In silico vergelijking van spike protein-ACE2 bindingsaffiniteiten tussen

soorten; betekenis voor de mogelijke oorsprong van het SARS-CoV-2-virus

Sakshi Piplani1,2, Puneet Kumar Singh2, David A. Winkler3-6*, Nikolai Petrovsky1,2*

1
College of Medicine and Public Health, Flinders University, Bedford Park 5046, Australië
2
Vaxine Pty Ltd, 11 Walkley Avenue, Warradale 5046, Australië
3
La Trobe University, Kingsbury Drive, Bundoora 3042, Australië
4
Monash Institute of Pharmaceutical Sciences, Monash University, Parkville 3052, Australië
5
School voor Farmacie, Universiteit van Nottingham, Nottingham NG7 2RD. UK 6 CSIRO
Data61, Pullenvale 4069, Australië

*Gezamelijke senior auteurs

Abstract
De verwoestende gevolgen van de COVID-19 pandemie veroorzaakt door het SARS-coronavirus
2 (SARSCoV-
2) heeft belangrijke vragen doen rijzen over de oorsprong van dit virus, de mechanismen van elke
zoönoseoverdracht van exotische dieren naar de mens, of gezelschapsdieren of dieren die voor
commerciële doeleinden worden gebruikt, kunnen fungeren als reservoir voor besmetting, en de
redenen voor de grote variaties in de gevoeligheid voor SARS-CoV- 2 bij verschillende
diersoorten. Traditionele, op laboratoria gebaseerde methoden zullen uiteindelijk veel van deze
vragen beantwoorden, maar vergen veel tijd. De steeds krachtiger wordende silico-
modelleringsmethoden bieden de mogelijkheid om snel informatie te genereren over nieuw
ontstane pathogenen om de ontwikkeling van tegenmaatregelen te ondersteunen en ook om
potentiële toekomstige gedragingen te voorspellen. We gebruikten een in silico structurele
homologie modellering aanpak om het SARS-CoV-2 spike eiwit te karakteriseren dat zijn hoge
affiniteitsbinding met de menselijke ACE2 receptor voorspelde. Vervolgens probeerden we
inzicht te krijgen in de mogelijke oorsprong en het transmissiepad waarmee SARS-CoV-2 naar
de mens zou kunnen zijn overgestoken door modellen te construeren van de ACE2-receptoren
van relevante soorten, en vervolgens de bindingsenergie van het SARS-CoV-2 spike eiwit te
berekenen aan elk van deze soorten. Met name SARS-CoV-2 spike proteïne had de hoogste
totale bindingsenergie voor de menselijke ACE2, groter dan alle andere geteste soorten, inclusief
vleermuis, de gepostuleerde bron van het virus. Dit geeft aan dat SARS-CoV-2 een sterk
aangepaste menselijke ziekteverwekker is. Van de onderzochte soorten was de volgende hoogste
bindingsaffiniteit na de mens schubdier, wat waarschijnlijk verklaard wordt door een proces van
convergente evolutie. De binding van SARS-CoV-2 voor hond en kat ACE2 was vergelijkbaar
met de affiniteit voor vleermuis ACE2, die allemaal lager is dan voor menselijke ACE2, en is
consistent met slechts incidentele waarnemingen van infecties van deze gedomesticeerde dieren.
Slang ACE2 had een lage affiniteit voor spike proteïne, waardoor het zeer onwaarschijnlijk is dat
slangen als een tussenliggende vector fungeerden. Over het algemeen geven de gegevens aan dat
SARS-CoV-2 op unieke wijze is aangepast om mensen te besmetten, wat belangrijke vragen
oproept over de vraag of het in de natuur is ontstaan door een zeldzame toevallige gebeurtenis of
dat de oorsprong ervan elders zou kunnen liggen.
Inleiding
De verwoestende impact van COVID-19 infecties veroorzaakt door het SARS-coronavirus 2
(SARS-CoV-2) heeft een ongekende internationale activiteit gestimuleerd om effectieve vaccins
1-16
en geneesmiddelen voor dit en andere pathogene coronavirussen te ontdekken. Het heeft ook
belangrijke vragen doen rijzen over de mechanismen van zoönotische overdracht van virussen
van dieren op mensen, over de vraag of gezelschapsdieren of dieren die voor commerciële
doeleinden worden gebruikt, kunnen fungeren als reservoir voor infecties, en over de redenen
voor de grote verschillen in de gevoeligheid voor SARS-CoV-2 in de verschillende diersoorten.
17-19
Inzicht in de manier waarop virussen van de ene soort naar de andere bewegen kan ons
helpen om deze paden in de toekomst te voorkomen of te minimaliseren. Door de moleculaire
basis voor de verschillende vatbaarheid van soorten te verduidelijken, kunnen ook de verschillen
in vatbaarheid in verschillende subgroepen van de mens aan het licht komen.

Zeer recentelijk publiceerden Shi et al. de resultaten van experimenten om de gevoeligheid voor
20
SARS-CoV-2 van fretten, katten, honden en andere gedomesticeerde dieren te bepalen. Ze
toonden aan dat het SARSCoV-2-virus zich slecht vermenigvuldigt bij honden, varkens, kippen
en eenden, maar dat fretten en katten zich niet laten infecteren. Andere studies hebben de
gevoeligheid van andere diersoorten voor SARS-CoV-2.17,20,21 gerapporteerd Gevoelige soorten
zoals makaken, hamsters en fretten worden gebruikt als diermodellen voor SARS-CoV-2-
22-24
infectie. Bij gebrek aan gezuiverde, geïsoleerde ACE2 van alle relevante diersoorten die
gebruikt zouden kunnen worden om de moleculaire affiniteiten voor spike proteïne
experimenteel te meten, bieden computermethoden een aanzienlijke belofte voor het bepalen van
de rangorde van affiniteiten tussen soorten, als een methode om aan te geven welke soorten
permissief zijn voor SARS-CoV- 2.

Hier laten we zien hoe computationele chemie methoden van structuur-gebaseerde drug design
kunnen worden gebruikt om de relatieve bindingsaffiniteiten van het SARS-CoV-2 spike eiwit
voor zijn receptor, angiotensine converterend enzym (ACE)-2, een kritische initiërende
gebeurtenis voor SARS-CoV-2 infectie, te bepalen over meerdere veelvoorkomende en exotische
25-27
diersoorten. Het doel van deze studies was om de soortspecifieke aard van deze interactie
beter te begrijpen en te kijken of dit kan helpen om de oorsprong van SARS-CoV-2 en de
mechanismen voor de zoönotische overdracht ervan op te helderen.
Materialen en methoden
Homologiemodellering van structuren
Om de driedimensionale structuur van het SARS-CoV-2-piek eiwit te construeren, werd de
sequentie opgehaald uit de NCBI Genbank Database (toetredingsnummer YP_009724390.1). Een
PSI-BLAST zoekopdracht tegen de PDB Database voor sjabloon selectie werd uitgevoerd en de
X-ray structuur van SARS coronavirus spike sjabloon (refcode 6ACC) werd geselecteerd met
76,4% sequentie gelijkenis met SARS-CoV-2 spike eiwit. De eiwitsequenties van de ACE2-
eiwitten voor verschillende soorten is samengevat in tabel 11 en volledige sequentie-uitlijning in
aanvullende figuur 1. De fylogenetische boom voor ACE2 eiwitten van geselecteerde diersoorten
wordt geïllustreerd in Aanvullende Figuur 2. De 3D-structuren zijn gebouwd met behulp van
Modeller 9.21 (https://salilab.org/modeller/). 28 De kwaliteit van de gegenereerde modellen werd
geëvalueerd met behulp van de GA341-score en de DOPE-score, en de modellen werden
beoordeeld met behulp van de SWISS-MODEL-structuurbeoordelingsserver.
(https://swissmodel.expasy.org/assess). 29

