para saber si el proceso sigue el comportamiento descrito por Michaelis-Menten y deducir fos valores de la constante de Michaelis k, ¥ de la velocidad méxima V,,.., Ver Tabla 4. TABLA 4, Célculo de la vinttics enzimética. t Pp s veg? us Ww amin giml gmt gmi-min mig mbmin/g 0 0 0084 - 11.86 2 5 0.017 0.068 3.29 14.73 303.95 10. 0.030 0.056 2.81 1781 354,99 1s 0.013 0.044 2.67 257 37453 20 0.049 0.038 230 26.42 434.78 2B 0.057 0.031 2.12 32.00 4n69 30 0.059 0.028 1.86 35:16 537.63 35. 0.060 0.027 1.62 36.18 61728 t= tiempo; P = Producto; $ = sustrato; V = velocidad La Figora 1., indica el efecto de la concentraciOn del sustrato sobre la velocidad de Ja reaccién enzimética, Se ‘observa que la reacci6n sigue el comportamiento descrito por Michaelis-Menten. La forma lineal propuesta por Lineweaver-Burksse presenta en la Figura 2., donde se grafica 1/S contra 1/V. La pendiente dea recta representa KJV.» €lintercepto en la abcisa corresponde a -I/k, y el intercepto en la ordenada indica el vator de 1/V jn, En esta forma se obticne un valor para k, de 0.08196 g/ml y para V,,,, de 7.246*10° giml.min, Debe tenerse en cuenta que el valor calculado para k, es la constante para todo el complejo enzimatico presente en la malta, por Tocual este valor puede ser diferente de otros reportados para las enzimas amiol{ticas puras. En conscouencia, la ecuacién que describe la cinética enzimética con malta cs la siguiente: V,= Vau!S Wy + §,) V, = 3.674108 gimlmin Donde V, cs Ja velocidad inicial de ta reaccién. La forma lineal de Lineweaver-Burk toma ios siguientes valores: AV = (&,/V,.,.(18) + UV _) WW = 108 + (11318) ’ Busraunga (Cstambs), 2H) Tj 190 35FERMENTACION ALCOHOLICA. *fodos los experimentos de fermentaci6n alcohdlica se etectuaron a 25°C y el voltimen de trabajo fué de 500 ml ‘No se agregaron nutrientes adicionales @ los medios de cultivo Wort Broth para el estado liquide y Agar de Sabouraud para el s6lido. La levadura puray estéril se conservé en la nevera, haciendo repiques frecuentes a un medio més fresco. Inicialmente se efectuaron varios ensayos a las mismas condiciones de trabajo con el fin de determinar ef némero apropiado de microorganismos para alcanvar Ia méxima produccién de etanol, Las condiciones de trabajo fueron jas siguientes: Concentraciéa inicial de glucosa (proveniente det almidéa hidrolizado) = 140 g/t ‘Temperatura = 25°C PHL = entre4.Sy52 Tiempo deaireacién = 30 minutos, Los resultados obtenicios se presentan en la Tabla 5. “TABLA 5. N° de células iniciales para la fermentaci6m alcob6lica. Cétulas iniciales Htanol formado (MO/mm’y g/100 ml 280 2.00 500 3500 5000 10000 MO/mE = microorgsnismos por milimetro cibico de mosto. De estos datos se observa que la mdxima producci6n se alcanza con una cantidad inicial de 3500 MO/mm’. Cuando la cantidad inicial de levadura es inferior a esta cifra se presenta una dilucién muy grande, por lo cual el tiempo de fermentacién seré més extenso. Si el niimero de-levaduras es superior, se-crea un nivel muy compoti- tivo por los nutrientes, lo que hace disminuir la cantidsd de etanol formado. Con base en esta concentracién inicial de células se efectué entonces una fermentacién de la cual se extrafan mmestras periédicas con el fin de analizar N° de células formadas, azicar utilizado y etanol producide. Los datos se presentan en la Tabla 6. Los datos experimentales obtenidos permiten graficar los cambios de estos tres pardmetros. con respecto al tiempo de fermentacién, Ver Figura 3. Se observa que el crecimiento cclular permanece aproximadamente constante desde fas 36 horas hasta las 48 horas y de ahf cn adclante comienva a decrecer. Tanto el consumo de azticar, como 1a produccién de etanol, se vuelven muy lentes a partir de Jas 48 horas. a es ION, Bcramanga (Coma), L577TABLA 6. Datos para calcular Ia cinética aloahblica Cetuias ‘Audear Uiitkado : MO pm ef 2/800 ml a 35 0 0 6 40 16 0.06 10 45 37 O45 12 123 40 0.20 18 195 16.1 0.38 24 585 218 0.40 30 167 522 165 33 1200 701 1.90 36 145.1 38.0 3.10 38 140.0 978. 