A.E.F.I. ASOCIACION ESPANOLA DE FARMACEUTICOS DE LA INDUSTRIA. VALIDACION DE METODOS ANALITICOS AUTORES Generalidades, materias primas y especialidades farmacéuticas Leticia Aguirre Ortega Maribel Martin Pomar F. Javier Garcia Garcia Begofa Mateos Pérez Tetesa Garcia Junca Cristina Ochoa de Echaguen Aguilar Mique! tilera Fontanet Miguel Angel Ortega Sanchez Marta Juncadella Roca Marti Pujol Forn Monica Lizondo Carbo Marisa Reig Serrat ‘Anna Maria Liuch Sanfeliu Marta Torres Gontaus Métodos en Microbiologia ‘Susana Antinez Moreno Cesca Niubé Prats ‘Ana Maria Carro Vinaras Maria Pilar Oliver Aguera Antonia Garcia Avila Métodos en Bioandlisis Me Cruz Caturla Perales Carlos Nieto Abad Carles Cetma Lezeano José Antonio Pérez Cuadrado Gregorio Encima Garcia Maria Rovira Guerin Josep M. Jansat Rufach Digna Tost Robusté Estadistica aplicada y tablas estadisticas Rogelio Cortés Loras COORDINADORES José Antonio Pérez Cuadrado, voca' ae 160 ae ls Seccin Caaiana de AEFI Marti Pujol For, vocal de Conte Caidad dels Secciin Coat de AEFILa Asociacion Espajiola de Farmacéuticos de la Industria-AEFI, agradece la inestimable colaboracién de las siguientes empre- sas que han facilitado la edicion de esta monografi Agilent Technologies Innovating the HP Way analitica MERCK AGILENT TECHNOLOGIES Carretera Nacional VI - Km 18,200 28230 Las Rozas (Madrid) Tel.: 91 631 30 42 MCC ANALITICA, S.A. C/. Ganduxer 129 08022 Barcelona Tel.: 93 212 00 33 MERCK EUROLAB Distribucion material para laboratorio Pol. Merck 08100 Mollet del Vallés (Barcelona) Tel.: 93 565 55 00 PERKIN ELMER, S.L. Av. Universitat Autonoma 3A 08290 Cerdanyola del Vallés (Barcelona) Tel.; 93 582 45 22 PH-C Laboratorio de analisis C/. Esmeragda 19-21 08950 Esplugues de Llobregat (Barcelona) Tel.: 93 473 96 62 SOCIEDAD DE VALIDACION DE SISTEMAS, S.L. C/. Fedanci 8-10 — Baixador de Sant Joan 08190 Sant Cugat del Vallés (Barcelona) Tel.: 93 675 25 24INTRODUCCION: OBJETO, AMBITO DE APLICACION Y CONTENIDO DE LA MONOGRAFIA En el afio 1989 un grupo de profesionales integrantes de la Seccion Catalana de AEFI (Asociacion Espanola de Farmacéuticos de Industria) preparé una. monografia sobre “Validacion de métodos analiticos”. Por aquel entonces era un tema de gran actualidad pero estaba lejos de su regulacion y habia muchas opiniones divergentes de su necesidad 0 de como llevarla a cabo. Estaba muy extendida la idea de que la validacién analitica era un {ramite burocratico, con poca 0 ninguna implicacién por parte del laboratorio y que bastaba incluiria en los dosiers de Registro Los objetivos primordiales de aquella publicacién fueron + Aportar una vision global y sistematizada de la validacion analitica. ‘ * Orientar a los técnicos de los laboratorios de control e 1D que se enfrentaban, en su trabajo diario, a la problematica de la validacién. EI ambito de aplicacién de a monografia’ se dirigié principalmente hacia los métodos analiticos de tipo quimico e instrumental de uso mas comun: control de materias primas. producto terminado y estudios de estabilidad y de desarrollo galénico, : Los métodos analiticos de tipo microbiolégico y los destinados a estudios de metabolismo. farmacocinética y bioequivalencia podian presentar particularidades que no se contemplaban en aquel trabajo. Desde entonces y hasta la actualidad la situacién ha cambiado radicalmente, de tal forma Que hoy en dia no se concibe la idea que un laboratorio pueda utilizar un método analitico que no haya sido objeto: previamente de algun tipo de validacion, transferencia o, simplemente, comprobacién. La bibliografia cientifica en este campo es tan abundante que se hace dificil seleccionar los trabajos mas interesantes. Actualmente el tema esta bien regulado, con monografias de caracter obligatorio como las publicadas en las Farmacopeas Europea y Americana o bien con textos de cumplimiento recomendable como son las Normas ICH (Intemational Conference Harmonisation) o las guias editadas por las agencias. teguladoras. A pesar de todo ello, de forma periédica_y desde diferentes sectores, se han venido fecibiendo peticiones de actualizacién de la Monografia AEFI. Las Vocalias de Control de Calidad e 1+D de AEFI Catalana decidieron finaimente acometer de forma conjunta ta confeccién de una nueva Monografia y crearon una comisién de trabajo con este fin A grandes rasgos el planteamiento de la Comisién se basé en que la Monografia debia ‘cumplimentar los puntos siguientes: 1) Ambito de aplicaci6n amplio, con inclusion de todos los campos analiticos de las areas quimica, galénica. microbiolégica y farmacolégica. 2) Explicacién y desarrollo de los principales conceptos tedricos. 3) Inclusion de ejemplos, 4) Explicacién de los éonceptos estadisticos necesarios para una buena comprensién de la parte teorica y de los ejemplos ’For motivos practicos, la Comision se dividié en cuatro Subcomisiones (Especialidades y La segunda parte trata de la Validacién de métodos analiticos de tipo quimico e instrumental para especialidades y materias primas. So desarrollan los parametros fundamentales de la validacion (selectividad, linealidad Precision, exactitud y limites de Geteccion y cuantificacion) y una serie de temas relacionados. idenenica de los sistemas, La cuarta parte trata de la Validacién de métodos analiticos para los estudios de Farmacologia, Farmacocinética y Bioequivalencia y se basa en of eetecio y comentario Critico del borrador de la FDA (Food and Drug Administration) sobre “ ioanalytical Methods Validation for Human Studies": Validacion durante la tase previa a un estan (selectividad, curva de calibracion, precision, exactitud, recuperacidn, estabilidad de las muestras), validacion durante la fase de realizacion del estudio y documentacion Finalmente la quinta parte sobre Estadistica aplicada incluye una exposicion de los desenige- stadisticos fundamentales (poblacion y muestra, indices estadisticcs fegresion y disefios factoriales, Finaliza con una resefia de k estadisticos disponibles en el mercado. La Comision agradece especialmente ta colaboracién de las empresas que han Maansorzado el proyecto, gracias a la cual se favorecera la difusién y distnibucion de 14 MonografiaINDICE GENERAL ABREVIATURAS_.......-. . i: GLOSARIO ... oe eed PARTE| — GENERALIDADES PARTE II: VALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MATERIAS PRIMAS Y ESPECIALIDADES FARMACEUTICAS PARTE Ill: VALIDACION DE METODOS DE ANALISIS EN MICROBIOLOGIA PARTE IV: VALIDACION DE METODOS EN BIOANALISIS PARTE V: — ESTADISTICA APLICADA. APENDICE " 19 39 136. 209 249 315a (=a) b (=B) e e% gl (=v, DF) kK miz eS oe x N Abreviaturas y simbolos. 7 ABREVIATURAS Y SIMBOLOS Termino independiente en una recta de regresién o curva de calibracion Pendiente en una recta de regresién o curva de calibracion. Diferencia significativa en una prueba estadistica v)) Residual en la recta de regresion Error en porcentaje. { Factor de respuesta | \ Grados de libertad. Factor de‘tapacidad.” Relacién masa/carga en espectrometria de masas. Generalmente coincide con la masa de un ién (si la carga es la unidad), Tamaho de la muestra; numero de valores ‘de una serie; numero de réplicas de un tratamiento. Nanogramo, Nanémetro, Probabilidad de que un estadistico determinado sea mayor que el valor observado. Partes por millon (equivalente a pg/mL 0 g/g). Partes por billon anglosajén (1x10) (equivalente a ng/mL. 0 ng/g). Coeficiente de correlacién. Coeficiente de determinacion. Desviacion estandar de una muestra Variancia de una muestra, Desviacién estandar de la media Estadistico de Student. Tiempo de retencién de un analito. Tiempo muerto (tiempo en el que un compuesto no retenido pasa por el interior del sistema). Variable independiente (valor nominal), Media de una muestra. Valor estimado 0 calculado de la variable independiente. Variable dependiente (valor experimental). Valor estimado 0 calculado de la variable dependiente. Variable tipificada de la curva de Gauss 0 normal.8 Abreviaturas y simbolos ‘AAPS American Association of Pharmaceutical Scientists. AOAC Association of Official Analytical Chemists. ‘ANOVA Analisis de la variancia. BPL (=GLP) Buenas practicas de laboratorio. CCF (=TLC) Cromatografia en capa fina. cr lonizacién quimica (método de ionizacion en Espectrometria de Masas) CLE Concentracién limite de endotoxinas (método LAL), CSE Endotoxina estandar de control (método LAL). CV (=CV%) Coeficiente de variacién D Estadistica de la prueba de normalidad de Kolmogorov. DAD Detector de diodos. DF Grados de libertad DLs Dosis letal 50. eC Electroforesis capilar : EMEA Agencia Europea de Medicamento. EPA Environmental Protection Agency, eu Unidades de endotoxina (método LAL). EP(=Eur. Pharm.) Farmacopea Europea. ER% Error relativo porcentual. Se utiliza especialmente en Bioandlisis, F Valor de la distribucién de Snedecor-Fisher. FDA Food and Drug Administration. FTIR Espectrometria IR con transformada de Fourier. 6 Estadistico de la prueba de homogeneidad de variancias de Cochran GC(=CG) —_Cromatografia de gases. ‘ Gc-Ms Acoplamiento de cromatografia de gases con espectrometria de masas. om Media geométrica (método LAL) HPLC Cromatografia liquida de alta resolucién, He Hipotesis nula. Hy Hipotesis alternativa. IC(=LC) —_Intervaio de confianza. ICH International Conference of Harmonisation. tupac International Union of Pure and Applied Chemistry, kK Numero de grupos. LAL Lisado de amebocitos de Limulus. LC (-LOQ) Limite de cuantificacion. LD(=LOD) Limite de deteccién Lims Laboratory Information Management Systems,Mc (=Ms) MDv Ms Ms-MS N NIST NMP RSE SC (=Ss) SIM T TSA TSB UFC usp uv a B v (=gl 6 DF) Zann m M ug (=meg) ¥ Abreviaturas y simbolos 9 Media cuadratica (en ANOVA). Maxima dilucion valida (método LAL). Espectrometria de masas. . Espectrometria de masas en tandem Numero de platos tebricos National Institute of Standards and Technology. Numero mas probable de microorganismos. Patron de referencia de! método endotoxina (LAL). Pass/Fail Cutoff (método LAL). Estadistico del test de recorrido de Dixon, Porcentaje de recuperacién Resolucién (cromatogfafia). Endotoxina estandar de referencia (método LAL). ‘Suma de cuadrados en ANOVA. Monitorizacion selectiva de iones (método de adquisicién de elevada sensibilidad en espectrometria de masas). Factor de asimetria Agar triptona soja. Caldo triptona soja. Unidades formadoras de colonias. Farmacopea de los Estados Unidos Ultravioleta. ‘Anchura de pico cromatografico. Error de tipo | (falso positivo), Error de tipo II (falso negativo). Grados de libertad, Longitud de onda. Sensibilidad del lisado (LAL). Estadistico de la distribucion de Poisson. Desviacion estandar de la poblacién. Variancia de la poblacion. ‘ Media de la poblacion. Microgramo. Estadistico de Chi cuadrado.Glosario 11 GLOSARIO El presente glosario se limita a los términos estadisticos y propios de, ja validacién analitica En los casos procedentes se indica entre paréntesis la expresién equivalente en lengua inglesa. Analito (Analyte) sustancia contenida en la muestra sometida a andlisis. Blanco de matriz biolégica (Blank matrix). Matriz biolégica (normalmente sangre, plasma, suero u orina) libre de los analitos a cuantificar. Blanco, placebo o matriz de la muestra (Blank, placebo, sample matrix). Muestra Preparada para la lectura final pero que no contiene analitos. Puede ser un blanco de los Feactivos 0 bien un blanco de la muestra problema que contenga todos los ingredientes de la muestra problema excepto los analitos. En este’ ultimo cago se denomina placebo o matriz de la muestra, - Este concepto de _matriz no puede aplicarse a las plantas medicinales, ya que no es posible Separar los analitos del resto de componentes. ‘En el ambito de plantas el término matriz se utiliza como sinénimo de muestra representativa, Cantidad declarada o nominal (Labeled amount). Es la cantidad 0 concentracién tedrica de un analito. Cuando se trabaja con concentraciones relativas se le da valor 100. Cantidad estimada 0 calculada. Contenido, riqueza, potencia. Es la cantidad o concentracién de analita hallada tras la ejecucion del método analitico, ya sea por un método directo 0 por comparacién con un estandar o varios estandares (interpolacion en una curva de calibracién), Coeficiente de variacion o desviacion estandar relativa (Coefficient of variation or relative standard deviation). Es la desviacién estandar expresada como funcion de la media. Normaimente se exptesa en porcentaje. cr ea= **100 Desviacién estandar (Standard deviation). Estadistico basico indicativo de la dispersién variabilidad de los resultados. ' - EOP, [ne Gy? TT ae Desviacién esténdar de la media o error estandar (Standard error of the mean). La desviacién estandar de una media de n resultados se obtiene a partir de la siguiente expresion: In Disefio factorial (Factorial design). Plan de experimentacién cuya caracteristica mas destacable es que los valores de todos los factores se van moviendo simulténeamente. En la experimentacion los disefios mas utiizados son los de dos niveles, de forma que un diseno factorial completo de K factores con dos niveles por factor, conduce a un numero de experimentos igual a 2"12 Glosinn. Disefio factorial fraccionac.» (Fractional factorial design). Los disefos tactoriales fraccionados permiten estudiar un numero elevado de factores con un numero de experimentos mucho menor de lo que requeriria un factorial completo. Si el numero de niveles es 2, el nlimero de factores a estudiar es K y el grado de fraccionamiento es P. el numero de experimentos a realizar es 2**. Al reducir el numero de experimentos se Presentan una serie de confusiones, que pueden afectar a la puesta en evidencia de las interacciones entre los efectos principales. Distribucion de probabilidad . Modelo matematico que relaciona los valores de una variable con su probabilidad de ocurrencia en la poblacién. Las distribuciones mas frecuentes son la normal, la { de Student, la F de Snedecor y la chi-cuacrado entre otras. Efecto de la dilucién (Dilution effect). El rango de una recta 0 curva de calibracion debe abarcar el rango de las concentraciones esperadas de analito en las muestras problema, No es recomendable extrapolar resultados por debajo ni por encima del rango estudiado en la linealidad. Cuando ta concentracion de la muestra problema es superior al limite superior de! rango de linealidad se puede diluir 1a muestra convenientemente (con agua o con blanco, seguin los casos) y reanalizarla. Conviene demostrar que el efecto de la dilucién no afecta la exactitud y precision de! método mediante el analisis de muestras con patrones o placebos cargados con analito sometidas al proceso de dilucion. Error relativo porcentual (Relative error in percentage), Desviacion en porcentaje de los valores experimentales frente a los valores tedricos. e%=ER' [(Valor experimental- valor teérico)/valor tedrico}*100 En el caso de una curva de calibracién el error relativo porcentual de cada uno de los Patrones se halla mediante la expresi6n: ER% = [s cu), 100 x siendo x, los valores tedricos y i; los valores experimentales estimados Por aplicacién de la ecuacién que define la curva de calibracion. (Si es una recta: x; = (y;-a)/b ). Error, Error sistematico, Error aleatorio (Systematic error, Random error). Los errores analiticos, que se cometen al efectuar los analisis, pueden