TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

──────── * ───────

TIỂU LUẬN
MÔN: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH TRONG CNSH
Đề tài: PHÂN TÍCH BETA-LACTAM TRONG DƯỢC PHẨM
BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG CAO ÁP (HPLC)

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Quản Lê Hà.

Sinh viên thực hiện: Nguyễn Đức Thành – MSSV: 20163718
Lớp: Kỹ thuật Sinh học 1 – K61

Hà Nội, ngày 18/03/2019

 LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đối với các thầy,cô của trường Đại học Bách
khoa Hà Nội, đặc biệt là cô Quản Lê Hà – Giảng viên môn Phương pháp phân tích trong
Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình hướng dẫn hướng dẫn em hoàn thành bài báo cáo tiểu
luận.
Trong quá trình báo cáo, cũng như là trong quá trình làm bài báo cáo, khó tránh
khỏi sai sót, rất mong các thầy, cô bỏ qua. Đồng thời do trình độ lý luận cũng như kinh
nghiệm thực tiễn còn hạn chế nên bài báo cáo không thể tránh khỏi những thiếu sót, em
rất mong nhận được ý kiến đóng góp thầy, cô để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và
sẽ hoàn thành tốt hơn bài báo cáo tốt nghiệp sắp tới.
Em xin chân thành cảm ơn!

1
 MỤC LỤC

Trang
LỜI MỞ ĐẦU 3
Phần I: TỔNG QUAN 4
I.1. Kháng sinh Beta - lactam 4
I.1.1. Định nghĩa 4
I.1.2. Cấu trúc – phân loại 4
I.1.3. Tính chất vật lý và hóa học 6
I.1.4. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới 6
hiện nay
I.2. Các phương pháp phân tích định lượng Beta-lactam 7
PHẦN II.ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 9
II.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu 9
II.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
9
II.3. Quy trình xử lý mẫu thuốc 11
PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 13
III.1. Khảo sát mẫu thuốc 13
III.2. Khảo sát điều kiện xác định Beta-lactam bằng LC/MS/ms 14
III.3. Đánh giá phương pháp phân tích 15
TÀI LIỆU THAM KHẢO 18

