Partea a doua BACTERIOLOGIE SI MICOLOGIE SPECIALA |15 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR STAFILOCOCICE 15.1. DATE GENERALE 15.1.1. O minidefinitie Stafilococii sunt coci sferici grampozitivi, asezafi in perechi sau ciorchini. Dimen- siunile gi capacitatea de a refine coloratia Gram sunt variabile. Sunt imobili, nesporulati. Facultativ anaerobi, ataca zaharurile fermentativ 15.1.2. Repere taxonomice Genul Staphylococcus face parte din familia Micrococcaceae alituri de alte genuri ‘cum sunt: Micrococcus $i Stomatococcus, prezente pe invelusurile omului si animalelor de unde se raspandesc in mediul ambiant. Microscopic asemanator cu stafilococii este genul Peptococeus cu 0 singura specie: P. niger, strict anacroba. Conform clasificarii actuale genul Staphylococcus reuneste 19 specii, pe care, practic, Je putem imparti astfel: Slafilococi coagulazopozitivi: S. aureus, specie antropozoofila S. intermedius, specie zoofila 1 Stafilococi coagulazonegativi: S. hominis S. Aaemolyticus S. capitis $. a. S. epidermia’s ecco 5. zallinarum Seamus | specii antropofile speci antropozoofile speci zoofile Mai frecvent in patologia umandi sunt implicate S. aureus, specie condifionat patogena, S. epidermidis si S, saprophyticus, speci accidental patogene. Diferentierea acestor specii cu interes pentru microbiologia medicala se face dup gama de caractere consemnate in tabelul 15.1. 166Tabelul 15.1. Diferentiarea specilor principale de Staphylococcus f Cares on 5 eerie saan conga ‘ . - — * : = arannderaaa ¢ : | * ivareaua : 7 = en : = So | oxen os * “ : esses srbixna s 5 ® (CMret.6 agin 5 — sensibil, R — eezsieat 15.1.3. Habitat S. epidermidis este gazduit constant, iar S. saprophyticus ocazional, pe tegumente si in nari, In colectivitatea generala, intre 20 si 40% din persoanele normale gizduiesc S. ‘aureus in ndivi si un procent asemanator in intestin, iar la personalul de spital procentul purtitorilor creste péind Ia 70—80. Prezenta S. aureus pe tegumente este tranzilorie, rezervorul nazal, cel intestinal si leziunile stafilococice sunt cele care contamincazd tegumentul cu aceasta specie. Habitatul natural al stafilococilor si rezistenta la uscaciune explica prezenta lor foarte frecventa in aer, in alimente si pe cele mai variate suprafeje din ambianta noastra. Frecvent contamineazd prelevatele patologice si impun criterii ferme pentru argumentarea sem- nificatiei clinice a tulpinilor izolate de la pacienti. S. aureus este un important indicator sanitar de contaminare cu secre}ii nazofarin- giene a acrului si a suprafetclor din blocul operator, maternitali, colectivitati de copii si institutii medicale. 15.1.4, Factori de patogenitate 5. aureus este 0 bacteric condifionat patogena invaziva si toxigend cu numerosi, dar foarte variabili, factori de patogenitate. Capsula si proteina A au efecte antifagocitare. Coagulazele elaborate de peste 96% din tulpini, coaguleaz plasma prin activarea unui factor similar trombinei (coagulaza libera) sau direct (coagulaza Iegata de celula cocilor). Elaborate in faza logaritmica de dezvoltare, coagulazele pot fi antifagocitare prin 167fibrina depusa pe suprafaa stafilococilor, Favorizeaza aparitia trombilor septici endovenosi In focarul de infectie stafilococica. Hemolizinele, in numar de patru (a, B, y si 6), sunt exotoxine cu efect letal, der~ monecrotic si membranodistructiv asupra hematiilor, leucocitelor, mastocitelor, trom- ocitelor