||| gy ostrumentacion 9001 ‘SA Ov. Dunas 46 © Colonia Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, D.F. Tels.: 369-4102 389-8707 Fax: 388-2184 LIQUID CHROMATOG td fea ems) 8 Ty bee tel We INJECTOR RECORDER Cf eT Pe SISTEMA DE SOLVENTE: El primer componente importante por orden de aparicion en un Sistema de HPLC es el solvente o fase movil, cuyo propésito es el de transportar la muestra a través de todo el sistema, Los requisitos del solvente para obtener una buena separacién de los componentes son los siguientes: 1. Debe ser capaz.de disolver la muestra 2. Ser de alta pureza (grado HPLC), 3. La polaridad del solvente debe ser controlada para producir valores de k entre 2-10. 4. Algunos factores de importancia secundaria para la seleccién de los solventes, incluyen: costo, viscosidad, toxicidad y punto de ebullicién. En el caso de la técnica de Absorcién los solventes cominmente utilizados son; hexano, cloruro de metileno, cloroformo, metanol y acetonittilo, 8 MONITOREO AMBIENTAL ® AA @ ICP @ UV/VIS @ FTIR © HPLCapc (ay [gnsiumentacion 8001 OV. Dunas 46 © Colonia Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, D.F Tels.: 369-4102 389-8707 Fax: 388-2184 Para la técnica de fase reversa son metanol/agua y acetonitrilo/agua, En la técnica de intercambio iénico, las soluciones buffer y por tiltimo para la técnica de permeacién en gel, los solventes son, tetrahidrofurano y tolueno. Para disolver la muestra, se debe tomar en cuenta la viscosidad del solvente, la compatibilidad con el empaque de la columna y el detector usado. Factores secundarios como el costo, toxicidad y punto de ebullicién del solvente también deben ser considerados. La filtracién del solvente antes de la entrada al sistema de cromatografia es un punto al que se debe poner especial atencién pues esto podria provocar dafios en el funcionamiento de las vilvulas check, fugas del solvente; ademas del posible rayado permanente de los sellos, Para evitar esto se hace necesario filtrar por membrana el solvente antes de adicionarlo a los reservorios. También se debe colocar un filtro de metal poroso (2 jum) a la entrada al sistema e incluso filtrar la muestra por membrana con un tamafio de poro del orden de 0.5 um. VSMC RS olay meow Td 1 Ee AS 2um FILTER @BEREEBEEEEEEE EE@asc oa | gy ostrumentacion SL EEN _ Dunas 48 © Colonia Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, D.F Tels.: 369-4102 389-8707 Fax: 388-2184 MAS DE BOMBEO: . EI propésito de la bomba es generar la presién suficiente para transportar la fase mévil a través de todo el sistema cromatografico, SIS LOS REQUERIMENTOS PARA UNA BOMBA SON: Debe de ser quimicamente inerte, permitiendo el uso de una gran variedad de solventes. Debera generar altas presiones; 5000 PSI son suficientes para realizar la mayoria de las separaciones cromatogrificas con velocidades de flujo entre 0.5 y 10 ml/min. EI sistema de bombeo debe estar libre de pulsos o ser capaz de amortiguarlos, ya que de lo contrario provocaria ruido en la sefial del detector Reproducibilidad en la velocidad de flujo. Capacidad de la bomba para llevar a cabo un gradiente de elucién, 1. CHEMICALLY INERT PAC Ma or10) 51a Mt oy) 3. FLOW RATE (0.5—10 ML/MIN) 4. PULSE FREE OR DAMPED 5. FLOW REPRODUCIBILITY < 1% 6. GRADIENT; RECYCLE; RAPID CHANGE DY 10 MONITOREO AMBIENTAL® AA@ICP@UV/VIS@FTIR@ HPLC |@asc Dunas 46 CS) ya OStrumentacion 9001 Shaecv Colonia Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, D.F Tels. Fax: COLUMNAS: EI siguiente componente importante en un sistema cromatografico es la columna, generalmente construida en acero inoxidable, Ia longitud de la columna varia entre 15 a 100 cm. siendo la mas frecuente de 25 cm. de largo con diametros de 3 a 4 mm. El empaque de la columna esta constituido por particulas. El area de contacto y la eficiencia en la separacién de los componentes son funcién del tamaito de particula en el empaque. Se tienen tres factores para caracterizar los tipos de empaque para la columna. EL primer factor es la estructura. amente son dos: porosa y pelicular Totalmente porosa significa, una estructura semejante a una esponja, a través de la cual la muestra y el solvente emigran, Los empaque peliculares consisten de esferitas de vidrio sélido recubiertas de una pelicula fina de material absorbente. EI segundo factor es el tamafio de particula. Son