Professional Documents
Culture Documents
Ferment 2017
Ferment 2017
laborgyakorlat
Biomérnöki, Membrántechnológiai és
Energetikai Kutató Intézet
1
Gyakorlatok:
2
Centrifugálás, Fehérje meghatározás
1. Centrifugálás
A centrifugálás szuszpenziók és folyadékelegyek (emulziók) szétválasztására alkalmazott
művelet, amelyben a szétválasztás a centrifugális erő hatására következik be. A centrifugálás
az elválasztandó fázisok sűrűségkülönbségén alapul. Az erre a célra alkalmazott gép a
centrifuga.
A dob köpenye vagy perforált vagy nem perforált kivitelű. Perforált kivitel esetében
tulajdonképpen egy szűrési műveletről van szó. A szilárd fázis a köpeny belső felületén
elhelyezett szűrőközegre rakódik rá, és ott szűrőlepényt alkot. A folyadék fázis a centrifugális
erőtér hatására szabadon áthalad rajta. Amennyiben a köpeny nem perforált, és ha a
szuszpenzió szárazanyag-tartalma kisebb, mint 2% akkor centrifugális derítésről, ha nagyobb,
akkor ülepítésről beszélünk.
Centrifugális erőteret tengely körül forgó rendszerrel tudunk előállítani. Ebben az esetben a
részecskékre ható erők a 2. ábrán láthatóak.
3
2. ábra: Részecskékre ható erők
Fgy=[d3/6(s-)]a Fk=3dv
4
2. Fehérjék
5
A szénsav-anhidráz enzim vizsgálata, aktivitásának
meghatározása
Elméleti háttér
Az ipari forradalom óta légkörbe kerülő nagy mennyiségű szén-dioxid rendkívüli mértékben
hozzájárul a globális felmelegedéshez. Mára lehetőség nyílt arra, hogy a nagyobb méretű
ipari létesítményekben, például széntüzelésű erőművekben lecsökkentsék, vagy teljesen
kiszűrjék a környezetbe bocsátott szén-dioxidot, ám ezeknek a megoldásoknak a használata
gazdaságilag nem kedvező, hiszen az eladott termékek árát akár a többszörösére is növelhetik.
A gyakorlat során egy jelenleg is kutatás alatt álló CO2 kinyerésre használható enzimet
vizsgálunk. Az említett enzim jó választásnak tűnik, hiszen a
𝐶𝑂2(𝑎𝑞) + 2𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻3 𝑂+
reakciót katalizálja óriási sebességgel, valamint mivel nagy a szelektivitása, ezért nem
fenyeget a veszély, hogy a gázelegyből eltűnjenek az adott esetben hasznosnak tartott
komponensek.
Az elvégzendő reakciók több részfolyamat összegeként értelmezhetőek, ezeket egyesével,
majd összesítve vizsgálva megállapítható, hogy hogyan lehet optimálisan lefolytatni a
reakciót. Ezeknek a részfolyamatoknak egyenként is vannak a reakciókra jellemző állandóik,
ám nem szabad figyelmen kívül hagyni azt sem, hogy az egyik reakció terméke esetünkben
egy másik reakció szubsztrátját adja. A következő egyenletek azon reakciók egyenletei,
melyekből az általunk vizsgálni kívánt folyamat összeáll.
𝐶𝑂2(𝑔) ⇌ 𝐶𝑂2(𝑎𝑞)
𝐶𝑂2(𝑎𝑞) + 2𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻3 𝑂+
𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐶𝑂32− + 𝐻3 𝑂+
E kémiai kaszkádot szénsav anhidráz enzimmel kiegészítve a rendszer hatékonysága
javítható.
Az enzimről általában
A szénsav-anhidráz olyan enzim, melyet minden vizsgált állati, fotoszintetizáló növényi
illetve néhány nem fotoszintetizáló baktériumban megtaláltak. Bár szénsav-anhidrázok
előfordulnak az előbb említett szervezetekben, a kutatások szerint – noha ezek az enzimek
ugyanazt a feladatot látják el az egyes szervezetekben – fejlődésük teljesen külön ment végbe.
Az egyetlen közös pont az enzim aktív centrumában található cink-ion. Ezen tényekből
sejthetővé válik, hogy az enzim kiváló példája a fehérjék párhuzamos evolúciójának.
Inhibíció
Az enzimnek rengeteg ismert inhibítora létezik, mint például az acetazolamid vagy a
topomirát, ám a legjelentősebb akadályozó tényező ugyanakkor az, hogy a biokémiai
gyakorlatban elterjedt pufferek közül (pl. –acetát, -foszfát, -citrát stb.) egyik sem használható
fel reakcióközegként, mivel ezek mindegyike inhibítorként működik, tehát akadályozza a
reakció végbemenetelét.
6
termékek mennyisége állandó. Az 1. ábrán látható, hogy a 4 és az alatti pH értékeken csak
H2CO3 található a rendszerben, míg 8-9 közötti értéken gyakorlatilag csak HCO3-.
1. ábra
Belátható tehát, hogy ha a ~4-es pH-jú szénsav-oldatot egy ~8-a pH-jú pufferhez öntjük –
mely törekszik a pH-t állandó értéken tartani – akkor a rendszerben található H2CO3 spontán
deprotonálódik HCO3--tá. Ez azt eredményezi, hogy a rendszerben felborul a vízben oldott
szén-dioxid/szénsav egyensúly, mely visszaállni törekszik azáltal, hogy az oldott CO2
szénsavvá alakul. Azonban ez a reakció a deprotonálódással szemben igen lassú. Ezt a
hidratálódási reakciót katalizálja a gyakorlat során vizsgált enzim. Az előzőek alapján
kijelenthetjük ugyanakkor, hogy a reakció folyamán keletkező HCO3- ha csak kis mértékben
is, de csökkenti az oldat pH-ját, mely csökkenés sebessége azonos a szén-dioxid
hidratációjával.