2
 LỜI MỞ ĐẦU
Các kháng sinh là một trong những nhóm thuốc thiết yếu trong y học hiện đại.
Nhờ thuốc kháng sinh mà y học đã có thể loại bỏ được các dịch bệnh nguy
hiểm như dịch hạch, tả, cúm,..và điều trị hiệu quả nhiều loại bệnh gây ra bởi các loại
virus, vi khuẩn. Đối với các nước nghèo thuốc kháng sinh lại giữ một vị trí rất quan trọng
vì ở các nước này do điều kiện vệ sinh kém và mức sống còn thấp nên thường xảy ra các
dịch bệnh.
Hiện nay, trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 kháng sinh và mỗi năm có
khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện. Kể từ khi penicillin được
ALEXANDER FLEMING phát hiện năm 1929 và được chứng minh có tác dụng chữa
bệnh năm 1941 thì trong hơn nửa thế kỉ qua kháng sinh đã trở thành dược phẩm không thể
thiếu được trong việc điều trị các loại bệnh do virus, vi khuẩn gây ra và nó có tác dụng
hơn hẳn so với các thuốc kháng khuẩn khác. Beta-Lactam là thuốc kháng sinh tổng hợp
quan trọng chữa bệnh cho con người, thú y từ khi chúng được giới thiệu vào thị trường
vào năm 1938 và là loại kháng sinh được dùng nhiều nhất hiện nay. Liều lượ ng và cách
dùng kháng sinh không đúng sẽ dễ bị vi khuẩn nhờn thuốc, kháng thuốc, từ đó việc chữa
trị càng khó khăn. Ngoài ra còn gây lãng phí cho người bệnh vì có những bệnh do virus
không chữa được bằng kháng sinh nhưng vẫn dùng kháng sinh, gây khó khăn cho việc
chuẩn đoán các bệnh và ảnh hưởng tới sức khỏe người bệnh. Hàm lượng lớn kháng sinh
trong máu gây các bệnh về thận, đặc biệt là người cao tuổi.
Vì vậy, kiểm soát và phân tích thuốc kháng sinh đối với người bệnh là biện pháp
cần thiết để nâng cao hiệu quả sử dụng chúng. Hai phương pháp thường dùng để phân
tích cácbeta-lactam là sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp điện di mao
quản (CE). Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao có độ chọn lọc, độ nhạy cao, sử dụng
lượng mẫu ít và thời gian phân tích ngắn. Tách và xác định đồng thời kháng sinh beta-
lactam bằng phương pháp HPLC với các detector hiện đại như huỳnh quang, MS trong
mẫu dược phẩm là mọt hướng nghiên cứu mới, với những ưu điểm nổi bật về độ nhạy, độ
chọn lọc ngày càng được áp dụng nhiều trong các phòng thí nghiệm và phân tích mẫu
dịch vụ. Trên cơ sở đó, tôi đã chọn nghiên cứu đề tài: "Phân tích beta-lactam trong mẫu
dược phẩm bằng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)”
3
 CHƯƠNG I. TỔNG QUAN
I.1. Kháng sinh Beta-lactam
I.1.1. Định nghĩa
Kháng sinh Beta – lactam là các kháng sinh mà phân tử chứa vòng Beta-lactam, gồm các
nhóm: penicillin, cephalosporin, monobactam, cacbapenem trong đó hai nhóm sử dụng
phổ biến và lớn nhất là penicillin và cephalosporin.
Các penicillin thu được từ môi trường nuôi cấy nấm Penicilium notatum và Penicillium
chryrogenum, bán tổng hợp từ axit 6-amino penicillanic (6APA).
Các cephalosporin tự nhiên được phan lập từ môi trường nuôi cấy nấm Cephalosporium
acremonium và bán tổng hợp từ axit 7-amino cephalosporinic (7ACA) xuất phát từ các
kháng sinh thiên nhiên.
I.1.2. Cấu trúc và phân loại
* Các penicillin
Các penicillin đều có cấu trúc cơ bản gồm 2 vòng: vòng thiazolidin và vòng Beta-
lactam.

Kháng sinh penicillin được chia thành 3 nhóm chính với các hoạt tính khác nhau.

4
 * Các cephalosporin
Các cephalosporin cấu trúc chung gồm 2 vòng: vòng Beta-Lactam 4 cạnh gắn với 1
dị vòng 6 cạnh, những cacbon bất đối có cấu hình 6R, 7R. Khác nhau bởi các gốc R.

Dựa vào khổ kháng khuẩn, chia các cephalosporin thành 4 thế hệ.

