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    ‘ Trabajo originales Resistencia de Helicobacter pylori a metronidazol, claritromicina y amoxicilina en pacientes colombianos Helicobacter pylori resistance to metronidazole, clarithromycin and amoxi in Colombian patients ‘Nba Alicia Trespalacios, MSc, Cand PhD," William Otero Regina, MD,® Marcela Mercado Reyes, Bact MSc. "pe hath atc: Resumen cimscepaenen PEE lcobatr pari (H py) sun paligeno universal que nica 2 mas dela mitt de pola muni Soa a fn as iimas dos dads, ratamienta recomenado para ev eralcan, cana estucna de mera " Ace ar aang, sal rp esta, conte orn br abana depos, anoxtnay dai ecemetcte Geeeeeomla plena amettoiaza, Enos dlincs asl efcacia de esta rai ha dolnad, dei espesaront 3 ga, cot, la resistencia de a bacteria a metronidazaly a claritomicina, " Plc osaibowtamyieiewaaees, __Qbjetlves: En ese estudio, se eva la prevalencia de resistencia pinata de cepas colombianas de pyon'a merondazo,lartomicin, amoxiina, Adem, se anazaron os yenotpos de vac y cagA de las ‘epasaislads ya corelacén entre ls marcadores de vnlenca a resistencia a claritomicna,amoxiina Y matranidezo, Métodos: La resistencia @ metronidazol, emoxictna y clariromicina fue detenmiada po el hneaee G0 Imétodo de Eos. Se eatrajo ol ADN gent y varanes aldicas de vac y cagA fueron identical por {a tics de raaccn en cadena do a polmrase (PCR). Resufados: La resistencia @mstennol faz de 810% (I 95% 70,3%-8,0%), a amoxiana de 3 8% (IC 95% 8.6) ya cairomicina de 17.72% (IC {95% 10,37-2828). No Se enconté asclacon signiicatva ere el enotipo de palogeniciad ya ressicia © suscepiiidad alos enfniiobianos cuando is valores de CIM de cada anibehco Se compararon con tos diferentes genotipas cagA y vac. Coneusién: Erconramcs una ala taa do resin a fs kes prinpas antibition uid en la mayora de os esquemas etosos de eadicadon de a inca 1 ual mola la necesidad de invesiar, con proridad, nueves esquemas de Wataionl para la eraciacion delainleccén en Coiombia, Palabras clave Helicobacter pyle, genotipos, dativonicin, amesicina, meronidazel, Summary Hojcabzcter py (H. po, a universal pathogen thet infects more than Ff he wosd population, In the ast two decades, the recommenced vealment for its eradication, as frstine scheme isthe standard Ape therapy, consng ofan inh of the proton pup, catvonycin and amoxilin or metridezole In recent yeas te efectveness ofthis therapy hs decn, especialy ce to te resslance of acter to metronidazole and itromycin Objectives this study we evahated the prevalence rary resistance of Goleman ponies ‘o metoniazole, laritwomycn, amoxii. I ation, the vaeA and cagA gencypes of tin lalate we ‘delemined and assocated to cael the viene maser and aruba esSlance. Methods: Minimum inhibstory concentration (MIC) for metronidazole, clritromyein and amoxil were determined ty © tot metho, Genomic DNA was etiaced and alec vaians of vac and cagh were Kentfed by be poynerase than eacon (PCR), Results: Ressiance io metindzzoe was 81.01% (COSY T03%-88.6%, a amo. sin 38% (IC 95% 08.6%), and to caritromyein 17.72% (95% 10:37-28.25), No stnfcantcoreaion betvcen pathogenicity and resistance or suscepliby was detected wen MIC values fr each antbitic ‘ere compared with dflerentvack and cagA genoypes. Conclusion: We fd a high rate of resiance to three principal aniboies used in he maj ofthe sucess schemes of eradication of the necon ich implies the neo to investigate wt proiy nw schomes of eatmen forthe erection of the infection Colonia Key words Helicobacter pylon, genotypes, ctarthromycin, amoxiciin, metrondazole, ‘© 2010 Asonaciones Colombiaas de Gastoonnloia, Endssona dete, Cloroctloi y Hesotoga 21 INTRODUCCION Helicobacter pylori (H. pylori) es un patogeno universal, que infecta a mis de la mitad de la poblacién mundial (1, 2) y es el principal agente etiolégico de gastritis crénica, tilee- ras pépticas, linfoma MALT gistrico y