UNIVERZITET U SARAJEVU

PRIRODNO – MATEMATIČKI FAKULTET

ODSJEK ZA HEMIJU

ODREĐIVANJE PESTICIDA U PLODOVIMA

CITRUSA
(Seminarski rad iz predmeta „Hemija prirodnih produkata – odabrana
poglavlja“)

Mentor: Kandidat:
Prof. dr. Danijela Vidic Alen Beganović

Sarajevo, januar 2019.

SADRŽAJ

1. UVOD ............................................................................................................................3
2. PLOD CITRUSA I NJEGOVA BIOLOŠKA STRUKTURA .....................................4
3. GLAVNE VRSTE CITRUSA I PROIZVODNJA .......................................................6
3.1. NARANČA .............................................................................................................6
3.2. LIMUN....................................................................................................................7
4. PRIRODNI PRODUKTI U PLODOVIMA CITRUSA ...............................................7
4.1. FLAVONOIDI ...........................................................................................................7
4.1. FENOLSKE KISELINE ........................................................................................8
4.2. LIMONOIDI...........................................................................................................8
4.3. ALKALOIDI ..........................................................................................................9
5. ODREĐIVANJE PESTICIDA U CITRUSIMA ........................................................ 10
5.1. PRIPREMA UZORAKA ZA ANALIZU ............................................................ 11
5.2. EKSTRAKCIJA PESTICIDA IZ UZORKA ...................................................... 11
5.3. PREČIŠĆAVANJE EKSTRAKATA ..................................................................14
5.4. IDENTIFIKACIJA I ODREĐIVANJE ANALITA ............................................ 16
5.5. USLOVI POD KOJIMA SU VRŠENA POJEDINA ISTRAŽIVANJA ............. 17
6. ZAKLJUČAK ............................................................................................................. 19
7. LITERATURA............................................................................................................ 21

2
1. UVOD

Uloga citrusa u obezbjeđivanju hranljivih tvari i njihova ljekovitost poznata je još od

antičkih vremena. Citrusi pripadaju rodu Citrus iz porodice Rutaceae, poznati su po svom
osvježavajućem mirisu, sposobnosti gašenja žeđi i obezbjeđivanju preporučene dnevne
količine (RDA, engl. Recommended Dietary Allowances) vitamina C. Pored askorbinske
kiseline, citrusi sadrže i nekoliko fitohemikalija, koje imaju ulogu nutraceutika, kao što su
karotenoidi, limonoidi, flavanoni, te vitamini B-kompleksa (tiamin, riboflavin, niacin,
pantotenska kiselina, pridoksin, folna kiselina, biotin, holin i inozitol). Flavonoidi iz
citrusnih sokova, o kojima će biti govora u nastavku, su efikasni u poboljšavanju cirkulacije
krvi i imaju antialergijska, antikarcinogena i antivirusna svojstva (Filatova i Kolesnova,
1999.). Svježi grejpfruti i naranče obezbjeđuju vlakna i pektin, za koje je poznato da
smanjuju rizik od srčanog udara ako se svakodnevno koriste u ishrani. Konzumacija svježih
plodova citrusa je važna kako zbog hranljivih tvari tako i zbog nutraceutika, tj. tvari koje
pružaju zdravstvene benefite (posebno antioksidansa). Konzumacijom svježih plodova
navedene tvari su odmah dostupne organizmu, a gubitak hranljivih tvari je zanemariv u
usporedbi sa prerađenim sokovima dobijenih iz ovih plodova.

Citrusi se uzgajaju u više od 80 zemalja. Uzgoj citrusa ne samo da je profitabilan, već i

stvara nova radna mjesta i kao što je ranije navedeno plodovi imaju nutritivnu i terapeutsku
vrijednost. Citrusi su prvi među voćnim kulturama u svijetu u pogledu proizvodnje. Tokom
devedesetih godina prošlog stoljeća, svjetska proizvodnja citrusa povećavala se za 4,5 %
svake godine, što je rezultiralo proizvodnjom od 98,35 miliona tona tokom 2001 godine i
ta cifra prešla je 100 miliona tona 2003 godine (FAO, 2006).

3
 2. PLOD CITRUSA I NJEGOVA BIOLOŠKA STRUKTURA

U poređenju sa ostalim plodovima voća, plodovi citrusa imaju specifičnu

karakterizaciju. Botanički se razlikuju od plodova bobičastog i ostalog voća i imaju visoku
nutritivnu vrijednost. Plodovi citrusa su obično loptasti, glavne morfološke osobine su
prikazane na slici 1.

Peteljka

Osnova Peteljkino
udubljenje

Bočni
dio Ekvator

Vrh

Slika 1. Plod citrusa

Kraj sa peteljkom se smatra osnovnom, suprotni kraj je vrh. Horizontalna linija je

poznata kao ekvator. Dio između ekvatora i osnove naziva se donjim ramenom (engl. lower
shoulder), a dio između ekvatora i vrha naziva se gornjim ramenom (engl. upper shoulder). Na
vrhu se obično nalazi pupak. Različite vrste značajno variraju u veličini i obliku pupka. Površina
ploda je prekrivena krhkim uljanim tačkama, koje sadrže različita eterična ulja u svojoj
unutrašnjosti, to su ustvari uljane kesice (Slika 1.) (Ye et al., 2005.).

U poređenju sa drugim voćem, unutrašnja struktura citrusa je kompleksnija. Idući spolja

prema vani susrećemo koru (flavedo, uljane žlijezde, albedo), segmente (segmente membrane,
kesice sa sokom i sjeme) te središnju jezgru (vaskularni snop i parenhim) (Slika 2.) (Kimball
1999).

4
 Središnja jezgra
Flavedo Kesice sa sokom

Albedo
Uljane kesice

Sjeme
Segment

Segmentni zid

Slika 2. Struktura ploda

Uljane kesice, još se nazivaju i uljanim žlijezdama, sastoje se od šupljine koja sadrži
nekoliko aromatičnih ulja. Uljane kesice sastoje se od tankih zidova koji se lako lome kada
sazriju. Broj uljnih kesica i svojstva ulja u njima se značajno razlikuju između različitih vrsta
citrusa. Ručna ekstrakcija eteričnih ulja je efikasna iz limuna, naranče, limete i drugih, dok iz
mandarine se dobija eterično ulje niskog kvaliteta.

