CAPITULO 5 CONTAMINACION MICROBIANA EN EL CULTIVO IN VITRO DE PLANTAS Yelenys Alvarado Capé INTRODUCCION Ev exito de tos sistemas de propagacién de plantas por biotecnologta depende en gran medida del control y prevencién de la contaminacién microbiana. Hoy en dia la contaminaci6n es uno de los principales y més severos problemas para los micropropagadores de plantas en el mundo, es un fenémeno multicausal que debe tenerse en cuenta desde la concepcién misma de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales. Factores tan disimiles como el disefio arquitect6nico de los locales de trabajo, la procedencia y edad del explante inicial, la higiene ambiental o la habilidad y preparaci6n técnica de los operarios, entre otros, pueden favorecer o controlar la incidencia de contaminantes microbianos. Como contaminantes frecuentes en el cultivo in vitro se menciona a los hongos filamentosos, las bacterias y las levaduras, Muchos no son conocidos por provocar dafios a las plantas en campo y_ sin embargo se convierten en Patégenos in vitro, Herman (1987) sugiri6 el término “vitropatégeno” para designarlos. Los microorganismos provocan pérdidas cuantiosas de material vegetal en los Procesos productivos o de investigacién. En Jas zonas tropicales, si no se tiene en cuenta, este problema puede alcanzar proporciones incalculables porque las condiciones climaticas favorecen el desarrollo y multiplicacién de los microorganismos, 1. Pres Rance, ed), Popaacén y Mejra Cena de tas por Bictcraegls pp. 8-104 11990 nut de Bech de ls Pans, Sata Cla, preso en Cubs —rsvarreauucurr CzAlvarado Cap Si i “er “ao nega sobre Us vitroplantas puede ser considerable si tenemos Su efecto ne; iten con ellas por los nutrientes del medio y les provocan en cuenta que ee por la colonizacién de sus tejidos 0 la expulsi6n al irectos e i in daos direct Itivo de metabolitos téxicos. De esta forma pueden reducir los medio de cultivo ‘én, inhibir el enraizamiento y ocasionar la muerte coeficientes de multipicaci 1991a; George, 1993). de la planta(Cassells, 1991; Leifert y col., Ena lucha por prevenit o eliminar la contaminacion polars enel cultivo in vitro de plantas se han ensayado y puesto en practica Gs erentes alternativas que van desde el incremento de las medidas de asepsia, fratarniento de las plantas donantes, hasta el subcultivo de las plantulas en medio de cultivo con productos antimicrobianos de origen sintético o natural. ESTRATEGIAS. PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION Hay vias para controlar y manejar la contaminacién pero es necesario determinar el tipo de contaminante y las fuentes de contaminacién para poder seleccionar los mejores métodos, MICROORGANISMOS CONTAMINANTES Todos los propagadores de plantas Por cultivo de tejidos se han visto ante el fenémeno de observar sus'pléntulas, callos, etc., contaminados; pero son pocos los que prestan atencién a qué tipo de microorganismo es. Algunos llegan a contentarse solo con saber que son bacterias u hongos. En el caso de las levaduras por la similitud de sus caracteres culturales se Confunden con mucha frecuencia con bacterias y esa es la causa de que en la mayoria de los laboratorios la Contaminacién bacteriana se estime mucho més alta de lo que en realidad es (Leifert y col., 1994), de personal especializad . lo en estas tareas en os lal i vo de tejidos. En Cuba, con la finalida ns ge ce id de que los problemas fitosanitarios, pudieran ‘ idad las biofabricas se Construyeron en dreas anidad Vegetal, Ademés centros de investigacién Ser resueltos con mayor fa clic aledafias a laboratorios de Lovaricauy Lun CéContaminacién Microbiana icrobi en el Cultivo in vit microbiana. e! Cultivo in vitro Concer el tipo y caracteristicas del microorganismo contaminante y lograr ubicarlo taxonémicamente ayuda a determinar las fuentes de contaminacién y proporciona informacién valiosa para trazar las estrategias de control mas adecuadas. Ademés de i) hongos filamentosos, las bacterias y las levaduras, algunos orgartismos fastidiosos como os virus, viroides, micoplasmas y rickettsias asi como bacterias fitopatégenas se refieren a menudo como contaminantes en procesos de micropropagacién de plantas carentes de un sistema de diagnéstico para pat6genos. En este capitulo nos referiremos solo a los microorganismos contaminantes (para pat6genos, ver capitulo: Obtencién-de plantas libres de patdgenos). Los microorganismos pueden introducirse en el proceso tanto con el explante inicial como en el laboratorio, De esta forma, se reportan contaminantes end6genos, latentes, o subliminares cuando aparecen asociados- al explante en las diferentes fases de la micropropagaci6n y por otra parte se alude a aquellos microorganismos que se introducen en el laboratorio por técnicas inadecuadas de trabajo. Contaminacién endégena o latente Cuando se reporta contaminacién endégena se hace referencia a bacterias pat6genas o no y a organismos fastidiosos ya que aparte de ciertos patégenos obligados los contaminantes fungosos no deben encontrarse latentes en los cultivos in vitro. Las bacterias son consideradas por muchos autores como los contaminantes mds comunes y las que cocasionan los problemas més serios, después de los virus, porque pueden ser sistémicas y su detecci6n es mas dificil (George, 1993; Leifert y col., 1994). Se han aislado especies de bacterias pertenecientes alos géneros: Micrococcus, Bacillus, Staphylococcus, Mycobacterium, Pseudomonas, Enterobacter, Acinetobacter, Xanthomonas, Lactobacillus, Erwinia, Agrobacterium, Corynebacterium, entre otros (George, 1993; Barrett y Cassells, 1994; Leifert y col., 1994; Reed y col.,1995). \e Lovalicauy vull UCYelenys Alvarado Capo En la micropropagacién de papa, variedad Désirée, por ejemplo, Enterobacter agglomerans fue hallado como