adenocarcinoma gistrico (1-3), aunque las consecuencias finales de la infee- cién dependen de factores genéticos del huésped, factores mediombientales externos ylainfeccién por genotipos mas virulentos de H. pylori como caga (+) y vac simi (4, 5). En las sltimas dos décadas, el tratamiento recomendado ppara su erradicacién como esquema de primera linea es la tsiple terapia estindar constitwida por un inhibidor de la bomba de protones, amoxicilina y claritromicina o metro- nidazol (6-8). Sin embargo, la eficacia de este esquema tra dicional, que inicialmente era del 90% (9-11), de manera progresiva ha disminuido en muchas partes del mundo y llega en la actualidad a cifras de $7-73% cuando la duracion es de siete dias, y de 67-79% cuando la duracidn es de diez dias (10), 10 que significa que la eicacia aumenta aproxima- damente 6% cuando el tratamiento dura diez dias en com paracién con siete dias, pero aun asi, es menor del 80% y ‘no alcanza resultados éptimas. La declinacién en la eficacia consistentemente encontrada en la actualidad, se considera que se debe fandamentalmente al progtesivo aumento de [a resistencia primaria de H. pylori a la claitromicina y al sncteonidazol (8-12). Porlo anterior, es importante evaluar Ja prevalencia de resistencia primaria de H, pylori a estos tres antimicrobianos elave, que son la estructura de la tera pia triple estindar ya que todavia se recomienda como la terapia de eleccidn de primera linea (8, 9), pero con la pre- caucién de utilizar antibiéticos diferentes cuando la resis- tenca local alos mismos esté por encima de ciertos valores que comprometerian su efieacia como son, 15-20% para clacitromicina y 40% para metronidazol (9). Uno o més de estos antibidticos también se uiilizan en la mayoria de los esqiemas que son exitosos en la erradicacién de H. pylori (9, 10). Por lo tanto, es necesario determinar los niveles de resistencia a los mismos ya que con base en esa informa- cidn, se podria planear la eleccion de los antimictobianos en la prictica clinica (11). En nuestro medio, hace més de tuna década, un grupo enconted una tasa de resistencia a metronidazol del 82%, utilizando la prueba de E-test (13), la cual puede sobrestimar la tasa de resistencia de H. pylori sise le compara con la técnica de dilucién en agar, que es considerada el estindar de oro para determinar la resisten- ‘ia ametronidazol (14), y ademésse desconoce la prevalen- cia de resistencia primariaa claritromicina y @ amoxicilina, asi como si existe relacién entre los diversos genotipos de H. pylori la resistencia a los antimicrobianos, aspecto que hasta donde investigamos, no ha sido estudiado en nuestro 2 Revol Gasrooneral/25 (1) 2010 pals. De acuerdo alo anterior, se decidi6 realizar el presente trabajo, con ls siguientes objetivos: 1. Determinar Ia prevalencia de resistencia primaria de H. pylori a los tres antibi6ticos considerados los mas importantes en las terapias de erradicacidn: claritromi- ina, metronidazol y amoxicilina. 2. Establecer si el genotipo de H. pylori cagA y vac po tivos ylos diferentes subtipos de este iltimo, se asocian’ con la resistencia alos diferentes antimicrobianos. MATERIALES Y METODOS Estudio prospectivo de prevalencia analitica, realizado en la unidad de gastroenterologia de la Clinica Fundadores, de Bogoté-Colombia, y el departamento de Microbiologia de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana, de Bogoti-Colombia, durante el periodo com= prendido entre enero de 2008 y junio de 2009. Se inclu- ‘yeron prospectivamente pacientes mayores de 18 afios que fueron remitidos a endescopia digestiva alta en Ia Clinica Fundadores, por dispepsia o sintomas de reflujo gastroeso- figico que no habian recibido tratamientos previos de erra dicacion de H. pylori como tampoco antibiéticos 0 sales de bismuto durante el tltime aio, © antisecretores, por lo menos tun mes antes de Is endoscopia realizada para ingre- ‘sar