Segment ploda

Vezikula (kesica)
sa sokom

Slika 3. Segment ploda i kesica sa sokom unutar segmenta

Kesica sa sokom predstavlja jestivi dio ploda citrusa, nalazi se u unutrašnjosti segmenta
(Slika 3.), površina kesice sadrži vosak i nešto pektina. Također u unutrašnjosti segmenta
moguće je naći i sjeme. Sjeme citrusa je bogato mastima, proteinima i gorkim supstancama.
Centralno jezgro sastoji se od nekoliko vaskularnih snopova okruženih labavim spužvastim
tkivima (Tisserat et al. 1990).

5
 3. GLAVNE VRSTE CITRUSA I PROIZVODNJA

Citrusi pripadaju porodici Rutaceae aurantioideae. Od 1753. godine kada je Linneaus

odredio rod Citrus L., mnogi naučnici su izveli niz morfoloških, citoloških i molekularnih
studija. U tome su se posebno istakli naučnici Swingle i Tanaka, prvi je rod Citrus L. podijelio
na 16 vrsta, a drugi na 159 vrsta. Neke od vrsta su:

• Citrus sinensis (L.) Osbeck - Slatka naranča

• Citrus reticulata Blanco - Mandarina

• Citrus aurantium L.- Kisela ili gorka naranča

• Citrus paradisi Macfadyen - Grejpfrut

• Citrus limon L. Burm. f. - Limun

• Citrus aurantiifolia (Christm.) - Limeta

• Citrus limonia - Rangpur

• Citrus medica L.- Četrun (Ye et al., 2017)

U nastavku bit će posebno obrađeni oni citrusi koji su/će se koristili/ti kao uzorci za
određivanje pesticida:

3.1. NARANČA

Naranča je hibrid nastala ukrštanjem pomela (Citrus maxima) i mandarine (Citrus

reticulata). Sadrži gene koji su 75% od mandarine i 25% od pomela. Postoje dvije vrste naranči:
jedna je slatka naranča (Citrus sinensis), a druga je kisela ili gorka naranča (Citrus aurantium).
Najviše se uzgajaju i prerađuju odnosno „proizvode“ slatke naranče, dok se za kisele naranče
koristi veoma mala površina za uzgoj, uglavnom se koristi za proizvodnju marmelada i drugih
proizvoda. Plodovi naranče su okrugli ili ovalni, žuti do narančasto-crveni. Plodovi sadrže 9-
12 segmenata koji imaju sladak ili blago kiseli ukus, sa malo sjemenki ili bez. Naranče cvjetaju
u periodu između marta i maja, a plodovi dozrijevaju od oktobra do decembra.

Naranče imaju slatki do blago kiseli okus, obično se gule i jedu svježe ili se koriste za
proizvodnju soka. Debela, gorka kora se obično odbacuje, ali se može preraditi u stočnu hranu
desikacijom, upotrebom povišenog pritiska i toplote.

6
 Također se koristi u kulinarstvu kao aroma ili dekoracija za hranu. Bijeli dio kore,
uključujući i centralno jezgro, dobar je izvor pektina i ima gotovo istu količinu vitamina C i
drugih nutrijenata kao i samo meso odnosno pulpa. Najviše se uzgaja odnosno proizvodi u
Brazilu, SAD-u, Meksiku i Evropskoj uniji. Međutim u zadnjih nekoliko godina ukupna
količina proizvodnje naranče je smanjena za 15%, uglavnom u Brazilu i SAD-u, dok je u
Argentini zabilježen porast od 41% (USDA, 2017).

3.2. LIMUN

Limun (Citrus x limon) je vrsta malog zimzelenog stabla porijeklom iz Azije. Studija o
genetičkom porijeklu limuna pokazala je da je to hibrid između gorke naranče i citrona. Žuti
elipsoidni plodovi limuna se koriste u kulinarstvu, ali i u druge svrhe, prije svega zbog svog
soka koji se koristi i u kulinarstvu, a i za čišćenje. Pulpa i kora se također koriste u kulinarstvu.
Sok limuna sadrži 5% do 6% limunske kiseline, što mu daje kiseli okus. Karakterističan kiseli
okus limunovog soka čini ga ključnim sastojkom u pićima i hrani, kao što su limunada i kolač
sa limunom (engl. lemon meringue pie). Pulpa, koja je ostala nakon ekstakcije soka, važan je
izvor citrusnog ulja, pektina i limunske kiseline, koji se koriste za prehrambene, kozmetičke ili
farmaceutske svrhe. Meksiko, Argentina i Evropska unija su njavažniji proizvođači limuna.
Proizvodnja limuna u blagom je porastu posljednjih godina (Gulsen i Roose, 2001).

4. PRIRODNI PRODUKTI U PLODOVIMA CITRUSA

Kao što je ranije u ovom radu naglašeno, citrusi su izuzetno bogati različitim tvarima. Osim
što su bogati pektinima, oligosaharidima, organskim kiselinama, različitim aminokiselinama i
drugim nutrijentima, citrusi su bogati i fiziološkim komponentama odnosno nutraceuticima kao
što su alkaloidi, fenoli i druge tvari. Ove fiziološke komponente promovišu ljudsko zdravlje i
povezani su prevencijom i liječenjem nekih bolesti, a osim toga daju plodovima svojstven ukus
(Duarte et al., 2016).

4.1. FLAVONOIDI

Flavonoidi su klasa fenolskih jedinjenja sa strukturom C6–C3–C6, to su najvažnije

komponente, a nalaze se u plodovima, kori, lišću i cvijeću svih vrsta naranči, kiselih naranči,
limuna, mandarina i grejpfruta. Na osnovu prisustva dvostruke veze između C2 i C3 atoma,
prisustva hidroksilne grupe, različitog načina povezivanja B i C prstena i da li je C prsten

7
otvoren, flavonoidi se mogu podijeliti u šest kategorija: flavoni, flavanoni, flavonoli, izoflavoni,
antocijanidini i flavanoli (katehini) (Peterson i Dwyer, 1998).