ser determinados o indeterminados. Los errores determinados 0 sistematicos van en una sola direccién y se deben a fallos de instrumentos, personas 0 métodos. Deben eliminarse (0 corregirse sus efectos) puesto que afectarian la exactitud del método. Los errores indeterminados 0 aleatorios son de origen desconocido, actuan en ambas direcciones y determinan la variabilidad de los resultados 0 precisién del método. Los errores indeterminados son objeto de los tratamientos estadisticos (no confundir los errores analiticos con los errores «ty fb 0 riesgos de los tests estadisticos). Estabilidad de la muestra (Sample stability). Es un requerimiento basico la demostracién de la estabilidad de la muestra y de los patrones durante el tiempo comprendido entre su Preparacién y la finalizacion del analisis, especialmente cuando se utilizan equipos automaticos en donde las muestras pueden permanecer horas antes de ser analizadas. En el Ambito bioanalitico ta estabilidad es un parametro fundamental. Estandar de referencia. Estandar de trabajo (Primary reference standard. Working standard). Un estandar de referencia 0 patron primario es un producto homogéneo con Propiedades especificas (identidad, pureza y riqueza) que ha sido analizado y certificado por un organismo cualificado y homologado (reconocido oficialmente),Glosario 13 Un esténdar de trabajo o patron secundario es un estandar cuya riqueza (u otras caracteristicas), ha sido comprobada y calibrada mediante un metodo validado frente a un patron de referencia Exactitud (Accuracy). Expresa la proximidad entre el valor que es aceptado Convencionalmente como’ valor verdadero, valor nominal, teérico un valor de referencia y el valor encontrado experimentalmente. Capacidad de! método analitico para proporcionar resultados lo mas cercanos posibles al valor tedrico 0 nominal. Matematicamente se expresa como el valor numérico del error sistematico (diferencia entre el valor medio hallado y el verdadero) o bien como error relativo porcentual, En Microbiologia. cuando se trata de efectuar contajes microbianos, Ja exactitud se define como el porcentaje de recuperacién frente al valor del inoculo. En Materias primas y Especialidades se utiliza también el porcentaje de recuperacion como expresion equivalente a la exactitud si bien el concepto de recuperacion puede ser diferente a la exactitud en otros ambitos de trabajo (Bioandlisis, Plantas medicinales, etc). Véase el término de “recuperacién’ de este glosario, Factor de capacidad (Capacity factor). En un método cromatografico es el numero de vollmenes de fase mévil necesarios para eluir un compuesto después del volumen inicial contenido en la columna. Factor de simetria, factor de asimetria o factor de cola. (Tailing factor). Medida de la asimetria de la sefial generada por el pico cromatografico. Fiabilidad (Reliability). Capacidad de un método analitico para mantener durante periodos Ge tiempo apropiados los cntenos tundamentales de validacion. La fiabilidad indica les Prestaciones del método para uso rutinario. . Grados de libertad (Degrees of freedom). Numero de categorias independientes que definen una muestra o una poblacién. En el cdlculo de la desviacion estandar significa el numero de desviaciones independientes con respecto a la media y vale n-1. En el caleuls de {a recta de regresién, el numero de grados de libertad es n-2 Homogeneldad de variancias (Variance homogeneity). En muchos tests estadisticos es mer esario comprobar previamente la homoscedasticidad (nomogeneidad de variancias) de las muestras mediante tests especificos (F de Snedecor, Cochran, Barielt. Levene. etc). La Condicion de variancias diferentes recibe el nombre de heteroscedasticidad Idoneidad det sistema (System suitability test). Conjunto de ensayos que permiten comprobar en el momento de utiizacién del, método que el Incertidumbre de una medida (Uncertainty). Estimacién del intervalo dentro del cual se encuentra el valor verdadero de la cantidad medida una vez efectuadas las correcciones debidas a errores sistematicos. en magnitud entre la mayor y isfactoriamente con adecuada Si bien la denominacién rango es muy comin, deberian utiizarse los términos intervalo, amplitud 0 recorrido como mas apropiados para esta definicion (Rango es el equivalente inglés del término “Rank” que significa niimero de orden dentro de una serie). Intervalo de confianza o limites de confianza (Confidence interval o confidence limits) Intervalo en torno al valor estimado que contiene el valor real con una probabilidad determinada. Se aplica en diversas situaciones: limites de confianza de ure determinacion individual, de una media de resultados, de una variancia, de una recta de tegresion, etc,V4 neain: Limite de cuantificacién (Limit of quantification), Minima cantidad de analito que puede determinarse cuantitativamente con una adecuada exactitud y precision Limite de deteccién (Limit of detection). Minima cantidad de analito que puede ser Getectado aunque no necesariamente cuantificado con precisién y exactiud tinealidad (Linearity). Capacidad del método para proporcionar resultados que son Girectamente (o por medio de transformaciones ‘matematicas) Proporcionales a la Concentracion del analito en la muestra dentro de un rango establecido Marcador de calidad, En el andlisis de ciertas plantas medicinales y con el objeto de definir de cae ticaciones de calidad se determinan analitos presentes en la planta (marcadores de calidad) que no son los causantes de la actividad terapeutica, Media aritmética (Mean, average). Valor de centralizacién de una muestra 0 poblacién. Equivale a la suma de todas las observaciones dividida por el numero de las mismae Método analitico © ensayo (Analitycal procedure, analitycal method, test Procedure). Procedimiento que explica delalladamente todas las operaciones necssariae para efectuar un analisis concreto. Método bioanalitico (Bioanalityeal method). Método destinado a la determinacién de analitos presentes en matrices bioldgicas, normalmente sangre, plasma, suero u orn Método de referencia (Referece method). Método validado del que se sabe que resulta adecuado para efectuar un cierto tipo de analisis. Método indicativo de estabilidad (Stability indicating method). Método altamente Selective en el que la presencia de impurezas y productos de degradacion influye on los resultados obtenidos. Muestra (Sample). Producto resultante de una operacién de muestreo. El muestreo debe seaigeresentativo y con un determinado caracter aleatorio si bien, en algunos tipos de analisisy en aplicacién de la flosofia del peor caso, se propician muestreos sesgados Muestra de contro! de calidad (en bioandlisis), (Quality contro! sample). Muestra de raz Blologica con una concentracién conocida de uno o varios analtos que se utiliza para comprobar la precisién y exactitud del método asi como la estabilidad de los analitos, No se utiliza para la determinacién de la curva de calibrado, Muestra de patrén de calibrado, (en bioanélisis), (Calibration standard sample); Muesta de matriz biolégica con una concentracion conocida de uno 0 varios analitos. Se utllina exclusivamente para la determinacién de la curva de calibrado. Muestra real, analitica 0 problema (en bioanilisis),"{Analityeai sample, real sample). Muestra biolégica susceptible de ser analizada. No se refiere a muestras de patron de alibrado 0 a muestras de control de calidad preparadas con blancos de una matris biolégica, Ponderacién, modelos de regresién ponderada (Weighting method). Se aplica para forreait la heteroscedasticidad 0 falta de homogeneidad de variancias en las respuestas de igs distintos niveles de una curva de calibracign. Se emplea en Bioandlisis al ser muy amplio el rango de concentraciones. Dado que en la regresion por minimos cuadrados las diferencias entre los valores experimentales y los valores calculados suelen ser mucho Trayores en los valores altos de concentracién, la ponderacién equilibra el peso de las distintas concentraciones de la curva de calibrado. Los factores de ponderacion mas utiizados son 1/Concentracion y 1/Concentracion al cuadrado.Glosario 15 Precision (Precision). Capacidad de un método para proporcionar resultados proximos entre si. Grado de, dispersién de los resultadas analiticos respecto.a su valor medio. Se puede estudiar a tres niveles: Repetibilidad. Evalua la precision de! método efectuando una serie de analisis sobre la misma muestra en las mismas condiciones operativas (aparatos, reactivos, analista) en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo corto. Precision intermedia: Evalua la precision del método frente a variaciones internas del laboratorio (analista, dia, instrumento, etc.). Es la precision intralaboratorio. Reproducibilidad: Evalda la precision entre laboratorios diferentes. Recta de regresién (Recta de calibracidn, Curva de calibracién). (Regresién line, Calibration line, Calibration curve). Relacién entre las respuestas instrumentales que Produce un analito y las concentraciones del mismo. Siempre que sea posible se buscaré una respuesta de tipo lineal. Cuando no lo sea se podran efectuar transformaciones matematicas para “rectificar” la curva de calibracion o bien se ajustara a funciones mas complejas. Cuando el rango de trabajo sea muy amplio se pueden utilizar factores de ponderacion. Recuperacién (Recovery). Se define como eficacia en el rescate del analito de la matriz de ‘a muestra. Es un parametro que se debe estudiar durante el desarrollo de! método analitico La recuperacion ideal es de! 100%. Recuperaciones mayores indican interferencias debidas a la matriz o errores determinados que deben eliminarse; recuperaciones menores indican pérdidas de analito durante las fases de preparacion de la muestra Cuando la recuperacién no es satisfactoria pero es reproducible cabe la posibilidad de utilizar ef método analitico empleando un factor de correccién que compense las pérdidas de analito. De esta forma no se ve afectada la exactitud. Es el caso por ejemplo de métodos analiticos para validar la limpieza de equipos. Lo mas habitual, sin embargo, es que el Propio método analitico incorpore mecanismos que eliminen el error de recuperacién, por ejemplo rectas de calibracién realizadas con la matriz, métodos de adicion de esténdar 0 métodos con estandar interné. Relacién sefal-ruido. Ruido de fondo (Signal to noise ratio, background noise). En temas instrumentales es la sefial residual o linea de base registrada con concentracin cero de analito. Es decir, es la sefial ruido que proporciona un blanco o placebo. Matematicamente suele expresarse como la desviacion estandar de la respuesta de un cierto numero de blancos. Réplicas y repeticiones. En la presente monografia se entiende como “réplicas” o replicados a los analisis sucesivos de una muestra en las mismas condiciones utilizando el metodo analitico completo, desde la preparacién de la muestra hasta la medicion final de analito. Las inyecciones repetidas de la muestra final (duplicado, triplicado) que se realizan para mejorar la precision instrumental no son réplicas, sino repeticiones que dependeran de la Precision del sistema instrumental empleado, Residual (Residual). Es la diferencia entre el valor observado experimentalmente y el valor estimado en una recta de regresién o curva de calibracion Resolucién (Resolution). Medida de la separacién entre dos picos cromatograticos. El valor de resolucién ideal es aquel que permite la resolucién hasta la linea de base entre los picos de interés, Revalidacion (Revalidation). Repeticion total o parcial de la validacion de un método analitico debido a modificaciones en el propio método, equipos, muestras a analizar. etc. al objeto de garantizar que los resultados contintian siendo fiables,16 Glosario Robustez (Robustness). Medida de la capacidad de un método analitico para permanecer inalterado ante pequefias pero deliberadas variaciones en cierlos parametros Proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su empleo en rutina, No debe confundirse con el término Ruggedness, citado.en la Farmacopea USP que seria asimilable al término reproducibilidad. Selectividad (Selectivity). Capacidad de un método analitico para medir ylo identificar Simultanea 0 separadamente los analitos de interés de forma inequivoca sin interferenciae ge impurezas , productos de degradacién. compuestos relacionados, excipientes u olrce sustancias presentes en la matriz de la muestra. Capacidad del método para producir una respuesta para el analito de interés distinguible de {odas las otras respuestas de los demas componentes de una mezcla potencialmente compleja, La especificidad se utiliza como sindnimo de la selectividad aunque deberia reservarse para aquellas situaciones donde la respuesta obtenida sélo se puede producir con una trica entidad quimica Sensibilidad (Sensitivity). Capacidad de un método analitico para detectar pequeas concentraciones de analito, Serie analitica 0 ensayo de lote de muestras en bioandlisis (Analitycal run, analytical batch): conjunto de muestras formado por al menos una curva de calibracion identica a ta ulizada en la validacién, muestras de control de calidad y muestras problema, procesadas conjuntamente. ‘Sesgo (Bias). Error sistematico o deterr inado. (Véase “error’ en este glosario). Suma de cuadrados (Mean square). En Estadistica y especialmente en ANOVA, una suma Ge cuadrados es la suma de los cuadrados de las diferencias entre los componentes de una serie y su media aritmética, La suma de cuadrados dividida por los correspondientes grados de libertad da el valor de la ‘media cuadratica o variancia. . Test o Prueba de Hipétesis (Hypothesis testing), Prueba que permite decidir con un Gierto riesgo de error cual dé las hipétesis (nula o alternativa) es la verdadera La hipétesis nula se designa por H, y es la que se debe probar o contrastar. La hipétesis alternativa es la complementaria y se designa por Hy. Esta hipotesis no se somete directamente a prueba pero es la mas verosimil cuando la prueba estadistica nos conduce a rechazar la hipotesis nula. ee . Tests unilaterales y bilaterales (one sided, two sided tests). En los tests bilaterales las diferencias de las muestras a comparar son en ambos sentidos; en los unilaterales en un solo sentido. Asi en una prueba teral para comparar dos desviaciones estandar (2 colas) Hipétesis nula Ho: 0; = 62 Hipotesis alternativa Hy: 6; + 02 En una prueba unilateral (1 cola a la derecha o la izquierda): Hipotesis nula Ho: 6; < 62 Hipétesis alternativa 0; > a Transferencia de un método analitico. Proceso de demostracién y verificacion dentro de un laboratorio que un método previamente validado en otro ambito conduce a resultados fiablesGlosario 17 Validacién (Validation). Establecimento de la evidencia documental que un procedimiento analitico conducira con un alto grado de seguridad a la obtencion de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones y atributos de calidad previamente establecidos Obtencién de pruebas documentadas de que un método analitico es lo suficientemente fiable como para producir el resultado previsto dentro de los intervalos definidos. Valor estimado en una recta de regresion (Expected value). En una recta de regresion de ecuacién y= bx + a, son los valores estimados de la variable dependiente ( ) obtenidos al aplicar dicha ecuacién sobre los valores tedricos x, Valor recalculado en una curva de calibracién (Back calculated values). En una recta de regresién de ecuacién y= bx + a, son los valores estimados de la variable independiente (*) obtenidos al aplicar dicha ecuacion sobre los puntos experimentales y,. Es decir, son los resultados de las concentraciones de los patrones recalculados utilizando la propia ecuacion de la curva de calibracién: Valor verdadero asignado (Assigned Value). En la determinacién de la exactitud es el valor que se asigna ala muestfa de concentracion conocida, es decir, el valor de concentracién que se acepta como verdadero en dicha muestra Variancia (Variance). Cuadrado de la desviacién estandar. LX n-1 n(n=1)GENERALIDADESINDICE: PARTE I Generalidades 1. GENERALIDADES.. 