al presente estudio, Todos los pacientes firmaron el con- sentimiento informaclo antes de ingresaral estudio, después cde una explicacién completa y detallada sobre este. Tanto el protocolo de investigacién como el consentimiento infor- ‘mado fueron aprobados por ell comité de ética e investiga- ‘in de la instituciOn en la cual se realiz6 el estudio. Criterios de exclusion Enfermedades concomitantes seria: insuficiencia cardiaca congestiva (ICC), accidente cerebrovascular (ACV), diabe- tes descompensadda,alteraciones de la coagulacién, cirrosis, cirugia géstrica previa, embarazadas 0 que estén lactando, adiccion a drogas 0 alcohol, 0 enfermedades siquistricas, infeccién por VIH, anticoagulados y los que tuvieran cén- cer o recibieran quimioterapia, ‘A todos los pacientes, a endoscopia digestiva se les rea- liz6 por la manana, después de un ayuno minimo de seis horas, en dectibito lateral inquierdo, en la forma usual (15) y siguiendo las recomendaciones generates para la limpieza de los endoscopios (15), No se utilizé sedacién y a todos se les aplicé lidocaina en atomizadot (Roxicaina, solucién t6pica, Ropsohn Therapeutics) utilizando dos aplicaciones (20 mg), para anestesiar la faringe. El equipo utilizado para In EVDA fue un Olympus Exera CV 145. Durante la endos- copia digestiva alta, se tomaron seis biopsias del antro a dos “Trabajs orginales eentimettos del piloro (tres de la curvatura mayor y tres de la curvatura menor) y sels biopsias del cuerpo a ocho centimetros del cardias (tres de la curvatura menor y tres de Ia curvetura mayor), siguiendo el protocolo de toma de biopsias recomendado por expertos (16, 17). De estos grupos de biopsias, dos del antro y dos del cuerpo fueron utilizadas para estudio de histologfa y determinacion de H. pylori mediante hematoxilina y eosina (HIE) y coloracién de Giemsa (cuando lz HE fue negativa) y dos del antro y dos del cuerpo para cultivo de H. pylori, Dos biopsias del antro y dos biopsias del cuerpo fueron guardadas con la intencién de ser utilizadas para nuevo cultivo, en caso de que suce- dere alguna dficultad con las primeras (contaminacién del medio de cultivo, mala calidad de sus ingredientes en alggn lote, et.), Se tomé una biopsia adicional del antro para la prueba de ureasa ripida y més biopsias si existieran lesiones endoscépicas que lo justificaran (tleeras gistricas, masas, elevaciones, tumores, etc.). La prueba de ureasa ripida utilizada fue preparada por nosotros (“homemade”), de acuerdo a las recomendaciones para la misma (18). En un formulario especificamente diseiado, se consignaron de ‘manera prospectiva y estandarizada las variables demoges- ficas y las demas variables incluidas en el estudio. Cultivo de H. pylori y pruebas de susceptibilidad de antibidticos in vitro Procedimiento de transporte: Cada biopsia) tomadie durante la endoscopia digestiva alta se deposité en tn cxio- vial con $00 ul de caldo Brucella y estos se mantuvieron en cadena de frio hasta su procesamiento. Procedimiento de aislamiento de Helicobacter pylori: Entotalasepsia yesterilidad, lasbiopsias se maceraroncon un aplicador de madera estéril,previamente tratado en wna solu cién de carbon activado al 1%, hasta obtener una solucion homogénea (19). Lauego se procediéa sembrarconasa curva dlesechable a solucién anterior en el medio Wilkins Chalgren modificado para H. pylori suplementado con Isovitalex y antibigticos, Una vez realizada la siembra, ls cajas de Petri se introdujeron en campanas de anaerobiosis yse generé una atmésfera de microaerofilia con sobres CampyPak (BBL- Beckton-Dikinson) y los cultivos se incubaron a 37 grados centigrados durante 4-15 dias (19, 20) Pruebas de identificacion para Helicobacter pylori: Para verificar la presencia de Helicobacter pylori en los cult vos, se realizaron ls siguientes pruebas (20); coloracién de gram: bacilos gram negativos curvos pequefios; prueba de catalasa: catalasa