MATERIALES Y METODOS Recoleceién Se recolectaron raices de Ambrosia anbrosioides, aproximadamente a 8 kn de Hermosillo, en las orillas de 1a carretera Hermosillo- El Novillo, en diferentes fechas de 1979. Separacién de Principios Activos Secado y Molienda. La planta se secé al sol sobre camas de ixtie, deter minindosele cada dfa su contenido de humedad hasta que este fue de 9. La planta seca se molié en un molino tipo Wiley,- para reducir su tamafo en astillas de 1a 3 ca. Extraceién. La planta se extrajo exahustivanente con éter de pe~ tr6leo, metanol y agua, en extractores soxhlet con capacidad de sifén de 2200 ml, obteniéndose los correspondientes extrac tos, Estos fueron concentrados a presién reducida en un rotavapor R Biichi- Brinkmann Instrunents. Separaci6n de Compuestos. Se utilizaron métodos cromatogréficos; cromatogra- fa en coluana seca, cronatograffa en capa delgada,cromatografte en capa delgada preparativa, ademas de métodos de cristalizacién usando en cada caso los solventes adecuados. Métodos Cromatogréficos. a) Cronatograffa en columna seca. Se utilizaron co lumnas de distintas dimensiones dependiendo de 1a cantidad a separar de material , #8 empacaron con sflica gel 60 (70-250 malas) uséndose una relaci6n de auestra/adsorbente, que va - ris de 1: 15 8 1:20. b) Cronatografta en capa delgade. Se usaron placas de vidrio de 10 x 10 em, 10x § cm, sobre las cuales se aplic6 una pasta de espesor uniforme de 0.25 mm, utilizande vn aparato enbadurnader de placas ajustable para espesor va - riable Sur. La pasta se preparé nezclango 30 g de sflica gol 600 de 1a casa Merck A.C. con 63 ml de agua destilada, se agita la mezcla y se aplica enseguida, se dejan roposar las placas por 20 minutos, enseguida se activan por calentamiento en un horno a 100-330°C durante una hora. ) Cromatografia en capa delgada preparetiva. Se utilizaron placas de vidrie de 20 x 20 cm sobre las cuales se aplic6 una capa de pasta de 1 mm, en forma similar a la utili sada para CCD. Para el desarrollo de 1a CCD y CCDP se utilizaron ca maras cilfndricas de 13 em de didmetro por 17.5 om de altura y cénaras para cromatograffes ascendente tanafio estandar taps das con placas de vidrio,Agentes Cromogénicos. Se usaron como reveladores generales luz ultraviole- ta, solucién de cloruro de cobalto al 2% en una solucién acuosa de 4cido sulfdrico al 19% y vapores de yodo. Pruebas Quinicas 4) Prucba de Licbermann- Burchard, Se mezelan 1 al de amhfarido acético y 1 ml de cloroformo, se enfrfan a 0°C y se les afiade una gota de acide sulfdrice concentrado. Una porci6n de 6ste reactivo se pone en contacto con 1a sustancia © su solucién clotoférmica,la prueba es positiva para esteroles cuando hay formaci6n de colores azul, verde, rojo, naranja, ete. (2). >) Prueba de Salkowski. Una solucién cloroférmica conteniendo de 1 2 2 ng de 1a muestra se ponen en contacto con 1 ml de dcido sulfirico. Si hay esteroles se observan colores amarillo o rojo. (2). €) Reaceién con cloruro de cobalt. Se tratan 0.2 ng de 1a muestra con cloruro de cobalto a1 24 con una soluciéa acuosa de fcido sulfdrico concentrado al 10%, La prueba es caractertstica para esteroles y triterpenos y es positiva cuando da una coloracién azul o violeta. (2). 4) Prueba de permanganato de potasio, 0.1 ¢ 0 0.2 al del compuesto se disuelven en 2 ml de agua o etanol, se afiade tuna soluci6n de pernanganato de potasio al 24 gota @ gota con agitacién, hasta que persista el color pGrpura del permangena to de potasio; 1a prueba es positiva para compuestos quetienen enlaces etilénicos, acetilénicos, con decotoracién de 1a solucion de permanganato. (1). €) Prueba de bromo, Se disuelven 0.2 mg de muestra en 1 ml de tetracloruro de carbono, y se agrega gota a gota una solucién de bromo en tetracloruro al 26 durante un minuto. La prueba es positiva si se decolora 1a solucién de bromo afi dida, para dobles Ligaduras. (2). f) Prueba de henOlisis. Sangre estandarizada, se suspenden de 10 a 20 ml de sangre humana entera en 100 ml de cloruro de sodio 