Ezt a pH csökkenést kell a pH mérő műszerrel nyomon követni, majd a kapott értékeket
ábrázolni. Az enzim nélküli reakció sebességéből, valamint az enzimmel együtt végzett
kísérlet sebességéből a 1. egyenlet segítségével kiszámítható az enzim aktivitása, mégpedig
úgy, hogy t0 az enzimmentes, t az enzimes reakcióidő. A reakcióidő az az időtartam, amíg a
pH a kezdetihez képest egy egységet csökken.
A mérés előkészítéseként 0°C-on tartott CO2-vel telített vizet készítünk oly módon, hogy a
termosztált, desztillált vízzel feltöltött edényen legalább fél óráig CO2-t buborékoltatunk át.
𝑇 1.
𝑈 = ( 𝑇0 ) − 1
7
Az elektród behelyezése után pár másodperc várakozás után a műszerről leolvasható érték
eléri maximumát, ekkor az „A” gombot benyomva elkezdődik az adatrögzítés. Az így kapott
adatokból számíthatóak a keresett értékek.
A méréseket legalább háromszor, de inkább többször célszerű elvégezni a pontosabb
eredményekhez. (Megj.: egy mérés kb 3 percet vesz igénybe, és mindenki egyénileg végzi
őket.)
A jegyzőkönyvben a szénsav-anhidráz enzimről kérek rövid összefoglalót, majd a mérés
leírása, ábrák, számítások és az aktivitásra kapott eredmény.
8
Soxhlet-extraktció
Az extrahálandó szilárd anyagot egy speciális vastag pórusos szűrőpapírszerű tokba (ez a
filter) teszik, majd ezt belehelyezik a Soxhlet-extraktorba. A Soxhlet-extraktort egy
lombikhoz erősítik, mely az oldószert (extrahálószert) tartalmazza. Az oldószert folyamatosan
9
melegítjük. Az oldószer a forralással a oldalcsövön át a felső térbe kerül, majd a hűtő a
gőzöket lekondenzálja és az így keletkező folyadék ellepi a filtert. Az ellepés által a meleg,
tiszta oldószer a kívánt anyag egy részét feloldja. Amennyiben a filtertérben a folyadékszint
eléri a szifon felső szintjét, a filtert tartalmazó rész teljes folyadéktere átömlik az alsó
lombikba (hasonlóan a bor egy felső edényből csővel való áttöltéséhez egy alsó edénybe). Ez
a ciklus újra ismétlődhet akár órákon át is. Az oldott anyag az oldószerrel a szifonból a
lombikba kerül. Innen azonban a forralással csak az oldószer távozik, így a lombikban egyre
töményebb formában lesz jelen az extrahálandó komponens. A módszer jelentős előnye, hogy
folyamatos extrakciót biztosít és folyamatosan megújítja az oldószert, így az extrakció
hajtóereje legfeljebb a filterben lévő extrahálandó komponens koncentrációjának
csökkenésével együtt csökken.
10
HPLC, szerves savak meghatározása
Elméleti háttér
12
A gyakorlaton elvégzendő feladat
A gyakorlat folyamán egy PRP –X300 Hamilton oszlopon választunk el szerves savakat
egymástól
Ez az oszlop a fenti besorolásokba nem illeszthető be egyértelműen, ugyanis az
elválasztáshoz három jelenséget is felhasznál:
hidrogén kötés
fordított fázis
ion kizárás
Az alábbi ábrán látható egy gyümölcslé savtartalmának elemzése.
ak ID: Compound:
1 Tartaric Acid
2 Malic Acid
Peak ID: Compound:
3 Citric Acid
Chromatographic Conditions:
Packing Material: PRP-X300
Column: 150 x 4.1 mm
Eluent A: Sulfuric Acid
Eluent A Concentration: 1.0 mN
Gradient: Isocratic
Flow Rate: 2.0 mL/min
Temperature: Ambient
Injection Volume: 20 µL
Detection: UV at 210 nm
13
Szakaszos szűrés vizsgálata
A szűrés során a folyadékot lyukacsos szilárd anyagon vagy szűrőanyag rétegen nyomatják át.
A lebegő szilárd részecskék részben vagy teljesen visszamaradnak a szűrőn. Ez egyszerű és
jól kezelhető vegyipari művelet jól definiált méretű és alakú kristályok esetében. A kicsi és
képlékeny sejtek jelenléte azonban megnehezíti a fermentlevek vagy más biológiai oldatok
szűrését. A klasszikus szakaszos szűrési módszerek alkalmazásával a művelet legtöbbször
túlságosan lassú lenne az ipari léptékű technológiákban.
. Az eltéréseket elsősorban a szűrőn összegyűlő sejttömeg tulajdonságai okozzák. A
biomassza legtöbbször nyálkás, ragacsos réteget képez a szűrőn, amely nagyon hamar
összetömörödik, és nem engedi át a szűrletet. Az ilyen rendszereket legtöbbször csak
szűrősegédanyagok (szemcsés, inert, merev, porózus anyagok, amelyek jól átengedik
folyadékot) hozzákeverésével lehet elválasztani.
.
14
15
16
17
18