Institut za medicinsku i kliničku biohemiju

Medicinski fakultet Univerziteta u Beogradu

logo

- tehnike za kvalitativno i
Detekcija apoptoze kvantitativno praćenje apoptoze -
Asist. dr Anđelka Isaković
logo Smrt ćelije
j

 FIZIOLOŠKI:  PATOLOŠKI:
 Razvoj  Poremećaj normalnog
biohemijske karrakteristike

 T ćelije procesa ćelijskog

 Formiranje
F i j prstiju
tij umiranja
i j
 Involucija Milerovih /  Povećano umiranje –
Volfovih kanala degenerativne bolesti
 Deskvamacija
k k
kože CNS-a
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

 Smanjeno umiranje –
tumori
 Nasilno umiranje
2015/2016,

 Mehanička trauma
 Temperatura
p
P
2

2
logo Ćelijska
j smrt (tipovi)
( p )

I. Apoptoza II. Autofagija

biohemijske karrakteristike

Programirana Programirana
ćelijska smrt ćelijska smrt tip II
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

III. Nekroza
Nasilna
ćelijska smrt
2015/2016,
P
2

3
logo
biohemijske karrakteristike Apoptoza
p p / nekroza

APOPTOZA

Pakovanje sadržaja ćelija u

Smežuravanje tzv. apoptotska tela
ćelije
j i organela
g
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

Normalna
ćelija
2015/2016,

NEKROZA
P
2

4 Otok ćelije i Liza ćelije (destrukcija

organela ćelijske membrane)
logo Ćelijska smrt – morfološke promene

Normalna
( d
(zdrava ćelija)
l )
biohemijske karrakteristike
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

Tip ćelijske
2015/2016,

smrti???
P
2

5
logo Apoptoza – morfološke karakteristike

Smanjenje volumena i zgušnjavanje citoplazme (piknoza)

Gubitak pseudopoda (zaokrugljivanje)
Kondenzacija hromatina
biohemijske karrakteristike

Fragmentacija jedra (karoreksa)

Pupljenje
P lj j ćelijske
ć lij k membrane
b („blebbing
( bl bbi g“))
Fragmentacija cele ćelije
Formiranje apoptotskih tela
Programirana ććelijska smrt - b

Tokom celog procesa ćelijska membrana je intaktna!

2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

6
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
biohemijske karrakteristike
MIKROSKOPIJA

1.Svetlosna mikroskopija Normalna

ćelija
1.*fluorescentna
1. fluorescentna mikroskopija
2.In situ imunocitohemija
3.Scanning elektronska mikroskopija Pupljenje
membrane
4T
4.Transmisiona
ii elektronska
l k k mikroskopija
ik k ij
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

Apoptotska
7
tela
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
1 Svetlosna mikroskopija
1.
Hematoksilin eozin bojenje kontrola apoptoza
biohemijske karrakteristike

May-Grunwald-Giemsa
bojenje
j j
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

8
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
* fluorescentna mikroskopija
Hoechst bojenje (vezuje AT  DAPI bojenje (vezuje
parove) se za AT parove
Normalne ćelije Ćelije u apoptozi
biohemijske karrakteristike
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

PI bojenje (vezuje DNK)

Normalne ćelije Ćelije u apoptozi
2015/2016,

Strelice predstavljaju
P
2

fragmentisana jedra
9
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
2 In situ imunocitohemija
2.
TUNEL esej
(Terminal
(T i l deoxinucleotidyl
d i l id l transferase
f dUTP Nick
Ni k End
E d Labeling)
L b li )
biohemijske karrakteristike

dodavanje dUTP koji je obeležen na krajeve koji su nastali

fragmentacijom DNK

Normalne ćelije Ćelije u apoptozi

Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:

Histološki
Hi t l ški preparati
ti
P
2

10
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
3 Scanning elektronska mikroskopija
3.
Normalna ćelija
biohemijske karrakteristike

Ćelija
j u apoptozi
p p
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

11
Omogućava ispitivanje površine (topografiju) skeniranog
materijala
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
4 Transmisiona elektronska mikroskopija
4.
Moguća je vizuelizacija finih unutarćelijskih struktura
Normalne ćelije Ćelije u apoptozi
biohemijske karrakteristike
Programirana ććelijska smrt - b

„zlatni standard“ za detekciju apoptoze!

2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

12
logo
Detekcija apoptoze – morfološke tehnike
biohemijske karrakteristike
MIKROSKOPIJA

1.Svetlosna mikroskopija Normalna

ćelija
*fluorescentna
fluorescentna mikroskopija
2.In situ imunocitohemija
3.Scanning elektronska mikroskopija Pupljenje
membrane
4T
4.Transmisiona
ii elektronska
l k k mikroskopija
ik k ij
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

Apoptotska
13
tela
logo Apoptoza – biohemijske karakteristike

 Precizno regulisan proces – programirana ćelijska smrt

biohemijske karrakteristike

 Spoljašnji (preko „receptora smrti“) i unutrašnji

(mitohondrijalni) put
 Aktivacija enzima koji će razgraditi ćelijski sadržaj – kaspaze!
 Aktivacija enzima koji će razgraditi jedro, tj. DNK
 Formiranje apoptotskih tela
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

 Fagocitoza od strane makrofaga

2015/2016,
P
2

14
 Unutrašnji Spoljašnji (posredovan
(mitohondrijalni) put receptorima smrti) put
logo
Nedostatak faktora Receptor-ligand interakcije
rasta, hormona FAS
TNF
receptor

