2019 年 7 月 中国粮油学报 Vol． 34，No． 7

第 34 卷第 7 期 Journal of the Chinese Cereals and Oils Association Jul． 2019

大米蛋白质中砷分布规律研究
邢常瑞 章 铖 杨 锴 董 雪 鞠兴荣 袁 建 何 荣
（ 南京财经大学食品科学与工程学院 ； 江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心 ；
江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室 ，南京 210023）

摘 米蛋白在婴幼儿产品和高端产品领域应用具有广阔前景 ，然而重金属易于在稻米蛋白质中富集
要
增加了米蛋白制品的安全风险。 以砷污染大米为研究对象，通过 Osborne 法连续提取大米中清蛋白、醇溶蛋
白、谷蛋白和球蛋白，用 SDS － PAGE、MALDI － TOF － MS 等方法对蛋白进行表征，并运用红外光谱法，紫外扫
描分析研究了各蛋白的光谱吸收特征 。利用 ICP － MS 法测定重金属含量得到不同蛋白结合砷的能力差异 ，得
出砷与清蛋白是优势的结合形态。通过氨基酸组成分析并比对正常大米的氨基酸组成 ，推测砷可能与蛋白中
的脯氨酸结合紧密。
关键词 大米 蛋白质 砷 Osborne 法
中图分类号： TS210． 2 文献标识码： A 文章编号： 1003 － 0174（ 2019） 07 － 0001 － 01
网络出版时间： 2019 － 07 － 12 09： 10： 56
网络出版地址： http： / / kns． cnki． net / kcms / detail /11． 2864． TS． 20190712． 0840． 002． html

［5］
大米蛋白及其功能性产品具有致敏性低、氨基 质形成的络合物。陈露等 采用 Osborne 分级法提取
羧含量高、比例合理等优点，近年以来在婴幼儿产品 籼糙米（ 镉含量 215． 31 μg / kg） 中的 4 种蛋白质（ 清蛋
和高端产品领域具有广阔的开发前景。 然而随着中 球蛋白、
白、 醇溶蛋白和谷蛋白） ， 发现 4 种大米蛋白中
国工业化快速发展，部分省市以污染环境为代价导致 的镉含量分别为 0． 66、 0． 63、0． 23 mg / kg，清蛋
0． 31、
［6］
土壤中重金属污染严重。这些重金属通过“天气 － 河 白中镉含量最高。杨居荣 采用组织化学及溶剂提
流 － 土壤 － 植物”的自然循环系统富集在植物中，并 取法研究发现，Cd、Cu、Pb 在稻谷和小麦籽实中优势
通过食物链进入人体从而引发一系列疾病，危害生 形态是蛋白质结合态，并且球蛋白和谷蛋白结合 Cd
命健康
［1］
，如日本富山县“痛痛病 ”事件。 镉易于在 的比例高。然而，
到目前为止，鲜有报道分析砷与大米
肾脏中累积，进而可能损害肾脏所处的泌尿系统，主 结合蛋白的特征和相关的理化性质以及结合机理。
要表现为近端肾小管功能障碍
［2］
。 重金属铅进入人 本实验选取砷污染较严重的大米为研究对象 ，
体后会溶于血液中，进而阻碍血细胞的合成，导致贫 通过 Osborne 法的原理连续提取各级蛋白质，并结合
血。长此以 往，会 对 人 体 的 血 液 循 环 系 统，消 化 系 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （ SDS － PAGE） 、紫外扫描分析
统，神经系统，免疫系统产生巨大危害。 根据联合国 （ UV ） 和 基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱
报道，在贫困地区的居民，长期饮用被砷污染的地下 （ MALDI － TOF － MS） 等方法对砷结合蛋白质进行性
水会造成多器官的细胞毒性，甚至是癌症
［3］
。 质表征。利用电感耦合等离子体质谱 （ ICP － MS） 定

