UNIVERZITET U TUZLI

TEHNOLOŠKI FAKULTET

ODSJEK: AGRONOMIJA - ANIMALNA PROIZVODNJA

SEMINARSKI RAD
FIZIKALNO HEMIJSKE METODE ANALIZE TLA

METODA BRZE EKSTRAKCIJE POLICKLIČKIH AROMATSKIH SPOJEVA IZ

TLA UPOTREBOM BAZIČNE SILIKATNE SELEKTIVNE EKSTRAKCIJE POD
PRITISKOM

Profesorica: Student:
Dr. sci.Amra Bratovčić, vanr. prof. Belmin Mehanović

Tuzla, april, 2020. godine

UVOD............................................................................................................................1

MATERIJALI I METODE............................................................................................2
HEMIKALIJE I MATERIJALI..............................................................................2
UZORCI ZEMLJIŠTA............................................................................................2

SELEKTIVNA EKSTRAKCIJE POD PRITISKOM (SPLE).......................................3

HEMIJSKA ANALIZA.................................................................................................5

OSIGURANJE I KONTROLA KVALITETA..............................................................5

REZULTATI I DISKUSIJA..........................................................................................6
IZBOR RASTVARAČA.........................................................................................6
STATIČKI CIKLUSI..............................................................................................6
ISPRANA ZAPREMINA.......................................................................................7

TEMPERATURA EKSTRAKCIJE...............................................................................7

PROVJERA METODE..................................................................................................8

PRIMJENA SPLE METODA NA UZORCIMA ZEMLJIŠTA..................................12

ZAKLJUČAK..............................................................................................................14

LITERATURA.............................................................................................................15
SAŽETAK

Složena hemijska jedinjenja koja se nalaze u zemljištu na kontaminiranim mjestima

uglavnom uključuju policiklčka aromatska jedinjanja (engl. Polycylic aromatic
compounds, PAC-ovi), koji predstavljaju potencijalni rizik za kontamincaiju okoliša i
narušavanje ljudskog zdravlja. Ekstrakcije tečnosti pod pritiskom (engl. Pressurized
liquid extraction, PLE), praćenja čišćenjem sa silicij dioksidom jedna je od najčešće
korištenih metoda ekstrakcije PAC-ova u zemljištu. Dok prečišćavanje silikom
omogućavana zadovoljavajuće izdvajanje oksidiranih policikličkih aromatskih
ugljikovodika (OPAH-ovi), ova tehinka omogućava ograničeno izdvajanje azarena. U
ovom radu je korištena PLE metoda unutar ćelije u kojoj se čisti osnovnim silicijevim
dioksidom kako bi se povećalo izdvajanje OPAH-ova i azarena. Zbog toga je se
koristila i proučena je metoda selektivne metode ekstrakcije s tečnim pritiskom (engl.
Selective pressurized liquid extraction, SPLE) koja je koristila 4g bazičnog silicijuma,
dihlormetana, 100% ispiranje, 100 i 120°C kao temperaturu ekstrakcije, sa dva
statička ciklusa za svaku temperaturu, bezi ispiranja između dvije ekstrakcije, te 20 i
120 sekundi za pročišćavanje za prvu i drugu temperaturu ekstrakcije. Metoda je
potvrđena za širok spektar PAC grupa, uključujući i OPAH-ove azarene i alkilirane
PAH-ove, te sumporne heterocikle (SPAC-ove) ukupno 87 PAC-ova, koristeći
certificirani materijal kao referentni za poređenje sa rezultatima iz drugih
međulaboratorijskih analiza. SPLE metoda je također donijela manje varijacije
rezultata kod analize OPAH-ova i azarean što ukazuje na veću preciznost od drugih
metoda. Još važnije, SPLE metoda je bolje pročišćavala spojeve, što je smanjilo jedan
dodatni korak čišćenja u odnosu na druge maetode. Zatim je uspješno korištena za
analize PAC-ova u tri različita uzorka.
UVOD

Policklička aromatska jedinjenja (PACs) su grupa organskih komponenata koje mogu

biti pristune u većoj koncentraciji u okolini. PAC obuhvataju širok spektar jedinjenja,
uključujući i policikličke aromatske ugljikovodike (PAH), alkilirani PAH, oksidirani
PAH ili OPAH (engl. Oxygenated PAH) te heterociklična jedinjenja uključujući i
sumporne heterocikle, te azarene (koji predstavljaju bilo koji organski spoj koji je
izveden iz arena zamjenom ugljikovog ili -CH atoma s atomom azota). Postoji
šesnaest PAH-ova koji se nalaze na popisu agencije za zaštitu okoline od prioritetnih
zagađivača, kako u Sjedinjenim Američkim Državama, tako i u evropskim državama,
posebno u predstavnicama EU. PAH-ovi u suštini predstavljaju polutante koji
izazivaju različita čak i kancerogena oboljenja, kod ljudi.
Ovih šesnaest PAH-ova se redovno ispituju u okolini, te je zbog toga potrebno raditi
ovu analizu. OPAH-ovi i azareni su posebno važni zbog toga što su postojani u
velikim količinama na mjestima zemljišta koje je kontaminirano sa PAC-om i OPAH-
om. Neki PAC-ovi su poznati predstavnici koji štete zdravlju ljudi odnosno zemljišta
zbog njihove toksičnosti i/ili aktivnosti estrogena. Kao primer, alkilirani PAH-ovi
mogu biti predominantni u petrogenim zemljištima, te zbog toga mogu značajno
doprinositi ukupnoj zagađenosti. Zbog toga se javlja povećana potreba za analizom i
detekcijom različitih komponenata, pored i osnovnih, matičnih PAH-ova u PAC
kontaminiranim područijima.

