UNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL FACULTAD DE CIENCIAS VETERINARIAS CATEDRA DE TERIOGENOLOGIA.~ Trabajo Préctico N12 ‘Tema: CITOLOGIA VAGINAL. Objetivos Que e aumao togre: ~ Valor la importancia de fa citologia vaginal en peas. + Utilzar a téenica de citologia vaginal como complemento de un examen clinica completo. = Ejecuta la téenica en caninos, = Relacionar ls datos del examen einico con la informacién que brinds dicha ‘nica para determinar el momento del ciclo en que se encuentra la pera Reconocer los diferentes tipos eellaresy con ello diferenciar las etapas del ciclo esta Materiales Hembrascaninas en diferentes estados del ciclo, Vaginoscopios, Material lubricate ‘Gaantes, Hisopos. Material para a jain ytneion de los extendides. Microscopis. Flementos de limpieza Contenidos I> Introduccion 1.1. Hormonas sexuales 12> Ciclo esl de a pera 2+ Citologia vaginal 2.1. Fundamento de la citologie vaginal 22-Toma de muestras 23.-Casificacibn de las eélulas vaginales 2.4-Observacin e intrpretacin de ls resultados 3-Bibliograia 41+ INTRODUCCION AL CICLO ESTRAL CANINO 2 ‘La adenshipéfisis produce tres hormonas de importanca en Ia reproduccin de la hembra FSH (Hormona Folculoestimulane), LH (Hormona Luteinizante) y PRI. (Prolactina). ‘La func principal de la FSH cs estimular el crecimiento de Ios foleules estas. LH es necesaria para el proceso ovulatorio y para la Iteinizacién dela granulosa, lo que resula fen a foxmacidn del cuerpo Tite (estas dos hormonas son sinérgicas). La PRL es responsable del desarollo del tj seeretor de laglindula mamaria y del manteniiento ela lacaei6n. Esta hormona ea a perra tiene acién luteoebfca. Hormonas SexualesLa liberacin de FSH y LH est controlada por GnRH (Hormona liberadora de Gonadotrofinas) y existen 2 formas de influenciar la secrecién de gonadotropinas. Una es vatiar la frecuencia o amplitud de los pulsos de liberacién de GnRH ya que se ha demostrado que la liberacién pulsatil de la misma es esencial para mantener la secrecin de LH y FSH por la adenohip6fisis. Otra es modificar la sensibilidad de la adenohipofisis a los pulsos de GnRH por medio de los efectos moduladores de los estrégenos y progesterona, El incremento de las concentraciones de estrogeno_aumenta la sensibilidad a la GnRH y aumenta la liberacién de gonadotrofinas. La progesterona posee un efecto puesto. El 17 b-estradiol causa un efecto de retroalimentacién positiva con la consiguiente liberacién ‘de una oleada de gonadotropinas en respuesta a concentraciones de estrgenos que aumentan gradualmente, En contraposici6n, la retroalimentacién negativa require a exposicién a concentraciones de estrégenos basales o minimas y de corta duracién. La FSH controla la sintesis esirogénica de los foliculos ovaricos y actiia sobre las eélulas de la granulosa. Ta LH también actita sobre la sintesis de estrdgenos, ya que controla la produceién de la molécula precursora esencial (testosterona) por las células de la Teca Interna. Las acciones de los Estrégenos son: - Estimular el crecimiento de las glindulas endometriales (necesario para el mantenimiento del cigoto antes de la implantacién).. = Estimular el crecimiento de los conductos de la glandula mamaria. = Causar actividad secretoria en el ovidueto (para favorecer la supervivencia del vulo y del espermatozoide) ~ Regular la seerecién de gonadotropinas. = Detener el crecimiento de los huesos largos al iniciar el cierre de la placa epifisaria de crecimiento. - Favorecer el metabolismo proteico. Las acciones de la Progesterona son: - Estimular el crecimiento de las glindulas endometriales. - Estimular el crecimiento lébulo-alveolar de la gkindula mamaria, - Estimular la actividad secretora del oviducto y de las glindulas endometriales, - Estimular la conducta de estro en algunas especies (oveja y petra) en coordinacién con los estrégenos. - Prevenir la contractibilidad del titero durante la gestacién. = Regular la secrecién de gonadotropinas. 