positiva; oxidasa: oxidasa pesitiva; ureasa: sureasa positiva Después de confirmadas por pruebas bioguimicas, se procedié ala evaluacion de susceptibilidad a meteonidazol, amoxicilina y clatitromicina. Adicionalmente, a 60 de los 79 aislamientos se les realiz6extraccion cel DNA y amplif- cacién de los genes de virulencia vacA y cagA por la técnica de PCR (19). Genotipificacién del gen cagA por PCR (19, 21, 22) Para la genotipificacién del gen cagA se obtuvieron pro. ductos de ampliicacién del DNA por PCR en an volu- men final de 25 ql, para lo cual se dispensaron: 0,t ull de ‘Taq polimerasa (TucariTaq-Corpogen), 2,5 ul de bulfer Tag (TucanTag-Corpogen), 1,5 yl de MgCl, (TucatiTag, Corpogen), 0,5 yl de dNTPs mix (Invitrogen), 1 yl de cada primer de caga Forward y Reverse (IDT-Coralvlle-USA), Sul de solacién de DNA a una concentracién de 100 ng y se completé con agua grado molecular para completar al volumen final de 25 pl. Las secuencias de los primers de cagA fueron: cagA F(+) 5 TTGACCAACAACCACAAACCGAAG - 3 cagA R(-) 5 CIPCCCTTAATPGCGAGATTCC - 3! Posiciones de acuerdo al ORF cagA en Genbank secuencia Luz. La amplificacién de cagA se realizé en un termocicls dor (MyCycler termal cycler-BIORAD), de la siguient 1. Denarmracién inicial 9mmina 94°C. 2. Caarenta cielosde denaturacién 95°C por 30 segundos, hibridacién SO°C por 45 segundos y extension 72°C por 45 segundos. 3. Extension final: 72°C por $ minutos. Después, os amplificados se corrieron en geles de agarosa al 2%, yse revelaron en soluci6n de bromuro de etc. Genotipificacién del gen vac por PCR (19, 21, 22) Para la genotipificacion del gen vac se obtuvieron pro- ductos de amplifcacién del DNA por PCR (19, 21) en un volumen final de 25 pl, para lo cual se dispensaron: 0,1 ul de Tag polimerasa (TucasiTaq-Corpogen), 2,5 yl de buifer Taq (Tacaritag-Corpogen), 1,5 yl de MgCl, (TucanTaq- Corpogen), 0,5 jl de ANTPs mix (Invitrogen), 1 ul de casda primer vac s1/32, vac sla, vacA sib, vac ml y vac m2 (tabla 1). (Ey R) (IDT-Coralvlle USA), § yl de solacién de DNA una concentracién de 100 ngy se completé con agua grado molecular para completaral yolumen final de 25 ul La amplificacién de vacA se realizé en un termocicla- dor (MyCycler termal cycler-BIORAD), de siguiente Fessinci de Henbater pyr a mtonidaal,clavomicn yanmilin en pacientes coambianas 33 1. Theinta y cinco ciclos de denaturacién 94°C por 1 minuto, hibridacién 52°C por 1 minuto y extension’ YC por | minuto. Extensién final: 72°C por $ minutos. Los diferentes genotipos de H. pylori se ageuparon en dos grupos, “grupo mas virulento” y “grupo menos virulento” (19). El primero estaba integrado por aquellos que eran cagA(+) y vacA(+) con subtipos stami+ y el segundo grupo cagA(-) vacA(+) pero con subtipos s2m2 (+). La secutencia de los primers utilizados se indica en la tabla Tabla 1. Secuencia de los primeros utilizados. Secuencia (5'3') VASF GGTCAARATGCGGTCATGG — 200bp (2741 CCATTEGTACCTGTAGARAC 3030) GGAGCCCCAGGAAACATTG 352bp (976- CATAACTAGCGCCTTGCAC 1327) ATGGAAATACRACAAACACAC 25909 (797- CTGCTTGAATECGCCAAAC 1056) ATEGAARTACAACAMACACAC — 280%p (284- CTGCTTGAATECGCCAAAC 569) GTCAGCATCACACCGCAAC 1900p (865- CTGCTTGAATGCGCCAAAC 1058), AGCGCCATACCGCARGAG == 187bp CTGCTTGAATGCGCCAAAG bop: pares de bases DETERMINACION LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI) Técnica de E-test (23-25) A partir de cultivos de 2.23 dias de incubacién, se preparé tuna suspensidn en caldo Brucella que se ajust6 a la escala 2-de MacFarland (1 x 10" UFC/ml), la suspensin se ino- cculé con un escobillén estérl sobre placas de agar Muelles- Hinton suplementado con 10% de suero de caballo, 2% de isovitalex. Se utiliz6 una caja con medio de cultivo por cada antibidtico (metronidazol, claritromicina, amoxicilina) a ensayar Las tiras de E-Test® (Biomeriux) se colocaron sobre las placas de medio de cultivo inoculadas con la bacteria y se incubaron a 37°C en condiciones de