Jedna od najčešće korištenih metoda ekstrakcije za analizu PAC-ova u okolišu je

ekstrakcija tekućine pod pritiskom (PLE). Različite studije i analize su koristile PLE
za ekstrakciju PAH-ova, OPAH-ova i azarena iz različitih uzoraka zemljišta. Iako su
visoke temperature i pritisak prilikom ekstrakcije PLE pouzdani, ovi ekstrakti se
većinom koriste za postupke čišćenja prije ostalih hemijskih analiza uzorka. Ova
metoda je inače veoma zahtjevna te može dovesti do nekih gubitaka prilikom analize.
Ova analiza nije naročito pogodna za OPAH-ove i azarenske analize zbog slabog
oporavka i tačnosti prilikom ispitivanja ovih spojeva. Međutim neka istraživanja su
pokazala da se ovo može smanjiti upotrebom silicijevog dioksida prilikom ekstrakcije
jer pomažu u izdvajanju prethodno pomenutih spojeva.

S obzirom da PLE metoda oduzima dosta vremena za pripremu uzorka, koristi se

selektivni PLE (SPLE) u većini slučajeva. Ova tehnika ekstrakcije kombinuje oboje i
ekstrakciju i čišćenje dodavanjem određenih sredstava koje održavaju matricu uzorka
stabilnom. U prošlosti je se ova metoda koristila i za različite druge analize na
prisustvo PAC-ova uključujući sedimente mora, mulj iz otpadnih voda i zemljišta itd.
Međutim, kako je silika gel kisele reakcije, te usljed njenog korištenja prilikom
analize dolazilo je do kontaminacije određenih PAC-ova, pa se zbog toga ova metoda
manje koristila.

Zbog toga će se u ovom radu istražiti upotreba i dejstvo baznog silika gela prilikom
ekstrakcije i čišćenja različitih spojeva, uključujući OPAH-ove, azarene, SPAC-ove i
alkilirane PAH-ove. Za potpunu optimizaciju metode SPLE razmotreno je nekoliko
različitih, ali uticajnih, faktora uključujući volumen ispiranja, temperaturu ekstrakcije
te broj statičkih ciklusa. Također su korištene i optimalne metode ekstrakcije.

1
MATERIJALI I METODE

HEMIKALIJE I MATERIJALI

Korišteni su bezvodni natrujim sulfat (čistoće 99%) i n-heksan (čistoće veće ili
jednako 98%).
Silika gel 60 i dihlormetan (99,8%), toluen (više ili jednako 99,7%).
PAH (n=38), alkilirani PAH i sumpor heterocikli (n=24), OPAH i azaren (n=25).
Izotopno s oznakom internih standarda i standarda za izdvajanje kupljeni su od raznih
dobavljača. Laboratorijsko posuđe i alat koje se koristilo u studiji je prethodno
očišćeno i ožareno na 450 °C 3 sata prije upotrebe. Treba napomenuti da su sve
hemikalije kupljene u certificiranim firmama.

UZORCI ZEMLJIŠTA

U ovom istraživanju korišteno je nekoliko različitih uzoraka zemljišta:

- Pozadinski uzorak (BS- background soil sample)

- tri uzorka zemljišta iz Švedske (koji su sakupljeni u blizini vode kontamirane

naftom)
- uzorak vodovodne vode(FS- freshwatter supply),

- uzorak sa luke (PS- port soil)) i

- uzorak lučkog zemljišta (HS- harbor soil).

Uzorci su certificirani iz biroa za referencu-524 (JRC-IRMM, Geel, Belgija) (BCR-

524), zemlja odnosno uzorci su certificirani i od europskih referentnih materijala
CC0123a (Federalni zavod za istraživanje i ispitivanje materijala u Berlinu,
Njemačka) i materijala sa certifikatom o zemljištu 170 (SigmaAldrich, Laramie,
Wyoming, USA) (CRM-170).

Uzorak BS je sakupljen sa poljovprivrednog zemljišta, odnosno sa testnog polja

Umea, te je on imao nizak udio PAC-ova s obzirom da se nalazi na ruralnom dijelu
(ukupna koncentracija suhe tvari je 36 ng/g).

Uzorak FS je uzet s lokacije u blizini slatke vode koja je bila kontaminirana uljem.

Uzorak PS je uzet iz luke onečišćene naftom i ugljenim kantranom usljed curenja

podzemne cisterne.

Uzorak HS je uzet iz brodogradilišta gdje bi eventualno zagađenje moglo doći s

brodova, odnosno brodskih boja i ulja.

2
BS uzorak i tri uzorka zemljišta iz švedske su homogenizirani i prosijani (do čestica
veličine manje ili jednako 2mm) te čuvani u zamrzivaču na -18 °C do analize. Sadržaj
vode i organske materije u tri uzorka iz Švedske su prvobitno označeni
.
Sadržaj vode je iznosio 1, 39, 8 i 9% za BS, FS, PS i HS uzorke zemljišta . Sadržaj
organske materije je određen kao gubitak u težini poslije žarenja a iznosio je 2, 46, 10
i 11% za uzorke BS, FS, PS i HS.

BCR-524 potiče sa mjesta očuvanja drveta (ima 2% vode i 13% organske materije) sa
visokim udjelomPAC-ova (ukupna koncentracija je 1900 mg/kg), dok je ERM-
CC013a nastao sa mjesta rada plinovoda (7,5% vode i 2,4 organske materije). CRM-
170 je bio uzorak sa povećanih 16 PAH-ova (2,3 vode i 4,3 organske materije).