Voorbereiding van de eiwitstructuur

De röntgenkristalstructuren van het menselijke ACE2 (recode 3SCI) en het menselijke SARS
spike eiwit (refcode 5XLR) werden uit de Protein Data Bank gehaald. Eiwitvoorbereiding en
verwijdering van niet-essentiële en niet-overbruggende watermoleculen voor docking studies
werden uitgevoerd met behulp van het UCSF Chimera-pakket
(https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/). 30

Moleculaire dokken
Deze gemodelleerde structuren werden met behulp van de HDOCK-server
31,32
(http://hdock.phys.hust.edu.cn/) tegen de SARS-CoV-2 spike eiwitstructuur aangekoppeld.
Moleculaire docking werd uitgevoerd op de homologie gemodelleerd SARS-CoV-2 spike eiwit
met menselijke en dierlijke ACE2 eiwitten. Het SARS-CoV spike eiwit werd ook gedokt met
humaan ACE2 eiwit om de docking te verkrijgen voor bindende energieberekeningen. De
docking poses werden gerangschikt met behulp van een op energie gebaseerde scorefunctie. De
aangedockte structuren werden geanalyseerd met behulp van UCSF Chimera software.

Moleculaire Dynamica Simulatie

De uiteindelijke modellen werden geoptimaliseerd met behulp van het AMBER99SB-ILDN-
krachtveld in Gromacs2020.
 33
(http://www.gromacs.org/). Docked complexen (SARS-CoV-2 spike met menselijke ACE2,
menselijke SARS-CoV spike met menselijke ACE2, SARS-CoV-2 spike met vleermuis ACE2
etc) werden gebruikt als startgeometrie voor MD-simulaties. De simulaties werden uitgevoerd
met de GPU-versnelde versie van het programma met het AMBER99SB-ILDN-krachtveld I
periodieke randvoorwaarden op een Oracle Cloud Server. Docked complexen werden
ondergedompeld in een afgeknotte octaëderbox van TIP3P watermoleculen. De opgeloste doos
werd verder geneutraliseerd met Na+ of Cl- teller ionen met behulp van het tleap programma.
Deeltjesnetwerk Ewald (PME) werd gebruikt om de lange afstand elektrostatische interacties te
berekenen. De cut-off afstand voor de lange afstand van der Waals (VDW) energie termijn was
12,0 Å. Het hele systeem werd zonder enige beperking geminimaliseerd. De bovenstaande
stappen pasten 2500 cycli van steilste afdalingsminimalisatie toe, gevolgd door 5000 cycli van
conjugaatgradiëntminimalisatie. Na de optimalisatie van het systeem werden de MD-simulaties
gestart door elk systeem in het NVT-ensemble geleidelijk te verwarmen van 0 tot 300 K voor 50
pk met behulp van een Langevin-thermostaat met een koppelingscoëfficiënt van 1,0/ps en met een
krachtconstante van 2,0 kcal/mol-Å2 op het complex. Tot slot werd een productieserie van 100
stuks MD-simulatie uitgevoerd onder een constante temperatuur van 300 K in het NPT-ensemble
met periodieke grenscondities voor elk systeem. Tijdens de MD-procedure werd het SHAKE-
algoritme toegepast voor de beperking van alle covalente bindingen met waterstofatomen. De
tijdstap werd ingesteld op 2 fs. De structurele stabiliteit van het complex werd gecontroleerd door
de RMSD- en RMSF-waarden van de ruggengraatatomen van het gehele eiwit. Tenslotte werden
de vrije bindingsenergieën berekend voor alle gesimuleerde aangedockte structuren.
Berekeningen werden ook uitgevoerd voor maximaal 500 ns op menselijke ACE2 om ervoor te
zorgen dat 100 ns voldoende lang is voor de convergentie. Duplicaat productie runs, beginnend
met verschillende willekeurige zaden, werden ook uitgevoerd om schattingen van de
bindingsenergie onzekerheden te kunnen bepalen voor de sterkste bindende ACE2 structuren.

MM-PBSA bindend vrije-energieonderzoek

De bindende vrije energieën van de eiwit-eiwitcomplexen werden op twee manieren geëvalueerd.
De traditionele methode is het berekenen van de energieën van opgeloste SARS-CoV-2 spike en
ACE2 eiwitten en die van de gebonden complexe eiwitten en het afleiden van de bindingsenergie
door aftrekking.

ΔG (bindend, aq) = ΔG (complex, aq) - (ΔG (piek, aq) + ΔG (ACE2,aq)

(1))
We hebben ook bindingsenergieën berekend met behulp van de moleculaire mechanica Poisson
Boltzmann oppervlakte (MM-PBSA) tool in GROMACS die is afgeleid van de niet-gebonden
34,35
interactie-energieën van het complex. De methode is ook een veelgebruikte methode voor
het binden van vrije energieberekeningen. De bindingsvrije energieën van de eiwitcomplexen
werden tijdens de evenwichtsfase geanalyseerd uit de outputbestanden van 100 ns MD-
simulaties. De g_mmpbsa tool in GROMACS werd gebruikt na moleculaire dynamica simulaties,
de verkregen outputbestanden werden gebruikt om de vrije energieën te binden met de single-
trajectory MM-PBSA methode. Specifiek voor een niet-covalente bindingsinteractie in de
waterige fase is de bindingsvrije energie, ΔG (bind,aq),: -

ΔG (binden,aqu) = ΔG (binden,vac) + ΔG (bind,solv) (2)

waarbij ΔG (bind,vac) de bindende vrije energie in vacuüm is en ΔG (bind,solv) de

oplosmiddelvrije energieverandering bij binding: –

ΔG (binding,solv) = ΔG (R:L, solv) - ΔG (R,solv) - ΔG (L,solv) (3)

waarbij ΔG (R:L,solv), ΔG (R,solv) en ΔG (L,solv) respectievelijk oplosmiddelvrije energieën van

complex, receptor en ligand zijn.

Ook werden door MM-PBSA ontledingsanalyses van vrije energie uitgevoerd om een
gedetailleerd inzicht te krijgen in de interacties tussen het ligand en elk residu in de
bindingsplaats. De bindingsinteractie van elk ligand-residupaar omvat drie termen: de van der
Waals bijdrage, de elektrostatische bijdrage en de solvatatiebijdrage.

Interactie-energie
Een andere schatting van de sterkte van de interactie tussen eiwit-eiwitcomplex kan worden
verkregen uit de niet-gebonden interactie-energie tussen het complex. GROMACS heeft het
vermogen om de niet-gebonden energieën op korte afstand te ontbinden tussen een willekeurig
aantal gedefinieerde groepen. Om de interactie-energieën te berekenen als onderdeel van onze
analyse, herberekenen we de tijdens de simulatie verkregen trajectbestanden om de energieën te
herberekenen met behulp van -rerun commando. De interactie-energie is de
combinatie van Coulombische interactie-energie op korte afstand (Coul-SR: Eiwit-Proteïne) en
de Lennard-Jones energie op korte afstand (LJ-SR: Eiwit-Proteïne (zie tabel 3).

Terwijl dit document werd voorbereid, beschreef een document van Guterres en Im een
aanzienlijke verbetering in eiwit-ligand docking resultaten met behulp van high-throughput MD
36
simulaties. Ze gebruikten docking met behulp van AutoDock Vina, gevolgd door MD-
simulatie met behulp van CHARMM. De parameters die zij bepleitten waren zeer vergelijkbaar
met de parameters die in onze studie werden gebruikt. Eiwitten werden opgelost in een doos met
TIP3P watermoleculen die 10 Å verder reiken dan de eiwitten en de deeltjes-mesh Ewald
methode werd gebruikt voor elektrostatische interacties. Niet-gebonden interacties meer dan 10
en 12 Å werden afgekapt. Hun systemen werden geminimaliseerd voor 5000 stappen met behulp
van de steilste afdaling methode, gevolgd door 1 ns evenwicht met een NVT instelling. Voor elk
eiwit-ligand complex, liepen ze 3
× 100 ns productie loopt vanuit dezelfde beginstructuur met verschillende beginsnelheden
random zaden en een integratiestapgrootte van 2 fs.