3.00 42 1435 107.5 3.70. 48 1518 1100 5.25 54 134.1 112.0 5.90 60 260 122 5.92 66 1058 13.4 5.92 7 1020 1140 588 EI paso siguiente es determinar las velocidades de crecimiento celular y la velocidad de formacion de! etanol mediante diferenciacién gréfica de Ja curva anterior. La velocidad cn cualquier punto faé caluulada mediante te pendiente de ese punto. Se calcularon enseguida las velacidades especificas de crecimiento celular y de formacién del producto dividi- endo la velocidad en cualquier instante de! proceso por fa concentracion celular en ese instante, Las velocidades especificas se definen como la velocidad por unidad de concentracién celular. Estos datos se presentan en Jt Tabla 7. Las velocidades especificas se caleulan oon el objeto de comprobar si el proceso de fermentaci6n alcohdlica cumple ef modelo propuesto por Luedeking y Piret (2,3) en e] cual la velocidad de formacién del producto est expresada cn términas dc 1a velocidad espectiica de crecimiento celular K: (lim) (dP/dt) = LK +B donde m es la concentraciOn celular, L es la constante de producciGn y B una constante de proporcionalidad, El modelo se cumple cuaindo se obtiene una relaci6n lincal al graficar 1a velocidad especifica do crecimiento celular como funcion de ls velocidad especifica de formacién del producto, El valor de Lserd la pendiente de ta recta y el valor de B serd su interseccidn en el eje de las ordenadas. La Figura 4,, presenta la velocidad de crecimiento oclular V,,y la velocidad de formaci6n del producto V,, contra él tiempo. Se observa que la mayor V,_ se obtiene a lus 30 horas de reaccidn y corresponde a un valor dé 7.3710" MOfmLh. La formacion del producto llega a su mayor velocidad V,, las 38 horas. fas JON, Bacar: (Colom) 1181-4 ono 7vs a ro Obl Oe OKs Ome Oke Oe OT a a 6 me ae Boncanteccidy torial? 8 FIGURA L Velocided de hideélisis contro: concen FIGURA 2. Cinética de Lineweqvar = Berk tracidn de sustroto, he 5 FRA 3. Sheamce Jun ata ote ae! ea ey mm eee 20M, Busaramange (Cori) PERSIA ie 0TABLA 7. Velocidades especiticas para la cinética alcobélica. 1 Vy Vee lay 6 1.000 0.017 0.250 4.36 10 1.190 0.025 0,143 3.00 2 1.250 o.026 0.447 2:39 18 2.948 0.045 onda 245 24 3.446 0.085 0,105 1.67 30 1.733 O178 0.088 2.02 33 6.500 0.192, 0.057 170 36 4.899 211 0.037 Lo 38 3333 0.227 0.024 1.62 42 win a2i7 0.007 1.46 43 0357 o2i7 0.002 146 t= tiempo en homme V, = velocidad de enecimlento celular en MOYal. #104 Volacidad de formaci6n de producto en 4/100 ia fee Velocind espeifica de crecisonto colulae en (U2D)"106 Vigp ~ Velocidad espection de formacin de producto en (gMO.8)*102 La Figura 5., presenta la relaci6n lineal entre las velocidades espectficas de crecimiento y de formacién, lo cual comprueba la validez del modelo cinético. Las valores calculados para Ly B son los signientes: L= 00% MOjg B= 0.0012 gyMOb La aplicacion de estos valores en 1a ecuacién de Luedeking y Piret proporciona datos de Ja velocidad de formaci6n del producto V, muy cereanas a los valores experimentales obtenidos, especialmente para valores de concentracién celular correspondientes 2 ia fase exponencial de crecimiento. Por ejemplo, pata 18 horas de proceso: Phat = ((0.094°0.111) + 0.0012)A(119.5)) AP/at = 0.043 9/100 mlb; (dato experimental = 0.045) Se utilize enseguida ol método propucsto por Adams y Hungate (1) para calcular et tiempo minimo requerido para la fermemtacion continua de un sustrato determinado, cl cual se basa en los datos de crecimiento celular. El ciclo de tiempo 6ptimo es aquel que cortesponda