1.2. Ciclo Estral de la Perra La perra es monoéstrica_estacional con escasa o nula estacionalidad. Luego de la ‘ocutrencia del ciclo estral se produce un periodo de anestro de duracién variable, lo que da como resultado un intervalo entre los ciclos que puede oscilar entre 5 y 12 meses. El periodo de proestro y comportamiento de estro es variable, de 3 a 20 dias, y el inicio del comportamiento de estro puede ser tan temprano como 5 dias antes de la ovulacién o tan tardio como 3 dias después. La ovulacin ocurre 2 dias después del pico,de LH. La hembra canina, a diferencia de otras especies, ovula ovocitos primarios que tardan 2 0 3 dias enmadurar en cl oviducto, momento en el cual podrin ser fecundados, es decir, aproximadamente 4 dias después del pico preovulatorio de LH. En la perra la pubertad puede reconocerse por el comienzo del primer proestro. El inicio de a pubertad se correlaciona con el momento en que la perma alcanza la talla de adulto. Por lo tanto, puede ocurrir entre los 6 y 10 meses en las perras de talla pequefia, mientras que en las de talla grande puede demorarse hasta aproximadamente los dos aos. La madurez sexual o méxima capacidad reproductiva puede no ser alcanzada hasta el segundo, tercer 0 cuarto celo, Es probable que las perras piberes demuestren menos su comportamiento de estro durante la ovulacién y en ellas, la duracién del proestro y estro sea menor. Generalmente mostrarén celos silerites, durante los cuales ocurriré ovulacién pero en ausencia de comportamiento 0 signos clinicos notables de proestro-estro. El ciclo reproductivo de la perra incluye 4 estadios: proesiro, estrro, diestro y anestro. La duracién del intervalo interestral es variable, pudiendo oscilar entre 4a 10 meses con un promedio de 7 meses. Si bien las hembras de talla pequsfia tienden a tener mas ciclos estrales por aiio que las de talla grande, esto no siempre ocurre, ya que el Ovejero Aleman tiene mas ciclos estrales por aiio que el Boston Terrier. Los intervalos interestrales mis frecuentes que 4 meses se asocian con infertilidad y los que demoran mas de 1] meses con subfertilidad. Las excepeiones son las razas caninas afficanas como el Basenji que ciclan ‘una vez por aio, La heredabilidad del intervalo interestral ha sido estimada en un 35%. 1.2.1. Proestro Estadio en el que son facilmente reconocibles cambios externos (vulva edematosa y turgente, con descarga serosanguinolenta de origen uterino). Se extiende desde la primera observacién de sangrado hasta que la perra acepta al mache. La duracién promedio es de 9 dias con un rango de 0 a 27 dias. La perra usualmente atrae al macho pero no esta receptiva, de manera que no permite el servicio. Este patrén de conducta cambia gradualmente a medida que avanza el proestro y la perra se torma més pasiva en su resistencia a la aproximacién del macho. El proestro, en general, esti asociado a cantidades variables de secrecién vaginal sanguinolenta que proviene del itero, Esta hemorragia es el resultado de la diapédesis y ruptura capilar subepitelial dentro del endometrio, ‘A medida que avanza el proestro, la vulva se agranda, esto asociado al edema y tumefaccién de los labios vulgares. En el proestro tardio la vulva estaré hinchada y turgente para luego ablandarse de manera notable en el estro. Ya hacia el final del proestro, pueden ser observados 3 reflejos sexuales: 1, inclinacién hacia arriba o “guifie” de la vulva expuesta a la friceién de la piel inmediatamente dorsal a la vulva. 2. curvatura ipsilateral de los miembros posteriores en respuesta a golpes suaves en la piel a la derecha o izquierda de la vulva. 