Resultaten
De voorouders van SARS-CoV-2 sporen terug naar de menselijke, civet- en vleermuis SARS-
CoV-stammen, die allemaal dezelfde ACE2-eiwitten gebruiken voor de cellulaire ingang. 37-39 De
overeenkomsten en variaties in de sequenties voor zowel het SARS-CoV-2 spike eiwit als het
SARS spike eiwit werden bepaald aan de hand van sequenties die uit de NCBI GenBank
Databank werden gehaald en uitgelijnd met behulp van CLUSTALW. De spike eiwit receptor
bindend domein (RBD) regio toonde een 72% identiteit tussen de twee virussen (figuur 1).
Figuur 1. SARS en SARS-CoV-2 receptor bindende domeinsequentie uitlijning met
geconserveerde gebieden in zwart en niet-conserveerde residuen in rood en blauw.

Spike Protein-ACE2 interactie

De gebruikte driedimensionale structuur van SARS-CoV-2 Spike proteïne (Figuur 2) was PDB
refcode 6VXX. ACE2 is de receptor voor SARS-CoV-2 en is nodig voor zijn cellulaire ingang.
De lage affiniteitsbinding van SARS spike eiwit voor muis ACE2 is gepostuleerd als de reden dat
muizen grotendeels niet gevoelig zijn voor SARS infectie. Ook hebben we gepostuleerd dat
variatie in ACE2 tussen soorten de affiniteit van binding van SARS-CoV-2 Spike eiwit kan
bepalen en dus bepalen welke soorten tolerant zijn voor SARS-CoV-2 infectie. De volgorde
uitlijning van de geselecteerde ACE2 soorten wordt weergegeven in Aanvullende Figuur 1 en de
fylogenetische boom die de verwantschap van ACE2-eiwitten over geselecteerde diersoorten
toont wordt geïllustreerd in Aanvullende Figuur 2. ACE2 gemodelleerde structuren werden
gegenereerd voor elke relevante soort en degenen met de laagste DOPE (Discrete
Geoptimaliseerde Eiwit Energie) score werden gekozen en verfijnd door energie te
minimaliseren en gebruikt voor verdere analyse.

Figuur 2. 3D-structuur van SARS-CoV-2 spike proteïne (PDB refcode 6VXX)

De Ramachandran scores van de gemodelleerde ACE2 structuren voor geselecteerde soorten zijn
samengevat in Tabel 1 met de werkelijke voorspelde ACE2 structuren en Ramachandran plots
voor elke geselecteerde soort weergegeven in Aanvullende Figuur 3.

Tabel 1. Ramachandran scores voor ACE2 gemodelleerde structuren voor geselecteerde soorten
Soorten MolProbity Score Ramachandran Score
(begunstigd gebied)
Rhinolophus sinicus (vleermuis) 2.45 97.8%
Musculus (muis) 2.49 98.2%
Mustela putorius furo (fret) 2.5 98.3%
Mesocricetus auratus (hamster) 2.59 98.7%
Felis catus (kat) 2.42 98.5%
Pagumalarvata (civet) 2.52 97.3%
Macaca fascicularis (aap) 2.59 98.2%
Manis javanica (schubdier) 2.42 98.3%
Ophiophagus hannah 2.93 96.0%
(koningscobra)
Canis lupus familiaris (hond) 2.9 97.1%
Equus caballus (paard) 2.29 96.3%
Panthera tigris altaica (tijger) 2.25 96.6%
Bos Taurus (vee) 2.70 96.2%

De driedimensionale structuren van de ACE2-receptor van geselecteerde soorten werden

gecreëerd met behulp van Modeller9.23. De templates die gebruikt zijn om de verschillende
ACE2 structuren te modelleren waren 1R42 (humane ACE2), 3CSI (glutathion transferase) en
3D0G (spike protein receptor-bindend domein van de 2002-2003 SARS coronavirus menselijke
stam) (Tabel 2). Overeenstemming van de template en query is belangrijk bij het bouwen van het
model, de query volgorde van Macaca fascicularis (aap) toetredingsnummer A0A2K5X283
bleek 96,9% vergelijkbaar met de structuur van de menselijke ACE2 (PDB id: 1R42), terwijl
Ophiophagus hannah (koningscobra) had een veel lagere gelijkenis van 61,42% met de template,
1R42 (Tabel 2). Alle structuren werden onderworpen aan energieminimalisatie en
De structuren met de laagste DOPE-score zijn geselecteerd voor verder onderzoek (aanvullend
figuur 3).

Tabel 2. Sjabloonstructuren die worden gebruikt voor het modelleren van geselecteerde ACE2-
soorten en gelijksoortige scores van elke ACE2-sequentie met de geselecteerde sjabloon die wordt
gebruikt

Soorten Toetredingsnum Sjabloon Gelijkaard

mer. igheid
Rhinolophus sinicus (Vleermuis) AGZ48803.1 3CSI 79.73%
Musculus (Muis) Q8R0I0 1R42 84.27%
Mustela putorius furo (Ferret) Q2WG88 1R42 83.44%
Mesocricetus auratus (hamster) A0A1U7QTA1 1R42 87.58%
Felis catus (Kat) Q56H28 1R42 85.93%
Canis luparis (Hond) J9P7Y2 1R42 84.93%
Pagumalarvata (Ccivet) Q56NL1 3D0G 86.77%
Macaca fascicularis (Aap) A0A2K5X283 1R42 96.91%
Manis javanica (Schubdier) XP_017505752.1 1R42 85.57%
Ophiophagus hannah V8NIH2 1R42 61.42%
(koningscobra)
Equus caballus (Paard) F6V9L3 6MI7 85.91%
Panthera tigris altaica (Tijger) XP_007090142.1 6MI7 85.91%
Bos taurus (Koe) NP_001019673.2 6MI7 80.30%

Structurele kwaliteitsbeoordeling
De gemodelleerde structuren werden verder beoordeeld voor kwaliteitscontrole met behulp van
Ramachandran Plot en molprobiteitsscores in de SWISSM-modelstructuurbeoordeling. De
Ramachandran Plot controleert de stereochemische kwaliteit van een eiwit door het analyseren
van residu-bij-residu geometrie en algemene structuur geometrie, is ook een manier om
energetisch toegestane regio's te visualiseren voor backbone dihedral hoeken ψ tegen φ van
aminozuurresiduen in de eiwitstructuur. De Ramachandran score van SARS-CoV-2 spike eiwit
was 90% in de bindende regio en molprobiteitsscores die een evaluatie van de kwaliteit van het
model op zowel het globale als het lokale niveau geven was 3,17. Verder werden de ACE2
gemodelleerde structuren van geselecteerde soorten ook beoordeeld met behulp van Zwitserse
modelstructuurbeoordeling. Ramachandran
score of het percentage aminozuurresiduen dat in het energetisch bevoorrechte gebied valt voor
alle soorten varieert van 96-99% (tabel 1). Deze Ramachandran en Molprobity scores laten zien
dat alle gebouwde constructies van goede kwaliteit waren en geschikt waren voor gebruik in
verdere studies. De Ramachandran grafieken zijn weergegeven in Aanvullende Figuur 3.