macroparticulas todas aquellas mayores a 50 micras, los empaques de tamafio intermedio van desde 20 hasta 50 micras. Estos se empacan secos, al igual que las macroparticulas. Las microparticulas son generalmente de 5 a 10 micras de didmetro con un intervalo de variacién menor a las 2 micras. Estas particulas tan pequefias producen las eficiencias més altas en columnas, debido a la mayor superficie de contacto que offecen. Sin embargo, se requiere de técnicas especiales para empacarlas eficientemente, ademas de ofrecer mayor resistencia al paso del flujo y por lo tanto levantar mayor presién. El tercer factor es la forma de la particula. En general las patticulas esféricas son mas féciles de empacar que las de forma irregular, dando como resultado una menor presion para la misma velocidad de flujo. La técnica’ de empaque de las columnas es especial y la mayoria de las comercialmente empacadas tiene marcada la direccién de entrada de la fase mévil, lo que mejora la eficiencia de la columna. A continuaci6n se discuten los principales empaques de la columna, La primera consideracién para escoger una columna en Cromatografia de Liquidos de Alta Resolucién es la clasificacién de la muestra de acuerdo a su peso molecular, su solubilidad, y su caracter iénico 4 MONITOREO AMBIENTAL © AA @ ICP @ UV/VIS @ FTI 369-4102, 389-8707 388-2184 IR® HPLC [ rf [ t l L@pasc nstrumentacion ‘SA GON. Dunas 46° * ‘Acueducto de C.P.07279 México, Tels.: Fax CROMATOGRAFIA DE ADSORCION: Esta técnica depende de Ja adsorcién del soluto en el adsorbente polar como la silica gel 0 alimina, esta técnica es aplicada generalmente a muesttas no ionizables. La superficie de la silica conticne grupos silanol formando puentes de hidrogeno originando que los componentes se adhieran a esos puentes con diferente fuerza. La fase movil rompe los puentes de hidrdgeno eluyendo los componentes de la muestra a lo largo de la columna, CROMATOGRAFIA DE PARTICION LIQUIDO-LiQUIDO: La ctomatografia de particién’ liquido-liquido se leva a cabo fijando mecanicamente un disolvente inmiscible (fase estacionaria) a un soporte y al fluir otro solvente inmiscible (fase mévil) sobre él, y encontrarse éstos en contacto intimo permiten que ocurra extracciones nrilliples, realizandose la separacién en funcién de la solubilidad. El problema que presenté este tipo de empaque fue el arrase de la fase estacionaria por la fase mévil, agotindola rapidamente y provocando grandes sefiales de fondo. CROMATOGRAFIA EN FASE QUIMICAMENTE UNIDA: En esta técnica la fase estacionaria que también es un liquido, esta enlazada quimicamente al soporte por enlaces covalentes. La principal ventaja es que la unién es estable (érmica e hidroliticamente, En contraste a fa cromatografia de particién liquido- liquido este grupo organico no se remueve por un cambio de temperatura y no se hidroliza con solventes polares tales como agua 0 metanol La cromatografia en fase quimicamente unida permite el uso de téenicas de elucién por gradiente, La elucién por gradiente involucra un cambio en la composicién del solvente normalmente incrementando la polaridad durante la corrida. Esto ayuda a eluir Jos componentes mas fuertemente unidos. Existen dos tipos de columnas en fase quimicamente unidas: Fase reversa y fase normal, La fase reversa usa cadenas de hidrocarburos no polares tales como el 9001 Colonia Guadalupe OF 369-4102 389-8707 388-2164 MONITORED AMBIENTAL @ AN© ICP® UV/VISe FTIn® HPLC1 @paBe : Oe enmgin Dunas 46 © — Colonia Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, DE Tels.: 369-4102 389-8707 Fax: 388-2184 octadecilsilano, octilsilano, fenil, etc., y la fase normal usa cadenas polares como el cianopropil y el aminopropil Los solventes usados en la cromatografia fase reversa son polares, de esta manera las moléculas menos polares son atraidas fuertemente por la fase estacionaria y se eluiran en un tiempo mas largo. Los solventes usados en cromatografia de fase normal son no polares y las moléculas mas polares son atraidas fuertemente por la fase estacionaria, siendo estas eluidas en un tiempo mas largo. CHEMICALLY BOUND PACKINGS OCTADECYL —-SI-O-SIVWWYWWY cH, fea NNTo) -Si-O-Siv/cN -Si-O- cram -Si-0-si-O) CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO: EI soporte usado en esta técnica es el poliestireno o la silica gel en una variedad