5
 - Thế hệ I: Tác dụng mạnh nhất trên vi khuẩn Gram (+), yếu nhất trên Gram (-).
Không bền và dễ bị Beta-lactamase phá hủy.
- Thế hệ II: Tác dụng yếu trên vi khuẩn Gram (+), mạnh hơn trên vi khuẩn Gram (-) so
với thế hệ I. Bền với Beta-lactamase.
- Thế hệ III: Tác dụng yếu hơn trên vi khuẩn Gram (+) so với thế hệ I, tác dụng mạnh
trên Gram (-). Bền với Beta-lactamase.
- Thế hệ IV: Hoạt phổ tác dụng như thế hệ III nhưng tốt hơn và kháng nhiều Beta-
lactamase hơn.
I.1.3. Tính chất vật lí và hóa học
Các β-lactam thường ở dạng bột kết tinh màu trắng, dạng axit ít tan trong nước,
dạng muối natri và kali dễ tan; tan được trong metanol và một số dung môi hữu cơ phân
cực vừa phải. Tan trong dung dịch axit và kiềm loãng do đa phần chứa đồng thời nhóm –
COOH và nhóm –NH2.
Cực đại hấp phụ chủ yếu do nhân phenyl, tùy vào cấu trúc khác làm dạng phổ thay
đổi (đỉnh phụ, vai, sự dịch chuyển sang bước sóng ngắn hoặc dài, giảm độ hấp thụ).
Các β-lactam là các axit với nhóm –COOH có pKa= 2,5-2,8 tùy vào cấu trúc phân
tử. Trong môi trường axit, kiềm, β-lactamase có tác dụng phân cắt khung phân tử, mở
vòng β-lactam làm kháng sinh mất tác dụng.
I.1.4. Tình hình lạm dụng kháng sinh ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay
Ta biết rằng, có nhiều loại kháng sinh khác nhau, tác động bằng các cơ chế khác
nhau đối với các vi trùng khác nhau. Kháng sinh chỉ có tác dụng với các bệnh do vi trùng
(bacteria), không có tác dụng với các bệnh do siêu vi (virus). Để điều trị bệnh nhiễm
trùng cần biết loại vi trùng gây bệnh để chọn kháng sinh thích hợp. Vì thiếu hiểu biết và
vì tin tưởng sai lầm, nên ở khắp nơi trên thế giới, nhất là ở các nước đang phát triển,
người ta đã dùng kháng sinh quá nhiều, cả khi không cần thiết, không đúng chỉ định và
không đúng cách. Từ đó, làm cho các vi khuẩn dần dần kháng thuốc , việc chữa trị bệnh
ngày càng khó khăn và sự ô nhiễm môi trường do kháng sinh gây ra càng trầm trọng hơn
Năm 2000, các bác sĩ Hoa kỳ viết 160 triệu toa thuốc kháng sinh cho 275 triệu
người dân, một nửa đến 2/3 số toa đó được coi là không cần thiết.Theo R. Gonzales, 3/4
số kháng sinh dùng ở ngoại chẩn là cho viêm đường hô hấp trên trong khi
6
60% các trường hợp viêm đường hô hấp trên là do siêu vi, không cần và không điều trị
được bằng kháng sinh. Dùng cephalosporins bừa bãi khiến enterococus trở nên đề kháng
và cũng đã xuất hiện các vi trùng enterococus kháng vancomycin. Theo báo cáo của
A.W. McCormick năm 2003, tỉ lệ pneumococus kháng penicillin tăng nhanh ở Hoa
kỳ, tác giả dự tính đến năm 2004, 41% pneumococcus sẽ đề kháng penicillin. Tỉ lệ vi
trùng lao kháng thuốc tăng cao khiến phải dùng 4 thứ thuốc kết hợp để điều trị bệnh lao.
I.2. Các phương pháp phân tích định lượng Beta-lactam
I.2.1. Phương pháp quang học
Phương pháp đo quang là phương pháp phân tích dựa trên tính chất quang học của chất
cần phân tích như tính hấp thụ quang, tính phát quang... Các phương pháp này đơn giản,
dễ tiến hành, thông dụng, được ứng dụng nhiều khi xác định Beta-lactam, đặc biệt trong
dược phẩm.
I.2.2. Phương pháp điện hóa
Một số phương pháp điện hóa được sử dụng để phân tích các Beta-lactam nhưng không
phỏ biến. Daniela P. Santos và cộng sự đã sử dụng sensor điện thế phân tích AMO, đạt
giới hạn phát hiện 0,92 μM (0,39 mg/l) trong môi trường đệm axetat 0,1M với pH=5,2.
I.2.3. Phương pháp điện di mao quản (Capillary electrophoresis – CE)
Gần đây, phương pháp CE được sử dụng rộng rãi do tính chất ưu việt về hiệu quả
tách cao, thời gian tách ngắn, lượng mẫu tiêu tốn ít. Phương pháp đã được ứng dụng để
tách và xác định các kháng sinh Beta-lactam trong nhiều đối tượng mẫu khác nhau.
I.2.4. Sắc ký bản mỏng ( TLC)
Phương pháp này đơn giản và không yêu cầu thiết bị đặc biệt dùng để kiểm tra
đánh giá sơ bộ các chất phân tích có tính ưu việt, tiến hành nhiều mẫu cùng một lúc song
song rất tiện lợi. Khi TLC được trang bị phần phát hiện là một máy đo quang có thể phân
tích định tính và định lượng. Tuy nhiên phương pháp này chỉ dùng để định tính.
I.2.5. Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
Trong những năm gần đây, phương pháp HPLC đã đóng một vai trò vô cùng quan
trọng trong việc tách và phân tích các chất trong mọi lĩnh vực khác nhau, nhất là lĩnh vực
hoá dược, sinh hoá, hoá thực phẩm, nông hoá, hoá dầu, hoá học hợp chất thiên nhiên,
phân tích môi trường,… đặc biệt là tách và phân tích lượng vết các chất.
7
 Một số các kết quả nghiên cứu về kháng sinh Beta-lactam bằng phương pháp HPLC.
Blanchflower WJ và cộng sự dùng HPLC – MS phân
tích penicillin V, PENG, OXA, CLO, dicloxacillin trong thịt, thận và sữa. Điều kiện chạy
sắc ký: cột Inertsil ODS2 (4,6 mm×150 mm, 5μm); pha động: ACN –(C2H5)3N
0,5% (45/55), dùng nafcillin làm nội chuẩn đạt giới hạn phát hiện trong sữa 2-10μg/kg,
trong thịt 25-100μg/kg.J.M.
Cha và cộng sự [11] dùng phương pháp HPLC – MS để phân tích Beta-lactam trong
nước sông và nước thải. Điều kiện chạy sắc ký: cột Xterra MS C 18 (2.1mm×50 mm,
2.5μm); pha động: A = axit focmic 0,1%, B = Metanol (MeOH), C =Acetonitril (ACN);
chạy gradient: bắt đầu A/B/C=90:5:5(v/v/v), 8 phútA/B/C=50:40:10, 20 phút
A/B/C=90:5:5; tốc độ pha động 0.25 ml/phút; nhiệt độ cột 45oC; thời gian 20 phút. Áp
dụng phân tích AMO, AMP, oxacillin, CLO, cephapirincó giới hạn phát hiện của phương
pháp là 8 – 10 ng /l với nước bề mặt, 13 – 18 ng /l với nước thải trước xử lý, 8 – 15 ng /l
với nước thải sau xử lý.
Sử dụng cột Osis MAX (500mg, 6ml, trao đổi anion để tách AMO, AMP, PEN,
penicillin V, oxacillin CLO, nafcillin và dicloxacillin trong nước thải cho độ thu hồi 76-
100%.
Nói chung, khi phân tích kháng sinh trong các đối tượng mẫu phức tạp như thực phẩm,
mẫu sinh học, mẫu nước thải, việc xử lý mẫu đối với các phương pháp đều đòi hỏi quy
trinh xử lý phức tạp do các kháng sinh liên kết chặt chẽ với nền mẫu và có nhiều chất
nhiễu cần loại trừ. Do đó việc kết hợp phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao và kỹ thuật
chiết pha rắn là phương pháp nghiên cứu đạt độ tối ưu cao trong việc phân tích Beta-
lactam do có độ nhạy, độ chính xác và lặp lại cao.