contaminante de alta frecuencia de aparicién en la fase de multiplicacién. Esta bacteria se observé después de varios subcultivos donde no se habfa apreciado visualmente contaminacién bacteriana en los lotes de plantas analizados. Los aislamientos de la zona adyacente a las plantas en el medio de cultivo coincidieron con los de las zonas basal, media y apical de las plantas comprobdndose el cardcter endofitico de esta bacteria. También pudo ser detectada en estas zonas cuando se aplicé un método turbidimétrico propuesto por Herndndez y col. (1996). Se comprobé ademas que en medio liquido provocaban dafios severos a las plantas inhibiendo la brotaci6n y ocasiondndoles la muerte. Enterobacter es un género que tiene amplia distribucién en la naturaleza y algunas de sus especies son patdgenas del hombre y los animales. Especificamente E. agglomerans puede ser aislado de plantas, flores, semillas, vegetales, suelo, el hombre y los animales (Richard, 1986). Contaminantes microbianos introducidos en el laboratorio Los microorganismos que se introducen en el laboratorio son generalmente habitantes del suelo que se encuentran en el ambiente; sapr6fitos o pat6genos de las plantas, asi como habitantes de la microbiota normal del cuerpo humano que se relacionan con procederes inadecuados en el laboratorio, condiciones higiénico sanitarias deficientes o incumplimientos de la disciplina tecnolégica. Giertas bacterias entran al cultivo. de tejidos con los explantes iniciales pero otras son claramente introducidas en el laboratorio. Entre | i los hongos filamentosos contaminantes, los géneros encontrados con mayor frecuencia han sido Aspergillus, Alternaria y Neurospora (Enjaltic y col, Y col., 1997), ; Cladosporium, Penicillium, Fusarium, 1988; Danby y col., 1994; Alvarado i6n se detallard mas | Lovaiicauy vvil CzContaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro adelante. DETECCION DE LOS MICROORGANISMOS CONTAMINANTES Los contaminantes fungosos no son dificiles de detectar en el medio de cultivo pues su crecimiento es visible en forma de colonias aisladas o alrededor de los explantes. Los caracteres culturales del crecimiento fungoso no difieren del que se observa en medios de cultivo micoldgicos LaS bacterias también crecen superficialmente en el medio de cultivo de las plantas, alrededor de los explantes y dentro del propio medio de cultivo. Se puede observar ademas crecimiento sobre el material vegetal, principalmente cuando existen tejidos necrosados. Cuando estos microorganismos se encuentran asociados al tejido vegetal no se distinguen colonias aisladas sino una masa bacteriana que adopta las formas de pliegues, halos o rosetas en el interior del medio de cultivo sélido y muestra abundante o escaso crecimiento sobre la superficie. Sus colores y texturas varian con la especie y en muchos casos con la composicién del-medio de cultivo. En el medio liquido las bacterias, forman turbidez uniforme o no, peliculas o sedimento. Sin embargo, para el caso de las bacterias la afirmacién de que los cultivos estén libres de contaminantes por apreciacién visual de la ausencia de crecimiento en el medio de cultivo puede conducir a certificaciones erréneas. A diferencia de los hongos filamentosos y las levaduras, las bacterias a menudo no producen crecimiento visible sobre el’ medio 0 sintomas en las plantas hasta mucho tiempo después de que fueron introducidas. Las altas presiones osméticas, el pH y determinadas hormonas pueden inhibir o limitar el crecimiento de las bacterias (Leifert y col., 1994). Por ejemplo, se ha comprobado que las citoquininas ejercen un efecto bacteriostatico sobre ellas (Boxus y Terzi, 1988; Duhem y col. 1988). Por estas razones se precisa de métodos de deteccién répidos y seguros. Uno de los més utilizados es la transferencia de fragmentos de material vegetal a medios de cultivo bacteriolégicos que permiten el crecimiento de un gran ndmero de representantes bacterianos y aunque algunas especies requieren de medios especificos se obtienen buenos resultados utilizando 2 6 3 medios de cultivo (Leifert y col., 1994; Reed y col., 1995; Borrds y col., 1996). Ademas 85 Lovancauy vu CeYelenys Alvarado Capo “se reporta la utilizacin de componentes de medios de cultivo bacteriolégicos en el medio de cultivo de las plantas (Boxus y Terzi, 1988) y el empleo de métodos turbidimétricos (Leifert y col., 1989; Meyner y Arnould, 1989). Otro ejemplo de estos ciltimos es el desarrollado por Hernéndez y col. (1996) que no es destructivo y permite procesar un ntimero elevado de muestras en 24 horas con un gasto minimo de recursos. Dicho método ha sido aplicado con éxito en el IBP por dos aos permitiendo trazar estrategias adecuadas para el control de la contaminacién bacteriana en la propagacién masiva de papa. Para la deteccién de bacterias contaminantes se ha comprobado que es més factible utilizar fragmentos de tejido que savia o extractos de plantas ya que sustancias como los taninos pudieran inhibir el crecimiento de dichos microorganismos sobre medios bacteriol6gicos (Cassells, 1991). IDENTIFICACION DE MICROORGANISMOS CONTAMINANTES * Para la identificacién de los microorganismos contaminantes se emplean los métodos tradicionales auxiliados de los manuales de clasificacién segin el grupo microbiano en estudio. Suele ocurrir, sobre todo con las bacterias, que las claves taxonémicas, sistemas automatizados, kit de diagnéstico, etc., de forma general se han disefiado para gérmenes de interés clinico o para bacterias fitopatégenas y a menudo resultan inadecuados para la clasificacién de contaminantes de los cuales, muchas veces, se desconoce su origen. No obstante técnicas como el andlisis de 4cidos grasos, PCR, RFLP y AFLP se incorporan para microorganismos especificos de un cultivo. Por la