Flavonoidi su široko rasprostranjeni u citusnim biljkama. Najviše su zastupljeni

neohesperidin, naringin, narirutin i hesperidin od flavanona, zatim nobiletin, tangeretin i
sinensetin od PMF-a.

Kelebek i saradnici (Kelebek et al., 2008) odredili su pet flavanona u dvije vrste naranče
(Moro i Sanguinello) upotrebom HPLC-DAD, a to su narirutin, naringin, hesperidin,
neohesperidin, i didimin. Također su otkrili da je Moro vrsta bogatija sa ovih pet komponenti
u odnosu na Sanguinello vrstu. He i saradnici (He et al., 1997) koristili su HPLC-MS za
izolaciju i identifikaciju osam flavonoida iz Citrus aurantium ekstrakta, uključujući
isonaringin, naringin, hesperidin, neohesperidin, naringenin, nobiletin, i naringenin.

4.1. FENOLSKE KISELINE

Fenolske kiseline su klasa spojeva koje karakteriše benzenov prsten sa hidrokosilnom

grupom vezanom na njega. Od ukupne količine fenolskih komponenti u hrani jedna tećina
otpada na fenolske kiseline.

Kelebek i saradnici (Kelebek et al., 2008) koristili su HPLC-DAD za određivanje sadržaja

dvije vrste benzojeve kiseline (galna kiselina i protokatehinska kiselina), pet cimetnih kiselina
(kafena kiselina, hlorogenska kiselina, p-kumarinska, ferulična i sinapinska kiselina) u dvije
vrste naranče, Moro i Sanguinello. Rezultati su pokazali da sok Moro vrste ima ukupno 9.25
mg/L benzojevih fenolskih kiselina i 74.35 mg/L cimetnih fenolskih kiselina, što je više u
odnosu na sadržaj soka Sanguinello vrste.

4.2. LIMONOIDI

Limonoidi, također nazivaju se lomonini, predstavljaju klasu visoko oksidiranih

sekundarnih metabolita tetracikličnih triterpenoida koji se nalaze u biljkama. Uglavnom su
prisutni u biljkama iz porodice Rutaceae i Meliaceae. Limonin (Slika 5.) je jedna od glavnih
komponenata u citrusima koja je odgovorna za gorak okus istih.

8
 Slika 5. Limonin

Limonoidi su široko rasprostranjeni u različitim vrstama roda Citrus, a sadržaj je različit

za različite vrste. Također različiti dijelovi ploda imaju različit sadržaj limonoida. Sjeme je
najbogatije, zatim slijedi kora, dok je pulpa najsiromašnija limonoidima (Luo i Pan,. 2008).
Zeng i saradnici (Zeng et al., 2003) odredili su sadržaj limonoida u različitim dijelovima tkiva
(kora, sjeme, sok iz pulpe) različitih vrsta citrusa. Utvrdili su da je sadržaj limonoida najveći u
sjemenu, zatim u kori, a najniži u soku. Sadržaj limonoida u sjemenu je najveći u Guanximiyou
vrsti (208.4 mg/kg), zatim u grejpfrutu (182.4 mg/kg), Nanchung slatkim narančama (165.2
mg/kg) i Jin narančama (34.2 mg/kg).

4.3. ALKALOIDI

Alkaloidi generalno se odnose na alkalna nitrogenova jedinjenja koja se nalaze u biljkama,

od kojih je većina heterociklična sa optičkom rotacijom i očiglednim fiziološkim efektom.
Alkaloidi u citrusima uključuju oktopamin, sinefrin, tiramin, N-metiltiramin, hordenin i drugi
fenetilamin alkaloidi. Među njima, sinefrin je najvažniji, za koji je dokazano da utiče na
metabolizam organizma. Sinefrin određenim mehanizmom stimulira lipolizu, enzim koji
ubrzava oksidaciju masti, što je od velike koristi gojaznim osobama. Sinefrin i N-metiltiramin
su dva identificirana, esencijalna sastojka u Citrus aurantium. Ova dva alkaloida jačaju srce i
krvne sudove, mogu se koristiti za liječenje bronhijalne astme, hipotenzije, kod stanja šoka i
kolapsa nakon operacije (Tang et al. 2006).

9
 5. ODREĐIVANJE PESTICIDA U CITRUSIMA

Uprkos značajnom napretku u razvoju metoda za pripremu uzoraka za analizu i za finalno

određivanje analita, analiza pesticida u biološkim uzorcima i dalje predstavlja izazov za
analitičare. U analizi rezidua pesticida pojavljuje se niz problema:

(1) Složenost i raznolikost matriksa u biološkim materijalima.

(2) Niske koncentracije pesticida u uzorcima plodova voća.

Zbog toga se analiti od interesa, u ovom slučaju pesticidi, moraju izolirati iz matriksa i
zatim obogatiti prije finalnog određivanja. Kompletna procedura za određivanje rezidua
pesticida u biološkim materijalima je složena i sastoji se od nekoliko faza, koje su sažete na
slici 6 (Pan et al., 2008).

Uzorkovanje

Transport i skladištenje

Ekstrakcija pesticida iz uzorka i

obogaćivanje ekstrakta

Prečišćavanje ekstrakta i
priprema za analizu

Identifikacija i determinacija
pesticida

Slika 6. Glavne faze u određivanju rezidua pesticida iz bioloških materijala

10
 5.1. PRIPREMA UZORAKA ZA ANALIZU

Faza pripreme uzorka i operacije koje su uključene u nju mogu utjecati na konačni rezultat
u većoj ili manjoj mjeri. Izuzetno je važno da uzorak materijala za analizu bude homogen i
reprezentativan. Reprezentativni uzorak ima hemijski sastav koji nalikuje što je moguće više
na prosječan sastav cjeline analiziranog materijala. Uzorak treba čuvati zamrznut i u mraku.
Uopšteno govoreći, proces pripreme uzorka sastoji se od nekoliko koraka. Konkretno kod
plodova voća, jedan takav korak je uklanjanje površinskih zagađivača ispiranjem uzoraka u
destilovanoj vodi. Uzorak se zatim suši na povišenoj ili sobnoj temperaturi ili uz pomoć
sredstava za sušenje.

