МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

Національний технічний університет України

«Київський політехнічний інститут імені Ігоря Сікорського»
Факультет біомедичної інженерії
Кафедра біомедичної інженерії

Домашня контрольна робота

на тему: «Методи аналізу агрегації клітин крові»
з дисципліни біохімія – аналітична хімія

Виконала
студентка групи БМ-71
Паламарчук Ю. В.

Перевірив
кандидат біологічних наук,
доцент кафедри БМІ
Калашнікова Л. Є.

Київ 2017
 ЗМІСТ
1. ТЕОРЕТИЧНІ ВІДОМОСТІ.............................................................................3
2. РОЗРАХУНКОВІ МЕТОДИ (СПОСОБИ)......................................................5
3. ЗАСТОСУВАННЯ У МЕДИЦИНІ..................................................................8

2
 1. ТЕОРЕТИЧНІ ВІДОМОСТІ
Клінічний аналіз крові – один з найпоширеніших і важливих
лабораторних аналізів. Зміни в цьому аналізі не завжди специфічні і
відображають процеси, що відбуваються в організмі у відповідь на вплив
фізіологічних і патологічних факторів.
Слід пам'ятати, що при розшифровці результатів аналізу крові можна
оцінювати окремо відхилення будь-якого показника від норми, а необхідно
оцінювати сукупність всіх показників крові. Такий підхід несе великий обсяг
діагностичної інформації, дозволяє поставити діагноз або звузити перелік
можливих діагнозів до мінімуму, а при необхідності визначитися з
напрямком подальшого обстеження, необхідного для остаточної постановки
діагнозу.
Особливе значення аналіз крові має при діагностиці захворювань крові.
Діагностика гострих і хронічних мієлоїдних і лімфоїдних лейкозів заснована
на специфічних змінах в периферичної крові та кістковому мозку, виявленні
безумовно у бластних клітин або збільшенні кількості дозріваючих і зрілих
клітин крові.
Клінічний аналіз крові широко використовується як первинний метод
обстеження при зверненні до фахівців будь-якого профілю, для
диспансеризації та контролю проведеного лікування.
Фізіологічний процес злипання формених елементів крові, якими є
тромбоцитарні клітини, прикріплення їх до стінок судин – це агрегація
тромбоцитів.
Цей механізм необхідний для формування кров’яного згустка – тромба,
що перешкоджає масивній крововтраті.
Способи агрегації клітин крові:
1) Спосіб визначення ступеня агрегації клітин крові.
Суть методу: отримують препарат клітин крові і визначають ступінь
агрегації клітин крові в залежності від оптичних властивостей препарату,
проводяться мікрозйомки препарату крові в момент часу t 1 поблизу початку
3
агрегації клітин крові і в момент часу t 2 поблизу закінчення агрегації клітин
крові. Потім розпізнаються на мікрознімках поодинокі клітини крові, і
1−N
ступінь агрегації клітин крові визначається за формулою A= K ,