1.1. Validacién de métodos analiticos 1 Definicion 4.1.1. Definicion general 1.4.2. Definicion analitica ei 4.1.3 Otros terminos relacionados con la validacion 2 Razones que justifican la validacion de métodos analiticos 1 3 1 1 2.1 Métodos susceptibles de ser validados. Entorno legal — 3.1. Requerimientos para el registro . . 3.2 Normas de Correcta Fabricacion de Medicamentos 1.3.3. Farmacopeas. —s 1.2 Organizacion: buenas practicas de laboratorio. 1.2.4. Organizacién y personal 1.2.2 Instalaciones rece - 1.2.3 Cuidado, alojamiento y confinamiento de los elementos utilizados en los sistemas experimentales biologicos es 1.2.4 Aparatos, reactivos, material y especimenes. 1.2.4.1 Aparatos - a 1.2.4.2 Reactivos... 1.2.4.3 Material y especimenes... 1.2.5 Sistemas experimentales cece 1.2.6 Productos de referencia y muestras de ensayo 1.2.7 Documentacién. Procedimientos escritos 1.2.8 Archivo de documentos 1.2.9 Verificacion de los resultados. 1.2.10 Autoinspeccion . 13 Fases en el desarrollo de un método analitico y criterios de validacion 1.3.1. Definicién de las caracteristicas de practicabilidad ... 1.32 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para analisis .. 1.3.3 Puesta a punto. Caracteristicas de idoneidad 1.3.4 Caracteristicas de fiabilidad . 1.4 Documentacién de la validacion 1.4.1. Protocolo de validacion . Soe 1.4.2 Realizacién de la validacién y evaluacion de los resultados 1.4.3 Informe de validacion....... 1.4.4 Certificado de validacién 1.4.5 Archivo 1.5 Revalidacion ...Generalidades 23 1. GENERALIDADES Este capitulo de introduccion general ha sido redactado basicamente desde el Punto de vista Gel andlisis de materias primas y de especialidades farmacéuticas. Por este motivo, muchos. Ge los procedimientos descritos no son aplicables en el eniomo de la validacon oc metodos poanalltcos © microbiolégicos. Los conceptos, procedimientos y parliculeriaades ae este ‘po de validaciones se comentaran de forma exhaustiva en los capitulos correspondientes. 1.1 Validacién de métodos analiticos 144° Definicion El Kérmino validacién ha sido definido en la literatura, de diversas maneras y Por numerosos autores. Aunque los términos dadés son diferentes el significado de las misnos cx siempre el mismo: a) especificar e implementar, b) aprobar y c) documentar. ‘Veamos dos de las posibles definiciones de validacién 14.4.1 Definicién general Segiin las Normas de Correcta Fabricacién (edicién 99): Validacién: Obtenci6n de pruebas con arreglo a las Normas de Correcta Fabricacion, de arian Guiet procedimicnto, proceso, equipo, material, actividad o sistema Produce en realidad el resultado previsto. 1.4.1.2 Definicién analitica ' Es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento lucira, con un alto grado de seguridad, a la obtencién de resultanoc Precisos y Sxactos, dentro de las especiticaciones y los attibutos de calidad previamronte establecidos. 14.4.3 Otros términos relacionados con la validacién Gallbracién: Conjunto de operaciones que determinan, bajo condiciones previamente definidas. la relacién entre los valores indicados por el vistors de medicién y los valores Conocides correspondientes a un patron de referencia (NCF. ed 99). En resumen, los términos “validacién, cualificacion y calibracién’, son conceptos que suelen emplearse de forma indistinta, sin embargo conceptuaimento son jiferentes, Validar es verificar documentaimente que un método 0 proceso hace lo que tiene que hacer. 0.05). La homogeneidad de variancias se comprueba con la prueba F de Snedecor: Prueba de homogeneidad de variancias F de Snedecor Estadistico F de Snedecor 0.3333333 Valor P 0.8734150 Se acepta el supuesto de homogeneidad de variancias, dado que el resultado de la prueba F de Snedecor es no significativo (P > 0.05) Se realiza una prueba t de Student-Fisher de comparacin de dos medias con grupos independientes: Prueba t de Student-Fisher de comparacion de dos medias con grupos independientes Estadistico t de Student-Fisher 7.745967 Valor P 0.000016 La prueba bilateral efectuada encuentra para una prueba de un riesgo a del 5% (4=0.05) diferencias significativas en la determinacién del principio activo segun Se realice’en presencia o ausencia de la matriz de excipientes.Selectividad ‘Materias primas y especialidades 53 Cuando la prueba realizada muestra diferencias estadisticamente significativas €5 oportuno estudiar la magnitud de la desigualdad y su intervalo de confianza. Placebo cargado Principio activo solo 6 6 Medi 16.10 15.90 Desviacién estandar 0.05477 0.03162 Diferencia entre medias D = |16.10-15.90) = 0,20 Error estandar combinado EE= Estadisticotde Student titen22ja0as = 2.2281 Intervalo de confianza del 95% para la dif encia entre medias IC95%: D +t + EE > 0.20 ¢ 2.2281-0.02582 + de 0.14 a 0.26 Conclusién: Con una confianza del-95%, el aumento en el volumen consumido de solucién valorante para la determinacién del principio activo en presencia de la matriz de excipientes se situa entre 0.14 y 0.26 ml. La aparicion de significacién estadistica permite establecer, con un porcentaje de Confianza establecido, que los dos grupos de valores observados provienen de Poblaciones distintas. La evaluacién de la magnitud de sesgo observado y su Posible posterior aceptacién dependera en cada caso del criterio técnico que se aplique y no se debe sujetar exclusivamente a la prueba estadistica. En este caso, el sesgo maximo posible, con una confianza del 95%, es de 0.26 mi, lo que fepresentaria aproximadamente un 1.6% sobre una valoracién del 100%. La aceptacién de este porcentaje de discrepancia dependera en cada caso de la tolerancia maxima preestablecida Si las interferencias no estan disponibles se puede realizar la comparacion de los resultados del método con un segundo procedimiento oficial o bien caracterizado. La siguiente tabla indica los criterios de aceptacién recomendables. No todos los parémetros son de aplicacion en todos los casos. Parametro, ~Griterio de aceptacion propuesto Capacidad de discriminacion del procedimiento Suficiente Desviacién frente a determinaciones sin interferencias < 2% (< 4%) Resolucion cromatogréfica entre picos cercanos > 1.5 (>2) Factor de cola cromatografico <2 N° de platos tedricos cromatogréficos > 2000 Identidad del pico cromatografico Pureza de pico. ausencia de coelucién Nota: Los valores indicados entre paréntesis hi 'acen referencia a los criterios maximos aceplables en determinados casos,4 Materias pias y especialidades Selectividag Un Principio activo o forma farmacéutica. Se debe comprobar, a ser posible, la identidad del Sralte ¥. gue la sefial proviene sélo de él. Las condiciones ae estrés para lograr una degradacién del orden del 10-20% en la mayoria de principios activos son: Condiciones itica Condiciones para la materia prima salor (40-70°C) Calor (40-100°C) Luz Luz Humedad relativa (85%) Acido (HCI 0.1N) Base (NaOH 0.1N) Oxidante (HO; 3%) no permite su clara Separacién. Sino es posible una Perfecta separacién debe demostrarse ue el valor de la interferencia no es superior al 0.5%. pa Gvaluacion de la degradacién se puede determinar comparando los Perfiles obtenidos del Froducto estresado y no estresado. Con esta finalidad puede ser de interes ve superposicién de los distintos cromatogramas obtenidos. Dichos cromatogramas se adjuntarén en el informe a una escala razonable que permita la pertecta visualizocion aul Perfil obtenido. La siguiente tabla indica tos eriterios de aceptacion recomendables, No todos los parémetros Son de aplicacién en todos los casos, Parametro Criterio de aceptacién propuesto apecidad de dsciminacién del procsdimiento El metodo ha de ‘permit det SGU SAS todas las posibles especies quimicas que Puedan generarse Resolucién cromatogratica entre picos cercanos * 1.5 (> 2) Factor de cola cromatogratico <2 N° de platos teéricos cromatograficos > 2000 Identidad det pico cromatogrético Pureza de pico, ausen Nota: “Los valores indicado: de 0.14 20.26 Conclusién: Con una confianza del:95%, el aumento en el volumen consumido de solucién valorante para la determinacién del principio activo en presencia de la matriz de excipientes se situa entre 0.14 y 0.26 mi. La aparicion de significacién estadistica permite establecer, con un porcentaje de confianza establecido, que los dos grupos de valores observados provienen de poblaciones distintas. La evaluacion de la magnitud de sesgo observado y su Posible posterior aceptacién dependera en cada caso del criterio tecnico que se aplique y no se debe sujetar exclusivamente a la prueba estadistica. En este caso, el sesgo maximo posible, con una confianza del 95%, es de 0.26 ml, fo que fepresentaria aproximadamente un 1.6% sobre una valoracion del 100%. La aceptacién de este porcentaje de discrepancia depender en cada caso de la tolerancia maxima preestablecida Silas interferencias no estan disponibles se puede realizar la comparacion de los resultados del método con un segundo procedimiento oficial o bien caracterizado. La siguiente tabla indica los criterias de aceptacién recomendables. No Yodos los parémetros son de aplicacién en todos los casos. Parametro _ Criterio de aceptacion propuesto Capacidad de discriminacion del procedimiento Suficiente Desviacion frente a determinaciones sin interferencias < 2% (< 4%) Resolucién cromatogréfica entre picos cercanos >15(>2) Factor de cola cromatografico <2 N° de platos tedricos cromatograficos > 2000 Identidad del pico cromatografico Nola: Los valores indicados entre determinados casos, Pureza de pico. ausencia de coelucién aréntesis hacen referencia a los erilerios maximos aceptables en24 Matenias pumas y especialidades Selectividag erate UP!0 activo o forma farmacéutica. Se debe comprobar. 2 cer Posible, ta identidad del analito y gue la seal proviene solo de él. Las condiciones de estrés para lograr una 1.5(> 2) Factor de cola cromatogratico <2 N° de platos tedricos cromatograticos > 2000 Identidad del pico cromatogratico Pureza de pico, ausencia de coelucién Nota: “Los valores indieados entre parent Feferencia a los criterios maximos aceplables on 0.999, aunque en el caso de impurezas se admite > 0.990, La informacion obtenida mediante el calculo de r es limitada y No justifica por si sola la linealidad, siendo *? coeficiente de determinacién el que aporta una mayor significacion estadistica ya que expresa la proporcién de la variacién total de y explicada por el modelo. 3.3.2.3 Variancia residual constante (homoscedasticidad) La representacion de los residuales e aporta mucha informacion acerca de la validez de! modelo. De entre las diversas formas de hacerlo la mas habitual consiste en representar los. residuales (eje de ordenadas) frente a los valores estimados (eje de abcisas). La distribucion de los puntos deberia ser aleatoria y no reflejar ninguna tendencia. 3.3.2.4 Anall de la Variancia: ANOVA. Para poder realizar una ANOVA se deben cumplir los siguientes supuestos: a) Homogeneidad de variancias b) Normalidad de los residuales a) Homogeneidad de variancias La homogeneidad de variancias se puede comprobar aplicando, por ejemplo, un test de Cochran que indicara si el factor concentracién tiene alguna influencia en la variabilidad de los resultados. Estadisticamente seria mas correcto normalizar previamente las respuesta, Ya que de Io contrario se comparan coeficientes de variacién que corresponden a medias de concentracién diferentes entre si. De todas formas es habitual efectuar el test sin cumplir este requisito cuando el intervalo de concentraciones no es excesivamente amplio. El valor de Geis Se calcula de la siguiente formaUnealidad y rango Variancia de cada grupo K S"nera™ Variancia maxima de los K grupos Gains (02=0.05, Las variancias no deben ser estadis OS ante diferentes entre si para el grado de Significacion escogido, generalmente a= 0.08 (véase el ejemplo), Una vez comprobados estos supuestos, se alcularan los estadisticos F, y F; tal y como se indicd del ANOVA, Frew > Frise demuestra la existencia de una Pendiente distinta de 0 Fae 0.310 5 3506 5 0.311 6 3504 6 0.308 7 3506 7 0.306 8 3504 8 0.310 9 3509 9 0.309 10 3507 40 9.312 ‘Area media 3507 Valor medio 0.309 CV (%) 0.12 CV (%) 0.70 4.3.2. Repetibilidad del método EI ensayo de repetibilidad del método se efectéia sobre una serie de alicuotas de una muestra homogénea que se analiza independientemente desde el principio (preparacion de muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y el mismo analistaIIIS I Ln Precision Materias primas y especialidades 71 Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: + Un minimo de 6 muestras a la concentracién nominal. * Un minimo de 3 muestras a tres niveles de concentracién cubriendo el intervalo especificado (un total de 9 muestras). La estimacion de la repetibilidad del método se realiza con el calculo del coeficiente de variacién de las respuestas obtenidas y Con los intervalos de confianza a cada nivel de concentracién estudiado, a) Coeficiente de variacion El célculo del coeficiente de variacién permite deducir el nimero de replicados que se deben ‘ealizar en el método de ensayo para un determinado intervalo de aceptacion, Esta relacion se establece segin la formula siguiente (aplicable a principios activos): aD (Camacho et al, 1993) CV = [100 - La} Donde: LA= valor limite aceptado. n= numero de replicados que se deben realizar en el metodo de analisis. Z (a= 0.01) = 2.58 fir la tabla 3 se relaciona el coeficiente de variacién con el nimero de replicados aplicando {a ecuacién anterior. Por ejemplo si al determinar la repetibilidad del método se obliere an cosficiente de variacién de 0.50% para un intervalo de aceptacién del 99,0-101 0% el numero de andlisis recomendable sera de dos. Tabla 3. Valores orientativos del nimero de réplicas en funcion de la repelibilidad del método. Intervalo de CV (%) maximo aceptable aceptacién (%) n=t n=2 n=3 Ne n 99.0- 101.0 0.39 0.55 0.67 0.78 0.87 98.5- 101.5 0.58 0.82 1.04 1.16 1.30 98.0- 102.0 0.78 1.10 1.34 1.55 1.73 95.0- 105.0 1.94 2.74 3.36 3.88 4.33 90.0- 110.0 3.88 5.48 671 7.75 8.67 85.0~ 115.0 5.81 8.22 10.07 11.63 13.00 Los valores aceptables del coeficiente de variacion del sistema instrumental deben ser inferiores a los valores que se aceptan para el cosficiente de variacién der método. La epresion matematica que permite relacionar ambos coeficientes de variacion es: C¥ método = CV sistema J (Carporal-Gautier et al, 1992)72 Materias primas y especialidades Precision A partir de esta expresion se pueden deducir los valores de la tabla 2 para el coeficiente de