complejidad del problema y la gran variedad de plantas que se propagan Por biotecnologfa es preciso que se estudien las caracteristicas de la microbiota que se desarrolla in vitro bajo las condiciones especificas de un pals, biofabrica © laboratorio para disefiar los métodos de deteccién y control en funcién de esto. PRINCIPALES FUENTES DE CONTAMINACION Se considera que la contaminacién por microorganismos es un problema 86 n- Lovaricauy vvuil UCContaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro multicausal. La determinacién exacta de la fuente de contaminacién retrospectivamente a menudo se dificulta serintroducidos en varios puntos del pro Alvarado y col., 1997). Ya que los microorganismos pueden eso productivo (Leifert y col., 1994; Es conveniente emplear microorganismos indicadores Para sefialar la fuente de contaminacién (los microorganismos indicadores son aquellos que se detectan en estados especificos, son los contaminantes Primarios bajo condiciones determinadas (Leifert y col., 1994), Los microorganismos pueden entrar al proceso productivo, principalmente, por ineficiente desinfecci6n de los explantes primarios utilizados en la fase de establecimiento, por inadecuada manipulacién del material vegetal, deficientes técnicas de asepsia, incompleta esterilizacién del medio de cultivo, por fallos en el funcionamiento de las cabinas de flujo laminar, 0 a través del ambiente de los locales. Ademas pueden diseminarse en las habitaciones por dcaros, trips, y hormigas El explante inicial En dependencia del tipo de explante utilizado los microorganismos superficiales 0 endofiticos de las plantas pueden ser introducidos al cultivo in vitro. Con el cultivo de meristemos, segtin el tamafo que se establezca, pueden ser eliminados muchos de ellos pero en explantes de hojas, peciolos o tallos en su mayoria pueden ser introducidos (Cassells, 1991). Los métodos de desinfeccién utilizados no siempre eliminan las poblaciones de microorganismos asociadas a los tejidos de las plantas in vivo, muchos son capaces de permanecer latentes en el interior de las células, en los espacios intercelulares o en los haces conductores y quedan protegidos de los agentes quimicos, De esta forma se introducen en el cultivo de tejidos, se propagan con el material vegetal y pueden manifestarse sobre los medios de cultivo en la fase de establecimiento o permanecer sin expresarse por largos perfodos de tiempo. Muchos microorganismos necesitan un perfodo de adaptacién a las nuevas condiciones ecolégicas y aumentar su ndmero. Debido a la inhibicién ocasionada por altas concenttraciones de sales, sacarosa o el pH, solo se manifiestan en condiciones de estrés (Cassells, 1991). 7 ay. Lovaiicduy cui veYelenys Alvarado Cap an : Para determinar siel explante inicial fue la fuente de contaminacién se requiere microorganismos que se encuentran asociados a la planta in vivo conocer los Generalmente los contaminantes i los que aparecen in vitro. yrelacionarlos con taminantes de la fase de establecimiento y muchos de los que aparecen “de stibito’ depués de varios subcultivos de las plantas y que afectan por igual a un lote de similar origen son microorganismos asociados a las plantas en la naturaleza. Por ejemplo, en estudios realizados en fase de establecimiento in vitro de cinco variedades de cafia de azticar las pérdidas por microorganismos, clasificados tentativamente en base a sus caracteres culturales como bacterias, se calcularon entre el 15 y el 34%. Al analizarlos microscépicamente se comprobé que del total de contaminantes analizados el 81.7% eran bacterias de las familias Enterobacteriaceae_y Pseudomonadaceae y el restante 18.3%, levaduras. Entre los géneros bacterianos identtificados se encontraron patégenos sistémicos de la cafia de azdcar y sapr6fitos descritos anteriormente como asociados a este cultivo lo cual demuestra su introduccién por el explante Las familias Enterobacteriaceae_y Pseudomonadaceae han sido reportados como los contaminantes principales en la fase de establecimiento in vitro ya que a menudo predominan en la naturaleza asociadas a la superficie aérea de las plantas ( Leifert y col., 1994), El ambiente El ambiente de los locales de trabajo es una fuente de contaminacién ya sea directa o indirectamente. A través de las corrientes de aire las particulas de suelo cargadas de esporas y células de mictoorganismos son arrastradas y Penetran en los locales de trabajo por los acondicionadores de aire, transportadas e introducidas por el hombre Y permanecen en el ambi Por condiciones higiénicas inadecuadas, son iente bajo influyen varios factores que lo i her ncrementan o disminuyen. Uno de ellos es el disefio arquitecténico de las instalaciones, 88 Lovancauy wun Ce/ / Contaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro Para realizar cultivo de tejidos se requiere del mantenimiento de condici asépticas. Las habitaciones que se Construyen més cercanas al suelo — mayores probabilidades de que los mictoorganismos arrastradoe pe, 1. corrientes aéreas penetren en los anata: a mismos. Si a esto se une el uso de acondicionadores de aire domésticos Para regular la temperatura de incubacién de las plantas, los cuales intercambian constantemente exterior, las probabilidades de entrada de microorganist una de las razones por las que en Cuba los disefios de biofAbricas comprenden el area aséptica en la planta alta de las instalaciones (ver capitulo: Disefio de instalaciones para la propagacién comercial), aire con el ambiente mos se elevan. Esta es Por otra parte el empleo de ventanales de cristal y clarabollas para permitir la incidencia de la luz solar en las cémaras de crecimiento Puede convertirse en un factor que incremente el contenido microbiano del aire si Presentan fisuras o deficiente