Fermentációs feldolgozás technológiák

laborgyakorlat

Biomérnöki, Membrántechnológiai és
Energetikai Kutató Intézet

1
Gyakorlatok:

Centrifugálás, Fehérje meghatározás ......................................................................................... 3

1. Centrifugálás ...................................................................................................................... 3
2. Fehérjék .............................................................................................................................. 5
A szénsav-anhidráz enzim vizsgálata, aktivitásának meghatározása ......................................... 6
Elméleti háttér ........................................................................................................................ 6
A gyakorlaton elvégzendő feladatok ...................................................................................... 6
Soxhlet-extraktció ...................................................................................................................... 9
HPLC, szerves savak meghatározása ....................................................................................... 11
Elméleti háttér ...................................................................................................................... 11
A gyakorlaton elvégzendő feladat ........................................................................................ 13
Szakaszos szűrés vizsgálata ..................................................................................................... 14

2
Centrifugálás, Fehérje meghatározás

1. Centrifugálás
A centrifugálás szuszpenziók és folyadékelegyek (emulziók) szétválasztására alkalmazott
művelet, amelyben a szétválasztás a centrifugális erő hatására következik be. A centrifugálás
az elválasztandó fázisok sűrűségkülönbségén alapul. Az erre a célra alkalmazott gép a
centrifuga.

1. ábra: A centrifugálás felhasználási lehetőségei

A centrifuga dobja (forgó rész) általában hengeres vagy kúpos kialakítású.

Működésüket tekintve lehetnek:

 Szakaszos üzemű centrifugák

 Folytonos üzemű ülepítő centrifugák
 Folytonos üzemű derítő centrifugák
 Derítő, emulzióbontó centrifugák.

A dob köpenye vagy perforált vagy nem perforált kivitelű. Perforált kivitel esetében
tulajdonképpen egy szűrési műveletről van szó. A szilárd fázis a köpeny belső felületén
elhelyezett szűrőközegre rakódik rá, és ott szűrőlepényt alkot. A folyadék fázis a centrifugális
erőtér hatására szabadon áthalad rajta. Amennyiben a köpeny nem perforált, és ha a
szuszpenzió szárazanyag-tartalma kisebb, mint 2% akkor centrifugális derítésről, ha nagyobb,
akkor ülepítésről beszélünk.
Centrifugális erőteret tengely körül forgó rendszerrel tudunk előállítani. Ebben az esetben a
részecskékre ható erők a 2. ábrán láthatóak.

3
 2. ábra: Részecskékre ható erők

Centrifugálásnál a gyorsulás a=2 * r, ülepedésnél pedig egyszerűen g.

Gyorsító erő: Közegellenállás:

Fgy=[d3/6(s-)]a Fk=3dv

(Centrifugális erő mínusz felhajtóerő) (Stokes-törvényből, gömb alakú

részecskére, lamináris
tartományban)

Ülepedési jelenségek fermentlevek centrifugálásánál

1. Különálló részecskék
2. Koaguláció
3. Gátolt v. zónás
ülepedés
4. Összepréselődés
(kis koncentrációnál)
(közepes koncentrációnál)
Nincs kölcsönhatás a
részecskék között
A részecskék menet
közben
összetapadnak, tömegük és
sebességük nő
A részecskék taszítják
egymást, távolságuk
állandó marad, zónában
ülepednek
A lerakódott részecskék
szerkezetét a folyamatosan
rárakódó súly összepréseli

Centrifugálás során számos különféle rotort használhatunk az elvégzendő feladatok

végrehajtásához. Az egyik legismertebb, és laborunkban is használt módszer, hogy a
részecskék ülepítése rögzített szögű rotorban történik.