a la maxima velocidad de crecimiento celular, puesto que la mayor produccién celular daré Ja mayor velocidad de fermentaciGn. Este ciclo de tiempo corresponde al inverso de la velocidad especifica de crecimiento celular calculada para el estudio cinético. os 203. Suen (Cova Burs 1 38La méxima velocidad de crecimiento celular se obtuvo 2 las 30 horas de proceso, tiempo para ¢| cual ta velocidad cspectfica de crecimiento celotar fué de 0.088, Por tanto, el ciclo de tiempo Optimo es de 11.36 horas. ‘Bu [as grafieas de velocidad de crocimiento celular y de formacidn de etangl s¢ observa que La utilizaci6u de tox anticares cs incompleta, atin en el punter para cl cual V_ ex Optima (30 horas). Para ese periods de tiempo 1a ‘velocidad méxima de formacién de alcohol ex de 0.178 yi100 mth Esto significa que la completa ulilizacién de los azieares no puede lograrse en un s6lo fermentador. Se propous entonces usar Un sistema con dos fermen tadores, para que en el primera de ellos se deje progresar fa reaceiGa en presencia de aire estéril hasta alcauzat el valor maximo de concentracién celular (30 horas). Se pusard [nego et mosto al segendo fermentador, donde el prozeso serd anaerobie para obteneraleahol puro, y tendré un tiempo de residencia de 11.36 horas con al fin de mantener una produccitin continua mésima. FERMENTACION ACETICA, Se prepararon inicialmente tres cultivas separadas on ¢1 medio 66 del Acchucter uceti, ef eual se aistd de wn vinagre casero (soluctén madre). Una vez esterilizado el medio, se tomnd de la solucia madse wia poyuciia maéstr don una pipeta estéril y se sembr6 en el medio, Se mantavo eit incubacidas durante varios dias, Baciceds un seguimientd al microscopic del ereeimiento bacterial. ‘Terminado el periodo de ineubaciéa se tomaron mucstras del mejor dc los eullivos para repetir el proceso hasta obtener un caltivo completamente puro del biocalalizadar. El gtnero Acclobacler 8 uerobio estrieto y se eaTacteriza por star coustituldo por células individuales elipsoidales en forma de basién o on pares o en cadenas cortss o largus, méviles con flagelo polar. Las célules jvenes son gramnegativas; en cambio las éélulas viejas son srampositivas. El sustrato proveninente de la fermentacién alcohGlica fué sometide a decantacién, centrifagaciOn y pasteuri- zacién con el fin de clininar todas las levaduras, caya presencia inhibe la accibn oxidativa de A. accti. Se agregaron luego las siguientes sales autritivas por lito de susteate: Pantotensto de Calcio: 2.6 g; Fosfato de diamionio e hidrégeno: D6 g; Fastato de dipotasio ¢ hidrégenu: 0.4 g: Sulfato de maynesio hidratado: 0.2 g Sulfate de manganeso bidratado: 0.01 g; Triclorueo,de hiesro : 0.002 g; Extracto de levadura :0.35 x, ‘Todas los experiments de oxidacién acética se efectuaron baja las siguientes coudiciones de operacién: pH inicial: 5.2; Temperatura: 30°C; Azécares iniclales: $0 gf; Etonol iniciei: 58 g/l; Aireacién; 3.3 min; Agitacioa ; 500 spon; Vodinen : 1.01 Inicialmente se efectuaron cluco experiments ena el fin de deierminar la cantidad inicial epropiada de bio- catalizacior para obtener el ntayor porceataje de deidlo acélico. Se uidtarcu las siguientes cartidades {niciales de A acetiz 10000, 25000, 30000., 120000, 220000,, MOAmmn3. Las mucsiras para analizat por cromaingratia de gases Ta cantidad de 4cido formado se tomaton @ las 72 h de reaccidn. Lox mejores rendiotientos se obtuvieron para 30000 MO/mm3, por lo cual se utitiz este valor para Los siguientes ensayo, o lee DN Bursemangs (Clan), (UT jie 190‘Bajo lus condiciones anteriores se restizé enseguida un experimento para medir la concentracién celular a través del tiempo de oxidacién con ef objeto de determinar.cl punto de méitimno crecimiento. En este punto se renueva el Sustrato pata lograr asf un sistema continuo. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla &y en fa m5. ‘TABLA 8. Concentracién celular contra tiempo para Ia oxidaci6n avética. c, (ht) (MO/m! *10°) 18. 24 36 42 30 58 63 70 8 30 90 Como se puede aprecisr cl mayor valor para el crecimiento celular C, fué de 43°10" MO/ml a las 73 horas de proceso. Posteriormente se analizaron dos experimentas de fermentacion continua en las condiciones de operacién ya deseritas, en los cuales el mimero inivial de bacterias ué de 0.3*10° Mo/ml. Por media de estos ensayos se deseaba determinar Ios valores experimentales de algunos pardmetros cinéticos y tener los datos necesarios para ealeular el ciclo de tiempo minimo requerida para la fermentacién acética continua, Las Tablas 9 y 10 presentan Ins resultaulos obtenidos en estos cxperimentos, Li reacciGn sé dejo progresar hasta Jas 73 horas, Liempo en el cual sc logra ¢l mayor crecimiento celutar, En este punto comienzan a remaverse 14 mifidel Liquide fermentado y sc adiciona simulLincamente el misuxovobimen de alimento y eélula irescas con el fin de mantener una procuccién méxima continua de dcido acético, Como puede observarse on las Tablas 9 y 10 la producci6n de dcide acktico permunece aproximadamente constante despues de Iss 73 horas de fermentacién, con un valor promedio de 7.48 yf para el experimento N° Ly de 7.38 g/l para cl experimento No 2, Las resultados obienidos en ¢l experimento No 1 sirvieron de pase para determiner sia cinética de este proceso sigue el modelo de Monot, y también para calculaz el ciclo de tiempo minimo para zenovar el sustrato. La Figura 6 presenta los resultados del experimento No J, ajustados por medio de un programa de minimos cuadrados, Ror JON: Bacarrngs (Ca awep (aanonid® vee. FIGURA 5. Velocidades expeetticas de cra luler y tarmesidn de preducte para comprobar modelo: de Luedeking and Piret para termantacién alechélien on tuadmin FRGURA 6. Concantvaciéo eablr, producto, sucate cars tee sora ia termantacléa tien nimere 1 Statnen 1 ‘0 ‘ 4 2 o esa eas ele ols Vs te91 FIGURA 6. 1/U contra 1/5 para caleular U mae xime y Xs de In seuaci¢n ds Mo- nod. ReJON usage (Clemti), )47 jm 900"TABLA 9. Resultados de la oxidacién acética, Experimento 1 - Sistema contina Tiempo, wa Células Htanol Producto ‘ Mojmt* lo a cy 700 a a 52 618 a1 16 5.0 585 3 2 48 429 2 3 41 429 3 49 3.8 429 56 63 38 429 69 B 3.6 429 16 89 3.6 50.2 76 94 3.6 45.3 82 7 3.6 45.3 15 113 35 45.3 66 Para llevar a caho el andtisis cinésico de estos experimentos, deben lencise en cuenta las ecuaciones 6-9 = ANNC-C) 0 @-P)= CANE. -C.) TABLA 10. Resulindos de la ogidaciGn ucéticaa. - Fixperimento 2 - Sistema continuo “tiempo a Claas Acar Etanol Producto b MOO" gl a yl00mt o 03 659 S15 02 16 22 53.6 36.0 22 22 35 40.1 246 30 25 40 39.8 212 33 39 St 399 29 4g 49 183 39.9 108 55 8 166 39.9 84 39 ts 242 48.5 Si 14 2 159 403 123 73 4 36 188 40.3 92 79 97 36 162 403 65 73 13 aq i78 403 35 70 os {ON craigs lob, 28) 47, jlo soO8Las cuales se obtienen al integrar les eeuaciones que- duseriben Ju velocidad de consumo de sustrato y de formaciéin del producto con respecte al tiempo. Cuando sé grafica (S, -S) y (P- P,) contra (C_- C,,) se dehen obtoner das tects eon. pendientes LY y Ly respectivamente. Lafigura7 indica que efectivamente para los datos obtenidos en el experimento No 1 se obtiene una rect en los puntos correspondientes a la fase logaritmica, lo cual confirma que-la cinética comple el modelo de Mono. 1La Figura 8 representa 1a forma lineal propuesta por Lineweaver-Burk, o sea la gréfica de 1/S contra 1/V. Se deducen entonces los siguientes valores experimentales para k,, y pata V,,, relacionados con este proceso de fermentacién: k, = 3.0514 gf V, 0.10847 MO/mi.h Los resultados del experimento