de tamaiios. La fase mévil es una solucién buffer o solucién amortiguadora. El pH y la fuerza iénica deben seleccionarse adecuadamente ya que afecta de + manera significativa la elucién de los componentes de la columna. MONITORED AMBIENTAL® AR ICP UV/VIS© FTIR® HPLC(apc ; | gnstrumentacion 9001 ‘SA ce Dunas 46. °* Colonia ‘Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, DE Tels, Fax La separacién de los componentes consiste de un equilibrio competitive entre los iones de la muestra y el solvente por los iones en el soporte, Para el intercambio aniénico se usa el grupo tetra-alquilamonio y ew el caso del intercambio calidnico se usa el grupo sulfonato. Las muestras que, pueden ser analizadas por esta técnica son los nucledtidos, carbohidratos, iones metalicos, aniones en agua y una amplia aplicacién en el Area bioquimica. CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION: Este tipo de cromatografia se divide a su vez en petmeacion en gel y filtracién en gel En Ja ctomatografia de filtracién en gel, las muestras son de alto peso molecular y solubles en agua; Ia fase estacionaria son geles hidrofilicos que se hinchan con el agua y Ja fase mévil es agua. En la cromatografia por permeacién en gel las muestras son polimeros solubles cn solventes organicos, la fase estacionaria son copolimeros de estireno y divinilbenceno y Ia fase mévil es un solvente orgénico, el cual generalmente es (ettahidrofurano y tolueno. La técnica de separacién consiste en la separacidn por tamaiio de particula o peso molecular de manera que eluiran de la columna primero los de mayor peso molecular y asi en forma decreciente. La cromatografia de exclusion ha encontrado un gran campo de aplicacién en la determinacién y distribucién del peso molecular de los polimeros y las parafinas. COLUMNAS MICROBORE: Tienen un didmetro interior de 1.0mm y se utilizan para la separacion de péptidos y proteinas en muestras pequefias. Estas columnas reducen significativamente el consumo de solventes. La sensibilidad es alta y los tiempos de andlisis son favorablemente pequefios en comparacién con algunas muestras analizadas en columnas comunes n MONITOREO AMBIENTAL® AA @ ICP @ UV/VIS @ FTI 369-4102 389-8707 388-2184 Re HPLCDunas 46 © ip 0 nstrumentacion 9001 SA RCV Colonia Acueducto de Guadalupe CP.07279 México, DF Tels. Fax COLUMNAS NARROWBORE: Son columnas con 2.1mm de didmetro interior. Son excelentes para muestras donde su Volumen es limitado la deteccién de trazas se dificulta, Se recomienda en algunas muestras biolégicas y ambientales. En comparacién con las columnas analiticas comunes la velocidad de flujo y el consumo de fase mévil disminuye en proporcidn de 1a 5 Las columnas narrowbore con empaques de tamaiio de particula entre 3 a Spm y con N (naimero de platos tedricos) entre 80,000 y 50,000 N/m (naimero de platos tedricos/ metro), ofrecen una alta resolucién, especialmente cuando se tienen trazas de componentes en una muestra. PRE y POST-COLUMNA: Se utilizan para dar una mayor sensibilidad a la deteccién de muestras como aminodcidos, proteinas, carbohidratos, iones inorgénicos, pesticidas y otros. Este tipo de componentes no tienen grupos funcionales en su estructura que puedan absorber en la region UV-Vis por lo que con una reaccién de derivacién antes o después de la columna analitica (pre 0 post-columna) los componentes simples en una muestra pueden dar una sefial que pueda ser detectada, Esta reaccién incrementa la sensibilidad en la deteccién 0 capacita su uso mejorando las condiciones de selectividad, La reaccién puede ser un simple cambio de pH del efluente de la columna, sin embargo los resultados son significativos. GUARDA COLUMNAS, Un guarda columna se coloca antes de la columna analitica con una longitud de 2cm para muestras muy sucias, prolongando el tiempo de vida de la columna analitica. DETECTORES EI siguiente componente importante en un HPLC, es el Sistema de deteccién, en donde se genera una seffal eléctrica proporcional a la concentracién de los componentes de una muestra. Entre los detectores que se encuentran en el mercado tenemos los detectores UV-Vis de longitud de onda fija, de longitud de onda variable, arreglo de diodos, de barrido rapido de Indice de refraccién, de Fluorescencia, electroquimico, de conductividad 18 MONITOREO AMBIENTAL® AA@ICP@UV/VIS@FTIR® HPLC _ 369-4102 389-8707 388-2184Dunas 46 * Colonia Acueducto de Guadalupe CP.07279 México, DF. Tels: 369-4102 389-8707 Fax: 388-2184 @ ULTRAVIOLET - FIXED WAVELENGTH - VARIABLE WAVELENGTH (INCLUDING PHOTODIODE ARRAY) @ REFRACTIVE INDEX DET) TOR ULTRAVIOLE’ in los detectores UV-Vis, los equipos contienen una fuente de radiacién para la isible y otta para la regidn ultravioleta. Esta luz se hace incidir sobre una rejilla , 1o cual dispersa esta luz y produce un espectro de diferentes longitudes de region holografi onda. Las diferentes longitudes de onda inciden sobre una abertura o rendija, ajustada de tal manera que sdlo pasa la linea o banda espectral deseada a través de ella. Esta luz de una longitud de onda especifica se hace pasar por la muestra, la cual absorbe un porcentaje proporcional a la concentracién del analito de interés. Después de pasar por la llega a un fotodetector que la convierte en una sefial, eléctt esta sefial es amplificada ya que es muy pequeita, Por iiltimo esta sefial eléctrica se leva a un registrador o sistema de manejo de datos En el caso de los equipos de doble haz, la energia de la fuente luminica pasa por la abertura espectral a la salida del monocromador, haciéndola incidir en forma alternada 19 MONITOREO AMBIENTAL® AA © ICP © UV/VIS@ FTIR® HPLC¢)aBc ww) a Ostrumentacion 900 ‘SA GOV. . Dunas 46 * Colonia Acueducto de Guadalupe C.P.07279 México, DF Tels: 369-4102 389-8707 Fac 388-2184 sobre el compartimiento de la muestra y Ia referencia, Estos dos haces de luz llegan 4 alternadamente al detector en donde su-energia éptica se convierte en seiial eléctrica Comercialmente existen detectores de UV-Vis de longitud de onda fija , longitud de onda variable, arreglo de diodos y de barrido rapido. ‘TOR DE INDICE DE REFRACCIO Los detectores de indice de refraccién se basan en el principio de la luz refractada a través de una celda de referencia y la celda de la muestra, originando una diferencia en el indice de refraccién entre las mismas. El detector de indice de refraccién es un detector de respuesta universal, poco sensible (10° gr.), no se puede utilizar en sistemas de gradiente, por los cambios de indice de refraccién, Es sensible a los cambios de temperatura Es muy usado en la cromatografia de exclusién, en donde no se requiere de alta sensibilidad y en donde por la naturaleza de la separacién por peso molecular todos los componentes producen una respuesta. También es usado en columnas preparativas. DETECTOR DE FLUORESCENCIA: EI fendmeno de fluorescencia, se presenta cuando un electron que ha sido desplazado a un nivel de energia més alto por Ia energia activante, vuelve a su nivel energético original liberando el exceso de energia que habia absorbido 0 almacenado, provocando con ello radiacién electromagnética visible. Si el tomo que lo contiene choca con otra particula y le cede toda o parte de su energia, Ia fluorescencia * disminuye o se inhibe o no aparece Un detector de fluorescencia consta de los siguientes componentes: Una fuente de radiacién luminosa (lampara de xenén), un monocromador de excitacion, un monocromador de emisién, un sistema dptico, una microcelda de flujo y un tubo fotomultiplicador ( que convierte la sefial fotdnica en corriente eléctrica). ~ DETECTOR ELECTROQUIMICO: Este detector encuentra una amplia aplicacin en el area clinica y ambiental. 5 Algunas de estas aplicaciones incluyen los andlisis de rutina como catecolaminas, para el diagnostico de cancer, fenoles en agua potable y de desecho, benzidinas en el monitoreo + ambiental y todos pueden ser analizados con una alta sensibilidad. MONITORED AMBIENTAL® AA@ICP@UV/VIS@FTIR@ HPLC a| @asc | Ore enacn ———— Dunas 45 * Colonia Acueducto de Guadalupe CP.07279 México, D.F Tels.: 369-4102 389-8707 Fax: 388-2184 La deteccién electroquimica esta basada en el principio amperométrico, en donde la corriente es directamente proporcional a la concentracién del componente. DETECTOR DE CONDUCTIVIDAD El detector de conductividad es un detector especifico y sensible a los compuestos iénicos, por Io cual tiene un amplio campo de aplicacién en muestras aniénicas, catidnicas, acidos organicos, metales de transicién y surfactantes. RESUMEN DE DETECTORES USADOS EN HPLC SUNIMARY -- HPLC DETECTORS Seay ese Titel lor ot) " Ale) Tle 10% 21 MONITOREO AMBIENTAL © AA @ ICP © UV/VIS @ FTIR® HPLC