impermeabilizacién. En anilisis microbiol6gicos al ambiente’ de locales de trabajo del érea aséptica en dos laboratorios de cultivo de tejidos (con capacidad de produccién de 2 y 5 millones de vitroplantas anuales, respectivamente) se pudo comprobar que el 90% de los géneros fingicos aislados habian sido reportados como habitantes del suelo y muchas especies de los géneros bacterianos de mayor frecuencia de aparicién tenian también como hébitat natural este sustrato. Ademés, se establecié correlacién entre los microorganismos aislados como contaminantes de las vitroplantas y los reportados en el ambiente. (Alvarado y col., 1993, 1997). Si tenemos en cuenta que ademés de la contaminacién introducida por el operario, las vitroplantas pueden contaminarse en las habitaciones destinadas a su crecimiento donde ocurre intercambio entre el interior del frasco de Cultivo y el ambiente exterior y que el perfodo de permanencia de las plantas en estos locales es prolongado, debemos concederle atencién permanente al estricto mantenimiento de la limpieza para disminuir la carga microbiana ambiental. La organizacién del proceso productivo juega también un papel muy importante. Cuando en una misma area se entremezcla la entrada de material 89 Xe Lovaricauy vvuil UCYelenys Alvarado ‘Capo limpic (rascos con medio de cultivo, a la sali iales estériles, etc.) Con -_ ici: Bice minados, etc.) las condiciones son propicias para que se frascos conta , ete lesar n que se extienden répidamente. desarrollen focos de contaminaci6n qu ienden répidament rr vitroplantas para subcultivar, instrumentos ida de material sucio (desecho de plantas, El hombre nte en todas las operaciones que se realizan yes una fuente primaria de contaminantes a la conversacién, etc. La presencia de microorganismos contaminantes que son habitantes de 'a microbiota normal del cuerpo humano como por ejemplo: Staphylococcus epidermidis o Candida albicans, generalmente indica ineficientes técnicas de asepsia por parte de los operarios (George, 1993; Weller, 1996). El hombre interviene directame! en el cultivo in vitro de plantas través del estornudo, la tos, En el trabajo dentro de la cabina de flujo laminar es donde el operario puede introducir la mayorfa de los microorganismos. Los protocolos para el subcultivo del material vegetal incluyen operaciones donde se seccionan las plantas, callos, embriones etc. 0 se cambia el medio de cultivo a las suspensiones celulares. Incumplimientos de la disciplina tecnolégica que pueden ir desde el lavado incorrecto de las manos, la disposicién inadecuada de los frascos e instrumentos dentro de la cabina frente al flujo de aire, pasar las manos y brazos por encima de los frascos destapados con medio de cultivo, hasta la no limpieza de los mismos antes de ser utilizados, contribuyen al incremento de la contaminacién, 2 pee Por impresién digital a las manos de seis operadoras después efectuado el lavado y antes de comenzar a trabajar Alvarado y col. (1997) determinaron insuficiencias en esta operacién, A las operati rific’ el mayor ndmero de baiterias y h oe moat es \ongos fil . de pérdidas més elevados, '80s filamentosos mostraron los indices Lovaricauy vuln CéContaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro muy costosas: Los microorganismos contaminantes que el hombre puede introducir aqui se multiplican répidamente en los medios de culo que generalmente son enriquecidos y que se incuban en condiciones de agitacion ytemperaturas favorables para su crecimiento. Las bacterias en este caso son los contaminantes més frecuentes. Por ejemplo en suspensiones contaminadas de cafia de azticar se han identificado bacterias de los géneros Micrococcus y Staphylococcus que demuestran la intervencién del hombre. Se debe hacer referencia ademas a que no solo los operarios que trabajan en cabinas de flujo laminar pueden introducir contaminacién. En este fenémeno intervienen todos los que de una forma u otra participan en el Proceso. Muchas veces este es un aspecto que se descuida en los andlisis. El personal técnico y auxiliar juega un papel muy importante en el fregado y limpieza de los frascos, en la preparacién de los medios de cultivo, en el control de la calidad del proceso, etc. y cada uno desde su puesto de trabajo puede contribuir a diseminar 0 controlar la contaminaci6n. Los equipos y el instrumental Enel cultivo de tejidos vegetales se emplean varios equipos, por la importancia que revisten para el tema que trata este capitulo nos referiremos a algunos de ellos, Laesterilizaci6n por calor hmedo en autoclave se emplea cominmente para eliminar los microorganismos de los medios de cultivo, ya sea cuando se esteriliza el medio junto con el frasco de cultivo como cuando se prepara, se esteriliza y luego se distribuye, De la calidad de este paso depende en gran ‘medida la continuidad del proceso. Los problemas en la esterilizacin pueden deberse a fallos en el funcionamiento de las autoclaves o a errores en su manipulacién. Determinados ‘™microorganismos son particularmente introducidos por esta via. Ejemplo de ello es el género Bacillus que puede contaminar los medios de cultivo por insuficiente esterilizacién o mal funcionamiento de las autoclaves y puede ser diseminado durante las operaciones con el material vegetal. ( Boxus y Terzi, 1987; Leifert y col., 1994). Las colonias bacterianas pueden detectarse dentro del_medio de cultivo a partir de las 24 horas de preparado y posteriormente 1 Lovaicauy Lun CéYelenys Alvarado Cap6 erficie ocasionando dafos severos a las plantas. Esta problematica es muy comtn en las biofabricas y por ejemplo en un ee de Jantas de papa en fase de multiplicacién destruyé més del 95% de las plantas iss ahf la importancia de mantener en reposo uae de cultivo por 24a 72 horas para verificar