si celulelor tisulare. Leucocidina lexeaz membranele celulare si lizozomale ale leucocitelor. Exfoliatina (epidermolizina) este o exotoxina, care difuzeaza si la distantd de focarul infectios cutanat 9i rupe desmozomii stratului spinocelular, provoctind decolarea paturilor superficiale ale epidermei de stratul granulos cu formare de flictene, leziuni intalnite in ‘esindromul stafilococic al pielii oparites — boala Ritter, sindromul Lyell, impetigo bulos Toxina | a sindromului socului toxic, abreviat TSST-1, numita si toxina pirogena, determina febra si un rash scarlatiniform. Inoculata experimental, mareste de 50 000 de ori sensibilitatea iepurilor la socul endotoxinic. Enterotoxinele, A, B, C, D, E si F, termostabile si rezistente la enzimele digestive actioneazi asupra mucoasei digestive si sistemului nervos central, determinand hiper- salivatie, greturi si varsaturi grave, dureri epigastrice si, uncori, diaree apoasa. Doza toxic’ se realizeaz cand in aliment tulpina enterotoxigend de S. aureus depaseste concentratil de 10°UFC/g (mb. Semnele de boala apar dupa o incubatie de 3—6 ore si persista |—2 zile pang la eliminarea toxinei din organism. Alli factori de patogenitate ai S. aureus sunt: hialuronidaza, factor de difuziune tisulara, stafilokinaza, fibrinolizind cu rol posibil in generarea septicopioemiilor stafiloco- cice prin liza trombilor septici endovenosi, lipaze, care ti explica tropismul pentru unitatile pilosebacee. S. epidermidis 5i S. saprophyticus au un echipament de patogenitate modest din care putem retine prezenta variabila a hemolizinelor, dar mai ales a glicocalixului cu rol de ligand la epiteliu si suprafata cateterelor. 15.1.5. Receptivitatea la stafilococi Raportata la frecventa portajului, frecventa infectiilor determinate de S. aureus este relativ redusi. Deficienfe ale apdrarii antiinfectioase locale si sistemice deschid calea infectiilor stafilococice. Cand aceste deficiente sunt foarte importante, isi pot manifesta potentialul de patogenitate redus chiar si stafilococii coagulazonegativi. 15.1.6. Infecfiile stafilococice 5. aureus determina infectit cu caracter supurativ, piogen: foliculite, furuncule, car- buncul, hidrosadenita, panaritii, flegmoane. infectii ale plagilor. Infecteaza mucoasele cu apararea antiinfectioasé compromisa: otite, sinuzite (complicate eventual cu meningite), Pneumonii postgripale; endometrite post-partum si post-abortum. Infectiile cu S. aureus pot evolua bacteriemic si septicemic cu metastaze septice (osteomielite, abcese viscerale). Uncori este implicat in uretritele si prostatitele nespecifice. Frecvente sunt toxiinfectiile alimentare stafilococice. Enterocolitele stafilococice, ca disbioze ale antibioticoterapiei, sunt posibile. 168S. aureus cauzeazd frecvent cazuri sporadice sau izbucniri epidemice de infect nozocomiale. S. epidermidis poate determina foliculite, acnee, blefarite. La pacienti cu proteze valvulare cardiace cauzeaza endocardite subacute. In cursul cateterismelor venoase prelun- site genereazA bacteriemii de cateter. S, saprophyticus este cunoscut ca o cauza de cistita la femei tinere active sexual 15.2, INVESTIGATIA ETIOLOGICA A INFECTIILOR STAFILOCOCICE 15.2.1. Diagnosticul microbiologic 15.2.1.1. Prelevate patologice Prelevatele patologice examinate sunt in functie de tipul infectiei: puroi, sange, insertia intravenoasa a catcterelor, lichid cefalorahidian, sputa, raclat uterin in