水稻是较易富集重金属的主粮之一，重金属镉、 量分析不同大米蛋白中重金属含量，并结合氨基酸
［4］ 组成分析研究特征蛋白氨基酸组成，得出砷在稻米
铅、
砷更易于与大米的蛋白质结合。 孔庆新 对受
中的分布规律，为后续稻米砷消减技术和开发优质
污染大米可能镉分布部位的实验探究 ，得出镉主要与
米蛋白产品、响应国家优质粮食工程建设提供参考 。
米胚乳中的谷蛋白络合而存在，是一类金属镉与蛋白
基金项目： 国家重点研发计划 （ 2017YFD0401404 ） ，国家自然科
学 基 金 （ 31601547 ） ，江 苏 省 教 育 厅 面 上 项 目 1 材料与方法
（ 16KJB550003） ，江 苏 省 产 学 研 计 划 （ BY2016009 －
02） ，江苏高校优势学科建设工程（ 2014 － 124） 1． 1 样品采集与处理
收稿日期： 2018 － 10 － 17 实验样品为采集的砷污染严重的大米 （ 粳稻、产
作者简介： 邢常瑞，男， 1987 年出生，讲师，食品科学
通信作者： 袁建，男， 1965 年出生，教授，粮油品质与控制 2017 年秋 ） 。 取重金属污染大米适量，
自湖南某地、
 2 中国粮油学报
用砻谷机将稻谷外壳去掉，保留糙米，然后用万能粉
碎机将糙米磨成粉末，过 60 目筛得到糙米粉，待用。
1． 2 试剂与仪器
石油醚、乙醇、氢氧化钠、盐酸、氯化钠、硝酸、过
硫酸铵、Tris － HCl、过氧化氢、浓硝酸、溴化钾、聚丙
烯酰胺凝胶电泳相关试剂、ZipTip C4 微量层析柱、
SA 基质溶液。
JXFM110 锤式旋风磨； CEM MAＲSX 微波消解萃
取装置； 7700x 电感耦合等离子质谱仪； pHS － 3C 型
精密数显 pH 计； 5800MALDI － TOF － MS 基质辅助激
光解吸电离飞行时间质谱； BLH － 3250 型实验砻谷
机； JNMJ6 型检验碾米机； TENSOＲ 27 傅里叶变换红
外光谱仪； ＲE － 5299 旋转蒸发仪； U － 3900 紫外可见
分光光度计； Bio － Ｒed 165 － 8001 小型垂直电泳仪。
1． 3 方法
1． 3． 1 大米中蛋白的提取与纯化
根据 4 种蛋白（ 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋
白） 溶解 度 的 差 异，分 别 以 蒸 馏 水，5% NaCl 溶 液，
70% 乙醇溶液，0． 05 mol / L NaOH 溶液作为主要溶
剂，采用 Osborne 法分步提取四种蛋白。每次室温搅
通过离心（ 10 000 r / min，
拌提取时间 2 h，固液比 4∶ 1，
10 min） 分离沉淀蛋白，每步重复提取 3 次。 合并提
取液并通 过 0． 45 μmol / L 过 滤，通 过 滴 加 2 mol / L
HCl 调节等电点沉淀提取液中的蛋白质 ，进行冷冻干
燥，－ 20 ℃ 保存。具体提取步骤见图 1。
1． 3． 2 SDS － PAGE 电泳
将分离得到的适量清蛋白，球蛋白，醇溶蛋白，
图1 Osborne 分级法提取糙米中的蛋白质
2019 年第 7 期
谷蛋白分别溶于蒸馏水， 5% （ m / V） NaCl 溶液，
70%
（ V / V） 乙醇溶液，
0． 05 mol / L NaOH 溶液制成 0． 3%
（ m / V） 蛋白样液。并分别吸取各蛋白样液 10 μL，加
入上样缓冲液 30 μL 于 2． 5 mL 离心管中，沸水浴加
热 3 min 备用。配制 10% （ m / V） 分离胶，5% （ m / V）
浓缩胶。连接电泳槽，装入已制备好的凝胶，在电泳
槽中加适量电泳缓冲液，依次缓慢滴加 Marker，蛋白
样液各 10 μL。凝胶电泳初始电压设置为 70 V，待条
带跑至黑线时，加大电压至 120 V。 凝胶电泳结束后
将凝胶小心取下，置于考马斯亮蓝染色液中摇床振
荡 40 ～ 60 min，后置于脱色液中摇床振荡约 180 min，
最后使用凝胶成像系统拍照。
1． 3． 3 MALDI － TOF － MS 检测
用 ZipTip C4 对蛋白样品进行脱盐，在样品靶上
点样 1 μL 蛋白样品并风干，加入 0． 6 μL SA 基质溶
液点后风干，在旁边做标准样对照。 选取线性方法
在正离子条件下进行相关样品的校准测试，并用线
性方法测试蛋白样品的分子质量 。
1． 3． 4 紫外扫描分析
将适量清 蛋 白 ，球 蛋 白 ，醇 溶 蛋 白 ，谷 蛋 白 分
别溶于蒸馏水 ，5 % （ m / V） NaCl 溶 液 ，70 % （ V / V）
乙 醇 溶 液 ，0 ． 05 mol / L NaOH 溶 液 制 成 0 ． 1 %
（ m / V） 蛋 白 样 液 。 分 别 以 蒸 馏 水 、5 % （ m / V ）
NaCl 溶 液 、70 % （ V / V ） 乙 醇 溶 液 、0 ． 05 mol / L
NaOH 溶液作为空白进行基线校正 ，再对同溶剂的
蛋白溶液在 200 － 800 nm 范围内的紫外吸收强度
进行扫描测试 。
 第 34 卷第 7 期 邢常瑞等 大米蛋白质中砷分布规律研究 3