la calidad de la esterilizaci6n. emergen a la sup Las cabinas de flujo laminar si funcionan adecuadamente proporcionan condiciones de asepsia para el trabajo en biotecnologia vegetal pero esto depende en gran medida del uso, cuidado y revisién periédica de los filtros. Otros equipos que pueden introducir contaminacién son los destinados al tratamiento del agua (desionizadores, destiladores, etc.). Por fallos en el mantenimiento 0 procederes inadecuados, en sus resinas pueden abrirse oquedades donde los microorganismos, principalmente bacterias, se sitéan y multiplican. ‘Aunque ya se ha hecho referencia a los equipos de climatizacién (especificamente a los acondicionadores de aire domésticos) es meritorio sefialar que en los laboratorios con clima centralizado también estos equipos pueden introducir ydiseminar contaminaci6n. Cuando se combina la limpieza ineficiente de los cuartos de las consolas con la existencia de focos de contaminacién y se producen fluctuaciones de temperatura; en los conductos de aire hongos filamentosos como Cladosporium sp. se pueden multiplicar y ‘Sus esporas se esparcen por todas las dreas. Por otra parte, los instrumentos utilizados se esterilizan comGnmente por calor seco o se flamean en alcohol. Precisamente si no se flamean suficiente tiempo las esporas de Bacillus sp. pueden sobrevivir y Contaminar los cultivos. Agramonte y col. (1993) introdujeron en Cuba el uso del hipoclorito de sodio en sustitucién del flameo. Dicho : Proceder garantiza una alta efectividad e incrementa la productividad pero ; el desinfectante debe estar correctamente valorado para que la concentracién utilizada sea la adecuada. Ademés deben usarse varios juegos de pinzas y bisturf para permitir un tiempo de inmersién correcto, X- 7 Lovalicauy vVLvVIlI ucContaminacién Microbiana en el Cultivo in viro Insecto una répida aparicién de contaminantes fui INgiCos en muchos frascos a la vez dentro de una cémara de cultivo puede ser evidencia de la Presencia de scares, tips u hormigas que aunque no provocan graves dafos alas plantas given como vectores para esparcir la contaminacién (George, 1993; Roca y Mogriski, 1993; Leifert y col., 1994), Infestaciones por dcaros y trips han causado la pérdida total del material vegetal en varios laboratorios de cultivo de tejidos (Blake, 1988; Leifert y col., 1991) ya que por su pequefio tamafio pueden penetrar en los recipientes de cultivo répidamente antes de que puedan ser detectados, lo cual ocurre cuando se observa crecimiento fungoso sobre el medio de cultivo de las plantas. a partir de esporas que cargan en su migracién por el laboratorio. Aunque los caros no causan serios dajios a las plantas in vitro, los cultivos se pierden debido a la diseminacién de contaminantes fungosos. Ademés de las esporas de hongos pueden llevar sobre su superficie bacterias tales como Erwinia sp. (Pype y col., 1996). Al igual que los dcaros, los trips tienen una corta vida y muchas especies pueden completar su ciclo en tres semanas. Se han encontrado in vitro trips de los géneros: Thrips, Allelotrips y- Frankliniella (George, 1993) y dcaros de los géneros Tyrophagus, Siteroptes y Pyernotus (Pype y col., 1996). Un caso demostrativo del dafio que pueden ocasionar los insectos es el siguiente. En un lote de vitroplantas de papa, el 52.72% se perdié por Contaminantes fungosos diferentes. En los recipientes de cultivo se detectaron '0s géneros Aspergillus, Penicillium, Cladosporium, Nigrospora y Fusarium con alta frecuencia de aparicién y se observaron colonias de varios de ellos en un mismo frasco. Se apreci6 ademés crecimiento bacteriano y una peculiaridad Para ambos tipos de microorganisms: la disposicién de colonias de una misma Specie una a continuacién de la otra describiendo “surcos". En andlisis al Mictoscopio estereoscépico se verificé la presencia de larvas y adultos de Thrips tabaci Linderman que se localizaban principalmente en el envés de las hojas. Al hacer‘un andlisis de lasituacién se comprob6 que el material vegetal Se introdujo a la biofébrica'desde un area no aséptica sin previa inspeccion 93 N\- Lovaricauy vuil UCYelenys Alvarado Caps 7 para detectar insectos, se envejeci6 en la c4mara de crecimiento lo cual permitié que los insectos se reprodujeran en los frascos aumantando. su poblacién y al completat su ciclo se convirtieron en focos de infeccién primatios. METODOS PARA EL CONTROL DE LA CONTAMINACION Toda vez que yael material vegetal estécontaminado a primera vista aparecen dos alternativas: se desecha todo y se destruye por autoclaveo o se intenta salvarlo por alguna va. La segunda opcién es muy utilizada cuando se trata de un material con alto valor genético o de interés comercial. Legado este punto comienza un dilema muy discutido sobre el uso o no de sustancias antimicrobianas (antibiéticos, fungicidas, desinfectantes), el empleo de métodos fisicos (calor, radiaciones), 0 la manipulacién in vitro siguiendo determinados principios. Empleo de sustancias antimicrobianas para el control de la contaminacién Entre los antibi6ticos y fungicidas mas empleados se encuentran: .cefotaxima (clafordn), rifampicina, gentamicina, anfotericin B, benomil y carbendazim Gilva y col., 1988; Debergh y col., 1993; George, 1993). El uso de sustancias antimicrobianas puede ser una alternativa si se tienen en Cuenta aspectos tales como: que la contaminacién en la poblacién de plantas cultivadas in vitro. esté causada por un mismo microorganismo, que este se identifique, que se realicen las pruebas de susceptibilidad de los contaminantes frente alos productos antimicrobianos y se determine la Minima Concentracién Inhibitoria (MC), la Minima Concentracién Bactericida (MCB) o la Minima Concentraci6n Fungicida (MCF) de estos, asi como que se verifique su no fitotoxicidad. No