SELEKTIVNA EKSTRAKCIJE POD PRITISKOM (SPLE)

Ova metoda je izvedena pomoću ubrzanog sistema otapala (engl. ASE- acclerated
Solvent system) 350, upotrebljavajući ekstrakcionu ćeliju od nehrđajućeg čelika od 34
ml. PLE ćelije su oprane prije korištenja. Ćelije su opremljene sa celuloznim filterom
te sa 4g baznog silicij dioksida, homogenat 0,5 - 4g zemljište i bezvodni Na2 SO4 u
omjeru 1:5 a zatim bezvodni Na2 SO 4 do vrha (približno do 1cm od vrha). Bazni
slilicij dioksid je pripremljen rastvaranjem 84 g kalijum hidroksida u 400 ml metanola
i dodavanjem 150 g silika gela u rastvor. Smjesa je stavljena u rotacijski isprivač 90
minuta na 45°C, te prebačen u lijevak za odvajanje, ispran sa etanolom i osušen. Dio
zemljišta od 0,25 g je korišteno za BCR-524 i CRM-170, 2g su korištena za FS, PS i
HS uzorke a 4g su korištena za BS uzorak.
Treba naglasiti da se nisu primijetila nikakva značajna zagađenja molekularnim
sumporom u bilo kojem od uzoraka. Ukoliko bi postojala potreba za uklanjanjem
molekularnog sumpora iz bilo kojeg uzorka, dodao bi se aktivni bakar prilikom
homogenizacije. Nakon dodavanja mješavine IS, postavlja se površni sloj Na2 SO4 i
još jedan celulozni filter na vrhu. Sastav ekstrakcione ćelije je prikazan na slici 2.
Vršena ekstrakcije je ASE (engl. accelerated solvent extraciton) odnosno ubrzana
ekstrakcija sa rastavaračem (slika 1), na pritisku približno 11,720 kPa.

3
 Slika 1. Izgled aparata za ubrzanu ekstrakciju i princip rada istog

Da bi se odredili optimalni parametri za SPLE metodu, treba obratiti pažnju na odabir

rastvarača, količinu ispiranja, temperaturu ekstrakcije i broj statičkih ciklusa koji se
koriste za uzorak BS koji su pojačani sa IS mješavinom za matričnu referencu. Za
preliminarni pregled odabrana skupina IS je izabrana kako bi se odredilo izdvajanje
komponenti. Lista uključuje sve IS-ove od 16 PAH-ova, d12-9-MANT, d10-1-
MNAP, d8-DBT, d8-CARB, d9-ACR i d8-AQN. SPLE ekstrakti su upareni do
približno 5ml koristeći rotaciijski isparivač (rotavapor) na pritisku od približno 75 kPa
i temperaturi od 40 °C , te zatim do 0,5 do 1 ml koristeći blagi mlaz azota s RS
d12_PER za kvantifikaciju izdvajanje za IS.

4
 Slika 3. Rotacijski evaportator

HEMIJSKA ANALIZA

Ekstrakti su analizirano upotrebom Agilent 7890A GC u sprezi do 5975C MS, koji

radi u modu elektronske jonizacije (EI), sa Agilent Select PAH kapilarnim stubom. 1
μL ekstrakta ubrizgan je u razdvojenom režimu a mjerenja su provedena u odabranom
režimu praćenju jona (SIM) režim. Temperaturni program za hemijsku analizu bio je
sljedeći: 70 ° C (0 min.), 8 ° C / min. do 205 ° C (2 min.), 8 ° C / min. do 250 ° C, 3 °
C / min. do 270 ° C (2 min.), 9 ° C / min. Do 279 ° C (1 min.), 1 ° C / min. do 280 ° C
(3 min.) i 5 ° C / min. do 325 ° C (5 min.).

OSIGURANJE I KONTROLA KVALITETA

U svrhu razvoja metode, pojačani BS uzorci su ekstrahirani i analizirani sa

duplikatima koristeći GC/MS.

Oprimizirana metoda SPLE je potvrđena primjenom BCR-524, ERM-CC013a i

uzoraka zemljišta CRM-170 te se primjenjuju za analize FS, PS i HS a svi se izvedeni
po 3 puta. U postupak su uključeni bezvodni Na2 SO4 i alkilirani silicijev dioksid u

5
svim analizama. Kvantifikacija je izvedena pomoću izotopa metodom razblaživanja s
označenim internim standardima. Za jedinjenja nedostaje podudaranje određenih
standarda, a za unutrašnji standard istog korišteno je jedinjenje koje zahtjeva najbolje
vrijeme zadržavanja. Detaljne informacije o internim standardima se nalaze u tablici
S1 u SD. Kalibracijske krivulje od najmanje 5 tačaka, u rasponu od 1 do 2000 ng,
korištene su za kvanitifikaciju spojeva sa relativno standardnim odstupanjem (RSD)
relativnih faktora odziva (RRF) manje od 20% izvornog PAH-a, azarena, SPAC i
alkilirani PAH, a manje od 28% za OPAH. Instrumentalna granica od detekcija
(iLOD) određena je na osnovu tri puta većeg signala omjera šuma i mase podijeljenog
s masom zemljišta. PS tla (9% vode) koristi se za izračunavanje iLOD, EDL i LOQ.
ILOD su se kretali od 0,22 do 7,06 ng / g, 0,40 do 9,52 ng / g i 0,58 do 108,44 ng / g
za PAH, alkilirane PAH-ove i SPAC-ove, te OPAH-ove i azaarene.
.
Proračunate granice detekcije (EDL) primjenom EPA metode 8280. EDL su se kretali
u rasponu 0,30 do 41,60 ng / g, 3,29 do 87,79 ng / g i 0,25 do 278,84 ng / g za PAH-
ove, alkilirane PAH-ove i SPAC-ove, te OPAH-ove i azaarene. Visok šum je bio
vidljiva kasnije za eliminirajuće OPAH-ove i azarene kako su naznačili iLOD-ovi koji
su rezultirali višim EDL-om nekih spojeva. Granica kvantifikacije (LOQ) su 3.3 × za
odgovarajuće EDL vrijednosti 0,30 do 41,60 ng / g, 3,29 do 87,79 ng / g i 0,25 do
278,84 ng / g za PAH-ove, alkilirane PAH-ove i SPAC-ove, OPAH-ove i azaarene.