де А – ступінь агрегації крові,

N – кількість одиничних клітин крові на знімку, отриманому в момент часу t2,
К – кількість одиничних клітин крові на знімку, отриманому в момент часу t1.
Винахід забезпечує підвищення продуктивності і точності визначення
ступеня агрегації клітин крові, що дає можливість діагностики розладів
мікроциркуляції крові при різних захворюваннях і патологічних станах[1].
2) Cпосіб визначення агрегації еритроцитів на основі оцінки швидкості
осідання еритроцитів (ШОЕ).
Спосіб полягає у порівнянні рівня вільно осілих клітин, у вертикально
встановленому капілярі з кров'ю протягом 2 годин і примусово обложених
еритроцитів крові шляхом їх центрифугування протягом 20 хвилин при 3000
об/хв.[1].
Був запропонований новий варіант оцінки агрегації еритроцитів на
основі дослідження мікроскопічної картини осідання еритроцитів в
гематокритному капілярі з реєстрацією швидкості осідання клітин[2]. Однак
круглий перетин капілярної трубки не дозволяє точно сфокусувати
зображення клітин або їх агрегатів. Крім того, на швидкість осідання
еритроцитів і в цьому випадку істотно позначається різна в'язкість
середовища (плазми) і концентрація еритроцитів (їх гематокрит). Отже,
точність визначення агрегації еритроцитів цим методом буде помітно
обмежена.
Загальним істотним недоліком варіантів методу ШОЕ для аналізу
агрегації еритроцитів є те, що швидкість осідання клітин сильно залежить від
щільності середовища (в'язкості плазми) і від концентрації клітин
(гематокриту), і в меншій мірі від об'єднання клітин в комплекси-агрегати.
Внаслідок чого точність і достовірність методу викликає сумнів.
4
 2. РОЗРАХУНКОВІ МЕТОДИ (СПОСОБИ)
1. Спосіб вимірювання ступеня агрегації еритроцитів на основі оцінки
світлопропускання через краплю цільної крові або суспензії еритроцитів в
агрегуючому середовищі.
Спосіб заснований на вимірюванні інтенсивності світлопропускання в
залежності від агрегатного стану крові. Інтенсивна агрегація в зразку крові
характеризується більш високою інтенсивністю проходження світла через
зразок крові і навпаки.
2. Фотометричний метод є найбільш поширеним для дослідження
агрегаційних властивостей еритроцитів. За допомогою цього методу можлива
кількісна оцінка агрегатного стану крові – розмірів і щільності мікроагрегатів
еритроцитів.
Інтенсивність світла, що пройшло через шар суспензії еритроцитів,
змінюється відповідно до їх агрегатного стану, що характеризується
розмірами і щільністю агрегатів, що утворюються. Можливості вимірювання
прозорості крові практично обмежені шарами товщиною 2-3 мм. Оскільки
досліджувана проба крові являє собою суспензію зважених еритроцитів, то
на інтенсивність минулого світлового потоку будуть надавати великий вплив
властивості, що розсіюються, агрегатів еритроцитів. Крім цього при
вимірюванні в суспензії зважених еритроцитів інтенсивність минулого
світлового потоку залежить не тільки від розмірів і форми еритроцитів, але і
від їх об'ємної концентрації та функціонального стану гемоглобіну. У зв'язку
з цим більш широке застосування отримали методи дослідження суспензії
еритроцитів у відбитому світловому потоці.
3. Для вивчення агрегації еритроцитів застосовують метод
«силектрометрії», сутність якого полягає у зменшенні світлорозсіювання
після припинення перемішування в процесі дезагрегації-агрегації клітин[4].
4. Різновидом способу оцінки агрегації при світлопропусканні є
п’єзодинамічна агрегатометрія[5]. У поле зору мікроскопа з вбудованим
фоторезистором розташовується предметне скло з наклеєним на відстані 3
5
діаметрів еритроцита покривним склом. На покривному склі жорстко
закріплений п'єзокристал, що живиться від звукового генератора. У
порожнину між стеклами вводиться проба гепаринизорованої цільної крові.
У міру збільшення напруги звукового генератора зростає потужність
коливання верхнього скла, і агрегати починають руйнуватися. Відповідно
змінюється екстінція і сигнал з фоторезистора. Після досягнення повної
дезагрегації і вихід кривої, яка реєструється самописцем, на плато, напруга
скидається і реєструється процес спонтанної агрегації.
Недоліком способу світлопропускання є неможливість диференціювати
істинні агрегати від простого оптичного зближення клітин. Також неможливо
коректно визначити агрегацію еритроцитів при низьких величинах
гематокриту (Hct>35%), що знижує ступінь достовірності отриманого
результату.
5. Найбільш близький до заявленого є спосіб визначення агрегації
еритроцитів шляхом прямої мікроскопії розведеної (1:200) суспензії
еритроцитів у власній плазмі або декстранами [6].
Спосіб полягає у приготуванні суспензії еритроцитів, приміщенні її в
лічильну камеру Горяєва, і під мікроскопом підраховуються окремо
неагреговані клітини і агрегати еритроцитів. Розраховується індекс агрегації
еритроцитів як відношення числа агрегатів до числа неагрегованих
еритроцитів.
Основним недоліком способу є те, що при ручному підрахунку клітин і
агрегатів процес агрегатоутворення в лічильної камері триває, і їх число
змінюється в різних місцях камери непередбачувано, що тягне за собою
великі помилки у визначенні рівня агрегації в цілому. Крім того, в даному
способі збільшення розмірів агрегатів істотно позначиться на підсумковому
результаті. Спосіб дуже трудомісткий і вимагає значних витрат часу і
досвідченого персоналу для адекватної обробки мікроскопічної картини
агрегації.

6
 Метою винаходу є підвищення продуктивності і точності визначення
ступеня агрегації клітин крові.
Поставлена мета досягається тим, що в способі визначення ступеня
агрегації клітин крові отримують препарат клітин крові і визначають ступінь
агрегації клітин крові в залежності від оптичних властивостей препарату.
Основні методи дослідження ШОЕ,
які поділяються на вище перераховані:
1. Кондуктометричний.
2. Електрокінетичний.
3. Фотометричний[3].