obstante, muchos autores coinciden en en casos de excepcién y en cultivos especiticidad de los mismos implica que no previenen la proliferacién de todos los microorganisms, ademis tales productos modifican la composicién de los medios de cultivo ¥ Pueden ser metabolizados por los explantes asf sone muchos son fitot6xicos Para las plantas (Roca Y Mogrinski, 1993; Falkiner, ). a ‘ ue su empleo solamente se justfica de corta duracién ya que la alta 4 Lovaricauy Lun CéContaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro En todas las ocasiones que se utilicen antibidticos para eliminar los microorganismos contaminantes deben tealizarse pruebas de sensibilidad antes de aplicarlos en el medio de cultivo o directamente a los explantes. Entre las que més se emplean estan los antibiogramas por la técnica de difusi6n en agar y la determinacién de la minima concentracién inhibitoria (MCI) de los antibidticos por dilucién en agar o en caldo ( Barrett y Cassells, 1994; Reed, 1995) . Dichas pruebas deben realizarse ademas en el medio de cultivo de las plantas donde se aplicard posteriormente, pues una de las dificultades para el uso de antibiéticos en el cultivo de tejidos es que su sensibilidad puede ser reducida en los medios de cultivo de las plantas y que algunos son afectados por la luz, 0 por el pH. Duhem y col. sugieren que para reducir la fitotoxicidad de los antibiéticos in vitro deben ser tratadas mejor las plantas donantes que los explantes. No obstante, se reportan resultados positivos en cultivos tales como: papa, menta, manzana, Pelargonium, Hemerocallis, Choysa y Delphinium, entre otros (Duhem y col., 1988; Gilbert y col., 1991; Leifert y col. 1991a; Barrett y Cassells, 1994). De igual forma en la micropropagacién de la papa en fase de multiplicacion el uso de sulfato de gentamicina en concentraci6n de 2.5 mg/L result6 efectivo para el control de Enterobacter sp: en el,80% de la poblacién tratada. En el caso de los fungicidas entre los que se han empleado con mejores resultados se encuentran el benomil y el carbendazim (Debergh y col., 1993; Vilarific y col., 1995). Para determinar la susceptibilidad de los hongos a diferentes sustancias con acci6n fungicida se refiere el método de dilucién en agar con discos de micelio como inéculo (Silva y col., 1988). Tales fungicidas reducen la contaminaci6n fungosa pero al igual que los antibiéticos pueden resultar fitot6xicos a muchas especies de plantas por lo cual es necesario realizar pruebas preliminares antes de aplicarlos en el cultivo in vitro de plantas. Manipulacién del material vegetal in vitro Una tendencia que gana adeptos por no ser nociva para el material vegetal es 95 Lovaneauu-cun CéYelenys ANarado Capé mbién como manejo) para ipulaci ismo in vitro (conocida tar ; la manipulaci6n del mismo decals ap oenith eliminar los microorganismos contaminantes, empleando las propias técnicas biotecnolégicas. i is itulo: Entre estos procedimientos se menciona el cultivo de meristemos Wee cap 2 i ica Obtencién de plantas libres de patogenos) que ha devenido a pr sale va eliminar muchos patégenos y que puede resultar para microorgat contaminantes. Heméndez y col (1996) comprobaron que la distribuci6n de Enterobacter sp. en papa disminuta de la base al 4pice. Utilizando este resultado se han logrado obtener plantas libres de bacterias detectables subcultivando dpices de vitroplantas de papa contaminadas endofiticamente con Bacillus sp. Otra via para no perder el material contaminado con bacterias en muchas biofébricas es subcultivar estos lotes a enraizamiento y pasarlos a aclimatizacién posteriormente. Esta practica si bien aparentemente resuelve un problema trae consigo peligros como la diseminaci6n de bacterias que en estas fases pueden ser perjudiciales para las plantas. En estudios en papa se ha comprobado que estas poblaciones de plantas presentan sintomas de envejecimiento, inhibicién del enraizamiento y tienen indices de sobrevivencia bajos en la fase de aclimatizacién. La manipulaci6n de pH del medio de cultivo ha sido empleada también para el control de las bacterias contaminantes. En experiencias realizadas se controlé !a contaminacién bacteriana en el biorreactor ajustando el pH del medio al requerido por el material vegetal, el cual limitaba el crecimiento de la bacteria contaminante y por su parte Leifert y col. (1994) lograron disminuir en un 50% la contaminaci6n bacteriana en plantas de Delphinium reduciendo el PH del medio de cultivo a 3.5 sin afectaciones al material vegetal, PREVENCION DE LA CONTAMINACION MICROBIANA En la propagacién in vitro de plantas ya sea en biofébricas o laboratorios de investigacién deben buscarse todas las alternativas que conduzcan a elevar la eficiencia del proceso del que se trate, En esto juega un papel importante el Conocer los puntos de introduccién de microorganismos eee te ml Factores de riesgo y las fuentes de contaminacién, A partir del et Fi 96 los Lovaricauy Lun CéContaniacnon Ma rabuans en ef Cult in vteo laboratorio: construct Se programas de prevencisn del caracteristicas propias de cada k 3s, mater y humanas, J cantaminacién que abarquen Meva a cabo alli, pueden dise todas las fases del proceso que se De igual forma en los laboratorios de inv ‘estigacion debe velarse por el control de la contamin acién microbiana. Especificamente el control de la acteriana endégena resulta de vital importancia pues en experimentos de transformacién de plantas, contaminacion by en determinados momentos puede ‘ocasionar falsos positives cuando se emplean técnicas histoquimicas de tincién (GUS) por contener genes homélogos. SELECCION Y TRATAMIENTO DE LA PLANTA DONANTE El control de las condiciones asépticas de los cultivos primarios en los trépicos requiere de proteccién de las plantas madres o donantes