en- dometrite, urina, materi fecale. In toxiinfectiile alimentare se preleva probe de alimente, tampoane nazale de la personalul care manipuleaza alimentele, lichidul de lavaj al mainilor si ustensilelor din Ducati, 15.2.1.2. Microscopia directa Se efectucaza si se coloreaza Gram frotiuri, care sunt examinate prin obiectivul cu Se urmareste prezenta cocilor sferici grampozitivi izolaji, in perechi sau, carac- teristic, in gramezi neregulate in contextul inflamator caracterizat prin prezenia leucocitelor, frecvent alterate sia fibrinei In funetie de produs, pot aparea si celuletisulare alterate, Im infect eronicizatestaflococi pot 88 apart gramvariabil lor cu Neisseria in prelevatele din uretrite, prostatite, cistite. Microscopia, ca prima etapa, este orientativa, dar indispensabila pentru interpre icatiei stafilococilor izolati in cultura. de unde riseul confundarii rea .3. Izolarea si identificarea Ftapa I. Se epuizeazi o ans’ din prelevatul patologic sau tamponul de prelevare pe mediul de izolare: — gelozi-sange: prelevate necontaminate sau cu contaminare redusa ca puroi, lichid cefalorahidian, tampon nazal etc.; — hiperclorurat cu lapte 9i ou, hiperciorurat cu manitol (Chapman): pretevate hiper- contaminate ca materii fecale, alimente, sputa. Etapa 1H. Dupa incubare aeroba peste noapte la 37°C, stafilococit formeaza colonii S, cu diametrul de 1—2 mm, bombate, opace, pigmentate auriu, alb sau galben, cu sau fara hemoliza completa pe gelozi-sange si cu halou opac determinat de lecitinazd pe geloza eu lapte si ou. Pe mediul Chapman coloniile de S. aureus suat manitopozitive (galbene prin fermentarea manitei). Alfi stafilococi sunt manitonegativi. 169Un numar de 3—4 colonii tipice, bine izolate, pe geloz’-sange sunt controlate micro- scopic si repicate pe pant de geloz4, pentru a obtine suficient4 cultura pura in vederea identificarii, Coloniile sugestive de pe mediile selective hiperclorurate vor fi reepuizate pe © plac cu geloza-siinge, pentru a verifica puritatea culturii (pot contine bacterii de con- taminare inhibate) Etapa 11. Cultura purd, verificata microscopic, este supusa testelor de iden- tificare (tabelul 15.1). = Depistarea coagulazei Ingato (clumping factor). Pe o lama de microscop, inte-o picatura de apa, se omogenizeazi o ans din cultura pura pentru a obtine o suspensie laptoasa. Se inmoaie un fir drept in plasma de iepure si se agita, prin miscare circulard continua, timp de 5 secunde, in suspensie bacterin’. Aglutinarea stafilococilor din pic&turd in interval de 10 secunde semnifica un test pozitiv. Testul negativ, absenja aglutinari, trebuie confirmat prin testul coagulazei libere, In tub. NOTA: Nu se suspensioneaza stafilococ insole salin8 (caus de reautae fals negative cu unee th Pin). Un exces de plasma (cg. oansi) poate cavra rezllate fas postive. w= Testul coaguiazei libere. Intr-un tub 10/100 mm cu 0,5 mi plasma citratata de iepure diluati 1/4 se suspensioneaza 0 ansa plina din cultura pura. Se incubeaz’ in baie de api la 37°C si se verifici, prin inclinarea tubului, dupa 30 minute si 4 ore aparitia cheagului. In caz de rezultat negativ tn acest interval, 50 last tubul pin’ a doua zi la temperatura camerei si se urmareste din nou aparitia cheagului = Se epuizeaza cultura pe geloza cu 0,01% fosfat de fenoiftaleina si se incubeaza peste noapte la 37°C. Se expune cultura vaporilor de amoniac (0 bucata de hartic de filtru imbibata cu amoniac si fixata pe