4
2. Fehérjék

A fehérjék aminosavak lineáris polimereiből felépülő szerves makromolekulák. A fehérjék

aminosav sorrendjét a gének nukleotid szekvenciája kódolja a genetikai kódszótárnak
megfelelően. A fehérjék kialakításában a 20 féle "proteinogén" aminosav vesz részt, melyek
szomszédos amino és karboxil csoportjaik között kialakuló peptidkötés révén kapcsolódnak
egymáshoz.
A peptidek aminosavakból épülnek fel peptidkötéssel. A részt vevő aminosavak száma
szerint megkülönböztetünk dipeptideket (két aminosav, egy peptidkötés), tripeptideket (három
aminosav, két peptidkötés), tetrapeptideket. Ha a molekulában tíznél kevesebb aminosav
található, akkor oligopeptidekről, tíznél több aminosav esetében polipeptidekről beszélünk.
Fehérjének akkor nevezzük a polipeptidet, ha az aminosav összetevők száma 100 vagy annál
több.

5. ábra: Peptidkötés kialakulása

5
A szénsav-anhidráz enzim vizsgálata, aktivitásának
meghatározása
Elméleti háttér
Az ipari forradalom óta légkörbe kerülő nagy mennyiségű szén-dioxid rendkívüli mértékben
hozzájárul a globális felmelegedéshez. Mára lehetőség nyílt arra, hogy a nagyobb méretű
ipari létesítményekben, például széntüzelésű erőművekben lecsökkentsék, vagy teljesen
kiszűrjék a környezetbe bocsátott szén-dioxidot, ám ezeknek a megoldásoknak a használata
gazdaságilag nem kedvező, hiszen az eladott termékek árát akár a többszörösére is növelhetik.
A gyakorlat során egy jelenleg is kutatás alatt álló CO2 kinyerésre használható enzimet
vizsgálunk. Az említett enzim jó választásnak tűnik, hiszen a
𝐶𝑂2(𝑎𝑞) + 2𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻3 𝑂+
reakciót katalizálja óriási sebességgel, valamint mivel nagy a szelektivitása, ezért nem
fenyeget a veszély, hogy a gázelegyből eltűnjenek az adott esetben hasznosnak tartott
komponensek.
Az elvégzendő reakciók több részfolyamat összegeként értelmezhetőek, ezeket egyesével,
majd összesítve vizsgálva megállapítható, hogy hogyan lehet optimálisan lefolytatni a
reakciót. Ezeknek a részfolyamatoknak egyenként is vannak a reakciókra jellemző állandóik,
ám nem szabad figyelmen kívül hagyni azt sem, hogy az egyik reakció terméke esetünkben
egy másik reakció szubsztrátját adja. A következő egyenletek azon reakciók egyenletei,
melyekből az általunk vizsgálni kívánt folyamat összeáll.
𝐶𝑂2(𝑔) ⇌ 𝐶𝑂2(𝑎𝑞)
𝐶𝑂2(𝑎𝑞) + 2𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻3 𝑂+
𝐻𝐶𝑂3− + 𝐻2 𝑂 ⇌ 𝐶𝑂32− + 𝐻3 𝑂+
E kémiai kaszkádot szénsav anhidráz enzimmel kiegészítve a rendszer hatékonysága
javítható.
Az enzimről általában
A szénsav-anhidráz olyan enzim, melyet minden vizsgált állati, fotoszintetizáló növényi
illetve néhány nem fotoszintetizáló baktériumban megtaláltak. Bár szénsav-anhidrázok
előfordulnak az előbb említett szervezetekben, a kutatások szerint – noha ezek az enzimek
ugyanazt a feladatot látják el az egyes szervezetekben – fejlődésük teljesen külön ment végbe.
Az egyetlen közös pont az enzim aktív centrumában található cink-ion. Ezen tényekből
sejthetővé válik, hogy az enzim kiváló példája a fehérjék párhuzamos evolúciójának.
Inhibíció
Az enzimnek rengeteg ismert inhibítora létezik, mint például az acetazolamid vagy a
topomirát, ám a legjelentősebb akadályozó tényező ugyanakkor az, hogy a biokémiai
gyakorlatban elterjedt pufferek közül (pl. –acetát, -foszfát, -citrát stb.) egyik sem használható
fel reakcióközegként, mivel ezek mindegyike inhibítorként működik, tehát akadályozza a
reakció végbemenetelét.