U sljedećem koraku uzorak se drobi, ili melje u mlinu ili pomoću avana i tučka, nakon čega
se uzorak homogenizira. Tačna procedura pripreme uzorka zavisi od prirode materijala koji se
ispituje, a svaka kombinacija operacija u ovom postupku može dovesti do gubitka analita i/ili
uzrokovati dodatne kontaminacije uzorka (Fenik et al., 2011).

Dio uzorka naranče (200 g) je usitnjen i homogeniziran tri minute pri velikoj brzini u
blenderu (Blasco et al., 2006). Anastassiades i saradnici preporučuju upotrebu snažnih uređaja za
sječenje i usitnjavanje kako bi se postigla dobra homogenost uzorka. Također preporučuje se
upotreba suhog leda kako bi se smanjili gubici pesticida (Anastassiades et al., 2003).

5.2. EKSTRAKCIJA PESTICIDA IZ UZORKA

Faza ekstrakcije uključuje i obogaćivanje ciljnih analita. Ovo je neophodno s obzirom da

su niske koncentracije pesticida u različitim dijelovima okoliša. Ova faza je od suštinskog
značaja, jer u mnogim slučajevima raspoložive analitičke metode nisu dovoljno osjetljive da
izvrše finalno određivanje sastojaka u tragovima direktno iz uzorka. Izolacija i koncentriranje
predstavlja transfer analita iz primarnog matriksa u sekundarni sa istovremenim uklanjanje
interferencija i povećanje koncentracije ciljnog analita do nivoa iznad limita detekcije (LOD)
primijenjene analitičke tehnike. Obzirom da je sadržaj pesticida u voću generalno nizak,
obogaćivanje ciljnih analita je uobičajeno (Juan-García et al., 2004).

11
 Kod plodova voća, čvrsti matriks često treba zamijeniti tečnim. To se radi pomoću
odgovarajućeg postupka ekstrakcije. Pogodne metode za ekstrakciju pesticida su :

(1) Ekstrakcija tečnom fazom (LLE)

(2) Ekstrakcija ultrazvukom (UE)
(3) Soxhlet ekstrakcija
(4) Soxtec ekstrakcija
(5) Ekstrakcija mikrotalasima (MAE)
(6) Soxhlet ekstrakcija potpomognuta mikrotalasima
(7) Ekstrakcija superkritičnim fluidima (SFE)
(8) Ekstrakcija ubrzanim rastvaračem (ASE)

Kako bi se ubrzala priprema uzorka, nove metode ekstrakcije [npr. ekstrakcija ubrzanim
rastvaračem (ASE) i ekstrakcija mikrotalasima (MAE)], zasnovane su na upotrebi visoke
temperature i pritiska za zagrijavanje smjese uzorak-rastvarač. Metoda MAE predstavlja proces
zagrijavanja mikrotalasnom energijom rastvarača koji je u kontaktu sa uzorkom. Mikrotalasi
zagrijavaju cijeli volumen uzorka simultano i oštećuju vodikove veze. Kretanje rastvorenih iona
povećava penetraciju rastvarača u matriks te na taj način potiče rastvaranje komponenata od
interesa iz matriksa (Fenik et al., 2011).

Tehnika ASE je relativno nova, ekstrahuje uzorke na povišenoj temperaturi, dok povišeni
pritisak osigurava da isparljive supstance, koje se ekstrahuju, ostanu u tečnom stanju. Tehnika
ASE se može u potpunosti automatizovati, potrebne su relativno male količine rastvarača, a
vrijeme trajanja ekstrakcije je manje od 1 h. Kao takva, ASE ima mogućnost da prevaziđe
Soxhlet ekstrakciju. Ekstrakcija rastvaračem u Soxhlet aparaturi je jednostavna za izvođenje,
ali ekstrakcija dugo traje, potrebne su velike količine rastvarača i moguće je dobiti ekstrakt iz
samo jednog uzorka u toku ekstrakcije.

Metoda Soxtec je poboljšana verzija Soxhlet metode, ona daje bolji prinos, kraće je vrijeme
ekstakcije, a moguće je ekstrahovati nekoliko uzoraka u isto vrijeme, nedostatak je to što je ova
aparatura izuzetno skupa. Tehnike ekstrakcije rastvaračem često su potpomognute
mikrotalasima i ultrazvukom kako bi se poboljšao prinos analita. Uobičajeni rastvarači su
aceton, acetonitril i etil acetat. Tabela 1. prikazuje najčešće korištene rastvarače za ekstrakciju
pesticida (Tanaka et al., 2007).

12
Tabela 1. Rastvarači korišteni za ekstrakciju pesticida iz različitih uzoraka

Analit Uzorak Rastvarač Literatura

Organohlorni, Fernández et al.,
Masno povrće (npr. Etil acetat –
organofosfatni pesticidi i 2006.
avokado) cikloheksan (1:1)
fungicidi
Escuderos-
Organohlorni pesticidi Voće, povrće Aceton, heksan Morenas et al.,
2003.
Organofosforni pesticidi Jabuka, sok od jabuke Aceton Cai et al,. 2006.
Organohlorni,
organofosfatni pesticidi i Mrkva, naranča Acetonitril Guan et al., 2010.
fungicidi
Organohlorni, Blasco et al.,
organofosfatni pesticidi i Naranča Metanol 2002.
fungicidi