Moleculaire Docking analyse

Het Receptor Binding Domain (RBD) van SARS-CoV-2 spike proteïne werd met behulp van
HDOCK server tegen ACE2 receptor van verschillende soorten aangemeerd. De op elkaar
inwerkende residuen van ACE2 en SARSCoV-2 spike proteïne zijn weergegeven in tabel 3. We
vonden bepaalde belangrijke aminozuren in het receptorbindende motief (RBM) die in
overeenstemming waren met eerdere studies40. Bepaalde aminozuren waaronder PHE28,
ASN330, ASP355 en ARG357 werden geconserveerd in ACE2 van de meeste geselecteerde
soorten en werden waargenomen om deel te nemen aan de interactie met spike proteïne. TYR41,
LYS353, ALA386 en ARG393 hadden ook een wisselwerking met spike proteïneresiduen en
werden in hoge mate geconserveerd in alle soorten behalve vleermuis, muis, fret en schubdier,
respectievelijk. Spike eiwitresten die in wisselwerking staan met Ophiophagus hannah
(koningscobra) kwamen het minst vaak voor bij alle ACE2-soorten die in de studie zijn
opgenomen, in overeenstemming met zijn lage sequentie-achtige gelijkenis met het menselijke
ACE2.
 Tabel 3. Eiwit dat in geselecteerde ACE2-soorten op elkaar inwerkt wanneer het wordt gedokt met SARS-CoV-2-piepeiwit. Residuen die
gemeenschappelijk zijn voor op elkaar inwerkende spijkereiwitten in menselijk ACE2 worden rood gelabeld.

Toetredin
Positie
gsnumme
Soorten
r
19 24 27 28 30 31 34 37 38 41 42 79 83 330 353 393

Homo sapiens (Mens) Q9BYF1 S Q T F D K H E D Y Q L Y N K R

Macaca fascicularis (Aap) A0A2K5X283 S Q T F D K H E D Y Q L Y N K R

Rhinolophus sinicus (Vleermuis) U5WHY8 S E M F D K T E D H Q L Y N K R

Mustela putorius furo (Ferret) Q2WG88 D L T F E K T E E Y Q - Y N K R

Manis javanica (Schubdier) - E T F E K S E E Y Q I Y N K R

XP_017505752.1

Ophiophagus hannah (Slang) ETE61880,1 Q V K F E Q A - D Y N N F N L R

Canis luparis (Hond) J9P7Y2 - L T F E K Y E E Y Q L Y N K R

Mesocricetus auratus (hamster) A0A1U7QTA1 S Q T F D L Q E D Y Q L Y N K R

Panthera tigris (Tijger) XP_007090142.1 S L T F D K H E E Y Q L Y K K R

Bos Stier (Koe) NP_001019673.2 S Q T F E K H E D Y Q M Y N K R

Musculus (Muis) Q8R0I0 S N T F N N Q E D Y Q Y F N K R

Pagumalarvata (Civet) Q56NL1 S L T F E K Y E Q Y Q L Y N K R

Felis catus (Kat) Q56H28 S L T F E K H E E Y Q L Y N K R

Equus ferus caballus (Paard) F6V9L3 S L T F D K S E E H Q L Y N K R

Simulaties van moleculaire dynamica

De moleculaire dynamica simulatie van complexen van SARS-CoV-2 spike proteïne en ACE2 receptoren van verschillende soorten werden
uitgevoerd voor 100ns. Alle complexen werden stabiel tijdens de simulatie met RMSD-fluctuaties die convergeren naar een bereik van 0.5 tot
0.8 nm van de oorspronkelijke positie. De berekende bindingsenergieën voor de interacties van SARS-CoV-2 met ACE2 van de bestudeerde
soorten zijn weergegeven in tabel 4. De MMPBSA-bindingsenergieën zijn samengevat ter vergelijking. De energieën berekend met vergelijking
1 en die van het MMPBSA-algoritme correleren sterk (r2=0,92). De bindingsenergieën (tabel 2) correleren slecht met de sequentiegelijkenis
(r2=0,27). Ook getoond is de waargenomen en voorspelde SARS-CoV-2 susceptibiliteit van de soort uit analyse van fylogenetische clustering en
sequentie afstemming met momenteel bekende ACE2s gebruikt door SARS-CoV-2, zoals beschreven door Qiu et al. 41 (Aanvullende Figuur 2)
Ook vermeld is de interactie energieën van de spike en ACE2 eiwitten voor elke soort berekend door Wu et al. met behulp van een automatische
docking-methode, ICM-Pro42. Tabel 4 bevat ook observationele in vivo gegevens over SARS-CoV-2 infectiviteit en ziektesymptomen bij de
soorten waar dit is gemeld.
Tabel 4. Bindende energieën van SARS-CoV-2 spijkereiwit aan ACE2 van geselecteerde soorten en potentiële soortengevoeligheid uit andere studies
Soorten Bindende MMPBSA COVID-besmettelijkheid n.v.t.
energie energie kcal/mol = niet beoordeeld
kcal/mol
Homo sapiens (mens) -52.8 -57.6 Toegestane, hoge besmettelijkheid, ernstige
ziekte in 5-10%,
Manis javanica (schubdier) -52.0 -56.5 Toegestane

Canis luparis (hond) -50.8 -49.5 Toegestane, lage besmettelijkheid, geen

openlijke ziekte
Macaca fascicularis (aap) -50.4 -50.8 Toegestane, gemiddelde besmettelijkheid,
longziekte
Mesocricetus auratus (hamster) -49.7 -50.0 Toegestane, hoge besmettelijkheid,
longziekte
Mustela putorius furo (fret) -48.6 -49.2 Toegestane, gemiddelde besmettelijkheid,
milde ziekte
Felis catus (kat) -47.6 -48.9 Toegestane, hoge besmettelijkheid,
longziekte
Panthera tigris (tijger) -47.3 -42.5 Toegestane, openlijke
ademhalingssymptomen
Rhinolophus sinicus (vleermuis) -46.9 -49.6 n.v.t.

Pagumalarvata (civet) -45.1 -46.1 n.v.t.

Equus ferus caballus (paard) -44.1 -49.2 Toegestane, lage besmettelijkheid, geen
openlijke ziekte
Bos taurus (koe) -43.6 -42.5 n.v.t.

Ophiophagus hannah (slang) -39.5 -52.5 n.v.t.

Musculus (muis) -38.8 -39.4 n.v.t.
Bespreking
Het is zeer belangrijk om te weten welke soort SARS-CoV-2 toelaatbaar is, zowel met betrekking
tot het identificeren van tussengastheren en de potentiële bron van het oorspronkelijke virus, als om
te helpen bij het identificeren van geschikte soorten voor gebruik als besmettingsmodel om het
testen van COVID-19-medicijnen en vaccins mogelijk te maken. Het rechtstreeks testen van een
breed scala aan soorten op gevoeligheid voor het virus is moeilijk en tijdrovend, en in het geval van
zeer zeldzame soorten is het misschien niet eens uitvoerbaar. Een minder directe methode om te
proberen dezelfde informatie te verkrijgen kan het meten van de bindingsaffiniteit van het
SARSCoV-2 spike eiwit met de doelwit ACE2-receptor van verschillende soorten inhouden. Dit
kan bijvoorbeeld worden gedaan door het gebruik van cellijnen die getransfecteerd zijn met ACE2-
receptoren van elke afzonderlijke soort, maar dit zou weer tijdrovend en niet uitvoerbaar zijn. Een
derde benadering, die hier wordt gehanteerd, is het gebruik van snelle, efficiënte in silico structurele
modellering en docking algoritmes, met behulp van beschikbare genomische en structurele
biologiegegevens, om relevante ACE2 structurele modellen te genereren en de moleculaire
dynamica te gebruiken om de bindingsenergieën te berekenen. Deze aanpak onthulde verrassend
genoeg dat de bindingsenergie tussen SARS-CoV-2 spike proteïne en ACE2 het hoogst was voor
mensen van alle geteste soorten, wat suggereert dat SARS- CoV-2 spike proteïne uniek geëvolueerd
is om cellen te binden en te besmetten die menselijke ACE2 uitdrukken. Deze bevinding is vooral
verrassend omdat, typisch, een virus zou worden verwacht om de hoogste affiniteit voor de receptor
in zijn oorspronkelijke gastheer soort, bijvoorbeeld vleermuis, met een lagere initiële bindende
affiniteit voor de receptor van een nieuwe gastheer, bijvoorbeeld de mens te hebben. In dit geval is
de affiniteit van SARS-CoV-2 echter hoger voor de mens dan voor de vermeende oorspronkelijke
gastheersoort, vleermuizen, of voor elke potentiële intermediaire gastheersoort.