8
 PHẦN II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
II.1. Đối tượng, mục tiêu và nội dung nghiên cứu
II.1.1. Đối tượng và mục tiêu nghiên cứu
Hiện nay, các chỉ tiêu về chất lượng, dư lượng các chất đọc hại là một vấn đề cấp thiết
đang được quan tâm. Trong đó, chỉ tiêu về dư lượng kháng sinh trong mẫu thuốc là một
mảng đề tài rất thực tế và quan trọng. Như đã đề cập ở trên, vấn đề lạm dụng không đúng
hàm lượng kháng sinh đem lại rất nhiều tác hại và ảnh hưởng đến sức khỏe con người.
Trong đề tài này, chất phân tích mà tôi chọn để nghiên cứu là ampicillin (AMP) là kháng
sinh Beta-lactam được sử dụng rộng rãi hiện nay.
II.1.2. Nội dung nghiên cứu
Tập trung nghiên cứu các vấn đề sau:
1. Tối ưu hóa điều kiện tách bằng phương pháp HPLC sử dụng detector khối phổ:
- Điều kiện vận hành máy LC-MS/MS
- Chọn pha tĩnh
- Tối ưu hóa pha động: Thành phần, tốc độ và các điều kiện khác...
2. Điều kiện định lượng:
- Khảo sát khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
- Độ đúng và độ lặp lại của phép đo
3. Phân tích mẫu thực, đánh giá khả năng áp dụng của phương pháp
Phân tích mẫu thuốc
II.2. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất
II.2.1. Thiết bị
- Hệ thống sắc ký lỏng HPLC của Shimazu (Nhật Bản) gồm: Bộ phận bơm dung môi,
bộ loại khí, bộ phận điều nhiệt, cột sắc ký C18 của Dionex(150mm × 2,1mm × 3μm)
ghép nối với detector khối phổ MS/MS Triple Quad 5500 của AB Sciex (Hoa Kì).
- Cân phân tích (độ đọc 0,1mg, 0,01mg).
- Cân kỹ thuật (độ đọc 0,01g).
II.2.2. Dụng cụ
- Pipet: 1, 2, 5, 10, 20ml.