REZULTATI I DISKUSIJA

IZBOR RASTVARAČA

Prethodni eksperimenti testirali su izdvajanje pojačanih IS-ova u BS i ekstrehovani sa

različim kombinacijama otapala, uključujući dihlormetan (DCM), aceton, n-heksan:
aceton (1: 1 i 3: 1 v / v), n-heksan: DCM (9: 1 v / v) i n-heksan: etil acetat (3: 1 v / v).
DCM i n-heksan: DCM (9: 1 v / v) dobiva se u najvišim količinama i njihovo
izdvajanje će biti prikazano na slikama. Pored toga izdvajanje PAC-ova upotrebom
DCM ili n-heksana: DCM (9:1 v/v) testirani su pojačanim analitima na BS (tabela i
sl). DCM je izabran na osnovu većeg oporavka IS i ciljne molekulske mase PAC-a,
posebno NAP, 1 i 2-MNAP, QON i IND (sl i tabela). DCM je bio također odabran
kako bi se dobili spojevi veće polarnosti, kao što su hidroksilirani PAH-ovi
(OHPAH), gdje je u preliminarnom postupku studija otkriveno da je DCM dalo veći
izdvajanje za neke OHPAH-ove u poređenjui s n-heksanom: DCM (9:1 v/v).

STATIČKI CIKLUSI

SPLE metoda je testirana korištenjem dva statička ciklusa. Jedan statički ciklus je
uzet u obzir ali izdavajnje d8.NAP je bio ispod 30%, rezultirajuću netačnost NAP-
ova, odnosno njihove koncentracije. Koncentracije FLT, PHE, BkF, i DBahA su
također niže u odnosu na certificirane vrijednosti i rezultate iz međulaboratorijskih
studija kada se koristi jedan statički ciklus. Dok je rezultujuća zapremina ekstrakta
veća, dva statička ciklusa se smatraju neophodnim kako bi se postigla optimalna
ekstrakcija PAC-ova iz uzorka tla. Zbog toga su se koristila dva statička ciklusa pri

6
analizama (po 5 minuta svaki).

ISPRANA ZAPREMINA

Ispitane su tri različita ispiranja: 50, 75 i 150% sa ciljem samnjenja upotrebe otapala.
150% ispiranje zapremina je osiguralo najbolje izdvajanje IS-ova u odnosu na 50 i
75% ispiranja. Rezultati su bili statistički značajni za deset od ovih 16 IS PAH-ova i
jedan od tri IS OPAH-a, te azarena. Izdvajanje IS-ova za LMW-ŠAH, tačnije d8-
NAP, d8-ACY i d8-ACE bili su ispod minimuma što je bilo definisano kao manje ili
jednako od 30%, bez obzira na količinu ispiranja. Slično tome, izdvajanja za d12-
9.MANT i d10-1-MNAP su također bile slave. Izdvajanje za d10-ANT, d10-PHE,
d10-FLO i d8-DBT su bili bolji kada je upotrijebljeno 150% zapremine ispiranja ali
rezultati nisu bili statistički značajni. Povećana zapremina ispiranja bila je potreba
kako bi se omogućilo da što više otapala dođe u kontakt kako bi se oporavilo više
uzorka. Nije bilo uočljivih razlika između d8-CARB i d8-AQN. Na osnovu ovog
razultata odabire se ispiranje zapremine od 150%.

TEMPERATURA EKSTRAKCIJE

Testirane su tri različite temperature ekstrakcije:

1. 100 °C dva puta,
2. 100 i 120 °C ,
3. te 100 i 140 °C
Više ekstrakcione temperature testirane su na osnovu rezultata iz prethodnih studija
koje su pokazale uspješnu ekstrakciju OPAH-ova na višim temperaturama. Nisu
pronađene značajne razlike između različitih temperatura za ekstrakcije IS-ova.

Izdvajanje PAH-ova sa većim brojem prstenova su veći u odnosu na LMW-PAH, što

se može pripisati visokim stepenom isparavanja LMW-PAH-ova. Između IS-ova u
LMW-PAH-ovima, izdvajanja d8-ACY i d8-ACE su bili iznad minimalnog izdvajanja
ali ne i za d8-NAP. Za alkilirane PAH i SPAC-ove kombinacija od 100 i 200 °C
omogućila je bolji izdvajanje za d12-9-MANT u odnosu na druge ekstrakcije sa
drugim temperaturama. Oporavci za d10-1-MNAP bili su bolji u kombinaciji od 100 i
140 °C u odnosu na 100 i 120 °C , dok su oporavci za d8-DBT bili bolji na 100 °C
dva puta. Također ukoliko dođe do bilo kakvih grešaka prilikom izvođenja ekstrakcije
doći će i do velikih varijacija u rezultatima. Za OPAH-ove i azarene promjena
temperature nije utjecala na njihovo izdvajanje. Na osnovu rezultata je odlučeno da se
koriste temperature ekstrakcije od 100 i 120 °C za SPLE metodu. Izdvajanje LMW-
PAH nije bilo zadovoljavajuće na ovim temperaturama pa je na osnovu toga korištena
kombinacija od 100 °C dva puta, kako je naznačeno u užim trakama grešaka, vrijeme
ekstrakcije u ovom slučaju je brže sa 100 i 140 °C za alkilirane PAH-ove i SPAC-
ove, te su bili pogodoniji od ostalih metoda. Zbog niskog povrata IS-a za LMW-PAH,
istražena je mogućnost gubitka analita osnovnog silicijuma i procesa isparavanja.
Uspoređena su izdvajanja IS-ova i PAC-ova , pojačanim sa BS-om, gdje su
ekstrahirani pri temperaturama od 100 °C dva puta, sa oporavkom IS-ova i PAC-ova

7
sa dodanim Na2 SO4 bez BS i osnovne silike, kao i ekstrakcije na 100 °C dva puta i
PACova i IS-ova sa dodatim DCM prije isparavanja. Pronađeno su određeni gubici
LMW-PAH-ova zbog ispravanja, ali su veći gubici pronađeni tokom ekstrakcije, koje
sugeriraju na slabo izdvajanje LMW-PAH-ova prvenstveno zbog posljedica
hlapljivosti. Slično tome, izdvajanje pojačanih PAC-ova sa BS-om je također
pokazalo slabo izdvajanje PAH-ova, poput 2- i 1-MNAP zbog velike isparljivosti ovih
spojeva.