1． 3． 5 傅里叶红外光谱仪检测
采用压片法进行傅里叶红外光谱检测，样品与
KBr 的比例约为 1： 100 于研钵中研磨均匀，并用压片
－1
机进行压片。在 400 ～ 4 000 cm 范围内对样品进行
－1
扫描测量，分辨率为 4 cm 。
1． 3． 6 砷含量检测
准确称取 0． 3 g 样品于消解管中，并加入 2 mL
30% （ V / V） 过氧化氢溶液以及 5 mL 65% （ V / V） 浓硝
酸，置于通风橱静置 40 min 后 ，将消解管放入微波
消解萃取装置中消解 60 min，待消 解 完 毕 后 ，放 入
电加热器中设定 160 ℃ ，进行赶酸 ，赶酸结 束 后 用
图2 SDS － PAGE 测试结果
2% 稀硝酸将消解管中样品定容至 10 mL 容 量 瓶 ，
经 0． 22 μm 微孔滤膜过滤后 ，用电感耦合等离子质
谱仪 （ ICP － MS） 测试样品中砷含量 。
1． 3． 7 蛋白氨基酸组成分析
称取 0． 2 g 样 品 放 入 水 解 管 中，加 入 10 mL
6 mol / L HCl后密封，于 110 ℃ 的烘箱下水解 24 h。
将水解 液 用 旋 蒸 仪 进 行 旋 蒸 以 除 去 盐 酸，后 加 入
0． 02 mol / L HCl 定 容 至 50 mL，吸 取 少 量 水 解 液 经
0． 22 μm滤膜过滤，装入进样瓶中，采用氨基酸分析
仪中对各个蛋白进行氨基酸组成分析 。
1． 3． 8 数据处理与统计
数据用 IBM SPSS 22． 0 进行分析和处理，图表用
Origin Pro 2016 绘制。

2 结果与讨论
2． 1 SDS － PAGE 分析
SDS － PAGE 测 试 结 果 如 图 2 所 示，用 Osborne
法分步提取 4 种蛋白中，醇溶蛋白有一条清晰的条
带，分子质量在 14． 2 ku 左右，表明醇溶蛋白是一个
相对单一的组分； 清蛋白有 3 个条带，分子量分别在
14． 0、 35 ～ 37 ku 左右； 球蛋白有 2 个条带，分子
20． 1、
质量分别在 18． 5 ～ 19． 5、 37． 0 ku 左右。 谷蛋白比较
复杂，存在 4 个条带，分子质量分别在 14． 6、 20 ～ 21、
37． 1 ～ 38． 0 ku 左右。 该电泳结果与李亦蔚［7］ 提
31、
取和分离大米蛋白的研究结果较一致。 说明了此提
取、分离、纯化方法能制备出纯度均一的各级大米蛋
白。
2． 2 MALDI － TOF － MS 分析
通过基 质 辅 助 激 光 解 吸 电 离 飞 行 时 间 质 谱 法
（ MALDI － TOF － MS） 测定分子质量，结果如图 3 所
示。比较 4 种大米蛋白可知，醇溶蛋白只有一个较
图3 大米醇溶蛋白（ a） 、球蛋白（ b） 、清蛋白（ c）
明显的峰 ，分子质量约为 14 ． 1 ku ，这点与之前的电 和谷蛋白（ D） 的 MALDI － TOF － MS 测试结果
 4 中国粮油学报 2019 年第 7 期