9
 - Bình định mức: 10, 50, 100, 200, 1000ml.
- Ống li tâm 50ml, 10ml.
- Vial loại 1,8 ml.
- Ống đong, phễu, giấy lọc.
- Pipetman loại 200µl, 1000µl và đầu côn.
- Catrige lọc với kích thước mao quản 0,45µm, bề siêu âm, tủ lạnh, tủ sấy, và các dụng
cụ thí nghiệm thông dụng khác.
II.2.3. Hóa chất
- Chất chuẩn Beta-lactam gồm: AMP do viện kiểm nghiệm Bộ Y tế ( 48A Hai Bà
Trưng – Hà Nội) sản xuất và cung cấp.
- MeOH, ACN tinh khiết chạy HPLC Merck (Đức). Các hóa chất khác: Axitacetic,
nước cất hai lần.
* Nguốn gốc chất phân tích:
Thuốc kháng sinh ampicillin (AMP) thuộc nhóm ampicillin phổ rộng, tác dụng với cả
Gram (+) và Gram (-). Không kháng Beta-lactam và penicillinase.
- Nhà sản xuất: công ty CPDP trung ương 1- PHARBACO.
- Ngày sản xuất: 20/8/2011.
- Số đăng kí: Vd- 5967- 08.
- Thành phần: Viên con nang, đóng vỉ, 10 viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg ampicilin, tá
dược vừa đủ.
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn:
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác 0,01g các chất chuẩn trên cân phân tích (độ đọc
0,01mg) của từng Beta-lactam, hòa tan vào từng bình định mức 50ml và định mức đến
vạch bằng nước cất. Chuẩn gốc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0-5oC, tránh ánh sáng trực
tiếp. Hạn sử dụng trong 3 tháng.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian 1 ppm: lấy chính xác thể tích dung dịch chuẩn gốc
của mỗi chuẩn gốc Beta-lactam vào bình định mức 10ml và định mức đến vạch bằng
nước cất. Chuẩn trung gian được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 - 5°C, tránh ánh sáng trực tiếp,
sử dụng trong ngày.
- Dung dịch chuẩn hỗn hợp làm việc: lấy chính xác thể tích hỗ hợp dung môi ACN: H2O
10
(1:1) và thể tích dung dịch chuẩn hỗn hợp trung gian cho vào vial loại 1,5ml thu được các
chuẩn làm việc 1 ppb, 5 ppb, 10 ppb, 50 ppb, 100 ppb, 200 ppb,300 ppb, 500 ppb. Chuẩn
làm việc được bảo quản ở nhiệt độ từ 0 - 5°C, tránh ánh sáng trưc tiếp, sử dụng trong
ngày.
* Chuẩn bị dung môi pha động
- Kênh A: dung dịch acid acetic 0,1% trong nước: lấy chính xác 1 ml acid acetic vào
bình
định mức 1000ml và định mức đến vạch bằng nước cất. Dung dịch được lọc qua màng lọc
0,45µm trước ki bơm vào cột sắc ký.
- Kênh B: ACN
* Cách chuẩn bị mẫu
Mẫu thuốc dưới dạng viên nén, lấy 10 viên đem cân, ghi lại chính xác khối lượng, tính
khối lượng trung bình viên rồi nghiền mịn và trộn đều. Mẫu được cân một lượng thích
hợp để phân tích. Mẫu thuốc còn lại được bảo quản trong tủ lạnh, mẫu đem khảo sát các
điều kiện định lượng. Kết quả được so sánh và đánh giá theo phương pháp thống kê kiểm
tra độ lặp và độ thu hồi. Cách tính khối lượng trung bình viên như sau:
Khối lượng trung bình viên= (khối lượng 10 viên- khối lượng vỏ của 10 viên)/10
Từ đó ta có:
- Khối lượng 10 viên: 7,0647 (g)
- Khối lượng vỏ: 0,9950 (g)
- Khối lượng trung bình viên: 0,6069 (g)
II.3. Quy trình xử lý mẫu thuốc
Trong mẫu thuốc có thành phần chủ yếu là chất phân tích, các tá dược không đáng kể và
không ảnh hưởng đến chất phân tích.