Grafik 1. Poređenja različih zapremina ispiranja kod izdvajanja IS-ova sa dodatim BS-om- uočene
značajne razlike

Grafik 2.Poređenje utjecaja različitih temperatura ekstrakcije na izdvajne IS-ova sa dodatim BS-om

PROVJERA METODE

Optimalna metoda koristi sljedeće parametre: 4 g osnovnog silicjum dioksida, DCM

rastavarač, 100% ispiranje, 100 i 120 °C metoda ekstrakcije, s dva statička ciklusa
( po 5 minuta) za svaku temperaturu, nema ispiranja između dvije ekstrakcije, te 20 i
120 sekundi za prvu i drugu ekstrakcionu temperaturu, retrospektivno. Propuštanje
ispiranja između dvije ekstrakcije i vrijeme čišćenja je urađeno radi smanjenja
mogućnosti gubitaka analita. Rezultat zapremine ekstrakta bio je približno 130 ml što
je postignuto u oko 45 minuta ekstrakcije. Da bi se potvrdila SPLE metoda,
ekstrahirani su uzorci tla BCR-524, ERMCC013a i CRM-170 i upoređenji sa

8
rezultatima potvrđenih vrijednosti iz prethodnih laboratorijskih provjera. Za BCR-
524, rezultati u ovom studiju za 6 od 16 EPA PAH-ova su se slagali sa certifiriranim
vrijednostima iz međulaboratorijskih radova. SPLE metoda je također dobro
upoređivala sa nizom drugih tenika ekstrakcije, kao što su PLE ili mikrovalna
ekstrakcija, koje su korištene iz međulaboratorijskih studija. Rezultati su se dobro
slagali sa ovim međulaboratorijskim radovima za preostalih 10 od 16 PAH-oba.
Nadalje, tehnika vađenja također pokazuje manje varijacije koncentracije nekih
komponenti, sa intervalom pouzdanosti od 95% u uporedbi sa rezultatim iz
međulaboratorijskih radova. Rezultati NAP-a, ACY-a i ACE-a također su pokazali da
je dodatak dva statička ciklusa po ekstraciji temperature pomogla porastu oporavka
LMW-PAH-ova. Rezultati za PAH-ove sa većim brojem prstenova kao što su DBahA
i BhhiP se također slažu sa međulaboratorijskim rezultatima, kao što je bilo sa
podacima koji su sugerirali da je SPLE metoda sposobna za vađenje PAH-ova iz tla.
Uz to, dodavanje osnovne silike za zadržavanje matrice nije umalo nikakvog utjecaja
na analizu za ovih 16 PAH-ova u uzorcima. BCR-524 uzuorak nije dala certificirane
vrijednosit OPAH-ova i azarena, pa su upoređeni ovi rezultati sa
međulaboratorijskim. Koncentracija OPAH-ova i azarena je izdvojena metodom
SPLE, te se oni također slažu sa međulaboratorijskim radovima, s izuzetkom BcdPN,
gdje je dobijen veći rezultat od međulaboratorijskog rada. Razlika može biti
djelimično zbog greške prilikom rada. Međulaboratorisjka istraživanja su također
analizirala 5,12-NQN, ali je bilo nemoguće uporediti rezultate za ovu komponentu
zbog koeluacije vrhova sa 1,4-CQN. U ovoj studiji izračunati su projesčni RSD za
OPAH-ove i azarene koji iznose 6,8% odnosno 6,5%. S izuzetkom RSD-a iz jednog
laboratorija iz međulaboratorijskih istraživanja, te su dobiveni rezultati bili bolji od ili
u skladu s RSD vrijednostima dobiveni iz ovih laboratoija, što je sugeriralo na
primjenjivost SPLE metode za analizu OPAH-ova i azarena.
Ne postoje certificirani novoi alkiliranih PAH-ova i SPAC-ova za tlo BCR-524 i
nijedna gruba spojeva nije bila obujvaćena u laboratorijskim radovima. Međutim zbog
alikiliranog PAH-a i SPAC-ova koji eluiraju u istoj frakciji kao roditeljski PAH, te
spojeve je uspješno i lahko ekstrahirati SPLE metodom. Rezultati alkiliranih PAH-
ova i SPAC-ova koji su pojačani sa BS su također dali zadovoljavajuće izdvajanje
(31-101%), što je dodatno potvrdilo primjenjivost SPLE metode na ekstrakt alkiiranih
PAH-ova i SPAC-ova. Dobijeno je 16 EPA PAH-ova, OPAH-ova i azarena za EMR-
CC013a, te je ovaj uzorak također pokazao sposobnost metode SPLE da analizira
uzorak, gdje je pronađen mali udio organske tvari. Analiza je bila u skladu sa
certificiranim i standardizovanim vrijednomstima iz međulaboratorijske studije za 11
od 16 EPA PAH-ova. Rezultati za ACE i DVahA proklapaju se sa rezultatima iz
mešulaboratorijske studije ali ne sa ovjerenim vrijednostima. Za PYR, CHR i BghiP,
rezultati su se poklapali sa certificiranim vrijednostima, ali ne i sa
međulaboratorijskim. Slično kao kod BCR-524 nije bilo vojerenih vrijednosti OPAH-
ova i azarena pa su uspoređeni rezultati sa EMR-CC013a i međulaboratorijskim
vrijednostima. Pronađeno je poklapanje između dva rezultata. Dalje je potvrđena
analiza CRM-170, koja je sadržavala samo dodate koncentracije 6 EPA PAH-ova, koi
su bili u skladu sa certificiranim vrijednostima. Koncentracija 12 od 16 EPA PAH-
ova su bili u skladu sa certificiranim vrijednostima, preostala 4 su bili izvan
provjerenog intervala, ali to je ipak bilo predviđeno.