Anastassiades i saradnici predlažu jednostavnu i brzu metodu ekstrakcije u kojoj je

potrebno izvagati 10 g prethodno homogenizovanog uzorka i prebaciti u teflonsku epruvetu za
centrifugiranje. Zatim se dodaje 10 mL acetonitrila, epruveta se zatvara i snažno protresa
pomoću Vortex uređaja u trajanju od 1 minute na maksimalnoj brzini. Zatim dodaje se 4 g
anhidrovanog MgSO4 i 1 g NaCl, i odmah po dodavanju započeti miješanje na Vortex uređaju
u trajanju od 1 minute. Vrlo je važno odmah započeti miješanje kako bi se spriječilo stvaranje
MgSO4 konglomerata. Dodati 50 µL internog standarda (Trifenilfosfat. Rastvor 20 µg/mL
trifenilfosfata u acetonitrilu), miješati na Vortex uređaju još 30 sekundi, zatim centrifugirati
(Sorvall RT6000B) ekstrakt (ili seriju ekstrakata) u trajanju od 5 minuta na 5000 rpm
(Anastassiades et al., 2003).

13
 5.3. PREČIŠĆAVANJE EKSTRAKATA

Nastali ekstrakti ne sadrže samo ciljne analite, već i interferente kao što su ugljikohidrati,
masti, hlorofil, koji mogu uticati na krajnji rezultat analize (Gunther, 1969). Prečišćavanje
ekstrakta je neophodno i treba uvijek prethoditi analizi ekstrakta (Lawrence, 1982).

Uobičajene tehnike za prečišćavanje ekstrakata voća i povrća su:

(1) Ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE)

(2) Mikroekstrakcija na čvrstoj fazi (SPME)
(3) Ekstrakcija miješanjem (SBSE)
(4) Raspršenje matriksa uzorka kroz čvrstu fazu (MSPDE)
(5) Adsorptivna hromatografija
(6) Gel-permeacijska hromatografija (GPC)

Smatra se da je SPE najpopularnija tehnika prečišćavanja. Kako uzorak prolazi kroz

kolonu sorbenta, ciljni analiti se adsorbuju na čestice sorbenta. Zadržana jedinjenja se zatim
resorbuju rastvaračem i analiziraju. Sol, NaCl ili Na2SO4, često se dodaje u rastvor kako bi se
povećala njegova ionska sila, a to povećava udio analita ekstrahovanog na sorbentu.

Sorbenti koji se koriste za SPE uključuju C18, polimere, grafitizirane neporozne karbone,
ionoizmjenjivače. Sorbenti B15C5 su najprikladniji za upotrebu prilikom određivanja
organofosfornih pesticida. Metoda je jednostavna i može biti automatizovana.

Kod SPME, analiti se adsorbuju na vlakno obloženo sa prikladnom čvrstom koja se

istiskuje iz mikrosiringe, analit se termalno desorbuje i spreman je za dalju analizu tj. prebacuje
se u GC ili HPLC injektor. Tehnika GPC se često koristi kao tehnika prečišćavanja. Omogućava
mikromolekularnim pesticidima da se izdvoje iz makromolekularnih supstanci prisutnih u
matriksu (Fenik et al., 2011).

Današnja istraživanja su usmjerena prema pronalasku adekvatnih tehnika za određivanje

pesticida koje će biti brze, jednostavne, jeftine, efikasne, čvrste i sigurne (QuEChERS engl.
quick, easy, cheap, effective, rugged, and safe), kao što je kombinacija ekstrakcije tečnom
fazom (LLE) i SPE. Zasniva se na više faza što je prikazano na slici 7.

14
 Ekstrakcija pesticida iz uzorka sa malom
količinom acetonitrila

Dodavanje MgSO4 i NaCl, za razdvajanje

faza na organsku i vodenu

Ekstrakcija na čvrstoj fazi (SPE) za uklanjanje

preostale vode i dodavanje sorbenta amina

Obogaćivanje uzorka

Analiza pesticida upotrebom GC ili

HPLC uz odgovarajuće detektore

Slika 7. Faze u određivanju pesticida upotrebom (QuEChERS) metode

U Tabeli 2. navedene su najčešće korištene tehnike za prečišćavanje ekstrakta prije

finalnog određivanja pesticida u uzorcima voća i povrća.

Tabela 2. Tehnike prečišćavanja ekstrakata prije finalnog određivanja pesticida u uzorcima

voća i povrća

Tehnika
Analit Uzorak prečišćavanja Literatura
ekstrakta
Organohlorni,
Knežević i Serdar,
organofosfatni pesticidi i Svježe voće GPC
2009
fungicidi
Organohlorni i
Naranča SPE Blasco et al., 2006
organofosfatni pesticidi
Organohlorni,
Naranča, grejpfrut,
organofosfatni pesticidi i MSPDE Soler et al., 2005
limun
fungicidi
Organofosforni pesticidi Jabuke, sok od jabuke SPME Cai et al., 2006

15
 Potrošnja uzorka i toksičnih otapala sa QuEChERS metodom je minimalna. Primjenom
QuEChERS metode za određivanje pesticida u voću i povrću, eliminišu se efekti različitih
matriksa, a prinosi su izuzetno visoki. Metoda se može modifikovati u zavisnosti od vrste
uzorka i ciljnih analita. Kako bi se poboljšala ekstrakcija polarnih organofosfornih pesticida,
metoda se modificira dodavanjem sirćetne kiseline. Kada su u pitanju uzorci citrusa, zaštitni
premazi voska se mogu ukloniti zamrzavanjem uzoraka najmanje 1 h (Payá et al., 2009). Za
analizu citrusa, ribizla i malina, kako bi se poboljšala analiza potebno je dodati razblaženu
otopinu NaOH da bi se dostigao pH = 5. U toku je rad na optimizaciji ove metode za analizu
pesticida raznih vrsta. Posljednja faza u QuEChERS metodi je finalno određivanje analita
pomoću GC ili HPLC (Economou et al., 2009).

Anastassiades i saradnici predlažu da se nakon ekstrakcije izvrši prečišćavanje ekstrakta.