11
Sử dụng mẫu thuốc dạng viên nang nhưng thành phần không chứa chất phân tích sau đó
thêm chuẩn ở mức nồng độ 20ppb và xử lý quy trình như trên. Ta thu được kết quả:
Chất phân tích là AMP có nồng độ 16,6ppb và có độ thu hồi 83,0%.

12
 PHẦN III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.1. Khảo sát mẫu thuốc
III.1.1 Độ lặp lại và độ thu hồi của quy trình xử lý mẫu thuốc
Tiếp tục sử dụng mẫu thêm chuẩn ở 3 mức độ nồng độ 5ppb, 100ppb, 200ppb, mỗi mức
làm lặp lại 6 lần và thực hiện theo quy trình trên ta được bảng sau:
Bảng 3.1: Độ lặp lại và độ thu hồi của mẫu thêm chuẩn ở 5ppb, 100ppb, 20ppb
Nồng độ Thông Trung RSD
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 SD
(ppb) số bình (%)
C (ppb) 4,45 4,57 4,32 4,81 4,78 4,36 4,54 0,21 4,61
5
R (%) 89,1 91,4 86,3 96,1 95,6 87,3
C (ppb) 86,4 93,9 95,7 86,6 93 87,7 90,4 4,22 4,67
100
R (%) 86,4 93,9 95,7 86,6 93 87,7
C (ppb) 171 177 175 162 168 182 173 7,06 4,1
200
R (%) 85,4 88,3 87,7 80,8 83,9 90,8

III.1.2. Phân tích mẫu thuốc

Mẫu thuốc sau khi thu thập được xử lý theo quy trình đã khảo sát và tiếp tục được pha
loãng 2500 lần, sau đó đem đo trên máy LC/MS/MS. Sau khi thu được kết quả phân tích
tôi đánh giá hàm lượng thuốc so với hàm lượng ghi trên nhãn. Sự sai khác về hàm lượng
so với kết quả in trên nhãn là
C% = (mi-Mo)/Mo. 100%
Trong đó: mi: khối lượng xác định theo phương pháp phân tích (mg/viên)
Mo: khối lượng thuốc ghi trên nhãn thuốc (mg/viên)
Hàm lượng chất phân tích trong mẫu thuôc sai khác với hàm lượng ghi trên nhãn tương
đối nhỏ.
III.2. Khảo sát điều kiện chạy xác định Beta-lactam bằng LC-MS/MS.
III.2.1. Khảo sát các điều kiện chạy của detector khối phổ
Theo tài liệu tham khảo, tác giả Lê Ngọc Sơn đã tiến hành phân tích các kháng sinh họ
beta-lactam trên thiết bị LC-MS/MS tại phòng thí nghiệm của viện kiểm nghiệm an toàn