De berekende bindingsenergieën van SAR-Cov2 spike proteïne met ACE2 van geselecteerde
soorten zijn over het algemeen in overeenstemming met de relatief beperkte hoeveelheid
gepubliceerde informatie. De bindende affiniteit van SAR-Cov2 met aap ACE2 was lager dan bij
het menselijke ACE2. Jonge cynomolgusapen wanneer geïnfecteerd uitgedrukt virale RNA in
neusswabs, maar ontwikkelden geen openlijke klinische symptomen, terwijl oude dieren vertoonden
hogere virale RNA-belasting en wat gewichtsverlies en snelle ademhaling geassocieerd met matige
23,48
interstitiële longontsteking en virusreplicatie in de bovenste en onderste luchtwegen. Syrische
hamsters en fretten zijn zeer gevoelig voor SARS-CoV-infectie en worden gebruikt als
diermodellen van de ziekte. Mahdy publiceerde een voordruk die de SARS-CoV-2-besmetting bij
dieren herziet en stelde voor dat SARS-CoV-2 ACE2 zou kunnen herkennen uit een
verscheidenheid aan diersoorten, waaronder palmburgers, de tussengastheer voor SARS-CoV. 45

Hoewel vleermuizen veel coronavirussen dragen, waaronder SARS-CoV, is er geen direct bewijs
voor het bestaan van SARS-CoV-2 in vleermuizen gevonden. Zoals uit onze gegevens blijkt, is de
bindende kracht van SARS-CoV-2 voor vleermuis ACE2 aanzienlijk lager dan voor menselijk
ACE2, wat suggereert dat zelfs als SARS-CoV-2 oorspronkelijk voortkomt uit een
vleermuisprecursor het later moet hebben
zijn spike eiwit aangepast om de binding met het menselijke ACE2 te optimaliseren. Er is geen
actuele verklaring voor hoe, wanneer of waar dit zou kunnen gebeuren. Gevallen van directe
menselijke infectie door coronavirussen of andere vleermuisvirussen zijn zeldzaam, waarbij meestal
een tussengastheer betrokken is. Zo worden bijvoorbeeld lyssavirussen zoals Hendra periodiek
overgedragen van vleermuizen op paarden en vervolgens op mensen die in contact komen met het
besmette paard. Op dezelfde manier werd aangetoond dat SARS-CoV wordt overgedragen van
vleermuizen op civetkatten en van hen op mensen. Tot op heden is een virus dat identiek is aan
SARS-CoV-2 niet geïdentificeerd bij vleermuizen of andere niet-menselijke soorten, waardoor de
oorsprong ervan onduidelijk is. Tot op heden is het coronavirus dat het nauwst verwant is aan
SARS-CoV-2, het vleermuiscoronavirus, BatCoV RaTG1, dat voor 96% een volledig genoom heeft
voor SARS-CoV-2.50. Het feit dat SARS-CoV-2 ook niet is gevonden in een waarschijnlijke
tussengastheer doet vragen rijzen over de oorsprong van het oorspronkelijke SARS-CoV-2-virus dat
eind 2019 het menselijke geval nul besmette. Wuhan, het epicentrum van de uitbraak, is de enige
gastheer van China's enige BSL4-faciliteit en is de plaats waar veel onderzoek naar het coronavirus
van vleermuizen wordt gedaan. Identificatie van een tussenliggende diergastheer waarbij SARS-
CoV-2 zich mogelijk heeft aangepast aan een menselijke ACE2 permissieve vorm zou de
bezorgdheid over het feit dat SARS-CoV-2 geen natuurlijk virus is, in hoge mate wegnemen. Lam
et al. 44 maakten verwarde publieke beweringen over het vinden van SARS-CoV-2 in Maleisische
schubdieren, wat suggereert dat schubdieren een tussenliggende vector voor SARS-CoV-2 zijn.
Echter, verdere sequentieanalyse van deze claims door Zhang et al. stelde vast dat schubdier-CoV
een zeer verschillend coronavirus was dat in het beste geval een bescheiden ~90%
sequentiegelijkenis met SARS-CoV-2 had. Terwijl PangolinCoV spike RBD enkele
overeenkomsten met SARS-CoV-2 deelde, de spike eiwit niet de furine splitsing site die een
prominente functie van SARS-CoV-2 spike eiwit. 51 Daarom was elke gelijkenis van schubdier-CoV
met SARS-CoV-2 beperkt tot de residuen in het RBD en RBM. Over het geheel genomen is
schubdier-CoV slechts een ver familielid van SARS-CoV- 2.

Op basis van onze gegevens, de gelijkenis van schubdier-CoV met SARS-CoV-2 in het spike RBM
zou een geval van convergente evolutie van de twee virussen kunnen zijn, waarbij de nauwe
gelijkenis van de structuur van het schubdier ACE2 spike binding domein (SBD) naar dezelfde
regio van het menselijk ACE2, dreef de convergente evolutie van het spike eiwit RBD van beide
virussen, waardoor ze te binden aan schubdier en menselijk ACE2, respectievelijk. Een dergelijke
nauwe gelijkenis van schubdier en menselijk ACE2 SBD zou het gemakkelijk kunnen maken voor
elke schubdier CoV om van schubdier naar mens over te steken. Niettemin, met geen enkel virus dat
overeenkomt met de SARS-CoV-2-sequentie die in schubdieren wordt geïdentificeerd, maakt dit het
minder waarschijnlijk dat SARSCoV-2 een schubdierachtige oorsprong heeft. Dit vraagt echter wel
om een intensiever onderzoek naar coronavirussen in schubdierpopulaties, mochten dergelijke
virussen in de toekomst een menselijke pandemie bedreigen. Deze bevinding ondersteunt ook de
noodzaak van een strikte handhaving van een wereldwijd verbod op de handel in schubdieren om
het risico te verminderen dat schubdiervirussen de mens oversteken en een trigger worden voor een
toekomstige pandemie van het coronavirus.
Er is echter nog steeds een gebrek aan bewijs om aan te geven dat SARSCoV-2 een van schubdieren
afgeleid virus is dat eind 2019 voor het eerst van schubdieren naar mensen is overgestoken.