con respecto al ambiente. Los explantes se deben seleccionar teniendo en cuenta la edad de la planta y la posicién en que se encuentran en ella. Es necesario también considerar el tamafo del explante y luego someterlo a una progresiva e intensiva desinfecci6n (Enjalric y col., 1988) (ver capitulo Propagaci6n via organogénesis). El stock de plantas donantes debe mantenerse libre de enfermedades y plagas con estrictos métodos de control quimico y biolégico.Es conveniente realizar aplicaciones de fungicidas, antibiéticos e insecticidas a estas plantas. Ademés cl ndimero de bacterias y hongos en los tejidos aéreos pueden ser reducidos por el mantenimiento de las mismas en condiciones de baja humedad tanto como sea posible en casas de cristal, invernaderos etc (Leifert y col., 1994). Se debe tratar en lo posible de fomentar un banco de donantes con todos los requisitos y si es con vitroplantas, mejor, por las ventajas conocidas de sanidad Y rejuvenecimiento de este tipo de material vegetal. DESINFECCION DE LOS EXPLANTES Los contaminantes microbianos de la superficie de los explantes se eliminan comdnmente por inmersién de estos en soluciones desinfectantes tales: come: etanol, hipoclorito de sodio (NaOC), hipoctorito de calcio Ca(OCh,, pes ‘rida de hidrégeno (H,O,), cloro comercial y bicloruro de mercurio ee ia ne otros. Ademés algunos antibidticos, fungicidas e insecticidas se han usa 97 n- Lovalicauy VLvil ucYelenys Alvarado Cap6 i i explantes . tratamientos antes de la desinfeccién de los expl las caractersticas de las poblaciones de microorganismos eer en la naturaleza para seleccionar los desinfectantes ce los microorganismos endofiticos generalmente de desinfecci6n superficial y requieren de je métodos para su detecci6n. Esimportai que colonizan los exp! més adecuados. No obstat no se eliminan con procedimientos medidas adicionales como el empleo 4 DETECCION DE MICROORGANISMOS CONTAMINANTES La deteccién temprana de la contaminaci6n es esencial para prevenir las pérdidas Para ello se necesitar métodos répidos y seguros. En todas las fases los explantes deben ser muestreados para detectar la presencia de contaminantes bacterianos. Hay que tener presente que los ‘mismos pueden ser introducidos permanentemente en el laboratorio ( Cassells, 1991; Leifert y col., 1994). En el cultivo in vitro de la cafia de azicar el uso de métodos de deteccién temprana (siembra de fragmentos vegetales en medios de cultivo bacteriol6gicos y observacién al microscopio 6ptico) permitié verificar que el 26.5% de las muestras analizadas tenian contaminantes endofiticos lo cual posibilité trazar estrategias de trabajo antes de que se expresara la contaminacién en el medio de cultivo. la # dsteccin de bacterias contaminantes en suspensiones celulares por ol i righ directa de estas al microscopio éptico ha devenido en préctica Con resultados positivos en café, cafia de azdcar y bananos. CONT ROL DE LAS FUENTES QUE INTRODUCEN CONTAMINACION Como se ha expresad . ; laboratorio, sin en eno’ Mirootganismos pueden ser introducidos en el in embargo, en muchos 105 asoc| casos es dificil distinguir entre iados a las plantas e i Ne Lovaricauy vvuil UC/ Contaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro Es necesario que se verifiquen y controlen si ‘ istematicamente todas las operaciones y 4reas donde pueden introducirse microorganismos, La toma de muestras, regularmente, del aire de los locales, la verificacién del funcionamiento de los equipos, el chequeo periédico de la eficiencia del lavado de las manos, del empleo de as téenicas de asepsiay el registro riguroso de todos los indices de pérdidas por contaminacién, asf como de las incidencias durante el proceso productivo, nos permiten conformar una base de datos primarios que analizados conscientemente ayudan a tomar decisiones ya establecer pronésticos. Leifert y Waites ( 1990) enfatizan en que todos los puntos de introduccién de contaminacién en el proceso productive deben vigilarse a través de un sistema de contro!'de los mismos y Sudrez y Alvarado (1997)por su parte proponen medidas para su deteccién y control a través de un sistema de control de la calidad que incluye el procesamiento de los datos por un software creado para ello (Ver capitulo: Organizacién de la produccién). La aplicacién de este sistema ha ayudado a capacitar a los trabajadores, a crear conciencia sobre la problématica de la contaminacién y el papel que cada cual juega en el control y prevenci6n de la misma. A la vez ha hecho que los indices de pérdidas se reduzcan y en base a los registros se puedan disefiar estrategias de trabajo. Con el empleo de medios protectores para el cabello, nariz, boca y manos se reducen los riesgos de contaminacién por el factor humano, asi como con el perfeccionamiento de las medidas de asepsia. Leifert y col. (1994) reportan la disminucién de las pérdidas por contaminacién bacteriana en un laboratorio comercial con capacidad de produccién anual de 4 millones de vitroplantas de 5 a 3.5% por medio del lavado de las manos y antebrazos siguiendo protoco- los establecidos para procederes quirirgicos. Ademés lograron disminuir las Pérdidas por debajo del 1% sometiendo a los trabajadores a rigurosos entrenamientos en métodos microbiolégicos. Para los muestreos ambientales resulta de gran utlidad establecer puntos fijos de muestreo y repetir los ensayos manteniendo ciertas regularidades ( tipo de medio de cultivo, tamafio de las placas de Petri, tiempo de exposicion, etc.) que permitan determinar los patrones del nimero de microorganismos islamiento de los Permisibles en el ambiente de cada local. Para el aislamiento 99 Lovaricauy wun CéYelenys ANarado Caps ados medios de cultivo generales que n ser utiliz regimenes de limpieza adecuados nimiento de ‘ales de trabajo