13
vệ sinh thực phẩm trong khoảng thời gian từ tháng 2 đến tháng 5 năm 2012. Do vẫn tiến
hành trên cùng thiết bị đó nên tiết kiệm thời gian phân tích tôi đã sử dụng một số kết quả
khảo sát đã được trình bày trong đề tài của tác giả Lê Ngọc Sơn [6] như sau:
Điều kiện tối ưu của thiết bị khối phổ:
- Các điều kiện tối ưu của thiết bị khối phổ được trình bày trong bảng 3.3:
Bảng 3.3: Điều kiện chạy nguồn ion hóa ESI
Curtain Gas (CUR) 35,0 psi
Collision Gas (CAD) 7,0 psi
IonSpray Voltage (IS) 5000V
Temperature (TEM) 300oC
IonSource (GS1) 30 psi
IonSource (GS2) 20 psi
Ý nghĩa của các thông số:
+ CUR: Luồng khí mang N2 tinh khiết thổi vào khe giữa 2 màn chắn của bộ phận ion hóa
và bộ phận phân tích phổ.
+ CAD: Kiểm soát áp suất khí N2 trong Q2, tạo năng lượng để phân mảnh ion mẹ.
+ IS: Thế ion hóa, thế này được áp lên đầu phun và màn chắn của bộ phân phân tích ion.
+ TEM: Nhiệt độ của luồng khí nóng thổi vào Gas 2.
+ GS1: Áp suất hai bên đầu phun, có tác dụng làm cho sự hình thành câc giọt được dễ
dàng hơn.
+ GS2: Áp suất của luồng khí nóng, hỗ trợ quá trình làm bay hơi dung môi.
III.2.2. Chọn pha tĩnh
Cột tách góp phần quan trọng trong việc quyết định quá trình tách chất. Các chất nhóm
Beta-lactam là các chất kém phân cực, do đó tôi vẫn sử dụng cột tách là cột tách pha đảo
cho quá trình phân tích. Trong điều kiện phòng thí nghiệm cho phép, chúng tôi chọn cột
pha đảo C18 để tách các chất Beta-lactam. Để bảo vệ cột, tôi sử dụng thêm tiền cột.
Thông số cột tách và tiền cột:
- Cột Acclaim C18 của Dionex (150mm x 2,1mm x 3µm).
- Tiền cột Acclaim C18 của Dionex.

14
 III.1.3. Chọn pha động
Theo tài liệu tham khảo [6] tôi sử dụng pha động như sau:
- Kênh A: Axit acetic 0,1% trong nước.
- Kênh B: ACN
Trong [9] sử dụng chương trình gradien chạy trong 12 phút với tốc độ dòng 0,4ml/phút
nhưng để tiết kiệm thời gian phân tích tôi chọn chương trình gradien chạy trong 10 phút
như sau:
Bảng 3.4: Chương trình chạy gradient tối ưu rửa giải các chất Beta-lactam

Thời gian (phút) Tốc độ dòng (ml/phút) CH3COOH 0,1% ACN

2,00 0,4 95 5
3,00 0,4 5 95
6,50 0,4 5 95
6,51 0,4 95 5
10,00 0,4 95 5
Như vậy các thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký như sau:
- Cột Symestry C18 của Dionex (150mm x 2,1 mm x 3µm).
- Tiền cột C18 của Dionex.
- Thành phần pha động: Kênh A là dung dịch acid acetic 0,1% trong nước, kênh B là
dung môi ACN.
- Chương trình chạy gradient ở bảng 3.4.
- Tốc độ dòng 0,4ml/phút.
- Detector MS/MS với các thông số ở bảng 3.3.
Tiến hành chạy sắc ký đối với chuẩn kháng sinh AMP Beta-lactam với các điều kiện tối
ưu thu được t= 5,27 phút.
III.3. Đánh giá phương pháp phân tích
III.3.1. Khảo sát khoảng tuyến tính
Từ các điều kiện đã tối ưu ở trên tiến hành khảo sát khoảng tuyến tính của phép đo với
các điều kiện sau:

15
- Khoảng nồng độ: 1ppb- 500ppb
- Phương pháp đo diện tích S
Kết quả thư được ở bảng 3.5. Từ đó ta xây dựng đường chuẩn với từng kháng sinh beta-
lactam.
Bảng 3.5: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Beta-lactam