variacion instrumental Para el analisis de impurezas y/o productos de degradacién, la Association of Official Analitycal Chemists (AOAC) propone una serie de valence limite de coeficiente de variacion Tabla 4. Limites del coeficiente de variacién para andlisis de Impurezas en funcién de la concentracién del analito Hanalito a 10 28 1 27 0.1 37 0.01 5.3 0.001 7.3 0.0001 Ww 0.00001 15, 0.000001 24 0.000001 30 ——a 8 ») Intervalos de confianza predeian GH 228 fecomienda introducir los intervalos de confianza en el estudio de la Precision. Estos itervalos deben determinarse para cada nivel de concentracion cote Los intervalos de confianza se calculan’a partir de: * Los resultados individuales Fires + Los resultados promedios etre media de una serie de resultados obtenidos en un mismo nivel de concentracién valor de la t de Student de tablas para n-1 grados de libertad y a= 0.08 numero de andlisis desviacion estandar wnaacién Se presenta un ejemplo de repetibilidad del método (ejemplo 3) donde se A conti Getermina el cloroformo residual de un principio activo por cromatogratie de gases. A partir de los resultados obtenidos se determina el coeficiente de variacién, (a) y los intervalos de confianza (b),Precisién Materias primas y especialidades 73 Elemplo 3: Determinacién de la repetibilidad de! método (3 concentraciones con 5 replicados) Muestra 1 Muestra 2 Muestra 3 (5 ppm) (25 ppm) (50 ppm) Area Ceaunis__ Area Ceseuada _ 1264 4.94 5906 26.21 1265 490 5862 25.78 1292 5.07 5915 26.25 1328 5.24 5376 24.70 _ 1272 02 5906 26.41_ 25.87 a) Coeficiente de variacion Segun la tabla 4 para impurezas de un nivel de concentracién proximo a 100 ppm el valor de Coeficiente de variacién aceptable es 5.3%, aunque para la concentracién de § ppm se podria aceptar como limite el valor 7.3%. Por lo tanto, los resultados mostrados en el ejemplo cumplen las especificaciones establecidas. b) Intervalos de confianza Las concentraciones mostradas en el ejemplo 3 han sido.obtenidas a partir de la recta de Ia linealidad. Estas concentraciones han sido normalizadas para obtener los resultados del intervale de confianza. Aplicando los siguientes intervalos de confianza de las medias de cada concentracién se obtiene: Ci(S ppm) 4.85 ~ 5.16 ppm C2 (25 ppm) 24.24 - 26.89 ppm C3(50 ppm) 48.07 - 50.74 ppm 4 Precisién intermedia | objetivo de! estudio de ta precision int ectuando una serie de andlisis sobre | ondiciones operativas diferentes, termedia es determinar la variabilidad del método la misma muestra, en un mismo laboratorio pero en nel estudio de la precision intermedia se deben considerar aquellas circunstancias en las 28 Se pretende desarrollar el método de ensayo. El analista debe evaluar los efectos lusados al variar una serie de factores. Tipicos factores a estudiar incluyen el dia, el talista, el instrumento, etc. (ver tabla 1). No es necesario estudiar cada uno de estos Giores individualmente sino que es suficiente comprobar que la variabilidad aportada por el injunto de factores esta dentro de los limites establecidos,74 Materias primas y especialidades disefio experimental (ejemplo 4) donde se 's, analista e instrumento. En este modelo variacién de los resultados obtenidos al Considerar dos analistas, dos instrumentos y realizando el andlisis hee dias diferentes, Elemplo 4. Precision intermedia Instrumento A Analista X DiatDia2 Dias _ Analista Y Diat___Dia2__Dia3 Instrumento 8 Analista X DiatDia2Dia3 Analista Y Diat _Dia2___—Dia3 lat Dia? ia La estimacion de la precisién intermedia se realiza con el céiculo del Coeficiente de variacion global de las respuestas obtenidas, es decir, consideraros cada resultado independientemente. Generalmente se aceptan valores de coeficiente de variacion de la precision intermedia inferiores al doble del coeficiente de variacién de la repetibilidad der método. En caso de que Poco eanhla es necesario evaluar cual es el factor responsable de sta variabilidad. Se paramienda, ademas, determinar el coeficiente de variacion para cada grupo de analisis Petoae Prba" ue se cumplen las especificaciones establecidas en le repetibilidad del método, En el ejemplo 5 se presenta un caso de repetibilidad intermedia basado en el disenio matricial propuesto en el ejemplo 4 Elemplo 5. Precisién intermedia _ Diat_ Dia2 98.8 97.5 Analista X 97.9 97.3 98.0 96.9 Instrumento A a CV(%)=0.5 CV (% 97.5 98.7 Analista Y 97.2 98.4 97.8 99.0 CV (%)=0.31___ OV (%): 96.9 99.0 Analista X ‘972 98.2 98.0 98.5 Instrumento B ee CV (%)=0.22 CV (%)=0.41 97.8 98.5 . Analista Y 98.2 98.3 100.0 97.6 99.2 98.9 CV(%)F031___ CV (%) A8__CV (%)=0.55 CV (%o)orecsin intermedia = 0.76Precision ‘Materias primas y especialidades 75 45 Reproducibilidad La reproducibilidad estudia la variabilidad de los resultados inter-laboratorio. El objetivo de @sle estudio es verificar que el método de analisis proporciona los mismos resultados en diferentes laboratorios. La reproducibilidad de dicho método de analisis se determina analizando una serie de alicuotas procedentes de lotes homogéneos en diferentes laboratorios, diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas Pero siguiendo el procedimiento descrito en el método (ver tabla 4). Estas condiciones operativas y ambientales diferentes (Huber, 1999) pueden ser: + Humedad y temperatura ambiental diferente * Analistas con diferente experiencia + Instrumentos de caracteristicas diferentes (volumen muerto en un HPLC) + Variaciones de condiciones instrumentales (composicién de la fase mévil, pH flujo) * Variaciones de detalles experimentales no especificadas en el método + Equipos y fungibles de diferente antigiiedad + Columnas cromatograficas de distintos lotes y/o proveedorés + Disolventes y reactivos de diferente calidad Este estudio es necesario si se pretende realizar el método en diferentes laboratorios o si se quiere estandarizar un procedimiento analitico, por ejemplo para incluirlo en las Farmacopeas. 4.6 Comentarios y conclusiones La precision estudia la variabilidad que existe entre los diferentes resultados, pero sin tener en cuenta su proximidad al valor real. La precision se determina con el calculo de la Cesviacion estandar relativa 0 coeficiente de variacién, y se expresa dando el valor medio obtenido junto con el mas-menos de la variabilidad de los resultados. Los resultados obtenidos en la repetibilidad instrumental dependen del instrumento, por clemplo no Se puede obtener el mismo coeficiente de variacién en un equipo con inyecan que con inyeccién manual. La repetibilidad del metodo depende generalmente del proceso de preparacién de la (husstia: Es decir, cuanto mayor sea la manipulacién de la muestra mas probable es que la Variabilidad de! método aumente. El parémetro de la reproducibilidad no es de obligado cumplimiento y se debe realizar solamente en aquellos casos en que se quiera transferir el método a otros laboratorios © incluirlo en guias oficiales.76 Materias prmas y especialidades Exactitud 5. EXACTITUD 5.1. Definicién y generalidades La exactitud de un procedimiento analitico expresa la proximidad entre el valor que es aceptado convencionalmente como valor verdadero o un valor de referencia y el valor experimental encontrado, No deben confundirse exactitud y precision. La precision esta relacionada con la dispersién de una serie de mediciones, pero no da ninguna indicacién de lo cerca que esta del valor verdadero, Se puede tener mediciones muy precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un método sea exacto se requiere un cierto grado de precision. De la definicion de exactitud surge el principal problema: {cual es el valor verdadero del analito en la muestra?. Por desgracia el valor verdadero en muchos casos se desconoce como, por ejemplo, en la industria alimentaria debido a la gran variedad de matrices posibles ¥ due practicamente no existen patrones de referencia certificados por organismos oficiales, No obstante, cuando se dispone de patrones de referencia certificados (caso a, Figura 1), el valor de dicho patron es el que se acepta como valor verdadero y la exactitud puede evaluarse aplicando el método sobre dicho patrén (caso a.1.) 0 bien analizando muestras de Placebo 0 de problema a las que se ha afiadido una cantidad conocida de dicho patron (caso a.2. y a.3.). También se acepta la comparacién de los resultados con un método de referencia validado del que.ya se ha demostrado su exactitud (caso b, Figura 1); entonces el valor verdadero es el que se obtiene'con dicho método de referencia y se compara con el valor hallado con el método nuevo que se quiere validar. VALOR DE REFERENCIA ‘ACEPTADO caso a) caso b) Método de referencia patrén | Método de referencia validado 1) Principio activo (analito puro) 2) Placebo cargado con el analito 3), Muestra problema cargada con el analito Figura 1. Concepto de valor de referencia aceptado 5.2 Ambito de aplicacién Seguin la guia (ICH, Q2A) debe ensayarse la exactitud en métodos de analisis para la valoracion en materia prima y en producto acabado y en métodos de andlisis de cuantificacién de impurezas. Seguin la USP 24 también debe evaluarse la exactitud en los métodos de andlisis de estudios de velocidad de disolucion.Exactitud ‘Materias primas y especialidades 77 5.3 Procedimientos de determinacion de la exactitud La exactitud debe demostrarse en todo el ran; fecomiendan un minimo de 9 determinacione: que cubran el rango especificado, 1go especificado para el método analitico. Se 'S Sobre 3 niveles de concentracion del analito Por ejemplo 3 determinaciones x 3 niveles de Concentracién, que podrian ser la concentracién central y las concentraciones en los extremos del rango. En funcién del tipo de método a validar y de cada caso concreto se deberd tener en cuenta el rango de concentraciones de trabajo: ' 1) Riqueza de un principio activo en materia prima o en producto acabado: 80-120%. 2) Impurezas: desde el 50% del nivel de especificacion hasta el 120% de dicho nivel. 3) Ensayo de disolucién: si se trata de un producto:de liberacién inmediata seria de Q-20% a Q+20%; si se trata de un producto de liberacién controlada, sobre cada limite de disolucién en cada periodo de tiempo se aplicaria (+20%), La exactitud se expresara como porcentaje de recuperacién en Ia valoracién de una cantidad conocida de analito ariadida sobre la muestra o como la diferencia entre la media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto a los intervalos de confianza (ver Figura 2). Porcentaje de recuperacién (R) Diferencia = xm -p Donde: Xm = valor medio hallado jalor aceptado como verdadero Figura 2. Expr 5.3.1. Riqueza de un principio activo 5.3.1.1 Aplicacién del método analitico a una muestra de riqueza conocida ara evaluar la riqueza de un tilizacion de un método absoluto, lemostrar la exactitud del método onocida y se compara el valor hal Principio activo 0 de una materia prima es habitual la Por ejemplo una valoracion acido-base. En este caso para Puede valorarse un patron de referencia de concentracion lado con el valor verdadero conocido. No obstante, como 2 se ha comentado anteriormente, en muchos casos no existen patrones de referencia ficados por un organismo oficial, como los patrones del NIST (National Institute ot tandards and Technology) 0 los suministrados por las diferentes Farmacopeas (EP. USP andards, BP standards). Entonces la evaluacién de la exactitud puede llevarse a cabo por comparacién con un método de referencia validado como se describe mas adelante sando se trata de un principio activo nuevo d ®parar un patron de referencia y valorar su riqu mo, por ejemplo, lesarrollado por primera vez, seria posible 1eza mediante una combinacién de métodos 'a valoracion absoluta junto con una cromatografia en diferentes78 Materias primas y especialidades Exactitud Condiciones de elucién para demostrar su pureza junto con otr identidad y estructura: la espectroscopia de infrarrojo, andlisis elemental, etc. fos métodos que aseguren su la resonancia magnetica nuclear, el 5.3.1.2 Comparacién con un método de referencia validado Se comparan los resultados obtenidos con el método analitico obtenidos con un método de referencia, cuya exactitud esta Ambos métodos deben ser independientes, que se quiere validar con los bien determinada o definida. Elemplo 1: Comparacion de 2 métodos anallticos a una concentracion tnica de anal. Se realizan 6 determinaciones por método. Un método es el que se estadistico de comparacién de dos medias de series no at test de t con la variancia conjunta). _N_ Método A 1 2 99.8 101.3 3 100.9 100.5 4 989 . 1006 5 100.6 99.2 6 101.0 100.0 media 100.30 100.47 s 0.80 0.78 s 0.6480 6146 Test de F Feap = 82 = 0.6480 _ 4 o549 si 0.6146 Fratias (Qla=6-1=5; gly=6-1 ),.05)= 5.05 Foup* Fusies significa que ambos métodos tienen variancias estimadas iguales y Por lo tanto, precisiones semejantes. Testdet Como consecuencia de que las variancias son homogéneas se puede aplicar e! Siguiente test de t (en caso contrario aplicar un test de t para variancias no homogéneas). Xa Xb s? st + no” ne siendo s? la variancia,conjunta que se calcula a partir de la expresién:eee ee ae Exactitud Materias primas y especialidades 79 (na —1)s3 + (ne ~1)s2 (1-1) (m1) = 0.6313 [100.30 -100.47| ia fe 313 0.6313 6 6 aus (gI=6+6-2=10; a=0,05/2)= 2.228 0.3633 lep< tabies Significa que no hay diferencia entre las dos medias. 53.2 Determinacién cuantitativa de un analito en un producto acabado El enfoque es similar al que se plantea para evaluar la exactitud de un método para la "nqueza de un principio activo pero en este caso se trabaja sobre el producto acabado 53.2.1 Aplicacién del método analitico a una muestra de concentracién conocida La muestra de concentracién conocida se prepara a partir de un placebo cargado con cantidades conocidas de analito, o in, cuando es dificil o imposible obtener un placebo Feroblgenteng@ el analito en cuestion, se puede usar el método de adicién de patron sobre el problema. lberacion controlada que constan de pellets 0 de comprimidoe eon recubrimientos Polimericos o también las formulas transdérmicas (Hokanson, 1994)80 Materias primas y especialidades, Ejemplo 2: Placebo cargado y evaluacién estadistica. Se parte de un placebo preparad Io del problema, y se le ahad conocidas de analito patron Exactitud jen car oa Concentracién teérica (ug/ml) ——Nvelt Nivel 2 Nivel 3 10.20 20.12 30.28 Respuesta 10.76 20.36 30.00 10.12 20.28 30.16 EI analito se determina en cada muestra utilizando el mismo mét evaluar y se calcula la recuperacién, (odo analitico a Cone. Area media dos Cone $*__ Recuperacion a _inyecciones hallada (1 (%) 2191755 10.04 88.43 Nivel 4 2308145 10.58 0.2802 98.33 BNNs te 100.59 20.14 100.10 20.45 100.44 20.21 _ 99.65 30.59 101.02 64918110 30.20 02043 © 10067 _.648741.0 30.417 100.03 Media (%) 99.918 CV (%)= 0.960 Para determinar si el factor con resultados se utiliza un test de ‘muestrales del mismo tamafio como \centracion tiene alguna infl igualdad de variancias de puede ser el test de Cochran. Soe 0.2802 7 Si+s?