7
 3. ЗАСТОСУВАННЯ У МЕДИЦИНІ
Винахід відноситься до медицини і біології і може бути використано
для оцінки змін агрегатного стану клітин крові і точної діагностики розладів
мікроциркуляції крові при різних захворюваннях і патологічних станах.
Тромбоцити відіграють важливу роль у регуляції активності
плазміноген/плазмінової системи. Вони накопичують та вивільняють значну
кількість функціонально активного РАІ-1, що здатний пригнічувати процес
активації плазміногену. Разом з тим тромбоцити сприяють активації
плазміногену та локальній генерації плазміну. Lys-плазміноген, який може
утворюватися на тромбоцитарній поверхні, виявляє потужну антиагрегаційну
дію та запобігає агоніст-індукованій реорганізації актинового цитоскелету
тромбоцитів. Антиагрегаційний ефект Lys-плазміногену потребує
щонайменше двоцентрової взаємодії LBS кринглових доменів проензиму з
мембраноасоційованими протеїнами тромбоцитів. Таким чином,
встановлено, що плазміноген/плазмінова система обмежує агрегаційну
здатність тромбоцитів і тим самим залучається до регуляції їх
функціонального стану[7].
Проведено літературний аналіз інноваційних фізичних методів
гематологічних досліджень, що використовуються або знаходяться на стадії
впровадження у сучасну клінічну практику. Розглянуто основні напрямки
сучасних тенденцій дослідження крові:
1) Розробка нових діагностичних методів є актуальним завданням
медичного приладобудування. Для ранньої діагностики онкологічних
захворювань перспективний метод, заснований на вимірюванні
електрофізичних параметрів крові. Незважаючи на успіхи в дослідженні
реологічних властивостей крові актуальним залишається завдання розробки
методів аналізу гемореології, що об'єктивно відтворюють агрегаційні й
реологічні властивості крові. Поява будь-якого принципово нового методу
завжди означає розширення можливостей дослідника та створення передумов
для висвітлення проблеми з нової сторони. З фізичних властивостей крові
8
важливе діагностичне значення має визначення її питомої ваги, в'язкості й
швидкості згортання, а також реакції осідання еритроцитів. В основі
реологічних вимірів у медицині лежить саме вимірювання в'язкості крові, яка
залежить від: гематокриту, концентрації білка в плазмі, швидкості кровотоку
та інших зовнішніх факторів.
2) Вивчення залежності процесів агрегації у рухомій крові від
електричних параметрів клітин на основі дослідження електромагнітної
взаємодії поляризованих клітин з урахуванням просторового розділення
заряду потребує відповіді на питання про характер розподілу клітин в
рухомому потоці.
3) На даний час багато дослідників приділяють велику увагу вивченню
реологічних властивостей крові на рівні мікроциркуляції, проте
використання різних методів визначення гемореологічних параметрів не
дозволяє знайти стандарти кількісного контролю, що необхідно для клінічної
практики. Розроблено мікрорідинні динамічні системи для вимірювання
швидкості і в'язкості біологічних рідин (наприклад, крові в коронарних
артеріях). Проте слід відзначити, що на даний час не існує єдиної методики
вивчення в'язкості крові.
Проте сучасні пристроїв та методи віскозиметрії не дозволяють
проводити аналіз в’язкості крові в умовах in vivo. Це спонукає до пошуку
нестандартних підходів під час розробки нетривіальні приладів та методів
дослідження біологічних рідин.
4) Зменшення відносної в'язкості пояснюють сепарацією еритроцитів
до центру кровоносної судини і утворенням близько стінки вільного від
еритроцитів шару плазми, в якому в'язкість менша. У процесі руху по
судинах еритроцити деформуються, повертаються, злипаються, утворюють
конгломерати. Реологічні властивості крові проявляються при течії по
судинах менше 300 мікрон – при зменшенні діаметра судини відносна
спостережувана в'язкість зменшується. Це явище відоме як залежність
в'язкості крові від діаметра кровоносної судини.
9
 В’язкість крові визначається наявним вмістом еритроцитів, у свою
чергу, відомо, що магнітні властивості еритроцита в цілому визначаються
співвідношенням наявних у ньому форм гемоглобіну Hb. Найбільш сильно
парамагнітні властивості виражені у metНb, зміст якого в нормальній крові
менше 4% (залежно від віку еритроцита), але значно зростає при деяких
патологічних станах. З огляду на це важливим є оцінка величини магнітного
моменту та магнітної сприйнятливості еритроцита. Експериментально
встановлено, що магнітна сприйнятливість крові залежить від величини
прикладеного магнітного поля. В артеріях спостерігається зменшення, а в
венах навпаки збільшення магнітної сприйнятливості зі зростанням величини
прикладеного магнітного поля.
Крім магнітних сил між еритроцитами діють ще сили молекулярного
притягання і електростатичного відштовхування. Під час дослідження
балансу сил агрегації клітин в зовнішньому магнітному полі, необхідно
враховувати їх взаємодію як наведених магнітних диполів. Реальне ж
індуковане поле клітини буде відрізнятися від поля диполя і сильно залежить
від форми еритроцита.
Встановлено, що осмотична стійкість еритроцитів лінійно залежить від
індукції магнітного поля. Слабкі поля активують утворення активних форм
кисню в нейтрофілах, а сильніші поля призводять до загибелі еритроцитів.
Експериментуючи з величиною магнітної індукції та тривалістю впливу,
підібрали такі параметри, при яких червоні кров'яні тільця поляризуються і
починають злипатися в дуже короткі ланцюжки, більш важчі ланцюжки
еритроцитів спрямовуються до середини судинного русла, завдяки такому
ефекту в'язкість крові знижується на 20-30%.
5) Важливим діагностичним показником також є час згортання крові.
Для дослідження згортання крові необхідно застосовувати велику кількість
дорогих лабораторних тестів, що вимагають тривалого часу.