Nồng độ (ppb) Diện tích pic

1 65700
5 322000
10 692000
20 1330000
50 3440000
100 6780000
200 13900000
300 20600000
500 27000000
Từ bảng trên ta có đồ thị đường chuẩn sau:
. Đồ thị đường chuẩn của AMP

16
 Phương trình đường chuẩn:
Y = (-9402,2 ± 68489,8) + (68943,0 ± 512,2).X
III.3.2. Giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ
Giới hạn phát hiện LOD được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống
phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa với tín hiệu của mẫu trắng hay tín hiệu
nền.
Giới hạn định lượng LOQ được xem là nồng độ thấp nhất mà hệ thống phân tích định
lượng được với tín hiệu phân tích khác có ý nghĩa định lượng với tín hiệu của mẫu trắng
hay tín hiệu nền. Theo lí thuyết thống kê hóa phân tích thì LOQ =3,33 LOD.
Để xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ, dùng mẫu chứa chất
phân tích pha loãng cho đến khi tín hiệu phân tích gấp 3 lần tín hiệu đường nền. Ta có kết
quả:
- LOD: 0,1ppb
- LOQ: 0,6ppb

17
 TÀI LIỆU THAM KHẢO

 Tài liệu Tiếng Việt:

1. Bộ Y Tế (2002), Hóa dược, tập 2, NXB Y học, Hà Nội.
2. Trần Thị Dung (2011), Nghiên cứu điều kiện phân tích thuốc kháng sinh họ
Beta-lactam trong các mẫu sinh học và dược phẩm, luận văn thạc sỹ,
ĐHQGHN
3. Nguyễn Văn Đích (2005), Không nên lạm dụng kháng sinh, Báo y học và đời
sống, số 27.
4. Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2003),
Hóa phân tích- Các phương pháp phân tích công cụ.
5. Nguyễn Thị Như Hoa (2012), Phân tích Beta-lactam trong mẫu dược phẩm và
sinh học bằng phương pháp HPLC, luận văn thạc sỹ khoa học, ĐHKHTN-
ĐHQGHN.
6. Lê Ngọc Sơn (2011), Xác định hàm lượng Beta-lactam trong thực phẩm bằng
phương pháp sắc ký lỏng hai lần khối phổ LC-MS/MS, khoa luận tốt nghiệp,
ĐHQGHN.
7. Lại Thị Thu Trang (2010), Nghiên cứu các phương pháp sắc kí xác định thuốc
kháng sinh họ Beta-lactam, luận văn thạc sỹ, ĐHQGHN.
 Tài liệu Tiếng Anh:
8. Althea W. McCormick (2003), " Geographic diversity and temporal trends of
antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae in the United States",
Journal Nature medicine, 9, 424 – 430
9. D.P. Raymond (2001), " Impact of a rotating empiric antibiotic schedule on
infectious mortality in an intensive care unit", Journal of Critical Care
Medicin,
29(6):1101-1108.
10. E. Benito-pena, A.I.Partal-Rodera, M.E.Leon-Gonzalez, M.C.Moreno-Bondi
(2005), “Evaluation of mixed mode solid phase extraction cartridges for the

18
 preconcentration of beta-lactam antibiotics in wastewater using liquid
chromatography with UV-DAD detection”, Analytical Chimica Acta, 556(2),
415-
422.
11. J.M. Cha, S. Yang, K.H. Carlson (2006), ,"Trace determination of β-lactam
antibiotics in surface water and urban wastewater using liquid chromatography
combined with electrospray tandem mass spectrometry", Journal of
Chromatography A, 1115(1-2), 46-57.
12. Nigel J.K Simpson (2000), Solid-phase extraction, Marcel Dekker, New York.
13. WJ Blanchflower, Hewitt SA, Kennedy DG (1994), "Confirmatory assay for
the
simultaneous detection of five penicillins in muscle, kidney and milk using
liquid
chromatography - electrospray mass spectrometry", Analyst, 119(12), 2595-
2601.

19