Potrebno je prenijeti 1 mL alikvota gornjeg acetonitrilnog sloja u bočicu za
mikrocentrifugiranje volumena 1,5 mL koja sadrži 25 mg PSA (primarni sekundarni amin)
sorbenta i 150 mg anhidrovanog MgSO4. Protresti ručno ili pomoću Vortex uređaja u trajanju
od 30 sekundi. Zatim je potrebno centrifugirati ekstrakte u trajanju od jedne minute na 6000
rpm. Volumen od 0,5 mL ekstrakta prenijeti u bočicu autosemplera za hromatografsku analizu
(Anastassiades et al., 2003).

5.4. IDENTIFIKACIJA I ODREĐIVANJE ANALITA

Posljednja faza u analitičkoj proceduri je identifikacija spojeva i njihovo kvantitativno

određivanje pomoću odgovarajućih instrumenata. Izbor tehnike za finalno određivanje zavisi
prije svega od osobina analita. Pesticidi se ne mogu posmatrati kao homogena grupa
kontaminanata okoliša, jer se razlikuju prema svojim fizičko-hemijskim osobinama.
Uobičajene tehnike za finalno određivanje pesticida uključuju kapilarnu gasnu hromatografiju
(GC) i visokoučinkovitu tečnu hromatografiju (HPLC) (obično na obrnutim fazama). Da bi se
mogli odrediti pomoću GC, pesticidi treba da budu volatilni i termički stabilni. Za određivanje
organofosfornih pesticida koristi se gasni hromatogram opremljen odgovarajućom kolonom
kao i detektorom. GC se može koristit za određivanje rezidua svih vrsta pesticida. Izbor
hromatografske kolone je izuzetno važan za odvajanje analita i za njihovo kvalitativno i
kvantitativno određivanje.

Hromatografska kolona treba da bude visoko efikasna i otporna na promjene parametara

sepracionog procesa. Čvrsta (stacionarna) faza treba biti termički stabilna i visoko selektivna
(Fenik et al., 2011).

16
 5.5. USLOVI POD KOJIMA SU VRŠENA POJEDINA ISTRAŽIVANJA

Blasco i saradnici su određivali deset pesticida u uzorcima naranče koje potiču iz Valensije.
Za ovu svrhu upotrebljeni su standardi onih pesticida koji se preporučuju za voćnjake citrusa,
a to su: bitertanol (azol fungicid), karbendazim i tiabendazol (benzimidazol fungicidi),
metiokarb (karbamatni insekticid), metidation i trihlorfon (organofosforni insekticidi), imazalil
(konazol fungicid) , heksitiazoks (karboksamid akaricid), i imidahloprid (hlornikotinoidni
insekticid). Rastvoreno je po 100 mg standarda pesticida u 100 mL metanola, osim
karbendazima koji je rastvoren u 10 N HCl umjesto metanola. Na ovaj način su napravljeni
osnovni rastvori, iz kojih se dalje spravljaju radni rastvori.

Dio uzorka naranče (200 g) je usitnjen i homogeniziran tri minute pri velikoj brzini, 50 g
usitnjenog uzorka stavljeno je u staklenu čašu od 250 mL i temeljito izmiješano sa 100 mL etil
acetata i 50 g bezvodnog natrij sulfata. Homogenat je ostavljen da se slegne a supernatant je
propušten kroz filter papir u rotacionu posudu za evaporaciju volumena 500 mL. Čvrsti ostatak
je ponovno ekstrahovan sa 100 mL etil acetata i ispiran dva puta sa 25 mL etil acetata.

Ekstrakt je uparen na volumen manji od 5 mL upotrebom rotacionog evaporatora na 40 °C

i 250 mBara, a zatim je prenešen u graduisanu koničnu epruvetu i uparen do suha pod strujom
nitrogena na ⩽ 50 °C.

Za analizu je korišten Hewlett Packard (Palo Alto, Kalifornija, SAD) HP-1100 serija LC-
MSD (engl. Liquid Chromatography/Mass Selective Detector) sistem opremljen binarnom
pumpom za rastvarače, autosemplerom, volumen injektiranja je podešen na 25 μL. Separacija
je izvršena na C18 koloni (150 × 4.6 mm, veličina čestica 5 μL) zaštićena sigurnosnim ketriđom
C18 (4 × 2 mm ), oba iz Phenomexa (Madrid, Španija). Mobilna faza je metanol-voda gradijent:
t = 0 – 5 min, udio metanola je 40%, od t = 5 – 18 min udio metanola je povećan na 80%, t =
18- 25 udio metanola je 90%. Brzina protoka je 0.8 mL min−1 (Blasco et al., 2006).

Topuz i saradnici su određivali različite pesticide u voćnim sokovima pomoću HPLC-

DAD. U ovom radu određivana su četiri fungicida (folpet, hlorotalonil, kvinometionat,
tetradifon) i jedan herbicid (trifluralin). Standardi ovih pesticida su prvo razblaženi u
acetonitrilu na rastvore koncentracije 5 μg/mL. Ovi rastvori su dalje korišteni za pripremanje
radnih rastvora pesticida koncentracionog opsega 0.025 - 0.4 μg/mL, to je postignuto
razblaženjem sa mobilnom fazon (acetonitril – voda, 40:60). Ovako dobijeni radni rastvori
čuvaju se na 4 °C.

17
 Hromatografska analiza je provedena na TSPLC (engl. Thermo Separation Products
Liquid Chromatograph) (Model Spectra System®, TSP, Kalifornija, SAD), koji je opremljen sa
HPLC pumpom ( SpectraSYSTEM® P4000), vakuum degazerom (SCM 1000). Parametri
sistema su kontrolisani pomoću sistemskog kontrolera (SN 4000), hromatografski podaci
sakupljeni i snimljeni pomoću PC 1000 softvera. Odvajanje je izvršeno pomoću C18, 5μm Luna
kolone (250 mm × 4,6 mm, Phenomenex, Kalifornija, SAD), koja je opremljena zaštitnom
kolonom (4 mm x 3 mm Phenomenex, Kalifornija, SAD). Eluat kolone je praćen sa UV 6000LP
foto-diodnim detektorom. Hromatografsko razdvajanje je izvršeno pomoću gradijentnog profila
acetonitrila i vode. Udio acetonitrila se sa početnih 40% povećava na 90% u toku 20 minuta,
ovo stanje se održava 5 minuta, a zatim se vraća u početne uslove. Brzina protoka mobilne faze
bila je 1 mL min−1, a temperatura kolone je bila ambijentalna. Detektor sa nizom dioda (DAD)
je postavljen na 220 i 260 nm. Spektri apsorpcije zabilježeni su u rasponu od 200 do 360 nm.