0.85%. La suspension es centrifugada el 1fquido sobrenadante se descarta. £1 procedimiento se repite dos veces. Los corpésculos de sangre se vuelven a suspender en 400 mi de solucién de cloruro de sodio al 0.85% mezcldndose 10 m1 de esta suspensién con 1 m1 de solucin de di- gitonina (10 mg de digitonina pura aforados @ 100 mi con una solucién acuosa de etanol al 80%). Se deja reposar la mezcla por 5 min, y se compara visualnente con un tubo que contiene suspensi6n de sangre sin digitonina; si he ocurrido 1a hen6- Lisis completa e1 tubo que contiene digitonina ester completamente claro. Si no ocurre hem6lisis completa le sus- pension stock de sangre se diluye progresivamente con Cloruro de sodio 0,85 hasta que 10 mi de 1a suspension de sangre sean completamente henolizados ha temperatura ambiente en 5 min,DetecciGn de saponina, Agregar 1 ml del extracto a 10 ml de suspensi6n sangufnea estandarizada y después de 5 min. observar si hay hen6lisis lo cual nos indicaré 1a presencia de saponinas. (12). g) Prueba de espuma, Colocar 1 m1 de muestra en un tubo de ensaye, se agrega agua caliente y se agita vigoro samonte si hay formacién de espuma abundante y estable es prueba positiva para saponinas. (2). h) Prueba de Shinoda. Esta prucba indica un nGcleo de benzopirona. Se trata 1 mg de la mucstra con 0.5 mi de Acido clorhférico a1 10% agregindose luego una limadura de magnesio, produciéndose una reaccién exotérmica desarrolléndo se un color que va del rojo palido al oscuro. (2). 4) Prueba de gelatina-sal para taninos. Se renojan 25 g de gelatina durante una hora en una soluci6n saturada de clorure de sodio; se calienta hasta disolucion completa y se afora a 1 1t, Una poreion de este reactivo se agrega a unos mgs. de 1a muestra; 1a formacién de un precipitado indica la presencia de taninos. (2) 4) Prueba de cloruro €érrico. Unas gotas de cloruro ferric al 20% se ponen en contacto con unos mgs. de Ia mues - tre; un precipitado azul verdoso aparece si hay taninos. (2). k) Prueba de Mayer para alcaloides. Se prepara el reactive disolviendo 1.36 g de cloruro de mercurio en 60 ml10 de agua y 5g de yoduro de potasio en 10 mi de agua. Se nezclan las 2 soluciones afordndose @ 100 ml. Se afaden unas gotas de reactive a una solucién de 1a muestra previanen te acidulada con écido clorhfdrico 6 acido sulfGrico dilusdo obteniéndose un precipitade cuando 1a reaceién es positiva Este se disuelve en un exceso del reactive, alcohol etfiico © Acido acético. (2). 1) Prueba de Bragendorf£. Se prepara el reactive Gisolviendo 8 g de nitrato de dismuto en 20 ml de Acido aftr, co y 27.2 ¢ de yoduro de potasio en so mi de agua. Se afiade e1 reactive sobre una solucién acidulada de muestra y se ob - serve 1a formacién de un precipitado anaranjado sarr6n cono prueba positiva, para alealoides (2). nn) Prucba de fornatdehtde. Acido ssulfarico, Preparar una solucién de aproxinadanente 50 mg del comuesto a prober en 1 ml de un solvente no arondtico (hexano, ciclohexa no 0 tetractoruro de carbono). Micionar 1 0 2 gotas de este soluci¢n a 1 m1 del reactivo, el cual se prepara al momento de usarse, adicionande una gota de formalina (formaldehfo a1 37-408) 2 1 mi de Acido sulfGrico concentrado y agitando lige ranente la solucién, observe el color en 1a caps superficial dei reactive después de adicionar 1a solucién problem , y el color del reactive después de que el tubo se ha agitado. Una coloracion rosa, roja, naranja, azul, verde, pGrpura, las cuales con el tiempo pueden cambiar a café o negro, son indi- cativos de prueba positive para aromfticos. (1).u fa) Prueba de legal. Tomar 1 0 2 mgs. de mestray di- solver en 26.3 gotas de piridine, afladiéndose une gota de una solucién reciente de nitroprusiato de sodio a1 0.54 y después se adicionan poco a poco 4 gotas de hidréxido de potasio 2 las lactonas dan una coloracién rosa y 1as metil cetonas tan- bign dan coloracién. (2). ©) Determinacién de carbone, Torar unos pocos de mi- Ligranes de Ia muestra = analizar en un tube de ensaye y Adicionar