9
Tabela 1. Poređenje koncentracija PAH-ova, OPAH-ova i azarena u uzorku BCR-524 analirizanih

korištenjem SPLE metode

10
Tabela 2. Poređenje koncentracija PAH-ova, OPAH-ova i azarena u uzorku tla ERM-CC013a

(Dobijeni rezultati koristeći SPLE metodu, certificirane vrijednosti)

11
 Tabela 3. Poređenje koncentracija PAH-ova u uzorku CRM-170 analiziranog primjenom SPLE

metode

Tabel 4. Prosječne koncentracije PAH-ova, alkiliranih PAH-ova i SPAC-ova, te OPAH-ova i

azarena

PRIMJENA SPLE METODA NA UZORCIMA ZEMLJIŠTA

Uz pomoć SPLE metode ekstrahovani su FS, PS i HS uzorci zemljišta kako bi se

analizirali PAHovi. PS je sadržavao najveću ukupnu koncentraciju PAC-ova, dok je
HS sadražavao najmanju koncentraciju. Kod PS i HS uzoraka, koncentracija PAH-ova
je bila najveća u odnosu na drugu grupu jedinjenja. Ipak, ukupna kombinacija
alkiliranih PAH-ova, SPAC-ova i OPAH-ova, te azarena premašila je vrijednosti od
koncentracije 16 EPA PAH-ova u uzorku FS, koja je kako je istaknuto sadržavala
različite stupnjeve zagađenja u izvoru u odnosu na PS i HS. Veća koncentracija
alkiliranog PAH-a u FS uključujući u 1,6-DMNAP, u odnosu na roditeljsku
kompenentu je sadržavala petrogene supstance, što je bilo očekivano zbog
kontaminacije ulja prilikom uzimanja uzorka. Prisustvo svih 16 EPA-PAH-ova je bilo

12
uočeno iako je njihova koncentracija redoslijedom veća u PS u usporedbi sa FS i HS.
Dok koncentracija od 16 PAH-ova dominira profilom koncentracije PAC-ova, analiza
je prikazala i izmjereno prisustvo drugih PAC-ova koji nisu spadali u ovih 16 osnovih
PAH-ova. Naprimer, BcFL i DBaIP su izmejerni u uzorku zemljišta. Oni su veoma
značajni zbog svoje toksičnosti koja je ekvivaletna ili veća od BaP. BcFL takođe ima
visoku toksičnost petrogenim materijalima, dok DB aIP nije posebno izražen u
okolini. DBaIP pripada grupi PAH-ova sa molekularnom težinom od 302 mikrometra,
koji također uključuje i DBbkF, DVaeP i N23aP, koji se vremenom razviju u toksične
materije. DBbkf i DBaeP su izmjereni u svim uzorcima, dok je N23aP jedino
izmjeren u PS uzorku. Ukupno 38 roditeljskih PAH-ova je uključeno u listu, 33, 37 i
35 od njih je pronađeno i količinsko izmjereno u FS, PS i HS uzorcima.

Koncentracije alkiliranih PAH-ova i SPAC-ova m,jerenu su prvenstveno u uzorcima

sa FS i PS. Samo 6 od 24 alkiliranih a SPAC-ovi su izmjereni u HS-u i koncentracije
su niske u odnosu na one koje su pronađene u uzorcima FS i PS. 18 i 19 od 25
alkiliranih PAH-ova i SPAC-ova su mjereni u FS i PS uzorcima. Najviša
koncentracija alkiliranog PAH-a i SPAC-a u FS iznosila je 1,6-DMNAP (6,51 µg / g)
i 2-MNAP (3,18 µg / g) u PS. 1- i 3-MCHR i DBT, to su jedinjenja koja su pokazala
estrogeno djelovanje dok je u nekim studijama pokazano da je i otrovno. 3-MCHR i
DBT su izmjereni u svim uzorcima tla, 1-MCHR je izmjereno u FS i PS uzorcima,
dok je 5-MCHR izmjereno u PS i HS uzorcima. Rezultat ukazuje na hitnost pregleda
ovih spojeva u uzorcima zemljišta. Najveća koncentracija OPAH-ova i azarena
izmjerena je u PS, dok je najniža LH. Od izmjerenih 24 OPAH-ova i azarena, 12, 17 i
9 jedinjenja u FS, PS i HS. S izuzetkom BaFLN-a u FS-u i BcdPN u HS-u, svi
OPAH-ovi i azareni koji su izmjereni u BCR-524 su također otkrivena u sva tri
uzorka. Iako svi spojevi nisu mjereljivi, njihovo prisustvo u više uzoraka su pokazali
njihovu izuzetnu važnost u zemljištu. Specifično, koncentracija AQN je bila veća od
ANT, koja je roditeljska komponenta u Fs i HS uzorcima, što ukazuje na moguću
rekaciju koja ih transformira, koje se dešava usljed fotohemijske ili mikrobiološke
aktivonosti, iako AQN također može potjecati iz primarnih izvora. Slično OPAH-
ovima, azareni su također poznati kao spojevi koje dovode do mutacija i obrazuju
kancerogena jedinjnja. To je još dodatni razlog da OPAH-ovi i azareni trebaju biti
uvršteni u analize, zbog toga što neke komponente kao ACR, IND i QON također
imaju estrogeno djelovanje na MPAH-ove i SPAC-ove. OPAH-ovi i azareni su
također interesantni zbog njihovog dejstva na bioraspoloživost i dostupnost u
zemljištu u poređenju sa roditeljskim PAH-ovima. SPLE meoda koja je razvijena u
istraživanju može služiti kao tehnika koja pojednostavljuje analize PAC-ova u uzorku
zemljišta. Za rutinsku analizu velikog broja uzoraka PAC-ova, SPLE metoda treba
dokazati pristupačnosti i za druge laboratorijske analize. U poređenju sa prethodnim
korištenim SPLE metodama za ekstrakciju PAC-ova iz okoline, ova SPLE metoda je
sposobna za ekstrahovanje širi dijapazon komponenti uz istovremeno poboljšanje
izdvajanja i dosljednost rezultata za OPAH-ove i azarene. Kao dodatak još, OPAH-
ovi su obično popratno formirani prilikom oporavka PAH-ova. Ovakve analize
zahtijevaju metodu ekstrakcije koja garantuje izdvajanje OPAH-ova, te korištena
metoda SPLE zadovoljava ovakav kriterij. Daljni potencijal korištenja ove ekstrakcije
povezana je sa ne ciljanim i/ili ciljanim analizama, koje se rijetko koriste. I dok SPLE
tehnika ne rastavlja zemljište na frakcije, ipak ekstrahuje svu toksičnost iz zemljišta.
Dokazano je da toksičnost može biti analizirana ovakvom tehnikom u studiju. Mogući
nedostatak ove analize bi mogao bit kod analize zemljišta sa malim udijelom organske
materije. Pokazano je da je ova studija u stanju da analizira prisustvo PAC-ova u