Voćni sokovi naranče, jabuke i višnje su prikupljeni iz lokalnih prodavnica. Uzorci su

čuvani na 4 – 10 °C. Metanol (15 mL) je dodan u uzorak od 25 g soka i miješan 10 minuta u
tikvici od 50 mL. Nastala smjesa je dopunjena do 50 mL sa destilovanom vodom. Alikvot
ovog rastvora od 10 mL je prebačen u drugu tikvicu u kojoj se nalazi 50 mL destilovane vode.
Ketriđi za SPE su kondicionirani sa 5 mL metanola i 5 mL vode. Uzorak je propušten kroz
ketriđ uz pomoć vakuumskog sistema. Nakon ispiranja sa 2 mL destilovane vode, sloj sorbenta
je sušen pod vakuumom u trajanju od 10 minuta. Analiti su eluirani sa 3 mL dihlormetana u
bočicu. Eluat je zatim uparavan pod blagom strujom azota na 40 °C. Ostatak je rastvoren u
mobilnoj fazi do konačne zapremine od 0,2 mL i injektiran u HPLC sistem (Topuz et al., 2005)

18
6. ZAKLJUČAK

❖ Citrusi pripadaju rodu Citrus iz porodice Rutaceae, poznati su po svom osvježavajućem

mirisu, sposobnosti gašenja žeđi i obezbjeđivanju preporučene dnevne količine (RDA,
engl. Recommended Dietary Allowances) vitamina C.
❖ Prva faza u procesu određivanja pesticida je priprema uzorka citrusa, prvi korak u
pripremi uzorka je uklanjanje površinskih onečišćenja, zatim sušenje uzorka na sobnoj
ili povišenoj temperaturi. U sljedećem koraku uzorak se usitnjava i homogenizira,
preporučuje se upotreba suhog leda kako bi se smanjili gubici pesticida.
❖ Standardi pesticida koji se preporučuju za voćnjake citrusa su: bitertanol (azol fungicid),
karbendazim i tiabendazol (benzimidazol fungicidi), metiokarb (karbamatni insekticid),
metidation i trihlorfon (organofosforni insekticidi), imazalil (konazol fungicid) ,
heksitiazoks (karboksamid akaricid), i imidahloprid (hlornikotinoidni insekticid).
Potrebno je rastvoriti po 100 mg standarda pesticida u 100 mL metanola, osim
karbendazima koji se rastvora u 10 N HCl umjesto metanola. Na ovaj način se spravljaju
osnovni rastvori standarda pesticida, iz koji se dalje spravljaju radni rastvori standarda
pesticida.
❖ Potrebno je izvagati 10 g prethodno homogenizovanog uzorka citrusa i prebaciti u
teflonsku epruvetu za centrifugiranje. Zatim se dodaje 10 mL acetonitrila, epruveta se
zatvara i snažno. Nakon čega se dodaju 4 g anhidrovanog MgSO4 i 1 g NaCl, i odmah
po dodavanju započinje miješanje na Vortex uređaju u trajanju od 1 minute. Dodati 50
µL internog standarda (Trifenilfosfat. Rastvor 20 µg/mL trifenilfosfata u acetonitrilu),
miješati na Vortex uređaju još 30 sekundi, zatim centrifugirati ekstrakt (ili seriju
ekstrakata) u trajanju od 5 minuta na 5000 rpm.
❖ Potrebno je prenijeti 1 mL alikvota gornjeg acetonitrilnog sloja u bočicu za
mikrocentrifugiranje volumena 1,5 mL koja sadrži 25 mg PSA (primarni sekundarni
amin) sorbenta i 150 mg anhidrovanog MgSO4. Protresti ručno ili pomoću Vortex
uređaja u trajanju od 30 sekundi. Zatim je potrebno centrifugirati ekstrakt u trajanju od
jedne minute na 6000 rpm. Volumen od 0,5 mL ekstrakta prenijeti u bočicu
autosemplera za hromatografsku analizu.

19
❖ Hromatografsko razdvajanje treba biti izvršeno pomoću gradijentnog profila
acetonitrila i vode. Udio acetonitrila se sa početnih 40% povećava na 90% u toku 20
minuta, ovo stanje se održava 5 minuta, a zatim se vraća u početne uslove. Brzina
protoka mobilne faze je 1 mL min−1, a temperatura kolone je ambijentalna. Detektor sa
nizom dioda (DAD) se postavlja na 220 i 260 nm.

20
7. LITERATURA

Anastassiades, Lehotay, Štajnbaher, Schenck. (2003). Fast and Easy Multiresidue Method
Employing Acetonitrile Extraction/Partitioning and “Dispersive Solid-Phase
Extraction” for the Determination of Pesticide Residues in Produce. Journal of AOAC
International. 86. 412-31.

Blasco, Font, Picó. (2002). Comparison of microextraction procedures to determine pesticides

in oranges by liquid chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography
A, 970(1), 201-212.

Blasco, Font, Picó. (2006). Evaluation of 10 pesticide residues in oranges and tangerines from
Valencia (Spain). Food Control, 17(11), 841-846.

Cai, Gong, Chen, Wu. (2006). Vinyl crown ether as a novel radical crosslinked sol–gel SPME
fiber for determination of organophosphorus pesticides in food samples. Analytica
Chimica Acta, 559(1), 89-96.