In het begin van de COVID-19-uitbraak werd gesuggereerd dat slangen een tussenliggende vector
kunnen zijn. ACE2 van schildpad en slang heeft een zeer lage homologie met het menselijke ACE2
en SARS-CoV-2 bleek niet te binden aan het reptielen ACE2, waardoor het onwaarschijnlijk is dat
46
slangen als mogelijke gastheer voor SARS-CoV-2 zullen optreden. Dit is in overeenstemming
met onze eigen gegevens die een matige tot lage binding van SARS-CoV-2 aan slang ACE2
voorspellen. Knaagdieren varieerden sterk in hun tolerantie ten opzichte van SARS-CoV, waarbij
muizen resistent zijn en hamsters tolerant. Ook is er inefficiënte virusreplicatie van SARS-CoV-2
bij muizen waardoor ze ongeschikt zijn als model voor het testen van SARS- of COVID-19-vaccins
of geneesmiddelen. 47 Dit weerspiegelt de laag voorspelde bindingsenergie van SARS-CoV-2 spike
proteïne voor muis ACE2, zoals aangetoond door onze modelgegevens. Muizen werden pas tolerant
voor SARS-besmetting wanneer ze transgenetisch werden gemaakt voor menselijk ACE2, met
dezelfde waarschijnlijkheid voor SARS-CoV-2. Hamsters daarentegen waren zeer tolerant voor
SARS-CoV-infectie. Ons model voorspelde dat hamsters tolerant zouden moeten zijn voor een
SARS-CoV-2 infectie, gebaseerd op de voorspelde sterke binding van SARS-Cov-2 spijkereiwit
voor hamster ACE2 (Tabel 4). In overeenstemming met onze modelgegevens is aangetoond dat
Syrische hamsters klinische en histopathologische reacties op SARS-CoV-2 vertonen die nauw
aansluiten bij menselijke infecties van de bovenste en onderste luchtwegen, met een hoge
24
virusuitscheiding en het vermogen tot overdracht op naïeve contactdieren. Fretten waren een
ander permissief model van SARS-CoV-infectie, en onze modelgegevens gaven aan dat SARS-
CoV-2 een gelijkaardige bindingsenergie heeft als fret, net als hamster, ACE2 (tabel 4). In
overeenstemming met onze modelgegevens is aangetoond dat fretten tolerant zijn voor infectie met
SARS-CoV-2, met een hoge virustiter in de bovenste luchtwegen, virusafscheiding, geïnfecteerde
fretten met acute bronchiolitis, maar zonder ernstige ziekte of dood, en actieve overdracht naar
naïeve fretten door direct contact. 20,22

Kat en tijger ACE2 werden door ons model aangetoond dat ze een gelijkaardige bindende affiniteit
hebben voor SARS-CoV-2 spike proteïne en beide soorten hebben aangetoond dat ze tolerant zijn
voor SARS-CoV-2 infectie. Op dezelfde manier suggereren onze gegevens dat SARS-CoV-2 bindt
met matige affiniteit voor hond ACE2 wat suggereert dat honden vatbaar kunnen zijn voor infectie
met SARS-CoV-2. In het geval van gezelschapsdieren die in de nabijheid van mensen leven, stelt
Shen al. dat SARS-CoV-2 efficiënt kan worden overgedragen bij katten en honden, terwijl Shi et al.
vonden dat SARS-CoV-2 slecht reproduceert bij honden, varkens, kippen en eenden, maar dat
fretten en katten tolerant waren voor infectie. Temmam et al. testten 9 katten en 12 honden die in
nauw contact met hun eigenaars leefden, waarvan er twee positief testten op SARS-CoV-2 en 11
van 18 anderen klinische tekenen van COVID-19 vertoonden, maar geen antistoffen tegen SARS-
CoV-2 waren aantoonbaar in hun bloed met behulp van een immunoprecipitatietest. Goumeniu et al.
publiceerden een redactionele vraagstelling over de rol van honden bij de uitbraak van COVID-19
in Lombardije en adviseerden het gebruik van
 43
computationele docking experimenten om bewijs te leveren voor of tegen infectie van honden.
Vandaar dat onze modelgegevens suggereren dat hond ACE2 mogelijk permissief is voor SARS-
CoV-2-binding en dat de infectie dus consistent is met anekdotische meldingen van honden die
besmet zijn met SARS-CoV-2. Vandaar dat andere genetische factoren aan de basis kunnen liggen
van het schijnbare gebrek aan gevoeligheid van honden voor COVID-19 klinische infectie.

Het is bekend dat er bij virussen functiewijzigingen (GOF-mutaties) optreden die kunnen leiden tot
pandemieën. GOF betekent dat virussen een nieuwe eigenschap krijgen, bijvoorbeeld in het
influenzavirus dat GOF in verband wordt gebracht met het verkrijgen van een nieuwe functie, zoals
overdraagbaarheid van zoogdieren, verhoogde virulentie voor de mens of het omzeilen van de
bestaande immuniteit van de gastheer. 49 De conditionering van virussen voor de mens naarmate een
pandemie voortschrijdt, wordt algemeen erkend. De SARS-CoV-2-structuren en -sequenties die we
gebruikten, waren echter afkomstig van virussen die zeer vroeg in de pandemie werden verzameld.
Het is daarom niet duidelijk hoe SARS-CoV-2 zo'n hoge affiniteit voor menselijk ACE2 kan hebben
ontwikkeld, met name hoger dan die van vermeende zoönosebronnen voor SARS-CoV-2, tenzij het
eerder is geselecteerd op menselijk ACE2 of een ACE2 van een andere soort die een nauw
homoloog spike proteïnebindingsdomein heeft. Interessant is dat schubdier ACE2 in zijn SBD enige
overeenkomsten vertoont met menselijk ACE2. Dit gaat samen met het feit dat schubdier- CoV een
zeer gelijkaardige RBD deelt met SARS-CoV-2, hoewel hun resterende sequentie slechts 90%
gelijkenis vertoont. Dit zou consistent kunnen zijn met een proces van convergente evolutie waarbij
menselijke en schubdierachtige coronavirussen die via ACE2 infecteren, tot dezelfde oplossing zijn
gekomen met betrekking tot het ontwikkelen van een optimale spike RBD voor binding van
respectievelijk menselijke of schubdier ACE2. Onze gegevens wijzen er wel op dat de mens
permissief zou kunnen zijn voor pangolin CoV's die ACE2 gebruiken voor het invoeren van cellen,
een feit dat in gedachten moet worden gehouden met betrekking tot de toekomstige potentiële
bronnen van een coronavirus pandemie. Dit betekent echter niet dat schubdier ACE2 de receptor
was waarop de SARS-CoV-2 spike proteïne RBD in eerste instantie werd geselecteerd, met de
kracht van binding aan schubdier ACE2 lager dan binding aan menselijk ACE2. Dit maakt het
onwaarschijnlijk dat schubdieren de ontbrekende tussengastheer zijn. Als SARS-CoV-2 spike werd
geselecteerd op schubdier ACE2, dan zou, gezien de hogere affiniteit van SARS-CoV-2 voor
menselijk ACE2 dan voor vleermuis ACE2, SARS-CoV-2 gedurende een lange periode in
schubdieren moeten hebben gecirculeerd om deze evolutie en selectie te laten plaatsvinden en tot op
heden is er geen bewijs van een SARS-CoV-2-achtig virus dat in schubdieren circuleert.

Een andere mogelijkheid zou een korte termijn evolutionaire stap zijn waarbij een schubdier
recentelijk werd gecoïnfecteerd met een vleermuisvoorouder aan SARS-CoV-2 op hetzelfde
moment dat het werd geïnfecteerd door een schubdier CoV waardoor een recombinatie gebeurtenis
kan plaatsvinden waarbij de spike RBD van het schubdiervirus werd ingebracht in de vleermuis
CoV, waardoor de vleermuis CoV met een hoge binding voor zowel het schubdier als het menselijk
ACE2 wordt verkregen. Zulke recombinatie-events komen voor met andere RNA-virussen en
kunnen het ontstaan van sommige van deze virussen verklaren.
pandemische griepstammen49. Toch zijn dergelijke gebeurtenissen noodzakelijkerwijs zeldzaam,
omdat ze precies op hetzelfde moment een mede-besmetting van de ene gastheer vereisen. Het
belangrijkste is dat als een dergelijke recombinatie in schubdieren had plaatsgevonden, men had
kunnen verwachten dat het nieuwe, zeer tolerante SARS-CoV-2-achtige virus zich op dezelfde
manier had verspreid onder schubdierpopulaties, zoals we nu zien gebeuren in de hele menselijke
populatie. Op dit moment is er geen bewijs voor een dergelijke schubdier SARS-CoV-2-achtige
uitbraak, waardoor dit hele scenario minder waarschijnlijk is. Inderdaad, schubdieren zouden
kunnen worden beschermd tegen SARS-CoV-2 infectie als gevolg van het bestaan van
crossbeschermende spike RBD neutraliserende antilichamen veroorzaakt door blootstelling aan
schubdier CoV, gezien de RBD-gelijkaardigheid van deze twee virussen. Een andere mogelijkheid
die nog steeds niet kan worden uitgesloten is dat SARSCoV-2 is ontstaan door een
recombinatiegebeurtenis die onopzettelijk of bewust heeft plaatsgevonden in een laboratorium waar
met coronavirussen wordt gewerkt, waarbij het nieuwe virus vervolgens per ongeluk is vrijgekomen
in de lokale menselijke bevolking.