10
 Проте інноваційна розробка, дозволила отримати максимум інформації
в ході лабораторного тестування методом лазерної спекл-реології (laser
speckle rheology).
При цьому властивості крові (текучість, в'язкість, здатність до
коагуляції) досліджуються за допомогою лазера. У ході пропущеного
лазерного променя через зразок утвориться спекл-структура. Зразок крові
просвічують лазерним променем, при цьому клітини крові й, зокрема,
тромбоцити розсіюють світло, формуючи спекл.
У крові зі звичайними показниками згортання об'єкти, що розсіюють
світло, переміщаються вільно. У крові з підвищеними показниками в'язкості,
з високою концентрацією фібриногену рух клітин крові сповільнений,
обмежений, що зменшує мерехтіння спекла в порівнянні зі спеклом
звичайної крові.
На агрегацію еритроцитів також впливають імуноглобуліни всіх класів,
імунні комплекси й компоненти комплементу[8].

11
 4. СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ
1. Dintenfass L., Elevation of plasma viscosity and aggregation of red blood
cells in melanoma metastasis // Biorheoloigy. - 1978. - Vol.15. - 99-106.
2. Baskurt O.K. Uyuklu M., Sebahat O., Meiselman H.J. Measurement of
red blood cell aggregation in disposable capillary tubes. Clinical Hemorheol. and
Microcirculation. - 2011. - Vol.47. - 295-305.
3. Левтов B.A., Левкович Ю.И., Потапова И.В. и др. Об исследовании
агрегационных свойств крови // Физиология человека. - 1978. - №3. - С.504-
513.
4. Schmid-Schönbein Н., Barcard В., Hilbrand Е. Erythrocyte aggregation:
causes, consequences and methods of assesment // Tijdschr. NVKC. - 1990 -
Vol.15. - P.88-97.
5. Тухватуллин P.T., Левтов B.A., Шуваева B.H. Агрегация эритроцитов
в крови, помещенной в макро- и микрокюветы // Физиол. журнал. - 1986. -
Т.72. - №6. - С.775-7784.
6. Селезнев С.А., Вашетина С.М., Музаркевич Г.Е. Комплексная оценка
кровообращения в экспериментальной патологии. - Л.: Медицина, 1976. - 207
с.
7. РЕГУЛЯЦІЯ АГРЕГАЦІЇ ТРОМБОЦИТІВ
ПЛАЗМІНОГЕН/ПЛАЗМІНОВОЮ СИСТЕМОЮ Рока-Мойя Яна Маріовна
[Електронний ресурс] – Режим доступу до ресурсу:
http://www.biochemistry.org.ua/index.php?
option=com_content&view=article&id=5328:regulyatsiya-agregatsiji-
trombotsitiv-plazminogen-plazminovoyu-
sistemoyu&catid=885&lang=uk&Itemid=827.
8. Новітні фізичні методи дослідження крові [Електронний ресурс] –
Режим доступу до ресурсу: https://www.bsmu.edu.ua/uk/news/digest/4804-
novitni-fizichni-metodi-doslidzhennya-krovi.

12