A gyakorlaton elvégzendő feladatok

A gyakorlat során vízben oldott szén-dioxid szénsavvá alakulását fogjuk mérni az idő
függvényében. A reakciót pH-metriás módszerrel követjük nyomon, a másodpercenként
kapott adatokat számítógépen rögzítjük.
A mérés elve
A CO2 oldhatósági tulajdonságait vizsgálva láthatjuk, hogy a vízben oldott gáz mennyisége
0°C-on maximális, táblázatokból megállapítható érték. Egyensúlyban lévő rendszer esetén a
szén-dioxid, a belőle keletkezett szénsav, valamint a szénsav deprotonálódásából származó

6
termékek mennyisége állandó. Az 1. ábrán látható, hogy a 4 és az alatti pH értékeken csak
H2CO3 található a rendszerben, míg 8-9 közötti értéken gyakorlatilag csak HCO3-.

1. ábra

Belátható tehát, hogy ha a ~4-es pH-jú szénsav-oldatot egy ~8-a pH-jú pufferhez öntjük –
mely törekszik a pH-t állandó értéken tartani – akkor a rendszerben található H2CO3 spontán
deprotonálódik HCO3--tá. Ez azt eredményezi, hogy a rendszerben felborul a vízben oldott
szén-dioxid/szénsav egyensúly, mely visszaállni törekszik azáltal, hogy az oldott CO2
szénsavvá alakul. Azonban ez a reakció a deprotonálódással szemben igen lassú. Ezt a
hidratálódási reakciót katalizálja a gyakorlat során vizsgált enzim. Az előzőek alapján
kijelenthetjük ugyanakkor, hogy a reakció folyamán keletkező HCO3- ha csak kis mértékben
is, de csökkenti az oldat pH-ját, mely csökkenés sebessége azonos a szén-dioxid
hidratációjával.
Ezt a pH csökkenést kell a pH mérő műszerrel nyomon követni, majd a kapott értékeket
ábrázolni. Az enzim nélküli reakció sebességéből, valamint az enzimmel együtt végzett
kísérlet sebességéből a 1. egyenlet segítségével kiszámítható az enzim aktivitása, mégpedig
úgy, hogy t0 az enzimmentes, t az enzimes reakcióidő. A reakcióidő az az időtartam, amíg a
pH a kezdetihez képest egy egységet csökken.
A mérés előkészítéseként 0°C-on tartott CO2-vel telített vizet készítünk oly módon, hogy a
termosztált, desztillált vízzel feltöltött edényen legalább fél óráig CO2-t buborékoltatunk át.
𝑇 1.
𝑈 = ( 𝑇0 ) − 1

Puffer: a reakcióközegként használt puffer 0.05M-os Na-Barbiturát. A puffer pH-ját ~8.3-ra

állítjuk be, majd ezt az oldatot is 0°C-ra hűtjük.
A harmadik reagens maga az enzimszuszpenzió, melyből két félét kell készíteni: A „vakot”
oly módon állítjuk elő, hogy az enzimszuszpenzió egyik részét felforraljuk, ezzel elérve azt,
hogy a vakban ugyan azok a mellékanyagok találhatóak meg mint az eredeti oldatban, ám
enzimaktivitása biztosan nincsen. A felforralt oldatot először folyó víz alatt
szobahőmérsékletre hűtjük, majd ezt is jégre tesszük.
A mérés során egy szintén 0°C-on tartott, kevertetett kémcsőbe mérünk a pufferből 3 ml-t, az
enzimből 1 ml-t, majd ezután a CO2-vel telített vízből is 3 ml-t. A szénsavas víz hozzáadása
után azonnal a kémcsőbe helyezzük a pH elektródot, melynek szárára egy olyan gumifeltét
van helyezve, mely egyrészt távtartóként funkcionál, másrészt légmentesen zárja a kémcsövet.