13
uzorku koji ima do 46% organske materije, sa standardnom greškom ispod 20%, što
ukazuje da je ova metoda pogodna za analize uzoraka sa većim udjelom ogranske
materije. Drugi nedostatak može biti prilikom nedostatka određene mase uzorka. Iako
je analiza ovog istraživanja bila uspješna sa malom količinom uzorka, može biti
slučajeva kada je potrebna veća količina uzorka za ekstrakciju radi postizanja donje
granice detekcije. U takvim slučajevima, koriste se veće ćelije za ekstrakciju i veća
količina osnovog silicijuma da bi se postigla potpuna ekstrakcija PAC-ova.

ZAKLJUČAK

U ovoj studiji je razvijena SPLE metoda za analizu PAC-ova u zemljištu kako bi se

poboljšala ista usljed većeg ispiranja zajedno sa ekstrakcijom, te korištenjem
osnovnog silicijuma kao matrice zadržavanja u ekstrakcijskim ćelijama. Također je
bio i cilj povećanja izdvajanja PAH-ova i alkiliranih PAH-ova, te SPAC-ova. Nakon
optimizacije, SPLE metoda je koristila 4g osnovnog silicijuma, zatim DCM rastvarač,
100% ispiranja i 100 i 120 °C temperature ekstrakcije, s dva statička ciklusa za svaku
temperaturu (4 ukupna ciklusa), bez ispiranja između dvije ekstrakcije u 20 i 120
sekundi pročišćavanje za prvu odnosno durgu temperaturu ekstrakcije. SPLE metoda
je testirana i ovjerena korištenjem certificiranog materijala za tlo kao reference, čiji su
se rezultati poklapali s ovim ovjerenim vrijednostima. Rezultati su se također
poklapali sa prethodnim analizama iz međulaboratorijskih radova za isti uzorak.
SPLE metoda je razvijena i potvrđena za mase uzorka u rasponu od 0,25-0,5 g i
organske materije u iznosu od 2.4, 4.3, 13 %. Metoda je prijavljenja za uzorke tla
mase u rasponu od 2-4 g i sadržajem organske materije između 2 i 46%. Raspon
koncentracija PAC-ova koji su pronađeni u uzorcima su se kretali u rasponu od 0,005
do 71,1 µg / g. Sve u svemu, SPLE metoda govori u ovoj studiji da je sposobna da
ekstrahuje širok spektar PAC-ova, uključujući PAH-ove i PAH-ove sa molekularnom
težinom od 302 u, alkilirane PAH-ove, SPAC-ove, OPAH-ovie i azarene. Zatim je
primjenjena SPLE metoda i za analizu PAC-a u tri različita uzorka zemljišta.
Otkriveni su PAC-ovi u različitim koncentracijama uključujući neke OPAH-ove i
azarene koji nisu uobičajni za ovakve analize. Metoda SPLE može biti i od koristi u
različitim drugim analizama, uključujući rutinsku analizu PAC-ova i praćenje
razgradnje proizvoda PAH-ova, nakon sanacija tla kontaminiranih PAH-ovima.
Također se može koristiti i za identificiranje nepoznatih organskih spojeva u uzorcima
zemljišta.

14
LITERATURA

1. M. Larsson, J. Hagberg, A. Rotander, B. van Bavel, M. Engwall, Chemical and

bioanalytical characterisation of PAHs in risk assessment of remediated
PAHcontaminated soils, Environ. Sci. Pollut. Res. 20 (2013) 8511–8520,
doi:10.1007/
s11356-013-1787-6.

2. B.A.M. Bandowe, S. Leimer, H. Meusel, A. Velescu, S. Dassen, N. Eisenhauer,

T. Hoffmann, Y. Oelmann, W. Wilcke, Plant diversity enhances the natural
attenuation of polycyclic aromatic compounds (PAHs and oxygenated PAHs) in
grassland soils, Soil Biol. Biochem. 129 (2019) 60–70, doi:10.1016/j.soilbio.2018.
10.017.