Regulatori: Pro-apoptoski Citotoksični

pripadnici Adapterni proteini T limfociti
molekuli
Bcl-2 (citohrom C,
familije AIF) Inicijatorne kaspaze

Egzekutorne Fagocit
Oštećenje Granzim B
Mitohondrije kaspaze
- radijacija p53
- toksini Oštećenje
- slobodni
l b d DNK
radikali Aktivacija Razgradnja
endonukleaza citoskeleta

DNK
fragmentacija

Ligandi za
receptore na
15 fagocitima
Apoptotsko
Pupljenje
telo
citoplazme
logo Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike

Kaspaze – enzimi koji vrše razgradnju proteina

Spoljašnji put UV zračenje
Receptori smrti
biohemijske karrakteristike

radijacija

FADD
DISC
Prokaspaza Unutrašnji put
Prokaspaza 8
8 Mitohondrijalni put
Programirana ććelijska smrt - b

Kaspaza 8 Bid
Izborrna nastava:

Apaf-1 Prokaspaza
9
Citohrom C
Inicijatorne kaspaze – 8,
8 9 Kaspaza 9
Egzekutorne kaspaze – 3, 6, 7
2015/2016,

Kaspaza 3

Apoptoza
P
2

16
logo
Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike
1 Detekcija kaspaza
1.
1) Fluorescentna mikroskopija 2
2) Imunocitohemija
3) Protočna citometrija
biohemijske karrakteristike

4) Western blot, ELISA

1
Količina aktivne kaspaze 3 u ćelijama
4
Programirana ććelijska smrt - b
Izborrna nastava:

3 kontrola tretman I tretman II tretman III

2015/2016,
P
2

17
logo
Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike
2 Detekcija citohroma C / AIF
2.
 Proteini koji se nalaze u međumembranskom prostoru
mitohondrija (unutrašnji put apoptoze)
 Potrebno je razdvojiti citoplazmatsku i mitohondrijalnu
biohemijske karrakteristike

frakciju ćelija
 Detekcija
D t k ij putemt Western
W t blota,
bl t ELISA tehnikom
t h ik
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

18
logo
Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike
3 Detekcija fragmentacije jedra
3.
DNK elektroforeza - „ladder“ nukleozom
biohemijske karrakteristike

Fragmenti DNK
veličine oko 180 bp (i
njihovi umnošci) koji
odgovaraju
g j
Programirana ććelijska smrt - b

internukleozomalnom
Izborrna nastava:

cepanju
2015/2016,
P
2

19
logo
Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike
3 Detekcija fragmentacije jedra
3.
Bojenje DNK propidijum jodidom (PI) i analiza na protočnom
citometru
biohemijske karrakteristike
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

20
logo
Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike
4 Promene u ćelijskoj membrani – signal za fagocite
4.

Eksternalizacija fosfatidil-serina

Ćelija u
biohemijske karrakteristike

Živa ćelija Ćelija u apoptozi

kasnoj apoptozi

Plazma
membrana
Programirana ććelijska smrt - b

Fosfatidilserin
Izborrna nastava:

Nukleus
2015/2016,
P
2

21
logo
Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike
4 Markeri na ćelijskoj membrani – fosfatidilserin
4.

Procenjuje se metodom protočne citometrije

Jedinjenje koje vezuje fosfatidilserin je Annexin
biohemijske karrakteristike
Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

22
logo Detekcija apoptoze – biohemijske tehnike

1.Ispitivanje aktivnosti kaspaza

Fluorescentna mikroskopija
Protočna citometrija
biohemijske karrakteristike

Western blot, ELISA

2.Ispitivanje prisustva citohroma C, AIF u citoplazmi

Western blot, ELISA
Programirana ććelijska smrt - b

3.Detekcija fragmentacije DNK

Izborrna nastava:

DNK „ladder“
Protočna citometrija
j (bojenje
( j j sa PI))

4.Detekcija eksternalizacije fosfatidilserina

2015/2016,

Protočna citometrija (bojenje sa Annexin/PI)

P
2

23
logo Detekcija apoptoze - sažetak

 Morfološki fenomen  Biohemijski procesi

11.Svetlosna
S l mikroskopija
ik k ij 1 I i i j aktivnosti
1.Ispitivanje ki i kaspaza
k
*fluorescentna mikroskopija Fluorescentna mikroskopija
biohemijske karrakteristike

Protočna citometrija
2.In situ imunocitohemija Western blot, ELISA
3 Scanning elektronska
3.Scanning 22.Ispitivanje
I iti j prisustva
i t citohroma
it h
mikroskopija C, AIF u citoplazmi
4.Transmisiona elektronska Western blot, ELISA
mikroskopija 3.Detekcija
j fragmentacije
g j DNK
Programirana ććelijska smrt - b

DNK „ladder“
Izborrna nastava:

Protočna citometrija (bojenje sa PI)

4.Detekcija eksternalizacije
fosfatidilserina
Protočna citometrija (bojenje sa
2015/2016,

Annexin/PI)
P
2

24
logo Teme za seminarske radove

1. Prenos signala i redosled biohemijskih promena u ćeliji

nakon pokretanja spoljašnjeg puta apoptoze
biohemijske karrakteristike

2. Prenos signala, uloga Bcl-2 proteina i redosled biohemijskih

promena u ćeliji nakon pokretanja unutrašnjeg puta apoptoze

3. Eksperimentalno dokazivanje apoptoze

Programirana ććelijska smrt - b
2015/2016, Izborrna nastava:
P
2

25