Duarte, A., Fernandes, J., Bernardes, J., Miguel, G. (2016). "Citrus as a Component of the
Mediterranean Diet". Journal of Spatial and Organizational Dynamics. 4: 289–304

Economou, Botitsi, Antoniou, Tsipi. (2009). Determination of multi-class pesticides in wines

by solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry.
Journal of Chromatography A, 1216(31), 5856-5867.

Escuderos-Morenas, Santos-Delgado, Rubio-Barroso, Polo-Dıé z. (2003). Direct determination

of monolinuron, linuron and chlorbromuron residues in potato samples by gas
chromatography with nitrogen–phosphorus detection. Journal of Chromatography A,
1011(1), 143-153.

FAO (2006). Citrus fruit - fresh and processed, annual statistics. Commodities and Trade
Division, FAO of the UN, Rome.

Fernández Moreno, Arrebola Liébanas, Garrido Frenich, Martínez Vidal. (2006). Evaluation
of different sample treatments for determining pesticide residues in fat vegetable
matrices like avocado by low-pressure gas chromatography–tandem mass spectrometry.
Journal of Chromatography A, 1111(1), 97-105.

21
Fenik, Tankiewicz, Biziuk. (2011). Properties and determination of pesticides in fruits and
vegetables. Trends in Analytical Chemistry, 30(6), 814-826.

Filatova, I.A., Kolesnova, Y. (1999). The significance of flavonoids from citrus juices in
disease prevention. Pishchevaya Promyshlennost 8, 62-63.

Guan, Brewer, Garris, Morgan. (2010). Disposable pipette extraction for the analysis of
pesticides in fruit and vegetables using gas chromatography/mass spectrometry. Journal
of Chromatography A, 1217(12), 1867-1874.

Gulsen, O., Roose, M. L. (2001). „Lemons: Diversity and Relationships with

Selected CitrusGenotypes as Measured with Nuclear Genome Markers”. Journal of the
American Society of Horticultural Science. 126: 309—317.

Gunther F.A. (1969) Insecticide residues in California citrus fruits and products. In: Gunther
F.A. (eds) Residue Reviews / Rückstands-Berichte. Reviews of Environmental
Contamination and Toxicology, vol 28. Springer, New York, NY.

He, X. G.,. Lian L., Bernart. W., (1997). High-performance liquid chromatography–
electrospray mass spectrometry in phytochemical analysis of sour orange (Citrus
aurantium L.). Journal of Chromatography A 791(1–2):127–134.

Juan-García, Mañes, Font, Picó. (2004). Evaluation of solid-phase extraction and stir-bar
sorptive extraction for the determination of fungicide residues at low-μg kg −1 levels in
grapes by liquid chromatography–mass spectrometry. Journal of Chromatography A,
1050(2), 119-127.

Kelebek, H., A. Canbas, S. Selli. (2008). Determination of phenolic composition and

antioxidant capacity of blood orange juices obtained from cvs. Moro and Sanguinello
(Citrus sinensis [L.] Osbeck) grown in Turkey. Food Chemistry 107:1710–1716.

Kimball, D. (Ed.). (1991). Citrus Processing: Quality control and technology. Springer Science
& Business Media.

Knežević, Serdar. (2009). Screening of fresh fruit and vegetables for pesticide residues on
Croatian market. Food Control, 20(4), 419-422.

Lawrence, J. (1982). High-performance liquid chromatography of pesticides (Analytical

methods for pesticides and plant growth regulators ; Volume XII).

22
Luo, S. Z., Pan, L. H. (2008). Advances in study on and use of limonoids. The Beverage
Industry 11(1):4–7

Pan, Xia, Liang. (2008). Analysis of pesticide multi-residues in leafy vegetables by ultrasonic
solvent extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Ultrasonics -
Sonochemistry, 15(1), 25-32.

Payá, Oliva, Zafrilla, Cámara, Barba. (2009). Bioavailability of insect growth regulator residues
in citrus. Ecotoxicology, 18(8), 1137-1142

Peterson, J. , Beecher, R., Bhagwat, A., Dwyer, J., Gebhardt, E., Haytowitz D., Holden, J.
(2006). Flavanones in grapefruit, lemons, and limes: A compilation and review of the
data from the analytical literature. Journal of Food Composition and Analysis 19:S74–
S80.

Soler, Mañes, Picó. (2005). Routine application using single quadrupole liquid
chromatography–mass spectrometry to pesticides analysis in citrus fruits. Journal of
Chromatography A, 1088(1), 224-233.

Tang, F., Tao L., Luo X., Ding L., Guo M., Nie L., Yao S. (2006). Determination of octopamine,
synephrine and tyramine in citrus herbs by ionic liquid improved ‘green’
chromatography. Journal of Chromatography A 1125(2):182–188.

Tanaka, Hori, Asada, Oikawa, Kawata. (2007). Simple one-step extraction and cleanup by
pressurized liquid extraction for gas chromatographic–mass spectrometric
determination of pesticides in green leafy vegetables. Journal of Chromatography A,
1175(2), 181-186.

Tisserat, B., D. Daniel Jones, P. D. Galletta. (1990). Juice vesicle populations in citrus fruit.
Botanical Gazette 151(1):64–72.

Topuz, S., Özhan, G., & Alpertunga, B. (2005). Simultaneous determination of various
pesticides in fruit juices by HPLC-DAD. Food Control, 16(1), 87-92.

USDA, United States Department of Agriculture, Foreign Agricultural Service. The Citrus:
World Markets and Trade, January 25, 2017. FAS Online: https://apps.fas
.usda.gov/psdonline/circulars/citrus.pdf.

23
Ye, X., Chen, J., Xu, J. (2017). Citrus Fruits, Varieties, Chemical Properties, and Products in
the Processing Industry. In Phytochemicals in Citrus: Applications in Functional Foods
(pp. 1-40).

Ye, X. Q., Liu D. H. (2005). Citrus Processing and Utilization. Beijing: Light Industry
Publishing House

Zeng F. K., Zou L. S., Jiao B. L. (2003). Study on the content and distribution of limonoides in
citrus fruits. Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology 3(4):79–81.

24