No J tmbién permiticron calenlar, segiin el método de Adams y Hungote (1), que la mnxima velocidad de crecimiento celular es de 1.2121*108 MO/tai.h, 1a cual se obtiene a las 49 horas de proceso. En este punta la conncentracién celutar ajustada es de 20.5*10" MO/ml. Por tanto la velocidad especifica de crecimiento celular (V.,.) €5 d¢:0,059 ir}, El inverso de esta velocidad proporciona el ciclo de tiempo dptimo, ‘9 sea uproximadamente 17 horas, Esto significa que se have necesario ef disefio de dos fermentadores, para que en el primero de ellos se Meve a cabo el proceso hasta alcnzar el crecimiento maximo a las 49 horas. Luego s€ pasa el mosto al segundo reactor donde se debe renovar el sustrato cada 17 horas para mantener una produccién de acético estable de 0.083 g/l.h. Este sltimo dato corresponde a la pendiente en la curva de P contra t, Figura 6., en el punto de 49 horas de fermentacion. Finalmente, el producto que sate del segundo fermentador al cabo de un total de 73 horas de praceso, tendréuna concentracion final (ajustada) de 7.4 p/100 ml de dcidu acéaivn, CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 1. Se seleccion el método més apropiado para efectuat la hidrolisis enzimatica del almidén de yuca usando malta _cervecera como agente catalizador. Se recomienda una temperatura de 95°C durante:30 mimatos para lacoccién del almidon y 6U°C durante 30 minutos para la hidrolisis, 2, El estudio estadistico del efecto dc las diferentes variables sobre el rendimicnta de la hidrélisis enzimdtica permitis deducir que las mejores condiciones de operaci6n son las siguientes: Coneentracion del Sustrato 10% Relacién Malta/Sustrato = 0.45 ‘Temperatura de hédrolisis ere pH = 52 2 3. Mediante andlisis estadistico de la hidsdtisis enzimdtica del almidén sc obtuvo le siguiente ecuaci6n lineal que representa matemdticamente este proceso y permite hacer prediecioncs dentro de los rangos estudiados: % Rendimiento = 71.34 + 3.54*A -4,08°B + 3.28°B*C 4 Rs JON. Rusty (Cou, 1}167 juno 80En esta ecuacida solo intervionen las variables que: resultan significativas al nivel dcl 95%, a saber: coucenten- cién dal sustrato (A), la relacion Enzima sustrato (B) y la interaceiém cnzima sustrato con la temperatura (B*C). Estas variables estén codificadas 4, Se establecié experimentalmente que Ja hidrdlisis enzimatica con malta, rcalizada segiin condiciones de operaciGn descrites atrés, tiene orden de reaccidn uno yquesuconstantede velocidad espectfica k tiene un valor de 0.0892 min 5. La hidiGlisis enzimética estudiada obedece el comportamiento descrito por Michaclis-Menten y presenta fos siguientes valores experimentales: k, = 0.08196 gjmt % 246108 piml.min a 6, Se caleul6 Ja velocidad inicial de 1a hidrdlisis enzimAtica, la cual tesult6 tener el siguionte valor: v, .GTAMO* gil onin As{ mismo, se caleul6 el valof del factor 1/V de 1a forma lineal de Linewcaver-Burk, el cual depende de ta concentracién del sustrato IV = 138 + (11.31/5) 7. Bl bivcatativador usado para Ja fermentaci6n slcohdlica fué la Sacharomiccs ccrevisae y las condictones de trabajo fueron las siguientes: Coneentraci6n inicial de glucosa 140 gf Temperatura = 25°C Rango de pH 45-52 ‘Tiempo de aireacién 30 minutos ‘Trabajando bajo estas condiciones, se dedujo que la maxima produccida de etanol se obtiene con una concentraci6n inicial de de Ievadura de 3500 MO/mm’ 7 8. El andlisis cinttico de la fermentacién alcoholica permitié calcular tanto Ja velocidad de crecimiento celular ‘V_,como lavclocidad de formaci6n del producto V,,,con relaciénal tiempo de reaceién. El mayor valor para ‘V._se obtuvo a las 30 horas de proceso y tiene una magnitud de7.73"10° MO/mi.h. La formacién de producto llega a su méxima velocidad V,, alas 38 horas ysu magnitud es de 0.227 g/100 