txiGxido de molibdeno finanente pulverizado hasta subir el nivel de 6-8 mn en el tubo, calentando primero 1a parte superior de 1a mezcla antes de calentar e1 fondo del tubo. continuar calentands 1a mezcla por 10 2 minutos. Le presencis de una zona azul entre 1a muestra y el éxido anari- 110, indica ia presencia de carbén en Ia muestra, (1) p) Fusién con sodie. Colocar una gota pequeta 0 unos pocos miligramos, si es un s6lido, de 1a muestra que se va 2 onalizar, en un tubo limpic y seco. Tonar una pieza de sodio (un cubo de 1/8 de putg.) del frasco reactivo y presi6- nelo entre dos hojas de papel filtro para quitar el Liquide adherido y colécario en el tubo de ensaye. Calentar el fondo del tubo Ligeramente y deje roposar 1a mezcla de 2 = 3 minutos. Colocar el tubo en posiciGn vertical con una pinta y aplicar graduatmente calor al fondo del tubo, hasta que el sodio sea fundide. Teniendo euidado de no tocar las paredes del tubo caliente, ahada unos cuantos miligranos de 1a substancia que se esté analizando en el sodio fundido. Calentar el fondo12 del tubo hasta que el yidrio esté al rojo vivo, y continuar calenténdolo por dos minutos, dejar enfriar el tubo a tempere- tura ambiente y ‘adicionar S$ gotas de metanol, Si el residuo es una masa gléular romper.con un agitador de vidrio limpio para permitir el contacto entre el alcohol y algan exceso de sodio metalico, $i se producen burbujas de gas esperar a que Ja reaccién sea completa. Adicionar 2 mi de agua destilada Hervir la mezcla por unos segundos y filtrarla. En lugar de filtrar 1a mezcla puede ser centrifugada y el sobrenadante decantando 0 removido con una pipeta, Diluir el filtrado a 4 m1 con agua destilada, Si en este punto 1a solucién es oscura, tanto que pueda oscurecer las futuras pruebas, es pro bable que 1a cantidad de muestra usada fuera mucha, 0 que la mezcla de fusion no fue calentada a temperaturas suficiente - mente altas. 1 procedimiento de fusién debera ser repetido. a. q) Determinacién de azufre. Colocar 0.2 ml del fi1- trado de 1a fusién con sodio en un tubo de ensaye, y adicionar una gota de nitroprusiato de sodio al 0.1%, Un coler rojo in tenso indica la presencia de iones sulfuro. r) Determinacién de halégenos. Colocar 0.5 mi del filtrado de la fusi6n con sodio en un tubo. Adicificar 1a soluci6n agregando gota a gota dcido nitrico dilufdo. Si no fueron encontrados nitrogeno ni azufre, proceder directamente adicionando una gota de solucién de nitrato de plata al St. ‘un precipitado o suspensién de color blanco a amarillo indica 1a13 presencia de jones cloruros, bromuros 0 yoduras. 5) Reactivo de Benedict, A una solucin o suspen - sidn de 0.2g del compuesto en 5 mi de agua se le afladen 5 m1 de 1a solucion de Benedict. Observar si se produce un preci- pitedo amarillo © amarillo verdoso; entonces caliente 1a nezcla hasta ebullicién y observar si se formé un precipitedo y si lo hubiera, observar su color. £1 reactivo se prepara disolviendo las siguientes sales en agua destila 173 g de citrato de sodio y 100 g de carbonato de sodio anhidro se disuelven con calentamiento en 800 ml de agua destilada, Se adiciona mas agua hasta ajustar el voldnen de 1a solucion a 850 ml, Se disuelven por separado 17.3 ¢ de sulfato de cobre hidratado en 100 mi de agua y 1a solucion re sultante se vierte lentamente, agitando, en la solucion de citrato y carbonato, La solucign final se afora a 1 it ana - diendole agua. La prueba es positiva para azJfeares reductores. (11). t) Reactivo de Barfoed. Disolver 16.6 g de acetato cGprico en 245 mi de agua, adicionar 2.4 m1 de Acido acético glacial. Tonar 2 ml del reactive de Barfoed y colocarlos en un tubo de ensaye y adicionar de 10 a 20 ng de le muestra, 0 un m1 de una solucién dilutda en agua. Calentar el tubo en un bafio de agua hirviendo por 3 minutos. La formacién de un precipitado amarillo-naranja, o rojo naranja es prucba positi va para monosacéridos. (11).4 u) Reactivo de Selivanof£, Disolver 0.30 g de re - Sorcinol en 100 mi de Acido clorhidrico 12.5%. En un tubo de ensaye colocar 1 ml de 1a muestra en agua, 1 m1 de reactive y calentar a ebullicién en bafio de agua. La aparicién en 2 minutos de un color rejo indica la presencia de cetosas. (1) ¥) Prueba de Tollens. fn un tubo de ensaye disol - ver de 5 a 10 mg de glicésidos en S a § gotas de piridina y afiadir de 4 a 6 gotas de reactivo de Tollens muy reciente (se mezelan 0.