+s? 0.2802+0.1626 +0.2343 G, 41386 Grasine(8=0.05; k =3; 0.8709 - Donde k el numero de grupos y n el numero de determinaciones por Al ser Gea utiizadas son equivalentes, es decir, variabilidad de los resultados. La recuperacién es satisfactoria (media=99.918%). * Para confirmar se aplica un test de t: {100 xf*vnr {100 -99.918|« v9 feep = = 9148 cv. 0.960 frases (=0.05; gl = 2.306 AN ser lop trois NO existe diferencia significativa entre la recuper 100, por lo que la exactitud es correcta, luencia en los varios grupos F grupo. *< Gracies significa que las variancias de las tres concentraciones que el factor concentracién no influye en la acion media yea Exactitud Materias primas y especialidades 79 (Me ~1)s3 + (ne~1)s? (n.=1)-+(ne=1) 0.6313 [100.30 - 100.47} 0.6313 0.6313 6 6 .05/2)= 2.228 = 0.3633 tiaios (QI=6+6-2=10; {em< taias. Significa que no hay diferencia entre las dos medias. 53.2 Determinacién cuantitativa de un analito en un producto acabado El enfoque es similar al que se plantea para evaluar la exactitud de un método para ta “aueza de un principio activo pero en este caso se trabaja sobre el producto acabade 53.2.1 Aplicacién del método an: ico a una muestra de concentracién conocida La muestra de concentracién conocida se prepara a partir de un Placebo cargado con Cantidades conocidas de analit, o bien, cuando es dificil o imposible obtener we placebo Siprobloma "22 &! analito en cuestién, se puede usar el método de adicion de patter cotre el problema, a) Método del placebo cargado. Se Prepara un placebo del problema que contiene todos los ingredientes excepto el analito a determinar. Sobre dicho placebo se afladen cantidades conocidas de Tango a estudiar. El ensayo de recuperacion se reall80 Materias primas y especialidades Exactitud om Elemplo 2: Placebo cargado y evaluacion estadistica, Se parte de un placebo preparado del problema y se le afaden cantidades conocidas de analito patron. —___. —____Concentracién teérica (jig/ml) nee Nivel 1 vel Nivel 3 10.20 30.28 Respuesta 10.76 30.00 40.12 30.16 El analito Se determina en cada muestra utiizando el mismo método analitco a evaluar y se calcula la recuperacion. Cone. ‘Area media dos Cone! ‘s” _ Recuperacion ee inyecciones hallada (g/m!) (%) 219975.5 a 98.43 Nivel 1 2308145, 10.58 0.2802 98.33 7 2222718 1018 _ 4348905 20.14 100.10 Nivel 2 4412380, 20.45 0.1626 100.44 nae 4362620 20.21 9965 "687696.0 30.59 101.02 Nivel 3 649181.0 30.20 0.2343 100.67 ___648741.0 30.17 100,03, Media (%) = 99.918 CV (%)= 0.960 Para determinar si el factor concentracién tiene alguna influencia en los resultados se utiliza un test de igualdad de variancias de varios grupos Muestrales del mismo tamafio como puede ser el test de Cochran Si 0.2802 Gey =, Sm = 0.41386 wP s?+s2 +s?” 0.2802 +0.1626 +0.2343, Gstias(0=0.05; )= 0.8709 Donde k el numero de grupos y n el numero de determinaciones por grupo, Al Set Geo< Gratis significa que las variancias de las tres concentraciones uilizadas son equivalentes, es décir, que el factor concentracion no influye en la Variabilidad de los resultados. + La recuperacién es satisfactoria (media=99.918%), * Para confirmar se aplica un test de t: hoo» o0-99.918|+-vo cv 0.960 = 2.306 fen = 148 Al Ser lao tae NO existe diferencia significativa entre la recuperacién media y 100, por.lo que la exactitud es correcta,Exactitud Materias primas y especialidades 81 b) Método de adicién de patron. Se utiliza esta aproximacién cuando no es posible Preparar un placebo de la matriz de la muestra que no contenga el analito. Este podria ser el caso de las muestras lioflizadas en los que la presencia o ausencia del analito es Significativamente distinta. Se afiaden sobre una o varias muestras cantidades conocidas de un analito patron a tres niveles de concentracién dentro del rango a estudiar. Se fealizan como minimo 3 replicados para cada nivel y se analizan las muestras adicionadas y no adicionadas segun el método analitico calculando finalmente la recuperacién. Este método tiene 1a ventaja de utilizar muestras reales y no requiere la Preparacion especial de un placebo cargado. No obstante, también debe hacerse la misma reflexion que para el método del placebo cargado, ya que la adicion de un patron sobre una muestra no es exactamente lo mismo que el producto acabado real Elemplo 3: Adicién de patron y evaluacion estadistica (Woodget, 1987). Se parle de una muestra de concentracién desconocida (blanco de concentracién x ppm en analito). Se afaden cantidades conocidas de analito a tres alicuotas de esta muestra y se analizan por triplicado. La recta de calibracién efectuada con soluciones patrén del analito (1-10 ppm) es: Y=164.3x+2.4 (r=0.9998) Para determinar la exactitud se hallan las respuestas experimentales netas para 2, 4 y 6 ppm y se comparan con los resultados obtenidos por interpolacion on la ‘recta de calibracién para las mismas concentraciones de analito: Concentracién «Respuesta exp neta - blanco Interpolacion _ Recuperacion i %) 2 ppm 435.7-108=327.7 0 a 4 ppm 761.7-108 y 99.1 6 ppm 1075.7-108=967.7 97.9 : 98.7 0.67 + Larecuperacién es satisfactoria (media=98.7%), * Para confirmar se aplica un test de t fto0-s}*vn f100-98.7]« V5 83 361 cv 0.67 ‘ ties (0.05; gle: =2) = 4.303 Al Ser loo< tasias NO existe diferencia Significativa entre la recuperacién media y 100, por lo que la exactitud es correcta82 Materias prmas y especialidades Exactitue 5.3.2.2 Comparacién con un método de referencia validado S resultados obtenidos con el método analltico Que se quiere validar con los n Método di Se comparan Io: obtenidos con ur Ccterencia, cuya exactitud esta bien determinaca 0 definida, ‘Ambos métodos deben ser independiente. Ejemplo 4: Comparacién de métodos con 2-4 concentraciones, respectivos coeficientes de variacién para cada Concentracién se toman como Season ,Ce, l@ tepetiblidad. Un test de F y, Posteriormente, un test de t aplicados a cada concentracion indicara, fespectivamente, si existen diferencias oo Precision y exactitud entre ambos métodos y si cl factor concentracién influye Sobre estos pardmetros (ver ejemplo 1) Elemplo §: Comparacion de métodos con § 0 mas concentraciones (regresion lineal y intervalos de confianza) Concentracion Método a Método b ee 603 359 612 593 60 504 59.6 608 59.0 _ 596 608 — 80.6 80.3 80.5 80.5 80 795 813 81.0 795 a 813 208 100.0 100.6 99.5 1005 989 99.1 ues 101.0 101.1 100.0 2 99.4 ~ 121.6 120.5 1213 i208 1201 1199 uJ 119.9 121.3 _ 1203 1205 1500 150.6 1502 1508 150.8 1499 ed 151.6 151.0Exactitud Materias primas y especialidades 83 En abcisas se representan los valores del método de referencia (a) de precision y exactitud conocidas y en ordenadas los valores correspondientes del metodo a evaluar (b). i Si el diagrama de puntos es curvado indica que los métodos conducen a resultados diferentes. Si se observa una linea recta que se curva a partir de un Gierto punto, este punto de desviacion indica un limite de linealidad. Si ambos métodos son equivalentes, se obtiene una recta de pendiente igual a 1 y ecuacion y=x. Cuando la equivalencia no es buena la ordenada en el origen no sera cero y/o la pendiente sera distinta de 1. La recta de regresion que se obtiene es: y= -0.7727 + 1.0063x a interpretacion estadistica se basa en el calculo de los intervalos de confianza de la pendiente b y del termino independiente a. + Para b: bites, donde t es tats (a=0.05/2;gl=n-2) 1 bites,= 1.0063 + 2.069+0.0062 (0.9934, 1.0192) * Para a: att+s, donde t es tatis (0°=0.05/2;gl=n-2) attess= -0.7727 42.069+0.6675 (-2,1535, 0.6081) Si los intervalos de confianza de b no incluyen el 1, significa que b es diferente de 1 para a=0.05 bilatgeral y existe un error proporcional a la concentracion del analito Si los intervalos de confianza de a no incluyen el cero, significa que a es diferente de cero para «=0.05 bilateral y existe un error sistematico por exceso 0 por defegto, 5.3.3 Determinacién cuantitativa de impurezas Se aplican los mismos métodos que para principio activo 0 producto acabado pero se utiizan muestras (principio activo/producto) cargadas con cantidades conocidas de. impurezas. En la determinacién de impurezas suele ser mas habitual utilizar el método de adicion de patron de la impureza patron sobre la muestra de principio activo o producto acabado. Deben tenerse en cuenta las mismas consideraciones que en el apartado 5.3.2. En los casos en que es imposible obtener muestras con cantidades conocidas de impurezas 2 productos de degradacién, por ejemplo cuando no se puede obtener la impureza aislada, Se considera aceptable comparar los resultados obtenidos con un segundo método independiente. Como los métodos de determinacién de impurezas son, en general. métodos clomatograficos, puede usarse el factor de respuesta relativo al principio activo, es decir, utlizar como patron de referencia un patrén del principio activo diluido a la concentracion limite de la impureza que se quiere determinar. Deberia quedar bien definido cémo se calcula el valor individual o total de impurezas (Peso/peso 0 tanto por ciento) respecto a la cantidad mayor de analito presente en el Producto.84 Materias primas y especialidades Exactitud 5.4 Criterios de aceptacién @) Valores orientativos aceptables en la industria farmacéutica Tipo Coef. Recuperacion (%) Materia prima 99.0 101.0 Formulado farmacéutico 97.0- 103.0 ‘Trazas (0.1-10ppm) Min. 90% Trazas (<0.1 ppm) Min. 75% eT Min. 75% ») Valores orientativos aceptables segin la AOAC (Asociacién Oficial de Quimicos Anallticos), en funcién de la concentracién del analito (AOAC, 1993; Huber, 1999) % Analito _Relacion ' Unidades _ Factor recuperac n (%) 100 1 100% 98-102 210 10" 10% 98-102 21 107 1% 97-103 201 10° 0.1% 95-105, 0.01 10% — 100 ppm 90-107 0.001 10° 10 ppm 80-110 0.0001 10° 1 ppm 80-110 0.00001 107 100 ppb 80-110 0.000001 10° 10 ppb 0.000001 10° 1 ppb ©) Valores orientativos aceptables para los métodos descritos en EPA: el porcentaje de la recuperacion debe estar entre el 50 y él 150 % del valor tebrico (Wiliams, 1983), ®) Ottos autores recomiendan que la recuperacién expresada como Porcentaje sea +4CV Gel valor teérico en todos los niveles, siendo CV el coeficiente do variacion en porcentaje obtenido en el ensayo de la precisién del método (Debesis, 1982).* Exactitud Materias primas y especialidades 85 55 Comentarios y conclusiones {a exactitud nos indica si los resultados que se obtienen con un método analitico estén Byoximos al valor verdadero o al que se acepta convencionalmente como valor verdadere Este puede obtenerse de distintas formas. Una alternativa es comparar los resultados del método a evaluar con otro método de referencia validado, cuya exactitud haya sido Gemostrada. Otra alternativa es analizar una muestra de concentracién conocida, es deci, un patrén de referencia certificado. En el caso de la determinacién de un analito en un Producto acabado, ya sea un principio activo, un excipiente o una impureza, la muestra de No siempre se obtienen valores de recuperacién cercanos al 100%, ya que ésta depende de 'a matriz de la muestra, de la efectividad del método de preparacion y extraccion y de la ‘concentracién del analito. la desviacion de la exactitud por exceso se produce cuando existen interferencias yla telectividad del método no es la adecuada, entonces se obtienen resultados Superiores al (alr verdadero. En este caso, si es posible, se deberian modificar las condiciones del nétodo para optimizar la selectividad o bien cambiar a otro alternativo que sea selective, a desviacion de la exactitud por defecto suele producirse cuando la matriz de la muestra Scomplele y la extraccion del analito requiere varios pasos obteniéndose recuperaciones nis bajas. Cuando esto ocurre seria conveniente intentar optimizar la preparacion do ses pata mejorar el factor de recuperacién. Si esto es muy costoso 0 no es posible85 Materias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantiticacién 6. LiMITE DE DETECCION Y LiMITE DE CUANTIFICACION 6.1 Definicion y gener: Dado un método a dicho metodo, la minima cantidad de ana Cuantificar, bajo las condiciones experimental El limite de cuantificacién es por tanto un término cuantitativo deteccién es sélo cualitativo, concentraciones en el que si bie razonable certeza, si puede detectar: Re esta definicion general se derivan, no obstante una serie de Cuestiones previas a resolver, tales como cuando es necesario establecer ls limites de cuantinew ses y deteccion Falicangmetode de andlisis y cual es el interés en su determinacién; es dear qué aporta ala Validacion del método estabiecer dichos limites Gomo ya se ha apuntado con anterioridad, a quia tripatta ICH establece como necesaria la Geterminacién del limite de deteccién en métodos de andlisis doctinadce la evaluacién de impurezas mediante ensayos Esto es, ensayos en los que simplemente se determina sila cantidad de impureza presente en la muestra es superior o na limite establecido en purezas conocidas y fesconocidas junto, con la suma total de éstas, y parece obvia que si se ha de dara Limite de deteccién y cuantiticacién Materias primas y especialidades 87 Por otra parte, cuando el método se define como un método de analisis de valoracién de contenido en el cual siempre se trabaj Es importante recordar Parametro de validaci 7 0 8@ Modifique el modelo de equipo empleado en el andlisis (ej: tansferencia de métodos analitcos interlaboratorio) tina vez se ha visto la importancia de estos parémetros de validacion, se tratara de Gesarrollar los diferentes métodos a través de los cuales pueden establocerce Ne obstante, rocedimientos de analisis y sistemas instrumentales hay de muy diversa indole y sus caracteristicas definen en muchos casos cual es el método dptime a seguir de entre los posibies. 63. Procedimientos de determinacién del LD y LC 6.3.1 Método basado en el examen visual Si definido, se deberia puntualizar que este procedimiento es el mas indicado en el caso de Iélodos de analisis no instrumentales, en los que no se tiene una seftal numérica, y que en icultad que puede entrafiar nor que permite ser detectada. Seguidamente debe com tlisis de un numero adecuado de réplicas a esta cone wr, 1990). 9 ejemplo muy frecuente y que sigue el mismo wacién volumétrica con un indicador visual de color.88 Matenias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantiicacién 6.3.2 do basado en la relacion sefialiruido Este método, uno de los mas conocidos y empleados, requiere que el procedimiento de anilisis Sea instrumental que proporcione una sefial blanco, un nde de fonds © una linea Ge base, es decir una sefial residual a concentracion cero de anallo. Es el cove de métodos instrumentals tan empleados en el campo quimico-farmacéues como la “sPectrofotometria UV-visible o la cromatografia de gases 0 liquida (HPLC), Fuando el método de andlisis se basa en alguna de estas técnicas, puede establecerse el limite de deteccién y cuantiticacion de forma tebrica mediante el siguiente procedimiento: fone, Sefal-uido es mas costoso, pero una vez establecido este valor puede conciares co forma tedrica y aproximada que el LC sera igual a la concentracion de onatite que Grohe sade ds myschal 10 veces superior (en ocasiones se admite hasta un valor de 20) # Gicho ruido de fondo, y que el LD seré igual a la concentracién de analito due Proporcione sea asphal 3 veces superior a éste. La justificacion a estos valores fue establocde do acuerdo a los interyalos de confianza de una distibucién normal (Long, 1983), LC = 10 veces seftal del ruido LD =°3 veces sefial del ruido| aa Limite de deteccién y cuantiicacién ‘Materias primas y especialidades 89 que no sea necesario alcanzar el verdadero limite del método siempre y cuando el LC encontrado sea inferior al 50% del valor limite de las es Pecificaciones de impurezas, 63.3 Método basado en la desviacién estandar de la respuesta, del blanco y la Pendiente de la recta de calibrado calibrado det anaiit. 