capacul placti Petri). In interval de 1—2 minute coloniile stafilococilor producatori de fosfatazd devin roz-rosii 1 Fermentarea sau oxidarea zaharuritor sunt urmarite prin testul O/. = Rezistenta la novobiocind poate fi testatd 0 data cu antibiograma tulpinii sem- nificativa clinic supusa identificarii Diagnosticul septicemiilor stafilococice impune hemoculturi repetate. In conditit de antisepsie si asepsie stricte, se recolteaz4 5—10 ml singe din vena eubitald gi se Instmantes in 50—100 mi bulion glucozat (proportia finala — singe: bulion = 1:10). Hemoculturile incubate la 37°C timp de 7—10 zile se urmaresc macroscopic, microscopic gi prin repicare pe geloza-sange in zilele 1; 2; 3; 5; 7 si 10. Coloniile izolate din hemoculturi se identifica conform testelor precizate mai sus. In toxiinfectiile alimentare, 5. aureus poate fi demonstrat ca agent etiologic pe baza urmatoarelor criteri: a) Izolarea S. aureus in concentrajii mai mari de 10°UFC/g (ml) de aliment, by Izolarea aceluiasi lizovar de S. aureus (vezi mai jos) din voma sau fecale de la boinavi, din alimentele incriminate pe baza celui mai mare indice de atac epidemiologic (torturi, creme, inghetate, produse lactate 5. a.) si de la purtitorii din personalul care a manipulat alimentele. ©) Depistarea enterotoxinelor stafilococice in alimente (reamintim termorezistenja lor), in voma sau culturi prin testul biologic la pui de pisica in greutate de 600—800 g injectate intraperitoneal. Dar testul are o reproductibilitate insuficienta, Testul de referinté este, pentru laboratoarele care dispun de reactivii necesari, identificarea enterotoxinclor prin imunodifuri in gel cu seruri antienterooxice poivalent si monovalente (A, By C, D, » F. 17015.2.2. Diagnosticul serologic Poate fi incercat in stafilocociile cronice. Se dozeaza anti-a-hemolizina. Serul per- soanelor normale confine intre 0 si 2 unitati antitoxice/ml. In stafilococii titrul antitoxic creste peste 2 UA/ml ser. 15.2.3, Investigarea epidemiologica a infectiilor stafilococice nozocomiale Demonstrarea filiatiei cazurilor de stafilococii in focarul epidemic si identificarea sursei de infectie pentru masurile de combatere si proflaxie impune lizotipia conform unci scheme cu truse de bacteriofagi stafilococici selectati pentru tulpinile umane si, respectiv, animale. Izolarea aceluiasi lizovar stafilococic din prelevatele patologice de la bolnavi, de la purtatori sau din alimente demonstreazA fenomenul epidemic. 15.2.4, Biopreparate si antibiotice pentru profilaxia si tratamentul stafilocociilor fiagnosticul de laborator, = Imunoglobulina antistafilococica. = Ser imun antistafilococic. = Plasma antistafilococica = Anatoxina stafilococica, = Vaccin omorat. = Autovacein, = Seruri antienterotoxice (A, B, C, D, E, F) = Bacteriofagi stafilococici. = Antibiotice utile in iratamentul stafilocociilor: a) In infectiile cu tulpini neproducatoare de f-lactamaze: penicilina G (asociata cu gentamicina in infectiile severe si septicemii). Alternativ, pentru pacientii sensibilizati la Peniciline, eritromicina, lincomicin’, cefalosporina, rifampicina, pristinamicin’, van- comicina (rezervata cazurilor determinate de tulpini rezistente la alte antibiotice) by In infectiile cu tulpini producatoare de f-lactamaze: 0 penicilina de semisinteza rezistenti la penicilinaza stafilococica (oxacilina etc., asociata cu gentamicina in infectiile severe). Antibiotice alternative vezi mai sus.