Gezien de ernst van de huidige SARS-CoV-2-pandemie is het absoluut noodzakelijk dat alles in het
werk wordt gesteld om de oorspronkelijke bron van het SARS-CoV-2-virus te achterhalen. Het zal
met name belangrijk zijn om vast te stellen of COVID-19 het gevolg is van een volledig natuurlijk
toeval waarbij een verondersteld vleermuisvirus via een tussengastheer van een dier op de mens is
overgedragen of dat COVID-19 een andere oorsprong heeft. Deze informatie zal van het grootste
belang zijn om een soortgelijke uitbraak van het menselijke coronavirus in de toekomst te helpen
voorkomen.

Erkenningen
We willen Harinda Rajapaksha bedanken voor de hulp bij het optimaliseren van Gromacs voor dit
project. We willen Oracle Corporation bedanken voor het leveren van hun Cloud computing-
resources via het Oracle for Research-programma voor de hierin beschreven modelstudies. In het
bijzonder willen we Peter Winn, Dennis Ward en Alison Derbenwick Miller bedanken voor het
faciliteren van deze toegang. S.P., P.K.S en N.P. worden ondersteund door het National Institute of
Allergy and Infectious Disease van de National Institutes of Health onder Contracts
HHSN272201400053C en HHSN272201800044C. De inhoud van deze publicatie valt uitsluitend
onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de
officiële standpunten van de bij hen aangesloten instellingen, financieringsorganen of Oracle
Corporation.