7
 Az elektród behelyezése után pár másodperc várakozás után a műszerről leolvasható érték
eléri maximumát, ekkor az „A” gombot benyomva elkezdődik az adatrögzítés. Az így kapott
adatokból számíthatóak a keresett értékek.
A méréseket legalább háromszor, de inkább többször célszerű elvégezni a pontosabb
eredményekhez. (Megj.: egy mérés kb 3 percet vesz igénybe, és mindenki egyénileg végzi
őket.)
A jegyzőkönyvben a szénsav-anhidráz enzimről kérek rövid összefoglalót, majd a mérés
leírása, ábrák, számítások és az aktivitásra kapott eredmény.

8
Soxhlet-extraktció

A Soxhlet-extraktor laboratóriumi berendezés, amelyet Franz von Soxhlet alkotott meg

1879-ben. Soxhlet a berendezést eredetileg lipidek szilárd anyagokból történő kiextrahálására
készítette, bár nemcsak lipidek extrakciójához használható. Mint szilárd-folyadék folyamatos
extraktort a preparatív kémiai gyakorlatban kiterjedten alkalmazzák. Soxhlet-extraktort
főképp akkor alkalmazunk, ha az extrahálandó komponens csak korlátoltan oldódik az
extrahálószerben, míg a szennyezés egyáltalán nem oldódik benne. Amennyiben az
elválasztani kívánt anyag jól oldódik az oldószerben, akkor egyszerű szűréssel elválasztható a
nem oldódó szennyeződéstől.

A Soxhlet-extraktor sematikus rajza

1: keverőrúd 2: csatlakozó csiszolat 3:oldalcső 4: filter 5: szilárd (extrahálandó) anyag 6: szifontető 7: szifon
kifolyó 8:csiszolatváltó 9: hűtő 10: hűtővíz bemenet11: hűtővíz kimenet

Az extrahálandó szilárd anyagot egy speciális vastag pórusos szűrőpapírszerű tokba (ez a
filter) teszik, majd ezt belehelyezik a Soxhlet-extraktorba. A Soxhlet-extraktort egy
lombikhoz erősítik, mely az oldószert (extrahálószert) tartalmazza. Az oldószert folyamatosan

9
melegítjük. Az oldószer a forralással a oldalcsövön át a felső térbe kerül, majd a hűtő a
gőzöket lekondenzálja és az így keletkező folyadék ellepi a filtert. Az ellepés által a meleg,
tiszta oldószer a kívánt anyag egy részét feloldja. Amennyiben a filtertérben a folyadékszint
eléri a szifon felső szintjét, a filtert tartalmazó rész teljes folyadéktere átömlik az alsó
lombikba (hasonlóan a bor egy felső edényből csővel való áttöltéséhez egy alsó edénybe). Ez
a ciklus újra ismétlődhet akár órákon át is. Az oldott anyag az oldószerrel a szifonból a
lombikba kerül. Innen azonban a forralással csak az oldószer távozik, így a lombikban egyre
töményebb formában lesz jelen az extrahálandó komponens. A módszer jelentős előnye, hogy
folyamatos extrakciót biztosít és folyamatosan megújítja az oldószert, így az extrakció
hajtóereje legfeljebb a filterben lévő extrahálandó komponens koncentrációjának
csökkenésével együtt csökken.

A gyakorlat során narancshéjból vonjuk ki az etanollal oldható komponenseket, majd

vákuum desztillációval szárazra párolva megállapítjuk azok mennyiségét.
Beadandó a narancshéj extrahálható anyagtartalma tömegszázalékban.