microaerofilia por 48-72 horas. Los aislamientos fueron considerados resis- tentes si la concentracién minima inhibitoria (CML) se encontraba en niveles iguales o superiores a 8 ug/ml para metronidazol; 0,5 ug/ml para claritromicinay | wg/ml para amoxicilina (23). Pata controlar medios de eultivo y tiras, 24 Rov Gol Gastontercl/25 (1) 2010 de E-Test, se utilizé la cepa control, H. pylori NCTC 11637 (24,25), ANALISIS ESTADISTICO Con los datos obtenidos se elabor6 una base datos en el programa EPIINFO version 6.0. Los resultados obtenidos, fueron procesados y analizados estadisticamente utilizando, elprograma STATA versién 6.0.Se determiné el porcentaje de resistencia a claritromicina, amoxicilina y metronidazol, asi como el porcentaje de presencia del gen cagA y los dife- rentes alelos para el gen vac, en los aislamientos analiza dos. Se buseé asociacién entre la presencia de los genes de virulencia y la resistencia a los antibidticos, la cual fue evaluada mediante una prueba de ji cuadrado (X), con un valor alfa (a) de 0,05. RESULTADOS Se lograron 79 aislamientos de H. pylori de 99 muestras caviadas de igual mimero de pacientes, en quienes se docu- menté el diagnéstico de H. pylori con base on el test de ureasa rapida postive e identificacién de H. pylori en la his- tologfa, representando una tasa de recuperacion del 80%. E67% de los pacientes en quienes se tecuperd cl micto- ‘organism eran mujeres. La edad promedio de la muestra, total era 54 ans +/-15 anos. EI diagnéstico endoscépico fue esofagitis erosiva en 16 pacientes (2596), gastritis cr0- nica corporoantral en 79 (100%), y dlcera duodenal en 4 (556) : Las prevalencias de las resistencias, utilizando E-test, fueron las siguientes: metronidazol 81,01% (IC 95% 70,31-88,64), claritromicina 17,72% (IC 95% 10,37. 28,20%), y amoxicilina 3,8% (IC 95% 0-8,69), (tabla 2). No hubo diferencias estadisticamente significativas en las tasas de resistencia para los tres antibisticos entre hom- bres y mujeres. Tabla 2. Prevalencis de resistencias alos diferentes antibiticos. ‘Amoxiciing —__ Metronidazol i TEST 6479 17,70 33% ator 1C95% 1037-2829% IC 95%O-86% 16 95% 7031-8864 E125% de los genotipos identificados fueron del grupo “mis virulentos’, como se ve en la tabla 4, en la cual se ‘muestran, ademas, las frecuencias relativas de los demas, genotipos de H, pylori en los 60 pacientes examinados. No se encontraron diferencias estadisticamente significativas “Teabajos ongrates Entre el genotipo cagA vac slam] y los demis genotipos con la resistencia a los antibidticos claritromicina, amoxi- cilina y metronidazol: p=0,36, p=0,36 y p=1, tespectiva mente tablas 3 y4 DISCUSION Actualmente, para los gastroenterSlogos y médicos de cui dado primario, la erradicacién de H. pylories un gran desafio ya que cada dia estd aumentando a resistencia primaria de «ste microorganismo los antibisticos mas frecuentemente utlizados on ou tratamiento (8-12, 26, 27), la cual se debe en parte ala exposicién de la poblacisn a esos antbisticos como monoterapia para diversas enfermedades infecciosas (11, 12). En el reciente tercer consenso de Maastricht (9) se recomendé continuar utilizando la triple terapia estin- dar durante siete dias en las poblaciones con resistencia ala laritromicina menor al 15-20% y, cuando es mayor al 20%, prolongasla a 14 dias o utilizar una terapia cuddruple con, bizmato durante 10 a 14 das. Asf mismo, recomendé utili- zar el metronidazol en la triple terapia cuando la resistencia es menor del 40%. En la presente investigacidn se encontré aque la resistencia primaria a metronidazol fue del 81,01%% ya claritromicina del 17,72%6 las cuales estén dentro de los limites sugeridos para no ser utilizado en la tiple terapia como esquema de primera linea (9) El resultado de resistencia a metronidazol encontrada por nosotros concuerda con los resultados de investiga-

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