3. I.A. Titaley, A. Chlebowski, L. Truong, R.L. Tanguay, S.L. Massey Simonich,

Identification and toxicological evaluation of unsubstituted PAHs and novel PAH
derivatives in pavement sealcoat products, Environ. Sci. Technol. Lett. 3 (2016)
234–242, doi:10.1021/acs.estlett.6b00116.

4. I.A. Titaley, D.M. Walden, S.E. Dorn, O.M. Ogba, S.L. Massey Simonich, P.H.-
Y. Cheong, Evaluating computational and structural approaches to predict
transformation products of polycyclic aromatic hydrocarbons, Environ. Sci.
Technol. 53 (2019) 1595–1607, doi:10.1021/acs.est.8b05198.

5. M.M. Lam, M. Engwall, M.S. Denison, M. Larsson, Methylated polycyclic

aromatic hydrocarbons and/or their metabolites are important contributors to the
overall estrogenic activity of polycyclic aromatic hydrocarbon–contaminated
soils, Environ. Toxicol. Chem. 37 (2018) 385–397, doi:10.1002/etc.3958.

6. M.M. Lam, R. Bülow, M. Engwall, J.P. Giesy, M. Larsson, Methylated PACs

are more potent than their parent compounds: a study of aryl hydrocarbon receptor–
mediated activity, degradability, and mixture interactions in the
H4IIE-luc assay, Environ. Toxicol. Chem. 37 (2018) 1409–1419, doi:10.1002/etc.
4087.

7. M. Larsson, M.M. Lam, P. van Hees, J.P. Giesy, M. Engwall, Occurrence and
leachability of polycyclic aromatic compounds in contaminated soils: Chemical and
bioanalytical characterization, Sci. Total Environ. 622–623 (2018) 1476–
1484, doi:10.1016/j.scitotenv.2017.12.015.

8. S. Lundstedt, P.A. White, C.L. Lemieux, K.D. Lynes, I.B. Lambert, L. Oberg,
P. Haglund, M. Tysklind, Sources, fate, and toxic hazards of oxygenated polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAHs) at PAH-contaminated sites, Ambio 36
(2007) 475–485.

9. C.A. Manzano, C. Marvin, D. Muir, T. Harner, J. Martin, Y. Zhang, Heterocyclic

aromatics in petroleum coke, snow, lake sediments, and air samples from the
athabasca oil sands region, Environ. Sci. Technol. 51 (2017) 5445–5453, doi:10.

15
1021/acs.est.7b01345.

10. L. Chibwe, C.A. Manzano, D. Muir, B. Atkinson, J.L. Kirk, C.H. Marvin, X.
Wang,
C. Teixeira, D. Shang, T. Harner, A.O. De Silva, Deposition and source identification
of nitrogen heterocyclic polycyclic aromatic compounds in snow, sediment, and air
samples from the athabasca oil sands region, Environ. Sci. Technol. 53 (2019) 2981–
2989, doi:10.1021/acs.est.8b06175.

11. J.T. Andersson, C. Achten, Time to say goodbye to the 16 EPA PAHs? Toward
an up-to-date use of PACs for environmental purposes, Polycycl. Aromat. Compd.
35 (2015) 330–354, doi:10.1080/10406638.2014.991042.

12. Z. Tian, A. Gold, J. Nakamura, Z. Zhang, J. Vila, D.R. Singleton, L.B. Collins,
M.D. Aitken, Nontarget analysis reveals a bacterial metabolite of pyrene implicated in
the genotoxicity of contaminated soil after bioremediation, Environ.
Sci. Technol. 51 (2017) 7091–7100, doi:10.1021/acs.est.7b01172.

13. L. Chibwe, C.L. Davie-Martin, M.D. Aitken, E. Hoh, S.L. Massey Simonich,
Identification of polar transformation products and high molecular weight polycyclic
aromatic hydrocarbons (PAHs) in contaminated soil following bioremediation,
Sci. Total Environ. 599–600 (2017) 1099–1107, doi:10.1016/j.scitotenv.2017.04.
190.

14. L.S.D. Trine, E.L. Davis, C. Roper, L. Truong, R.L. Tanguay, S.L.M. Simonich,
Formation of PAH derivatives and increased developmental toxicity during steam
enhanced extraction remediation of creosote contaminated superfund soil, Environ.
Sci. Technol. 53 (2019) 4460–4469, doi:10.1021/acs.est.8b07231.

15. M.C. Geier, A.C. Chlebowski, L. Truong, S.L. Massey Simonich, K.A.
Anderson, R.L. Tanguay, Comparative developmental toxicity of a comprehensive
suite of polycyclic aromatic hydrocarbons, Arch. Toxicol. 92 (2018) 571–586,
doi:10.1007/s00204-017-2068-9.

16. M. Brinkmann, S. Maletz, M. Krauss, K. Bluhm, S. Schiwy, J. Kuckelkorn,

A. Tiehm, W. Brack, H. Hollert, Heterocyclic aromatic hydrocarbons show estrogenic
activity upon metabolization in a recombinant transactivation assay,
Environ. Sci. Technol. 48 (2014) 5892–5901, doi:10.1021/es405731j.

17. A.L. Knecht, B.C. Goodale, L. Truong, M.T. Simonich, A.J. Swanson, M.M.
Matzke,
K.A. Anderson, K.M. Waters, R.L. Tanguay, Comparative developmental toxicity
of environmentally relevant oxygenated PAHs, Toxicol. Appl. Pharmacol. 271
(2013) 266–275, doi:10.1016/j.taap.2013.05.006.

18. O. Idowu, K.T. Semple, K. Ramadass, W. O’Connor, P. Hansbro, P. Thavamani,

Beyond the obvious: environme

16