§ ml de nitrato de plata al 10% y 0.5 mi de hidroxi, do de sodio al 108); después se afiade gota a gota de hidréxido de anonio hasta redisolucién del precipitado. Si hay reductores precipita o forma un espejo sobre el tubo. an. w) Reaccién con antrona. Disolver 0.3 g de antrona fen 10 ml de 4cido acético glacial y adicionar a la solucién 20 ml de etanol al 96%, 3 ml de acido fosf6rico concentrado y J ml de agua, se aplica sobre cromatograffa en papel. Después de rociar, calentar el cromatograna de 5 a 6 minutos @ une temperatura de 110°C. Cetosas y oligosacdridos que contengan cetosas se revelan como manchas amarillas, (13). x) Reacci6n con anilina Acido ftalico. Nesclar 0.93 ¢ de anilina y 1.66 g de acido ftélico en 100 ml de n-butanol saturade con agua, Rociar el cromatogram y calentar a 105-130°C por $ minutos, De - tecta aldosas, (13),4s y) Reaceién con nitrato de plata smoniacal. £1 reactivo se prepara con las siguientes soluciones. Solucién a), Solucién saturada de nitrato de plata en agua, hacer una soluci6n 1:20 en acetona de 1a solucién an terior. Solucién b). 0.5 g de hiér6xido de sodio en 100 mi de etanol al 80%. Solucién ¢), Hidr6xido de anonio 2N. Rociar el cromatograma con 1a solucién a, dejar eva, porar 1a acetona y rociar con 1a solucién b, después de 10 minutos si queda muy oscuro rociar con la solucién c. Revela azicares y glic6alcoholes, (13). 2) Determinacién de nitrégeno. En presencia de so- dio y carbén, el nitrégeno es convertide a ién cianuro y es asf como este ign es detectado. Tomar 0.8 mi del filtrado de 1a fusién con sodio en un tubo de ensaye y adicionar una gota do hidr6xido de sodio al 10%, una gota de Fluoruro de potasio a1 30%, y 15-20 mg de sulfato ferrase cristalino, calentar 1a mezcla suavenente por un minuto. Adicionar una gota de solucién de cloruro férrico al 1% y calentar 1a mezela, Adicionar acido sulfdrico 6N go- ta a gota hasta que el éxido de fierro ha sido disuelto. Reposar 1 tubo por 2-3 minutos un color azul o un precipitado azul es prueba positiva para nitrégeno. Le solucign debe ser filtrada, si aparece un color azul en el papel filtro, indica la presencia de nitrégeno. (1).16 Método de acetilacién. Anadir dos gramos del com - puesto polihidrexiledo a 20 al de piridina anhidra. Afiadir 8 granos de anhidrido acético, con agitacién y después que ha cesado 1a reaccin inicial, 1a solucién se hierve a refiujo durante $a 5 minutos. Enfriar le mezcla y vertir en 50a 75 ml de agua helada, £1 derivado acetilado se filtra, se 1a va con feido clorhfdrico al 2%, frfo y despues se lava con agua, Se purifica por cristalizact6n con alcohol. (1). Aparatos Utilizedos Punto de ‘usin. Se utiliz6 un aparato Melting- Point Electrothermal para determinar 1os puntos de fusién os cuales se indican en °C. Espectrofot6metro Infrarrojo. Los espectros de absorcién a infrarrojo, se obtuvieron en un espectrofotdnetro IR Perkin-Elmer 267 utilizando 1a técnica de pastilla de KBr para muestras sélidas y por formacién de una pelfcula sobre celdas de cloruro de sodio, en el caso de Ifquidos aceitosos. Espectrofotémetro UV-visible. Los espectros UV-v: sible se obtuvieron utilizando un espectrofot6metro UV-visible Beckman-25.AARE AARC ‘ARM IR pf. cep ccpP co LB EP Claves Utitizadas Ratz de Ambrosia ambrosioides Extracto etéreo de rafz de A. ambrosioides Extracto cloroférmico de rafz de A. ambrosioides Extracto metan6lico de rafz de A. anbrosioides Espectro ultravioleta Espectro infrarrojo Punto de fusion Cromatograffa en capa delgada Cronatografta en capa delgada preparativa Cromatograffa en colunna Liebermann-Burchard Benceno Cloroforno Acetona Metanol Eter de petréleo 7