10
HPLC, szerves savak meghatározása

Elméleti háttér

A HPLC, avagy nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (angolul High Performance

Liquid Chromatography, vagy High Pressure Liquid Chromatography) a biokémiában és
analitikai kémiában vegyületek elválasztására, azonosítására és mennyiségi meghatározására
gyakran használt kromatográfiás eljárás.
A HPLC rendszer a következő alkotórészekből áll: a kromatográfiás töltetet (állófázist)
tartalmazó oszlopból (kolonnából), a mobil fázist (mozgó fázist, eluenst) az oszlopon
átnyomó pumpából valamint a molekulák retenciós (visszatartási) idejét jelző detektorból. A
retenciós idő az álló fázis, a vizsgált molekula és a mozgó fázis közötti kölcsönhatásoktól
függ.
Normál fázisú kromatográfia
A normál fázisú HPLC (NP-HPLC) polaritás alapján választja el a vizsgált minta
komponenseit, ez volt az elsőként alkalmazott HPLC-s eljárás. Az NP-HPLC poláris álló
fázist és apoláris mozgó fázist alkalmaz, viszonylag poláris anyagok elválasztására
alkalmazható hatékonyan. A vizsgálni kívánt poláris anyag kapcsolatba lép a poláris álló
fázissal s így visszamarad. Az adszorpció erőssége nő a vizsgált anyag polaritásának
növekedésével. A poláris komponens és a (mozgó fázishoz képest) poláris álló fázis
kölcsönhatásának erősödésével nő a retenciós idő. A kölcsönhatás erőssége nemcsak a
vizsgált molekula funkciós csoportjaitól függ, hanem sztérikus tényezőktől is, ezért ezzel a
módszerrel szerkezeti izomerek elválasztása is lehetséges.
Ha a mozgó fázisban polárisabb oldószereket használunk, csökken a vizsgálandó anyagok
retenciós ideje, míg hidrofób oldószerek inkább növelik a retenciós időt. Nagyon poláris
oldószerek megkötődhetnek az állófázis felszínén, így használatuk deaktiválhatja a kolonnát.
Fordított fázisú kromatográfia
A fordított fázisú HPLC (Reversed phase HPLC, RP-HPLC vagy RPC) esetén az állófázis
felülete apoláris, míg a mozgó fázis poláris, jellemzően víz és valamely szerves oldószer
elegye. Apoláros oldószert adva a mozgó fázishoz csökkenthetjük, míg hidrofilebb oldószer
hozzáadásával pedig növelhetjük a retenciós időt.
A vizsgálandó anyag kötődése az állófázishoz arányos a vizsgált molekula apoláris
szegmense körül a vizes mozgó fázisban a ligandummal való kölcsönhatásban kialakuló
11
érintkező felület területével. A retenció csökkenthető, ha kevésbé poláros oldószert (metanolt,
acetonitrilt) adva a mozgó fázishoz csökkentjük a víz felületi feszültségét.
A vizsgált molekula szerkezeti tulajdonságai fontos szerepet töltenek be a retenciós
tulajdonságok meghatározásában. Általánosságban elmondhatjuk, hogy a nagyobb, a vízzel
kapcsolatba nem lépő, hidrofób felülettel rendelkező vizsgálandó anyagok (C-H, C-C, ill.
általában az apoláros kötések, mint pl. az S-S) retenciós ideje hosszabb. Másrészt a poláros
csoportok, mint például az -OH, -NH2, COO- vagy -NH+3 visszatartása kisebb, mivel ezek
jól elegyednek vízzel.
A fordított fázisú kolonnák sokkal kevésbé sérülékenyek, mint a normál fázisú szilika
oszlopok, bár számos fordított fázisú kolonna alkil-derivatizált szilika szemcséket tartalmaz,
melyeket soha nem szabad vízben oldott bázisokkal használni, mivel ezek lebontják a szilika
szemcséket. Vízben oldott savakat használhatunk, de lehetőleg ne tegyük ki a kolonnát túl
sokáig savaknak, mivel ezek korrodálhatják a HPLC készülék fém alkatrészeit. Használat után
az RP-HPLC kolonnákon tiszta oldószert kell áramoltatni, hogy eltávolítsuk a maradék
savakat vagy puffereket, majd a megfelelő oldószer alatt kell őket tárolni.
Méretkizárásos (size exclusion) kromatográfia
A méretkizárásos kromatográfia (angolul: size exclusion chromatography, rövidítve:
SEC), melyet gél permeációs kromatográfiaként vagy gélszűréses kromatográfiaként is
említenek, méret alapján választja el a részecskéket. Általában csak kis felbontás érhető el
vele, ezért általában csak a tisztítás utolsó lépéseként használják. Hasznos még tisztított
fehérjék harmadlagos vagy negyedleges szerkezetének meghatározásában. Az eljárást
széleskörűen alkalmazzák poliszacharidok molekulatömegének meghatározására.
Ioncserés kromatográfia
Ioncserés kromatográfia esetén a retenció az oldott ionok és az álló fázishoz kötött
töltéssel rendelkező helyek között létrejövő kölcsönhatáson alapszik. Az ugyanolyan töltésű
ionok nem kötődnek az oszlopon.
Az ioncserélők általában a nagyobb töltésű és kisebb átmérőjű ionokat kötik jobban. Az
ellenion (a gyanta funkciós csoportjaira vonatkoztatott) koncentráció növelése csökkenti a
retenciós időt. Kationcsere esetén a pH növelése csökkenti a retenciós időt, míg anioncsere
esetén a pH csökkentésével érhető el a retenciós idő csökkenése.
Az ioncserés kromatográfiát a következő területeken alkalmazzák széleskörűen:
víztisztítás, nyomokban jelenlevő komponensek elődúsítása, ligandumcsere-kromatográfia,
fehérjék ioncserés kromatográfiája, szénhidrátok és oligoszacharidok magas pH-n végzett
anioncserés kromatográfiája stb.