2 exPresion a aplicar para este célculo varia en funcién de si el método instrumental empleado corrige la sefial frente a un blanco o no 63.3.1 Métodos instrumentales que corrigen la sefial frente aun blanco Este primer caso corresponderia a un método sespectrofotométrico en el que se podria calcular e! LD y LC teéricos mediante la expresion se Conetaniacién de analito en el limite de cuantificacién 0 deteccién, K= Constante que usualmente se considera i desviacion estandar correspondiente a la 43.2 Métodos instrumentales que no Corrigen la sefial frente a un blanco [caso en que no se realiza correccién frente a un blanco es tipicamente el de métodos fombaraticos GC 0 HPLC. En éstos se ha de tener on Cuenta también la sefial media "lenida del anélisis correspondiente al placebo, es decir, el ruido de fondo 0 background {sistema (Yu) con lo que la expresion final sera entonces: Cy = YeH(K #55) ° = Yet (Ks, b be i‘40 Materias prmas y especialidades Limite de deteccién y cuantiticacién La aplicacion de estas formulas sélo es valida si la mayor fuente de variacion es debida a la desviacién estandar del blanco: Su1>> Say Sy >> Sp De lo contrario, con el fin de considerar también ta falta de linealidad y la existencia de 3.590 habria que sustituir en las expresiones anteriores la desviccion estandar del blanco Sa, Por el término’ sisi +(albye xs? Este procedimiento, al igual que el de ta relacion Sefia/ruido, plantea el problema de como calcular la sefal media de un blanco asi como su desviacion estandar. Es decir como caleular el ruido de fondo 0 background y su correspondiente desviacion estandar. Para ello pueden seguirse las pautas que a continuacién se detallan wi t t > we 1984), v 20 W1 620 w2 ») En la regién delimitada puede medirse la sefial del blanco como la ‘mayor fluctuacion Gn COs (Ne) © como la mayor fluctuacion de la sefal frente al cero en valor absoluto (N,). Del analisis reiterado de la muestra placebo se obtiene ure sone media y en Sater oie una desviacién estandar para la linea de base o ruido de fonder sistema, Estos seran los valores que deberan introducirse en ne expresiones anteriormente descritas.Umite de deteccién y cuantiticacion Materias primas y especialidades 91 Wu Aa Nz Now. Hay que aclarar que estos calculos no son mas que aproximaciones basadas en el andlisis de muestras placebo y que se evalua la altura de las fluctuaciones de la sefial aunque despues el método de analisis se valide tomando como sefial habitualmente el area de los bicos cromatograficos; por todo ello SIEMPRE es necesario tras el calculo tedrico, una comprobacion experimental del resultado obtenido, analizando a la concentracién de! LC {e6rico sucesivas muestras y’estudiando su precision y exactitud, asi como confirmando que 'a concentracién establecida para el LD es realmente la minima aceptable. 63.4 Método basado en Ia extrapolacion de la recta de calibrado a concentracién cero i Se trata de un procedimiento aplicable también a métodos analiticos instrumentales que proporcionan resultados numéricos y dirigido a evitar el calculo, en ocasiones costoso en tiempo, como se ha podido observar, de la sefial media del blanco y su desviacién estandar. Para ello el método utiliza igual que el expuesto con anterioridad la pendiente de una recta de calibrado realizada a niveles de concentracién cercanos a los limites esperados, pero sustituye el valor real de la sefial del blanco por el resultante de la extrapolacién de dicha recta. La interseccién con el ejé “Y" correspondera tedricamente al valor de la respuesta a concentracién cero de analito. De la misma manera se sustituye en la formula, la desviacién estandar del blanco por la obtenida de estimar a partir de esta recta la de un hipotetico blanco. Experimentalmente, consiste pues en analizar muestras con concentraciones conocidas Proximas al limite de cuantificacién y calcular la ecuacién de la recta Respuesta frente a Concentracion, y aplicar las mismas férmulas que las expuestas en el apartado anterior. Elemplo 1: Método por HPLC para determinar el LD y LC de un principio activo Para llevar a cabo una Validacién de Limpieza. La recta de calibrado obtenida en el estudio de la linealidad del principio activo es: Area = 30.05 [ppm cone] + 2.50 Se preparan para calcular estos limites tres muestras a concentraciones que se Suponen cercanas al LC y se analizan en las condiciones descritas en el método obteniendo la siguiente tabla de resultados:92 Materias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantificacion Concentracién Area Area media Desv. estandar em) ——— 25 76.0 785 7 772 7.253 5.0 182.1 155.0 148.8 151.9 3.102 10.0 300.1 293.5 309.1 300.9 7.831 De este pequefo estudio de linealidad a concentraciones bajas se deduce una nueva recta de calibrado que serd la que se extrapola: Area = 29.82 [ppm cone} + 2.73 (= 0.9991) Extrapolando a concentracién cero la ecuacién de esta recta, se obtiene como Sefial ruido la correspondiente al término independiente, es decir: Yo= 2.73 Para el calculo de la desviacion estandar de la sefial proporcionada por el ruido Se debe construir ta recta calculada tomando como eje de ordenadas las desviaciones estandar de las respuestas y como eje de abcisas las concentraciones estudiadas. De esta forma se obtiene una recta de ecuacion: Y=0.887X-1.11 (r=0.9983) Se considera que la desviacién estandar de las respuestas corresponderé al valor de la ordenada en el origen de esta recta: Sy 21.11 Una vez calculado el valor medio de la seftal del ruido por extrapolacién y la desviacion estandar de esta sefial, se pueden calcular los limites tedricos de detec: i 2734 3*1.11) cu = 22 +G*11) _ 9 12 ppm 29.81 *v3, Lc (K=10) 73+ (10*1.11) _ 9 97 ppm 29.81+V3, 6.3.5 Método experimental de célculo para el LC (Método EURACHEM) Cuando no se existe la posibilidad de tener una muestra placebo o cuando se especifica un crlerio concreto de precisién y exactitud, un método experimental, sencillo y eficaz, para el célculo de! LC eg el método EURACHEM (Eurachem, 1993): Gonsiste en preparar una serie de muestras con cantidades decrecientes de analito y analizar cada una de ellas 6 veces consecutivas, representando CV (%) de la precision frente a la concentracién de cada muestra,Limite de deteccién y cuantiticacion Materias primas y especialidades 93 CV (%) 10% Cone Le ‘Cone (ppm) Normaimente se fija un criterio de precisién de un CV=10% en el limite de cuantificacion, aunque se puede llegar a aceptar hasta un 20%, en funcién de las caracteristicas del metodo. Como es obvio habra también que fijar un criterio de exactitud que puede aso siguiente intervalo de confianza: se al RytCV#tr Ry -CVet] va vn Donde: Rm = recuperacién media n= numero de ensayos tar= tde Student para n-1 grados de libertad Siempre que el valor del 100% esté incluido dentro del intervalo puede considerarse exacto en el nivel de concentracién propuesto. Otra posibilidad pasa por considerar como aceptable la exactitud si la recuperacién media se encuentra entre los margenes establecidos en la siguiente tabla que fija su relacion con la Concentracién de analito en la muestra (AOAC, 1993): —% Concentracién _Unidades __% Recuperacion admitido 100 100% 98-102 >10 10% 98-102 >4 1% 97-103 >0.4 0.1% 95-105 0.01 100 ppm 90-107 0.001 10 ppm 80-110 0.0001 1 ppm 80-110 0.00001 100 ppb 80-110 0.000001 10 ppb 60-115 0.000001 1 ppb 40-12094 Matenias primas y especialidades Limite de deteccién y cuantificaciés Elemplo_2: Método HPLC para ta determinacién de un conservante a Concentracién nominal 0.05 mg/ml (50 ppm) Se prepara una bateria de diluciones que serén analizadas bajo las condiciones Geseritas por el método por sextuplicado, oblenionds una tabla con los siguientes resultados: Concentracion (100%) pm 10pm __Sppm__1.0 ppm 1625.0 320.1, 160.1 30.2 1620.8 325.2 162.2 32.5 Area 16276 321.6 165.5 35.6 16222 3238 = 196 «= 30.7 1629.1 32691657 208 16228 3201 1698 334 1624.6 304.5 463, —3.336 3.309 . 2.38 A la vista de estos resultados se puede establecer el limite de cuantificacién en 0.5 bpm considerando como aceptable un coeficiente de variacion mnferen al 10% Yuna recuperacién media de 100.9% 6.4 Comentarios y conclusiones Imprescindible de cualquier preparado farmacéutico, En este sentido es de destacar la importancia que adquieren e! LD y LC como herramientas indispensables en cualquier método analltico, ya que es cada vez mae frecuente y necesario Se Puede garantizar que es valido para evaluar el contenido en productos de degradacién de una especialidad, lo que a su vez permite controlar la estabilidad. iRobustez Materias primas y especialidades 95 7. ROBUSTEZ 74 Definicion La guia ICH, Q2A define la robustez de un método analitico como la medida de su capacidad para permanecer inalterado ante pequenas pero deliberadas variaciones en ceatcemmat fesultados validos en presencia de pequetios cambios Fespecto de las condiciones descritas en el método, susceptibles de producirse durare su utilizacion. obligando a la consiguiente revalidacion de los ies. Se considera por tanto que antes de fijar los Pardmetros anallticos y fedactar el método a validar, es recomendable hacer un estudio de robustez de forma que on ¥e2 fijados los margenes en los que el método es Fobusto, se pudieran incluir éstos96 Materias primas y especialidades Robustez impone son realmente hécesarios o limitan la realizacién del método a unas condiciones escasamente reproducibles. Todos los metodos, sea cual sea la técnica empleada, son susceptibles de ser sometidos a un estudio de robustez. Algunos pueden tener muchos pardmetros sobre los que actuar y otros menos. Ademas éstos no tienen por qué ser s6lo factores relacionados con la medida final, sino qué pueden ser de cualquier etapa del procedimiento analitico, como por ejemplo la preparacion de la muestra. Por esto, la primera etapa del estudio es precisamente analizar todo el método y definir qué factores son los que se espera que influyan mas en el resultado final. 7.3 Procedimiento de determinacién de la robustez 7.3.1 Factores y niveles de influencia Antes de definir los factores de variacion, hay que establecer donde se quieren estudiar su influencia, Dicho de otra forma, qué parametros se van a medir en cada ensayo. En el caso de un analisis cuantitativo resulta evidente que se debe analizar la influencia de cada variable sobre la concentracién de analito calculada. Pero en el caso de la cromatogratia, Por ejemplo, si hay presente mas de un analito interesard estudiar la influencia de cada factor sobre,los parametros que después definiran el test de idoneidad del método, como Pueden ser la resolucién entre dos picos préximos, la eficacia de la columna (N), el factor de Capacidad (k’) 0 el factor de asimetria. El estudio de {a influencia sobre varios parémetros NUNCA implica la realizacion de mas ensayos, sino que se puede hacer a partir de los mismos. Los factores a evaluar en cualquier método de analisis pueden ser tanto factores Cuantitativos (ej. influencia del valor de pH, del valor de temperatura, porcentaje de Componente organico en una fase mévil HPLC, etc.) como cualitativos (ej. fabricante de la columna cromatografica, fabricante de un determinado reactivo, etc.). Algunos ejemplos de los factores més cominmente evaluados dependiendo de la técnica analitica empleada son (Van der Heyden, 2000) n de fa fase movil: + Porcentaje de organico ‘+ Concentracién de sales en el tampén (fuerza iénica) + Concentracién de aditivos (e). aminas) * En gradientes: Composicion inicial y final de la fase rhévil y pendiente del gradiente + Volumen de inyeccién + pHdela fase movil © Temperatura de la columna © Flujo * Tipo de columna: * Fabricante de la fase estacionaria * Lote de columna + Antigdedad de la columna + Detector: Variacién de longitud de onda (UV) o voltaje (Deteccién electroquimica) ‘+ Sensibilidad de integraciénRobustez ‘Materias primas y especialidades 97 ic Flujo de gas portador Gradiente de flujo del gas portador: + Flujo inicial * Flujo final * Pendiente de la curva de flujo Flujo del split ‘+ Temperatura del inyector + Temperatura del detector * Volumen de inyeccién * Programacién de temperatura: * Temperatura inicial * Temperatura final * Gradiente de temperatura * Tipo de Liner * Tipo de columna: * Fabricante de la fase estacionaria * Lote de columna * Leves variaciones de longitud, * Antigdedad de la columna * Sensibilidad de integracion qc + Variaciones en la composicién del eluyente + pH de la fase mévil + Temperatura * Distancia de desarrolio + Forma y tamario de la mancha “+ Volumen de muestra + Lote de placa cromatogratica * Condiciones de secado + Condiciones de revelado + Concentracién de electrolito + pH del tampon * Concentracion de aditivos (surfactantes, solventes orgéinicos etc.) * Temperatura + Voltaje * Tiempo de inyeccion * Concentracién de ta muestra * Concentracion de los liquidos de tavado. + N°de lavados * Longitud de onda del detector98 Materias primas y especialidades Robustez * Factores de integracién + Tipo de capitar: * Fabricante * Lote ie ez Cefinidos los factores que pueden influir en el andlisis se ha de fjar entre qué margenes de variacién se quieren evalyar: : sormraimente los margenes de fluctuacién de cada factor cuantitativo se distribuyen simétricamente respecto al valor nominal descrito en el método de andlisis (e}, pH # 0-1 u) Lo que resulta algo mas dificil es fijar el intervalo de variacién; en teorla se deberia establecer la incertidumbre asociada a cada uno de los pasos involucrados en la medida de on cuenta ésta, Se puede defini el intervalo como el producto de dicha incertidumbre por un foeficiente de seguridad que habitualmente se define por defecto como K=5 (Van der Heyden, Nilhuis, 2000). En muchas ocasiones es la propia experiencia del analista la que Permite establecer unos margenes razonables de fluctuacion en cada factor. ZTias establecer los factores a estudiar la forma aparentemente mas sencilla de comprobar la influencia de cada uno de ellos sobre el método seria comparar los resultados obtenidos modificando dicho factor, pero manteniendo constantes los demas. No obstante esto conlieva dos problemas: * El efecto de modificar mas de un factor a la vez puede ser diferente de lo observado al modificarlos de uno en uno. * Cuando hay bastantes factores esto representa mucho trabajo, tiempo y dinero. La forma mas eficaz de estudiar la robustez es pues efectuar un disefo factorial. De esta forma, a menudo, sin realizar todas las combinaciones posibles, se puede concluit con un numero asequible y razonable de experimentos qué variables son las que mas influyen en el resultado y en qué magnitud. 