泳图所得结果较一致，陈露在提取分离得到的镉硫
［5］
蛋白也发现了类似的结果 ，这表明该醇溶蛋白是
一类低分子量的，纯度单一的结合蛋白，其余蛋白的
曲线图谱与电泳图谱基本一致，推测其余蛋白可能
是多种不同分子质量的蛋白质，也有可能是含有多
个亚基。
2． 3 紫外扫描分析
以波长为横坐标，吸光度为纵坐标。 各蛋白紫
外图谱如图 4 所示，从图 4 可以看出，醇溶蛋白在
257 nm 处存在吸收峰，已有报道发现通常在 250 nm
［8］
处存在镉硫蛋白特征吸收峰 ，因此可以初步得到
该类 蛋 白 是 一 种 典 型 的 金 属 硫 蛋 白。 清 蛋 白 在
242 nm 左右处有强吸收峰，推测该处可能为该砷清
蛋白特征吸收峰。

图4 特征蛋白紫外图谱
2． 4 傅里叶红外光谱仪分析
红外光谱的形成是以分子的振动为基础，在生
物大分子中，这些振动 （ 化学键 的 伸 缩、扭 曲、旋 转
等 ） 能 定 位 到 分 子 中 特 殊 的 键 和 基 团，主 要 包 括
—C O、—COOH、O—H，S—H 等［9］。 大 米 各 级 蛋
白的红外 谱 图 如 图 4 所 示，大 米 中 醇 溶 蛋 白、谷 蛋
白、清蛋白与球蛋白在红外谱图的形状上无明显的
－1
差异。在波数 3 414 ～ 3 417 cm 范围内的吸收峰，
－1
为 NH 伸缩振动导致的； 波数 2 924 cm 附近有一个
明显的特征吸收峰，为 C—H 伸缩振动导致的； 波数
－1
在 1 515 ～ 1 570 cm 范围内的吸收峰，为 NH 弯曲
振动和 C  N 伸缩振 动 导 致 的。 该 实 验 结 果 与 龚
［10］
倩 在研究微射流辅助大米蛋白分离及功能特性研
究所发现的规律较一致。 图5 大米中醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白、
2． 5 大米蛋白中重金属分布规律研究 球蛋白的 FTIＲ 图
前期研究中发现随着加工精度的增加，重金属 除率可达 24． 10% ，这是由于稻米籽粒中约 40% 的镉
去除率也随之增加。在碾米时间为 120 s 条件下，As 富集在占稻米总重 9% 的糊粉层中，而占稻米总重约
总去除率达到 42． 57% ，说明砷在糙米外层含量很 71% 的胚乳中仅富集了 45% 的镉。因此本实验选用
［11］ ［12］
高，很可能以砷蛋白形态存在 。杨居荣等 研究 去壳的糙米作为原料，制备米粉，来研究大米蛋白质
发现出米率为 68． 6% 的精米，与原稻谷相比镉的去 中砷的分布具有现实意义。
 第 34 卷第 7 期 邢常瑞等 大米蛋白质中砷分布规律研究 5