12
A gyakorlaton elvégzendő feladat

A gyakorlat folyamán egy PRP –X300 Hamilton oszlopon választunk el szerves savakat
egymástól
Ez az oszlop a fenti besorolásokba nem illeszthető be egyértelműen, ugyanis az
elválasztáshoz három jelenséget is felhasznál:
 hidrogén kötés
 fordított fázis
 ion kizárás
Az alábbi ábrán látható egy gyümölcslé savtartalmának elemzése.

ak ID: Compound:
1 Tartaric Acid

2 Malic Acid
Peak ID: Compound:
3 Citric Acid

Chromatographic Conditions:
Packing Material: PRP-X300
Column: 150 x 4.1 mm
Eluent A: Sulfuric Acid
Eluent A Concentration: 1.0 mN
Gradient: Isocratic
Flow Rate: 2.0 mL/min
Temperature: Ambient
Injection Volume: 20 µL
Detection: UV at 210 nm

A gyakorlaton kalibráció után egy ismeretlen minta savtartalmát kell meghatározni.

13
Szakaszos szűrés vizsgálata
A szűrés során a folyadékot lyukacsos szilárd anyagon vagy szűrőanyag rétegen nyomatják át.
A lebegő szilárd részecskék részben vagy teljesen visszamaradnak a szűrőn. Ez egyszerű és
jól kezelhető vegyipari művelet jól definiált méretű és alakú kristályok esetében. A kicsi és
képlékeny sejtek jelenléte azonban megnehezíti a fermentlevek vagy más biológiai oldatok
szűrését. A klasszikus szakaszos szűrési módszerek alkalmazásával a művelet legtöbbször
túlságosan lassú lenne az ipari léptékű technológiákban.
. Az eltéréseket elsősorban a szűrőn összegyűlő sejttömeg tulajdonságai okozzák. A
biomassza legtöbbször nyálkás, ragacsos réteget képez a szűrőn, amely nagyon hamar
összetömörödik, és nem engedi át a szűrletet. Az ilyen rendszereket legtöbbször csak
szűrősegédanyagok (szemcsés, inert, merev, porózus anyagok, amelyek jól átengedik
folyadékot) hozzákeverésével lehet elválasztani.
.

14
15
16
17
18