7.3.2 Disefios factoriales fraccionados Normaimente se utilizan dos tipos de disefios factoriales: * _Disefios factoriales completos y fraccionados + _Disefios de Plackett-Burman y Youden-Steiner, Los mas habituales y sencillos son los disefios de Plackett-Burman, con los que a partir de {"1) experimentos se pueden llegar a evaluar el efecto de { factores, la desventaja es que en estos disefios, a diferencia de los disefios fraccionados, los efectos de las interacciones entre 2 0 mas factores quedan confundidas con los efectos principales, es decir, no puede evaluarse el efecto de las interaccignes entre factores. No obstante, también ha de Sefialarse que dicho efecto suele ser en la practica casi siempre despreciable.Robustez Materias primas y especialidades 99 Como no se trata en esta guia de profundizar en exceso en el disefio factorial sino de establecer unas pautas de cémo evaluar cada parémetro dentro de la validacién, se limitard a explicar algunos ejemplos sencillos. Por razones de interpretacién estadistica, el numero de factores a evaluar es conveniente que sea como minimo de tres y de ocho el numero minimo de experimentos: 7.3.2.1 Disefio factor de tres factores. completo de ocho experimentos (2°) para evaluar la influencia Mediante la matriz resultante de! andlisis factorial para este caso, se puede establecer la influencia de tres factores A, B y C asi como de sus interacciones dos a dos, La interaccién 4e los tres conjuntamente también puede ser tenida en cuenta: i Factores Interacciones N? Ensayo A BO AB AC BC ABC 1 - : + +> + = 2 + : : rs 3 - po 5 4 pean ec! rs 5 5 | + + ane oer 6 +] + =| = 7 Te ae 7 Ee neal 8 + [+ a El signo contenido en las columnas A, B, C es el correspondiente a la desviacién disehada Gel factor respecto a su valor nominal. La columna Interaccién AB.es el resultado del Producto algebraico de los signos de las columnas A y B. Y de la misma forma la de la columna ABC es el correspondiente al producto de cada una de las columnas A, B, C. Cada linea representa un experimento a realizar. Por ejemplo, el factor A puede ser el pH de la fase movil en HPLC, que segin el método analitico debiera ser 3.5. El signo “-" indica que en ese experimento el valor de pH sera 3.2, ¥ $i el signo es “+” el pH sera 3.8. B corresponde al porcentaje de organico en la fase mévil (25 + 2%) y C al flujo (1 + 0.1 ml/min. ). De esta forma el experimento 4 se realizara en las siguientes condiciones: pH = 38 % organico = 27% Flujo = 0.9 mi/min, Se realizan los ocho ensayos segtin indica cada linea de la matriz, con lo que se obtendran ocho resultados para contenido en principio activo, o cualquiera de los parémetros que nos interese analizar (N? platos, resolucién, factor asimetria, elc.): Rt, R2, R3, R4. RS, RG, RY y RB. Una vez obtenidos los resultados el siguiente paso es realizar la evaluacion estadistica que evidencie cual de los factores, 0 que interaccion entre ellos tiene una influencia significativa.100 Materias primas y especialidades Robustez Una forma sencilla de llevarla a cabo seria calcular la influencia de cada factor de la siguiente manera (Caporal-Gautier, 1992): Influencia del factor A; A= 1/4 -R1 + R2-R3+R4—R5+R6—R7 + RB) Influencia del factor B: B= 1/4 (-R1-R2+R3+ R4—R5-R6+R7 + RB) La influencia sobre el parémetro de la interaccién entre el factor A y B sera: AB = 1/4 (#R1— R2—R3 + R4 + R5— RG —R7 + RB) ASI se calculan los efectos principales y las interacciones entre los diferentes factores, de forma que puede ya intuirse cuales de ellos pueden tener realmente relevancia, En cualquier caso una manera también sencilla de comprobar la importancia del efecto generado consiste en calcular para cada caso el correspondiente intervalo de confianza: Por ejemplo para el factor A: Sen Attest in Donde: . '= Coeficiente de Student para probabilidad (1-(a/2)) y el nimero de grados de libertad de Sexp Sem = desviacion estandar de los resultados de los experimentos. n= nde experimentos Si 21 intervalo de confianza del efecto de un factor contiene el cero, este efecto puede considerarse como negligible. Si el cero no se encuentra dentro del intervalo el resultado det analisis significa que se halla influenciado por la variacién del factor en cuestin. De esta forma todos aquellos factores cuyo intervalo de confianza excluya el cero deberdn ser fijados con gran exactitud en el procedimiento de andlisis, 7.3.2.2 Disefio factorial fraccionado de ocho experimentos (2“') para evaluar la influencia de cuatro factores La interaccién ABC obtenida en el disefio desarrollado con anterioridad es una interaccion de tercer orden. Estas interacciones se producen muy raramente, y como en el caso de Producirse, suelen ser despreciables, esto nos permite fraccionar el disefio factorial pasando de un disefio para evaluar tres factores a un disefo para evaluar cuatro, pero manteniendo el mismo numero de experimentos. Para ello se puede sustituir el efecto de la interaccién ABC, por considerarlo muy improbable, por el de un nuevo factor D (al que se llamard generador), de forma que mediante igualmente 8 experimentos ahora se conseguiria una matriz que permitirA evaluar la influencia de cuatro factores. EI inconveniente en este caso serd que las inleracciones de este nuevo factor con los anteriores también se han de tener presentes, con lo cual:Robustez Materias primas y especialidades 101 Factores Interacciones NeEnsayoo A | B c D(ABC) AB+CD AC+BD AD+BC Si tras realizar los ensayos correspondientes se observa algun efecto significativo, ya no se Puede atribuir la influencia a una sola interaccién sino a la suma de las dos. Para evitar esta ambigiedad y este cumulo de posibles confusiones, siempre existe ta posibilidad sencilla en la mayoria de las ocasiones de sustitdir la interaccién ABC por un factor D del cual se sepa Seguro que no puede interaccionar con los otros tres; por ejemplo en el caso tipico de la cromatografia liquida HPLC, los factores que pudieran influir en el resultado del contenido en principio activo podrian ser: A: Porcentaje de solvente organico en la fase movil B: Flujo de fase movil C: Volumen de Inyeccion D: Tiempo de extraccién durante la preparacién de la muestra La influencia que puede ejercer el factor D nunca sera resultado de la interaccién con A, B 0 C, los cuales entre ellos si que pueden interaccionar. De esta forma se elimina la interaccién del cuarto factor con los anteriores y se consigue una matriz con el menor grado de confusion posible: ' T { Interacciones NEnsayo | AC = 4 2] = _ 3 - + : 4 * + So = - 6 +] — 7 + e+ | + + + A partir de aqui la evaluacién estadistica seria idéntica a la de los casos anteriores Otra posibilidad seria realizar la misma técnica empleada con la interaccién de tercer orden n las de segundo orden, con lo que se podria evaluar 7 factores con 8 experimentos. En este caso las interacciones resultantes empiezan a ser indescifrables y la confusion puede conducir a un callején sin salida102 Materias primas y especialidades * Robustez ! Factores ‘| A Bf Cc T »p Ej FTG Abr) ABS AF* AG _ABY Ace) Ber Imteracciones; CF+ | CG+ BG+ | Br+ cbs | por | AD+ bG DF DE cE Fo | EG EF En estos casos, cuando el numero de factores a evaluar es superior a 4, se puede recurrir a Gisehos factoriales que por no tener en cuenta el posible elect ae las interacciones simplifican mucho el analisis de los resultados. 7.3.2.3 Disefios factoriales de Plackett-Burman Los diseftos de Plackett-Burman son quizés los mas empleados. Permiten evaluar ta influencia a dos iveles de 3 a 23 factores con f+1 experimentos (un nimern superior 24 combinadas entre ellos. Para generar ta matriz que permite construir ol disene colo oe siguiente Perec ia distribucién de ta primera columna de cada matriz, que seria la Siguiente (Plackett, 1946): N= N° ensayos eeiepepe eee a a i= eT EET ree tet 1 jletele GT pet +e ETE GT TPG pete A partir de esta tabla se puede construr cualquier matriz tniendo en cuenta que: * Fas siguientes columnas de la matriz se obtienen por una permutacién ciclica de una posicién con respecto a la columna anterior. La ultima fila se completa con todes ioc signos *-", ‘Ejemplo: La matriz en un disefio de 7 factores, 8 experimentos seria: 1A IF IE aaa T= i= 2 [+ + |- 3 | : + 4 5 f+ + fe 6 |. + + 7 + + al. : : * Guando el n° de factores es inferior a 7, se pueden completar mediante factores ficticios “dummys” que no tienen sentido ni relevancia analitica, * Como en los casos anteriores, se trataria de realizar aleatoriamente los experimentos Seguin indica la matriz del diseno y proceder tras ello a la evaluacion estadistice ie los resultados.Robustez Materias primas y especialidades 103 Primero se calcula el efecto de cada factor mediante la expresi6n: Dw) TO Ve ne nla 2 5 Donde: E, = efecto del factor x ZY (+) = suma de los resultados del factor x en el extremo superior del intervalo definido ZY (-) = suma de los resultados del factor x en el extremo inferior del intervalo definido 11= n° total de experimentos Este efecto puede normalizarse al dividirlo por la respuesta media del experimento realizado a valor nominal ¥(0) de forma que: %Ex= * +100 Y) Asl, se puede ver facilmente cual es el porcentaje de influencia ejercido por un determinado factor y considerarlo significativo o no incluso sin realizar una interpretacién estadistica mas compleja. 7.3.2.4 Disefios factoriales de Youden-Steiner Este es uno de los métodos clasicos para estudiar la robustez (Youden, 1975). Permite estudiar la influencia 0 efecto resultante de la modificacion de 7 factores descritos en el método mediante 8 experimentos. Los valores nominales indicados para cada factor en el método corresponden a las letras mayisculas (A, B, C. etc.). Los valores alternatives o modificados estan indicados por letras minusculas (a, b, c, etc.). En.los 8 experimentos a ‘ealzar tiene que haber 4 parémetros en mayisculas (valores nominaies) y 4 en minusculae (valores alternativos) no tratandose pues de evaluar un intervalo simétrico de varlabilided sino un valor concreto. La matriz resultante es: i Factores Exp. Ala Bib Cie Did Ele Fit Gig RESULTADO aaa B Cc D E F G s 2A B Cc D e t a t SaEmrAl b =c d E f 9 uv 4A b c d e F G v Sa B Cc d e F “9 w 6a 8 Cc d E f G x 7a b i D e f G ~y Smee b c D E F Q z Para cada factor se calcula el efecto que supone utilizar el valor indicado en el método (Vp) y él alternativo (V4). Dicho efecto se calcula como la media de los resultados obtenidos on los experimentos en los que se ha utilizado. Por ejemplo, el efecto de cambiar el valor “D” por “d” se calcula:104 Materias primas y especialidades Robustez — Gettyes)_ (evans) Fas dliferencias més elevatas indicaran que los factores correspondientes tienen mayor influencia que el resto sobre la precision de! método. Estadisticamente una forma de decidir sila influencia de un factor es relevante consiste en comparar el valor del efecto con la expresién sV2, donde s es la desviacién estandar obtenida en el ensayo de repetibilidad del método. Las diferencias superiores en valor absoluto al resultado de esta expresin se consideran significativas, El sistema de Youden-Steiner como ocurre también con el disefio de Plackett-Burman, puede aplicarse cuando el n® de factores es inferior a siete. En este caso a los factores que Auedarian sin variable se les debe asignar una operacién sin influencia analitica ("dummy"). Logicamente, la diferencia para estas variables debe ser irrelevante iemplo En un método destinado al andlisis de un principio activo por HPLC se quiere evaluar el efecto sobre la eficacia de la columna (N) de los siguientes factores: omposicion de la fase mévil tiempo de espera antes de inyectar la muestra ‘Se define que los valores nominales y alternativos de estos factores son: Factor | Valor (nominal) Factor | Valor (alternativo) aA | 1.0 mifmin a 4.5 ml/min B | 40°C je ~ 25°C. c | 10 nl ; oe 20 u! D | Fabricante X loa | Fabricante Y —e | 76 } e 74 F | 70/30 ; ¢ 65/35 (Tampén 50 mMoi pH7.6/ACN) | | (Tampén 60 mol pH 7.SIACN ) cs | Thora a | 12 horas Se realizan los 8 experimentos, descritos en la matriz, de forma aleatoria y se Obtione los siguientes resultados respecto a la eficacia de la columna:Robustez Materias primas y especialidades 105 Experimento Resultado ——__(N) 6540 6250 4789 4890 4985 5010 6589 6160 ——_2__6160__ Se puede ahora calcular el efecto de cada factor: loNOaken| Efecto A = 1/4 (6540+6250+4789+4890) - 1/4 (4985+5010+6589+6160) = -68.75 Efecto B = 1/4 (6540+6250+4985+5010) - 1/4 (4789+4890+6589+6160) = 357 Efecto C = 1/4 (6540+4789+4985+6589) - 1/4 (6250+4890+5010+6160) = 1650 Efecto D = 1/4 (6540+6250+6589+6160) - 1/4 (4789+4890+4985+5010) Efecto E = 1/4 (6540+4789+5010+6160) - 1/4 (6250+4890+4985+6589) Efecto F = 1/4 (6540+4890+4985+6160) - 1/4 (6250+4789+5010+6589) = -63 Efecto G = 1/4 (6540+4890+5010+6589) - 1/4 (6250+4789+4985+6160) = 845 A simple vista puede observarse que el factor D (fabricante de la fase estacionaria) influye significativamente sobre la eficacia de la columna. 7.4 Comentarios y conclusiones Los estudios de robustez de un método de analisis permiten, por una parte, conocer la estabilidad de dicho método ante pequefias modificaciones de las condiciones descritas en ¢1y por tanto su independencia frente a éstas. Por otra parte, también permiten conocer en muchos casos las condiciones de trabajo éptimas en cada paso del procedimiento de andlisis. Por todo ello, la robustez no debe considerarse como un parametro de validacion en si Iana®: Sino como el estudio que permitiré conocer cuales son las condiciones optimas de trabajo para tas diferentes variables estudiadas, asi como cudles de ellas son criticas y han de ser mas estrechamente controladas. Se trata de validar el mejor de los métodos posibles, el método "éptimo".106 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema 8. IDONEIDAD DEL SISTEMA (SYSTEM SUITABILITY TEST) 81 Definicion entender como parte integrante del procedimiento de analisis y requisito previo @ su fealzacion. En la practica, podria equipararse a una cualificacion del proceso analltico (PQ) © una “revalidacién en continuo”, ya que proporciona la seguridad de que en el momento de iniciar el ensayo, e| conjunto del sistema continua siendo *valido" para el propésito para el que fue concebido. 82 Ambito de aplicacion El test de idoneidad del sistema es susceptible de emplearse en cualquier procedimiento de medida en el que las condiciones analiticas puedan estar sometidas a variacion de las condiciones operacionales. Por ejemplo, en procedimientos analiticos volumétricos se incluye la evaluacion del blanco y una precisi6n de los resultados obtenidos. Sin embargo, 2s en las técnicas cromatograficas donde éste tipo de pruebas se emplean con mayor asiduidad, Este test no solo debe circunscribirse al ambito de la determinacién final sino que puede disefiarse con el fin de comprobar la idoneidad de cualquier etapa del procedimiento, como or ejemplo la preparacién de la muestra. 