Referenties
1 Zhang, T. et al. Klinische studies voor de behandeling van de ziekte van Coronavirus 2019
 (COVID-19): Een snelle reactie op de dringende noodzaak. Sci China Life Sci, doi:
10.1007/s11427-020-1660-2 (2020).
2 Zhang, J. et al. Vooruitgang en vooruitzichten op de ontwikkeling van het vaccin tegen
SARS-CoV-2. Vaccins (Basel) 8, doi:10.3390/vaccins8020153 (2020).
3 Yavuz, S. & Unal, S. Antivirale behandeling van Covid-19. Turk J Med Sci, doi:
10.3906/sag2004- 145 (2020).
4 Whitworth, J. COVID-19: een snel evoluerende pandemie. Trans R Soc Trop Med Hyg 114,
241248, doi:10.1093/trstmh/traa025 (2020).
5 Dan Le, T. et al. Het COVID-19 vaccin ontwikkelingslandschap. Nat Rev Drug Discov,
doi:10.1038/d41573-020-00073-5 (2020).
6 Sohrabi, C. et al. Wereldgezondheidsorganisatie verklaart de wereldwijde noodtoestand:
Een overzicht van het nieuwe coronavirus van 2019 (COVID-19). Int J Surg 76, 71-76,
doi:10.1016/j.ijsu.2020.02.034 (2020).
7 Schlagenhauf, P., Grobusch, M. P., Maier, J. D. & Gautret, P. Herbestemming van
antimalaria en andere geneesmiddelen voor COVID-19. Travel Med Infect Dis, 101658,
doi:10.1016/j.tmaid.2020.101658 (2020).
8 Sanders, J. M., Monogue, M. L., Jodlowski, T. Z. & Cutrell, J. B. Pharmacologic Treatments
for Coronavirus Disease 2019 (COVID-19): A Review. JAMA,
doi:10.1001/jama.2020.6019 (2020).
9 Rosales-Mendoza, S., Marquez-Escobar, V. A., Gonzalez-Ortega, O., Nieto-Gomez, R. &
Arevalo-Villalobos, J. I. Wat biedt de Plant-Based Vaccine Technology voor de strijd tegen
COVID-19? Vaccins (Basel) 8, doi:10.3390/vaccins8020183 (2020).
10 Rosa, S. G. V. & Santos, W. C. Klinische studies over de herpositionering van geneesmiddelen
voor COVID-19 behandeling. Kz Panam Salud Pub 44, e40, doi:10.26633/RPSP.2020.40
(2020).
11 Olsen, M., Cook, S. E., Huang, V., Pedersen, N. & Murphy, B. G. Perspectieven: Potentiële
therapeutische opties voor SARS-CoV-2-patiënten Gebaseerd op strategieën voor
infectieuze buikvliesontsteking bij katten: Invasie van het centrale zenuwstelsel en
medicijngebruik. Int J Antimicrobiële middelen, 105964,
doi:10.1016/j.ijantimicag.2020.105964 (2020).
12 Mendes, A. Onderzoek naar de behandeling van COVID-19. Br J Community Nurs 25, 204-
205, doi:10.12968/bjcn.2020.25.4.204 (2020).
13 Lu, S. Tijdige ontwikkeling van vaccins tegen SARS-CoV-2. Emerg Microbes Infect 9, 542-
544, doi:10.1080/22221751.2020.1737580 (2020).
14 Jiang, S. Haast je niet om COVID-19 vaccins en medicijnen in te zetten zonder voldoende
veiligheidsgaranties. Natuur 579, 321, doi:10.1038/d41586-020-00751-9 (2020).
15 Ciotti, M. et al. COVID-19 Outbreak: Een overzicht. Chemother, 1-9,
doi:10.1159/000507423 (2020).
16 Berkley, S. COVID-19 heeft een grote wetenschappelijke aanpak nodig. Wetenschap, doi:
10.1126/science.abb8654 (2020).
17 Almendros, A. & Gascoigne, E. Kunnen gezelschapsdieren besmet raken met COVID-19?
Vet Rec 186, 419-420, doi:10.1136/vr.m1322 (2020).
18 Almendros, A. Kunnen gezelschapsdieren besmet raken met COVID-19? Vet Rec 186, 388-
389, doi:10.1136/vr.m1194 (2020).
19 Ahmad, T. et al. COVID-19: Zoonotische aspecten. Travel Med Infect Dis, 101607,
doi:10.1016/j.tmaid.2020.101607 (2020).
20 Shi, J. et al. Gevoeligheid van fretten, katten, honden en andere gedomesticeerde dieren
voor het SARScoronavirus 2. 2. Wetenschap, doi:10.1126/science.abb7015 (2020).
21 Temmam, S. et al. Afwezigheid van SARS-CoV-2 infectie bij katten en honden in nauw
contact met een cluster van COVID-19 patiënten op een veterinaire campus. bioRxiv (2020)
doi: 10.1101/2020.04.07.029090...
22 Kim, Y. I. et al. Infectie en snelle overdracht van SARS-CoV-2 in fretten. Cell Host
Microbe, doi:10.1016/j.chom.2020.03.023 (2020).
23 Yu, P. et al. Leeftijdsgebonden resusmakaakmodellen van COVID-19. Animal Model Exp
Med. , 1- 5, doi:10.1002/ame2.12108 (2020).
24 Chan, J. F. et al. Simulatie van de klinische en pathologische manifestaties van de ziekte van
het Coronavirus 2019 (COVID-19) in het gouden Syrische hamstermodel: implicaties voor
de pathogenese en de overdraagbaarheid van de ziekte. Clin Infect Dis,
doi:10.1093/cid/ciaa325 (2020).
25 Yan, R. et al. Structurele basis voor de erkenning van SARS-CoV-2 door full-length human
ACE2. Wetenschap 367, 1444-1448, doi:10.1126/science.abb2762 (2020).
26 Touyz, R.M., Li, H. & Delles, C. ACE2 het Janus-eiwit - van cardiovasculaire bescherming
tot ernstig acuut respiratoir syndroom-coronavirus en COVID-19. Clin Sci (Lond) 134, 747-
750, doi: 10.1042/CS20200363 (2020).
27 Shang, J. et al. Structurele basis van receptorherkenning door SARS-CoV-2. Natuur,
doi:10.1038/s41586-020-2179-y (2020).
28 Sali, A. & Blundell, T. L. Vergelijkende eiwitmodellering door tevredenheid over
ruimtelijke beperkingen. J Mol Biol 234, 779-815, doi:10.1006/jmbi.1993.1626 (1993).
29 Benkert, P., Biasini, M. & Schwede, T. Naar de schatting van de absolute kwaliteit van
individuele eiwitstructuurmodellen. Bioinform 27, 343-350,
doi:10.1093/bioinformatics/btq662 (2011).
30 Pettersen, E. F. et al. UCSF Chimera - een visualisatiesysteem voor verkennend onderzoek
en analyse. J Comput Chem 25, 1605-1612, doi:10.1002/jcc.20084 (2004).
31 Yan, Y., Zhang, D., Zhou, P., Li, B. & Huang, S. Y. HDOCK: een webserver voor eiwit-
eiwit en eiwit-DNA/RNA-docking op basis van een hybride strategie. Nucleaire Zuren Res
45, W365- W373, doi:10.1093/nar/gkx407 (2017).
32 Yan, Y., Tao, H., He, J. & Huang, S. Y. De HDOCK server voor geïntegreerde eiwit-eiwit
docking. Nat Protoc, doi: 10.1038/s41596-020-0312-x (2020).
33 Abraham, M. J. et al. GROMACS; Hoogwaardige moleculaire simulaties door middel van
multilevel parallellisme van laptops tot supercomputers. SoftwareX 1-2, 19-25 (2015).
34 Baker, N.A., Sept, D., Joseph, S., Holst, M.J. & McCammon, J.A. Electrostatica van
nanosystemen: toepassing op microtubuli en het ribosoom. Proc Natl Acad Sci USA 98,
10037-10041, doi:10.1073/pnas.181342398 (2001).
35 Kumari, R., Kumar, R., Open Source Drug Discovery, C. & Lynn, A. g_mmpbsa--een
GROMACS tool voor high-throughput MM-PBSA berekeningen. J Chem Inf Model 54,
19511962, doi: 10.1021/ci500020m (2014).
36 Guterres, H. & Im, W. Verbetering van de Protein-Ligand Docking resultaten met High-
Throughput Molecular Dynamics Simulaties. J Chemische Inf Model, doi:
10.1021/acs.jcim.0c00057 (2020).
37 Ge, X. Y. et al. Isolatie en karakterisering van een vleermuis SARS-achtig coronavirus dat
de ACE2-receptor gebruikt. Nature 503, 535-538, doi:10.1038/nature12711 (2013).
38 Li, W. et al. Angiotensine-converterend enzym 2 is een functionele receptor voor het SARS-
coronavirus. Nature 426, 450-454, doi:10.1038/nature02145 (2003).
39 Wan, Y., Shang, J., Graham, R., Baric, R. S. & Li, F. Receptor Recognition by the Novel
Coronavirus from Wuhan: een analyse gebaseerd op decennialange structurele studies van
het SARS Coronavirus. J Virol 94, doi:10.1128/JVI.00127-20 (2020).
40 Yuan, M. et al. Een hoog geconserveerd cryptisch epitoop in de receptor-bindende
domeinen van SARS-CoV-2 en SARS-CoV. Wetenschap, doi: 10.1126/science.abb7269
(2020).
41 Qiu, Y. et al. Voorspellen van het angiotensine omzettingsenzym 2 (ACE2) met behulp van
vermogen als de receptor van SARS-CoV-2. Microben Besmet,
doi:10.1016/j.micinf.2020.03.003 (2020).
42 Wu, C. et al. In Silico Analysis of Intermediate Hosts and Susceptible Animals of
SARSCoV- 2. ChemRxiv (2020) doi: 10.26434/chemrxiv.12057996.v1.
43 Goumenou, M., Spandidos, D. A. & Tsatsakis, A. [Redactioneel] Mogelijkheid van
overdracht via honden draagt bij aan de extreme uitbraak van Covid19 in Noord-Italië. Mol
Med Rep 21, 2293-2295, doi:10.3892/mmr.2020.11037 (2020).
44 Lam, T. T. et al. Identificatie van SARS-CoV-2-gerelateerde coronavirussen in Maleisische
schubdieren.
Natuur, doi: 10.1038/s41586-020-2169-0 (2020).
45 Mahdy, M. Een overzicht van SARS-CoV-2 en Animal Infection. Preprints (2020) doi:
10.20944/preprints202004.0192.v1.
46 Luan, J., Jin, X., Lu, Y. & Zhang, L. SARS-CoV-2 spike protein begunstigt ACE2 van
Bovidae en Cricetidae. J Med Virol, doi:10.1002/jmv.25817 (2020).
47 Bao, L. et al. De pathogeniteit van het nieuwe coronavirus van 2019 in hACE2 transgene
muizen. bioRxiv (2020) doi: 2020/2002.2007.939389.
48 Rockx, B. et al. Vergelijkende pathogenese van COVID-19, MERS en SARS in een niet-
menselijk primatenmodel. bioRxiv (2020) doi: 2020/2003.2017.995639.
49 Casadevall, A. & Imperiale, M. J. Risico's en voordelen van gain-of-function experimenten
met pathogenen van pandemisch potentieel, zoals het influenzavirus: een oproep voor een
wetenschappelijke discussie. mBio 5, e01730-01714, doi:10.1128/mBio.01730-14 (2014).
50 Zhou, P., Yang, X.-L., Wang, X.-G., Hu, B., Zhang, L., Zhang, W., Si, H.-R.,Zhu, Y., Li, B.,
Huang, C.-L., et al. (2020). Een longontsteking die in verband wordt gebracht met een
nieuw coronavirus dat waarschijnlijk afkomstig is van vleermuizen. De natuur.
Gepubliceerd online op 3 februari 2020.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2012-7.
51 Zhang, T.; Wu, Q.; Zhang, Z. 2020, Huidige Biologie 30, 1346-1351, 6 april 2020
AANVULLENDE INFORMATIE
oog apr ag+i a

Rn:i+a1@hu s

nus Fla

N u- m l a

o o p apr ag+i a

Rn la1 Th+i s

nus Fla

N u- m l a

o o p apr ag+i a

Rn la1 Th+i s

nus Fla
Aanvullende afbeelding 1. Sequentie-uitlijning van ACE2-aminozuursequentie van geselecteerde
soorten. Het SAR-Cov-2 spijkereiwitbindingsgebied is in het rood gemarkeerd.
Aanvullende afbeelding 2. Fylogenetische boom die verwantschap toont van sequenties van ACE2-eiwitten van geselecteerde soorten.
BAT ACE2
CAT ACE2

CIVET ACE2
DOG ACE2

FERRET ACE2
HAMSTER ACE2
MONKEY ACE2
MOUSE ACE2
PANGOLIN ACE2

SNAKE ACE2

HORSE ACE2
CATTLE ACE2
TIGER ACE2

Aanvullende afbeelding 3. Gemodelleerde ACE2-structuren voor geselecteerde soorten, met Ramachandran-percelen en kwaliteitsmetriek
Aanvullende afbeelding 4. Voorspeld en bevestigd gebruik van ACE2 receptoren door de SARS-Cov-2 spike eiwit op basis
van sequentiehomologie van Qui et al. 41