contribuye notablemente a microorganismos pueder permitan su desarrollo, El mante y de la higiene en todos los loc Uisminuir la carga microbiana ambiental. Es muy importante tener en cuenta que todos aquellos frascos cont los laboratorios de cultivo de teji tal razén es imprescindible elimin aminados que permanecen en los locales de idos constituyen focos de contaminacién, por arlos répidamente. El empleo de la uz solar en los laboratorios de cultivo de tejidos (Cuba es un ejemplo de aprovechamiento de esta fuente de energia) implica el uso de cristales en paredes y techos que permitan el paso de la luz, por esta razon se recomienda revisar peridicamente el estado técnico de los mismos y de los equipos de clima de los locales de trabajo para localizar fisuras 0 aberturas por donde puedan penetrar los insectos y el polvo. De existir deben sellarse inmediatamente. De igual forma debe vigilarse la presencia de insectos en los frascos y mantener ‘en observacién todo el material que se introduzca en el laboratorio o biofabrica, si se detectan, deben destruirse por autoclaveo. Ademds deben ponerse trampas a la salida de los conductos de aire, pintar u oscurecer las puertas de os locales que permanezcan en horas de la noche con las luces encendidas para evitar la entrada de insectos nocturnos y mantener una estricta higiene. Para el control de las hormigas pueden aplicarse insecticidas en los sitios de entrada y proteger la base de los estantes con un anillo de goma entomolégica ‘0 una mezcla de vaselina (u otra grasa, que haga funcién de barrera mecénica) mezclada con insecticidas (Grillo, 1996, comunicacién personal). Las experiencias realizadas han demostrado la efectividad de este método. USO DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS. Eluso de sustancias antimicrobianas para prevenir la contaminacién tiene los mimes Incovenientes| que para controlarla. El efecto fitot6xico yel no control fe todos los microorganismos que pueden contaminar las plantas presupone el empleo de combinaciones que pudieran tener efectos sinérgicos pero también antagonicos. Encontrar una Sustancia, por ejemplo un antibidtico ideal, que cumpla los requisitos de ser soluble, r ; estable, el pH, ni por el medio de cultivo, que no se afecte por que tenga amplio espectro, no induzca 100 Lovaricauy Lun CéContaminacién Microbiana en el Cultivo in vitro resistencia, no tenga efectos secundarios, se pueda usar en combinacién con otros, barato y no téxico para la salud humana (Falkiner, 1990) parece poco probable. Sin embargo George (1993) refiere un medio “no estéril” utilizado con la adicién de antibisticos y fungicidas. En el Instituto de Biotecnologia de las Plantas desde finales de 1995 se comenzaron los estudios con una sustancia antimicrobiana de amplio espectro conocida como G1 para sustituir la esterilizaci6n fisica del medio de cultivo por la esterilizacién quimica con ella en combinacién con el hipoclorito de sodio. Los resultados obtenidos a nivel de laboratorio y a escala comercial avalan la efectividad de este método para los objetivos propuestos, lo cual permite alcanzar indices de eficiencia elevados (Ver capitulo: Aumento de la eficiencia en la propagacién masiva). TENDENCIAS Y PERSPECTIVAS FUTURAS El conocimiento de los microorganismos contaminantes, de las fuentes que Jos introducen al cultivo in vitro, de los factores de riesgo, asf como la aplicacién de métodos para prever, detectar y controlar la contaminacién conduciré en elfuturo a niveles de productividad cada vez més eficientes y logrard disminuir las consecuencias negativas de este fendmeno. Con el conocimiento e identificacién de los microorganismos contaminantes yala tendencia inicial de eliminar los microorganismos a toda costa del proceso va dejando paso a otra que lleva a preguntarse (generalmente ante la imposibilidad de eliminarlos) qué hacen allf y cémo usarlos. Por otra parte hoy en dia se incrementa el ntimero de investigadores interesados en los microorganismos contaminantes capaces de adaptarse a un ecosistema creado artificialmente y que puede servir de modelo para estudiar las relaciones ecol6gicas que se dan en la naturaleza entre microorganismos y plantas, Estos estudios ayudarén a comprender el papel de los microorganismos endofticos en esos nichos ecol6gicos y dardn la via de cmo poder utilizarlos en beneficio propio. Incluso, reconociendo algunas de sus funciones comienzan a aplicarse para mejorar por ejemplo, el enraizamiento en especies recalcitrantes como los 101 Lovarcauy Lun CéYelenys Alvarado Cap6 forestales. conocido que en ambientes naturales [os microorganismos asociados a las Es conocidi bi i jertos patégenos y i ‘én contra el ataque de ciel s les proporcionan protecci Oger a sedeptcién condiciones adversas. Nowak y col. (1996) pear " i lant es principio aplican bacterias del género Pseudomonas a cae tas es papa y logran estimular el crecimiento de las plantas y su proteccién contra otros contaminantes. Llama mucho la atencién también la presencia de plasmidos a estas Pacteris contaminantes toda vez que pudieran ser una via par la inserci6n de genes de interés en las plantas de importancia agricola. Las tendencias futuras deben encaminarse a prevenir la expresién de los contaminantes en el medio de cultivo y a poder utilizarlos para mejorar la ciencia que desarrollé el hombre a partir de la propiedad de las plantas de la totipotencia. BIBLIOGRAFIA Alvarado, ¥., L. Herrera y L. Garcfa,1993. Estudio preliminar sobre la contaminacién microbiana en la biofabrica de Villa Clara. En: ResGmenes Tercer Coloquio Internacional de Biotecnologfa de las Plantas, 20-22 de Junio, Santa Clara, Cuba. Alvarado, ¥, L. Herrera, MSuérez, ORivero, L.Garcia y M. Acosta, 1997. 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