8.3 Procedimiento de determinacién de la idoneidad EI test de idoneidad del sistema debe encontrarse vinculado de forma directa a las caracteristicas del método analitico para el que se establecié, ya que debe reflejar su viabilidad en el momento de empleario. Los requisitos que debe cumplir el método analitico se establecen desde la primera fase de desarrollo, aunque en esos momentos no es posible concretar la prueba que permitira comprobarios. Durante este periodo sera suficiente el registro de la evolucién de los distintos parémetros analiticos a Io largo del tiempo y la comprobacién de la precisién del sistema realizando medidas repetidas de una misma preparacién de muestra. Posteriormente, los resultados del estudio de robustez permitirin adquirir el conocimiento necesario para establecer los factores criticos y el impacto que éstos han tenido sobre el comportamiento del método. Este es el momento de disefiar las pruebas a realizar y establecer los criterios que permitan asegurar que los requisitos establecidos se cumpliran mas allé del momento concreto en el que se lleva a cabo la validacion propiamente dicha, Los ensayos de idoneidad del sistema que se establezcan vendrin dados por el conocimiento adquirido del método y la viabilidad de su empleo en rutina debiendo corresponderse con los valores minimos para los que los parametros estudiados Permanecen dentro de las especificaciones establecidas.LL eee ldoneidad del sistema ‘Materias primas y espécialidades 107 Estos ensayos no solo demuestran que el sistema se encuentra en perfectas condiciones ara realizar el andlisis sino que tambien permiten establecer el criterio por el que modificar is condiciones analiticas descritas en el procedimiento con el fin de slesnser is idoneidad. acciones a realizar en caso de no cumplirse 84 Parametros de evaluacion Los parametros de evaluacién de los ensayos de idoneidad se pueden agrupar en tres categorias: + Precision * Parametros cromatograficos: ~ Factor de capacidad (k’) » Numero de platos teéricos (N) * Factor de asimetria o de cola = Resolucién + Limites de deteccion o cuantificacien, Como se puede observar, las pruebas de idoneidad encuentran su mayor difusion dentro de las Sécnicas separativas, y por ello los parémetros de evaluacion son principalmente de Fite de aeieettenecientes a dos categorias, por ejemplo precision y résolucion Precision y limite de deteccién, 84.1 Precision del test de idoneidad del sistema @eeficiente de variacion igual o inferior al 2% en la inyeccion de ¢ replicados (0 real sobre 6 replicados si el requerimiento es superior al 2%) La guia de la FDA (Nov. 1994) recomienda un coeficiente de Variacion inferior al 1% para un imisimo de cinco inyecciones en el caso de principio active, ‘aceptando valores del 5-15% cuando se trata de impurezas o productos de degradacion.108 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema Numero de inyecciones 3 4 CV (%) maximo per 02% 0.30 0.37 215 0.31 0.44 0.55 #20 0.41 0.59 0.73 0.85 £25 0.52 0.74 0.92 1.06 #30 0.62 0.89 4.40 4.27 — $30 __062 obo tz La precision es el parémetro de mas amplia aplicacion para la evaluacién de la idoneidad det sistema. Aunque habitualmente se estudia sobre el area del pico cromatogréfico, también Puede evaluarse sobre la altura o el tiempo de retencién. Este ultimo permite dar una idea de la estabilidad del sistema en un momento determinado aunque sera dificil utilizarlo como un referente entre dias, porque sus cambios no tienen porqué afectar al resultado obtenido, Si la precision del tiempo de retencién se considera un factor critico es mas aconsejable expresarlo como tiempo de retencién relativo o factor de capacidad, o mejor atin, calcular la resolucion entre los picos de interés, 8.4.2 Parametros cromatograficos 8.4.2.1 Factor de capacidad (k’) EI factor de capacidad, también definido como relacién de distribucién de masa (D), se interpreta como el numero de volimene’ de fase mévil necesarios para eluir un compuesto después del volumen inicial contenido en la columna (tq). Este factor determina la retencién de un soluto y puede ser calculado como: te Roto Donde: tiempo en el que un compuesto no retenido pasa por el interior del sistema tiempo de retencién del compuesto considerado, Valores bajos de k’ indican que el pico eluye muy proximo al frente de solvente, pudiendo verse comprometida la selectividad. Son recomendables valores de k’ superiores a 1, consiguiéndose una éptima resolucion con valores mayores de 2. 8.4.2.2 Numero de platos teéricos (N) EI numero de platos teéricos es una medida de la eficacia del sistema cromatografico, que expresa el nimero de picos que pueden aparecer en el cromatograma por unidad de tiempo Y, Por lo tanto, de la capacidad del sistema de proporcionar bandas de elucion estrechas, El calculo de! numero de platos teéricos se basa en la relacién entre el tiempo de retencién y la anchura del pico cromatografico pudiendo emplearse distintas formulas tales como las que a continuacién se detallanOO _ TLL Woneidad del sistema * Materias primas y especialidades 109 [+ Farmacopea Europea y Japonesa ANCHURA 01 50% (Opcional en USP para integradores electrénicos). eh temo oe R,¥ RETENCIGN N= ay] Donde: Ry = tiempo de retencion W= anchura de pico al 50% de la ae altura Anche SD ‘elo are > eee ANCHURA por TANGENTES RY waio-(Fr) TeMPo De RETENOON Donde: R, = el tiempo de retencién I W= la anchura del pico en la linea de 7 base determinado por ta SA Bot tangente ajustada a un % de la altura del pico Otros calculos se basan en la asimetria del pico (Foley, 1983) 0 en la extrapolacién de éste auna campana de Gauss. {es parametros sobre los que se puede incidir para modificar el numero de platos tebricos sen la columna o soporte (longitud, calidad, tamafio de particula) y las diversas condiciones fomatograficas definidas en el método (temperatura, flujo, fase movil, etc.) Elnimero de platos teéricos depende del tiempo de elucién pero en general se recomienda Que sea superior a 2000. Este parametro tiene especial interés en las Pruebas de idoneidad te! sistema donde existe un solo pico de interés dentro del cromatograma y en el estudio ag tazas como complemento a la comprobacién del limite de deteccion, En otros casos es mas fecomendable el estudio de la resolucién. 84.2.3 Factor de asimetria o de cola factor de asimetria o de cola es una medida de la asimétrica de la sefal generada por el analto. Existen varias férmulas de célculo que toman la anchura de ambos lodee del pico a Gistintas alturas, siendo la mas habitual en las Farmacopeas.110 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema Woos TOF Donde: Woes= anchura de pico al 5% de la altura del pico. F= distancia entre la perpendicular ae I tazada desde el maximo del oe pico y el frente al 5% de la altura leanctuna est —o] del pico. Un pico perfectamente simétrico tendra un factor de cola de 1.0. Un pico que presente un ensanchamiento por el inicio del pico tendra valores inferiores a la unidad, mientras que si presenta cola el factor de asimetria serd superior a la unidad. ‘Como norma general el factor de asimetria deberia encontrarse entre 0.8 y 1.5, aunque pueden aceptarse valores de hasta 2.0. Las sefiales simétricas son preferibles porque minimizan las imprecisiones en la deteccion del inicio y el final del pico por parte de los sistemas de integracién. Por lo tanto, permiten tuna mejor y mas precisa cuantificacién del area bajo la curva. Accontinuacién, se muestran dos cromatogramas: ‘+ Cromatograma A: tres picos perfectamente simétricos (factores de cola de 1.0) + Cromatograma B: los mismos tres picos pero variando sus factores de asimetria: Pico 1: factores de cola de 1.0 Pico 2: factores de cola de 2.0 Pico 3: factores de cola de 4.0 PoIdoneidad del sistema Materias primas y especialidades 111 EI pico 3 del cromatograma B no tendra una precision tan buena como su homélogo del Gomatograma A al presentar mayor dificultad para detectar el inicio y final por el sistema Ge integraci6n, La presencia de picos asimétricos también puede incrementar el limite de deteccién, Gifcultar ta tesolucién entre picos y la reproducibilidad a largo plazo debida a la variabiiced entre lotes de columnas con distintos efectos de retencién secundaria, Otras posibles causas de asimetria en los picos se pueden atribuir a + Muesira sobrecargada, disolvente inapropiado o mal inyectada + Suciedad en los fitros (fritados) * Volumen vacio 0 suciedad en cabeza de columna + Envejecimiento de ta columna * Calidad de la columna (contenido en metales pesados, silanoles libres) ‘+ PH de la fase mévil (tampén) El test de idoneidad del sistema permite el control del factor de cola y establece las Pautas Para corregir la aparicién de picos asimétricos. 8.4.2, 4 Resolucién La resolucién es la medida de la separacién entre dos picos. Este parémetro resulta muy util para comirolar el comportamiento de posibles interferencias. La formula de caloulo para la resolucin es: Cw bee a tre Rs7 112 Materias primas y especialidades Idoneidad del sistema salen tery tke= tiempo de retencién (tiempo de elucién del maximo del pico medido desde el inicio de la inyecci6n), ta <'tee C= constante cuyo valor varia seguin el criterio con el que se mida la anchura de pico Wy W2 = anchura del pico a media altura, C=1.18 (EP y JP) W1 y W’ = anchura del pico por tangentes, C=2.0 (USP) Para realizar el calculo la anchura de pico y el tiempo de retencién se deben expresar en las. mismas unidades. El valor minimo de resolucién aceptable deberia ser aquel que permita la resolucion a linea de base entre los picos de interés. Se entiende como resolucién a linea de base la obtenida cuando la sefial correspondiente .a las ultimas trazas de analito llega a linea de base antes de que las primeras trazas del siguiente analito en eluir sean detectadas. Ahi Rs=1,.0 Rs-1.5 Ris=2.0 Para picos de tamatio similar se alcanza una resolucién a linea de base con valores de 1.5, ‘aunque es deseable fijar una resolucion mayor de 2.0 0 si se espera la aparicin de posibles‘doneidad de! sistema Materias primas y especialidades 113 lente, producto de degradacién, patrén interno, etc.). Se Guede considerar que la resolucion se encuentra minimamente afectada por la relacicn de areas entre compuestos, aunque si la relacién es muy desproporcionada, cong ones Pre ctv © impurezas, se debe tener en cuenta que la posible asimetria del Mayoritario no afecte al menor. 8.4.3 Limites de deteccién o cuantificacion Fata determinadas aplicaciones puede ser interesante el control de otros parémetros Simllares como el ruido de fondo y la deriva de la linea de base, por ejemplo para controle: {a estabilidad de la temperatura, la mezcla de fase mévil o la estabiliday de algunos detectores (indice de refraccion), Por la naturaleza de este parémetro su aplicacion sera de eleccion en cualquier método (cromatogratico 0 no) utiizado para la determinacién de impurezas. Una vez establecide Io Solucién de prueba del nivel adecuado, a comprobacién y célculo del limite se realizara Por cualquiera de los sistemas propuestos en esta Monografia: 8.5 Comentarios y conclusiones Las pruebas de idoneidad del sistema han de ser entendidas como parte integrante de! Procedimiento de analisis y en general su realizacién es un paso previo a la aplicacién fulinaria del método. Sus resultados permiten demostrar que los equipos funcionan correctamente y que la determinacion se realizara en las condiciones descritas durante la validacién. No deberian considerarse validos aquellos resultados obtenidos sin superar estas pruebas. EI ambito de aplicacién de las pruebas de idoneidad del sistema no debe centrarse exclusivamente en las técnicas cromatograficas, ya que pueden establecerse Comprobaciones similares en otras técnicas analiticas distintas. Para que las pruebas de idoneidad del sistema cumplan su funcién deben disefarse Considerando las caracteristicas de cada anélisis. Para ello, es importante que se basen en ies resultados obtenidos en el estudio de la robustez. Los requisitos minimos a cumplit (Precision, resolucion, limite de deteccién, etc.) dependeran de la exigencia necesaria para Cada aplicacién, Por este motivo no es recomendable la utilzacién de limites genéricos para todos los tipo de determinaciones. Las pruebas de idoneidad del sistema deberian incluir las iniciaciones de ajuste a realizar ‘cuando los criterios establecidos no se hayan cumplido.r 114 Materias primas y especialidades Transferencia de métodos analiticos 8. TRANSFERENCIA DE METODOS ANALITICOS 94° De i6n y generalidades Después de haber validado un método analitico, en un laboratorio puede surgir la necesidad @ransferirlo a otro centro. La transferencia de un método consiste en demostrar que el laboratorio receptor puede obtener resultados analiticos comparables a los det laboratorio emisor. Dicho de otra manera, es el proceso de verificar, dentro de un laboratorio, que un método previamente validado en otro ambito conduce a resultados flables (Rius, 2000), Aunque alin no hay ninguna guia sobre transferencia de métodos analiticos realizada por Seneral eect eon caph '@ ICH, 0 las Farmacopeas oficiales, existen opiniones generalizadas de como deberia hacerse (Lanese, 1998). Cuando se realiza una transferencia, lo mas habitual es que el emisor sea el laboratorio de HO que ha desarrollado y validado el método analitico y que el receptor sea el laboratorio de {anol de calidad, Pero no siempre es asi, ya que también puede darse el caco en que el laboratorio emisor sea un laboratorio que previamente ya haya transferdc, el metodo actuando como receptor 0, que se trate de laboratorios de analisis de companias diferentes. Es importante remarcar que el laboratorio receptor que desea utilizar Para el analisis de tuna un método analitico previamente validado, es el responsable de asegurar que dicho 92 Ambito de aplicacién No todos los métodos analiticos necesitan ser transferidos Ensayos que requieren transferencia analitica incluyen: * aguéllos donde se valora la riqueza y/o sustancias relacionadas en una ‘materia prima * 2s principios actives, conservadores y/o sustancias relacionadas on una especialidad farmacéutica * aquellos que se consideran crticos para el producto o bien que Fequieran especial Cuidado (viscosidad), ; Los métodos analiticos estandar como Monografias de Farmacopea no necesitan ser transferidos ni los de tipo cualitativo o semicuantitativo de loe que hay amplia experiencia (metales pesados, cloruros, pH, etc.). En cualquier caso ve tomaran las precauciones habituales de cuando se analiza algo desconocido por primera vez, Antes de iniciar ta transferencia analitica el laboratorio de origen 0 emisor debe suministrar: a) una copia vigente de! Método analitico (por lo tanto, con las modificaciones realizadas) 5) una copia del informe de validacién de dicho método <) Palrones de referencia con su correspondiente certilicado de ahdlisisTransferencia de métodos analiticos Materias primas y especialidades 115 Si se diera el caso de que el método ha variado, debe haber una revalidacién de éste o bien, una justificacién de que los cambios no afectan la validacion, La documentacién necesaria durante una transferencia analitica puede dividirse en cinco Categorias (Nordic Committee on Food Analysis, 1997): 1) Procedimiento analitico segin el formato del laboratorio receptor, reflejando los, Getalles concretos de la metodologia analitica para asegurar qué el mated oo aplica siempre del mismo modo, 2) Protocolo: éste debe ser claro, conciso y aprobado por ambas partes. Se incluye tun modelo de protocolo de transferencia (ejemplo 1). 8) Documentacién de los datos primarios (raw data) del trabajo experimental, 4) Documentacién de la evaluacion de los resultados. 5) Informe final, que incluiré una recopllacion de los resultados de la transferencia, La documentacién debe incluir también el informe de ta validacién analtica, el Protocolo 0 Procedimiento de transferencia aplicado, los responsables de la transferencia, los mucatran Ge an sido analizadas, los resultados del andlisis levado a cabo, como se han trsteds dichos resultados y el criterio de aceptacion.