mth. 8, Se comprobé que existe una relacién lineal entre las velacidades especificas de crecimiento celular Vy de formacidn de producto V,,,10 cual confirma que el proceso se ajusta al modelo cinético propuestty por Lucdcking y Piret. Los Valores calculados para ts constante de produccion L y para la -constante de proporcionalidad B son los siguientes: L = 0.094 MOfg; B= 00012 gMOn 10. Elciclo de tiempo Sptimo, calculado mediante cl procedimiento propuesto por Adams y Hungate, ¢3 de 11.36 horas, Esto indica qué Ia fermentacién continua para obtener etanol conviene realizarta en dos fermen- es ION, Hacarumange (Colin ANT, on atadores. En el primero de ellos se Neva ja reaccida aet6biea hasta ef crecimiento méximo (30) horas y Tego se pasa al seguido fermentador, donde el proceso es anaerobio con un liempo de residencia de 11.36 haras. En esta forma se puede mantener una produccién continua méxima de uleohol. 11. Para el proceso de fermentacién acética se utilizé como biocatalizador la bacteria Acetobacter aceti yse irabaj6 bajo las siguientes condiciones: pH inicial = 52 ‘Temperatura = 30°C Aaticares iniciales SUM Etanol inicial = S8pil Aireacién 35 limin Agitacién 500 rpm Volimen = 101 Para estas condiciones se dedujo experimentalmente que la concentracién inicial del biocatalizador que produce el mejor rendimiento cs de 30000 MO/mm3. 12, El mayor valor para el crecimiento celular en fa fermentaci6n acética fué de 43°10! MOjml a las 73 horas de proceso. Con base en este dato, se realizaron experimentos de fermentacién acética continua, en los cuales Se mantuva un valor promedio de 7.48 g/100 m1 de Secido avético entre 73 y 113 horas de proceso. La cinética de la fermentacin acética cumple el modelo de Monot y presenta tos siguientes valores experimentales para 1a constante de Michaclis-Menten k, y para la velocidad méxima V,.. K, = 3.0514 gl; V,,. = 0.10847 MO/mLh. |. La méxima velocidad de crecimiento celular se obtiene a las 49 horas de fermentacién, por lo cual so recomienda ejecutar el proceso en el primer reactor hasta ese perfodo y luego pasarlo a un segundo fermentador. 415, La velocitd especftica de crecimiento celular V,.,.para la fermentucitn acética es de 0.059 hi, El inverso de esta velocidad proporciona el ciclo de tiempo éptimo, 0 sea aproximadamente 17 horas. Este es el perfodo Fecomendado pura retirar dcido del segundo fermen tador yrenovar el sustrato, con el fin de mantener una produccién estable de 0.083 g/L.h de dcido. La concentracién final de dcido obtenido sera de 7.4 g/100 ml. ANEXG 1 METODO PARA HIDROLISIS DE ALMIDON DE YUCA USANDO MALTA CERVECERA Pesar la malta y el almidon en las cantidades necesarias, segiin Ja siguiente relaci6n: Almiston Matta Agwa Agregar todo el almidén a la mitad del agua de hidrslisis y calaentar a 60°. Estando a esta temperatura agregar a8 Ro JON. Gocasnig (ean) 0) ST, iamas 0 menos 1% de la malta y el resto del agua. Mantener a esta temperatura por 15 minutos y Hevar a pH 5.0 con fcido fosférice © enn amoniaco, segén el caso. Mantener la temperatura 15 minutos més con el finde ablandar el almidan, Enseguida aumentar la temperatura hasta 95°C y mantener asi 30 minutos para la coccién del ulmidén, Curnplido este tiempo, bajar la temperatura hasta 60°C, agregar Ia malta restante, previainente diluida en agua esta misma temperatura y dejar actuar durante 30 minutos. “Alffinalizar se filtra yse determina el contenido de azdcares fermentables. Mantener agitacin constante durentc toda el proceso. BIRLIOGRAFIA 1LADAMSS. y HUNGATE, R. Continuas fermentation cycte tins. Ind, and ng, Chemistry, 42,9, 1815, 1950, 2, AIBAS y HUMPHEREY.A. Biochemical Enginnering. Academie Press, New York, 1973. S.AIYAR, A.y LUEDEKING R. 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