首先测定砷污染稻谷的重金属含量并对分离得 比较表 3 中数据发现，几种蛋白样品的脯氨酸、

到的四种大米蛋白进行 重 金 属 含 量 分 析 如 表 1 所
示，结果表明： 污染大米中砷含量 为 0． 242 mg / kg。
通过分离 得 到 的 清 蛋 白 中 砷 含 量 最 高 达 到 2． 190
mg / kg，其次谷蛋白砷含量达到 0． 489 mg / kg，球蛋白
0． 076 mg / kg。 砷
和醇溶蛋白砷含量分别为 0． 110、
与蛋白质结合紧密 ，由此推断 其 结 合 强 度 依 次 为 ：
清蛋白 ＞ 谷蛋白 ＞ 球 蛋 白 ＞ 醇 溶 蛋 白 。 根 据 提 取
所得的四种蛋白质量以及对应的蛋白重金属含量 ，
对比原始样品的质量和重金属含量 （ 蛋白质量未给
出 ） ，计算得到四种蛋白砷含量占砷污染样品中的
63． 17% ，清蛋白的砷含量占总样品的 26． 03% ，表
明砷污染大米中砷与清蛋白的结合态为优势形态 。
表1 大米及大米蛋白砷含量
蛋白种类
大米
清蛋白
球蛋白
醇溶蛋白
谷蛋白
2． 6 氨基酸组成分析
表 2 分析了 4 种蛋白之间氨基酸含量的差异，以
及砷结合蛋白后蛋白氨基酸含量的变化。 由于无砷
污染大米的球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，与砷结合的
球蛋白、醇溶蛋白及谷蛋白之间的氨基酸含量差异
较小（ 该部分数据未给出 ） ，因此选用无砷污染大米
的清蛋白与砷结合清蛋白进行比较和分析砷对蛋白
氨基酸含量的影响。
表2 蛋白样品氨基酸组成
谷氨酸的含量整体较高，半胱氨酸的含量整体较低。
值得注意的是砷结合醇溶蛋白中脯氨酸含量远远高
于砷谷蛋白，两者相差 29． 21% ； 而砷结合谷蛋白中
谷氨酸含量高达 19． 39% 明显高于其他样品，该结果
［13］
与刘珊珊 研究镉结合蛋白所发现的规律较一致。
另外比较各种大米蛋白，发现砷结合蛋白中疏水性
氨基酸含量较高，推测砷可能通过与疏水性氨基酸
中的特征基团结合的方式形成砷结合蛋白 。
砷结合清蛋白与无砷污染的大米清蛋白相比 ，
重金属砷的存在提高了大米中天冬氨酸的含量，并
［14］
降低了赖氨酸含量，该规律与王凯荣 等人镉污染
对稻米品质的影响中所发现的规律较为一致。 并且
砷结合清蛋白与无污染的大米清蛋白相比，脯氨酸
砷含量 / mg / kg 含量提高了 10． 14% ，推测在砷结合清蛋白中，金属
0． 242 砷可能通过脯氨酸与蛋白质结合 。
2． 190
0． 110
0． 076 3 结论
0． 489
本研究对砷污染的大米进行连续提取，分离得
到大米 醇 溶 蛋 白、球 蛋 白、清 蛋 白 和 谷 蛋 白。 通 过
SDS － PAGE、MAlDI － TOF － MS、紫外光谱以及傅里
叶红外光谱等方法对四种蛋白表征后，发现砷与蛋
白质结合紧密，砷与蛋白质结合的强度依次为： 清蛋
白 ＞ 谷蛋白 ＞ 球蛋白 ＞ 醇溶蛋白。 通过 ICP － MS 与
氨基酸组成分析获取了砷在四种蛋白质中的分布规
律： 四种蛋白砷含量占砷污染样品中的 63． 17% ，清
蛋白的砷含量占总样品的 26． 03% ，由此推测砷与清
蛋白是优势的结合态； 砷结合蛋白中脯氨酸含量明
显高于其他样品，由此推测砷主要与蛋白中的脯氨

氨基酸
与 As 结合的大米蛋白 无污染 酸进行结合。
清蛋白 球蛋白 醇溶蛋白 谷蛋白 大米清蛋白
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The Distribution Law of As in Ｒice Protein

Xing Changrui Zhang Cheng Yang Kai Dong Xue Ju Xingrong Yuan Jian He Ｒong
（ College of Food science and Engineering； The Jiangsu Province Center of Collaborative Innovation Center
for Modern Grain Circulation and Safety； Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing，
Nanjing University of Finance and Economics，Nanjing 210023）

Abstract Fhe dominant binding complex in rice． Finally，it was speculated that As probably binds tightly to
proline in the protein by analyzing the amino acid composition and comparing with that of normal rice． This study re-
sponds to the national quality grain engineering construction and provides a theoretical basis for the development of
high － quality rice protein products and rice As reduction technology．
Key words rice，protein，As，osborne method