3. desviacidn contralateral 0 vertical de la cola en respuesta a golpes suaves en la piel a cada lado de fa vulva Este estadio se encuentra bajo influencia de los estrégenos, el cual es sintetizado y secretado por los foliculos ovaricos en desarrollo. El pico de estrogenemia se produce 24 a 48 hs. antes de que ocurra la aceptacién del macho y comience la declinacién de las concentraciones de esta hormona,Las concentraciones de progesterona son bajas durante todo el proestro, salvo en las ultimas 12 a 48 hs. El final del proestro y el comienzo del estro estan caracterizados por progesteronemias. Este incremento de la progesterona sérica esta relacionado con la luteinizacién preovulatoria de los foliculos. Las concentraciones de gonadotropinas aumentan en el proestro temprano para luego retomar a niveles basales hasta la préxima onda en el comienzo del estro. Las concentraciones de FSH disminuyen durante el proestro, probablemente en relacién a la retroalimentacién negativa producida por Inhibina VAGINOSCOPIA: mucosa edematosa y gruesa, de color rosa pilido, con pliegues redondeados y de borde liso que Ilenan la luz vaginal. El fluido uterino es claro y de color rojo brillante. A medida que avanza el proestro los pliegues se toman mas turgentes hiperémicos. 1.2.2. Estro Se caraeteriza por la receptividad de la hembra y la aparicién de reflejos posturales especificos. Finaliza cuando ésta ya no acepta el servicio. La vulva continiia aumentada de tamafio pero el edema disminuye, siendo entonces mis flacida, La descarga vulvar disminuye y contiene menos sangre que en el proestro. La scerecién vaginal contiene glucosa, debido a las crecientes progesteronemias que Promueven intolerancia a los carbohidratos mediante la estimulacién de la GH (Hormona de Crecimiento) indueida por la Progesterona. El estro esti asociado a una continua declinacién de la estrogenemia, La perra comienza a ser receptiva cuando la concentracién sérica de estradiol cae y la de progesterona aumenta La disminucién de la estrogenemia es un reflejo del proceso madurativo final de los foliculos. La declinacién de las concentraciones séricas de estradiol, precede al pico de LH que ocurre el dia 0 del ciclo y antecede a la ovulacién. La combinacién de progesteronemias crecientes y estrogenemias declinantes estimula por un lado el cambio en la conducta de la hembra que se vuelve receptiva y por otto ejerce una retroalimentacién positiva que redunda en una onda secretoria de FSH y LH cuando comienza la aceptacién del macho. La onda de LH es seguida por el inicio de la ovulacién 24 a 48 hs. mas tarde, para luego producirse la formacién del cuerpo Iiteo. Luego de la onda de LH, las concentraciones de esta hormona permanecen bajas. La ovulacién ocurre aproximadamente 2 0 3 dias después de que ocurre la onda preovulatoria de LH. VAGINOSCOPIA: los pliegues de la mucosa desarrollan surcos en su superficie, el color ‘es mas pilido y la tonalidad grisdcea. Disminuye el edema. La duracién promedio del celo es de 9 dias con un rango que varia de 4 a 24 dias. Se considera un estro “endrocrinologico” al que comienza con el pico de LH y termina cuando Ja observacién del extendido vaginal indica el primer dia del diestro. La abrupta caida en el porcentaje de células superficiales que indica el comienzo del diestro, ocurre en promedio 8 dias después del pico de LH. 1.2.3.- Diestro Comienza con el cese del celo, la perra rechaza al macho, al tiempo que es menos atractiva, La descarga vaginal disminuye hasta desaparecer y el edema vulvar se resuelve.Las concentraciones de progesterona sérica aumentan répidamente antes de la ovulacién y continuarin aumentando durante el estro. Luego comenzaré a declinar gradualmente durante las préximas 5 0 6 semanas. Las perras normales no gestantes que han pasado el celo poseen cuerpos liteos funcionales a pesar de la ausencia de gestacién, el cuerpo litteo de las perras no gestantes posee un periodo funcional mayor que el de las gestantes. La fase litea finaliza abruptamente en Ia perra gestante con el parto, mientras que en la no xgestante cae lentamente durante un lapso adicional de 10 a 20 dias. Es decir, la duracién del diestro sera de 2 a 3 meses en ausencia de prefiez. En esta especie, el mantenimiento de la prefiez depende de la produccién ovarica de progesterona. El cuerpo liteo parece ser la tinica fuente de progesterona durante la prenez y la induccién de lutedlisis en cualquier momento de la gestacién causa interrupcién de la prefiez 0 parto prematuro. Ta caida abrupta de la progesterona ocurre antes del alumbramiento, Puede observatse desarrollo mamario durante el diestro, tanto en hembras prefiadas como no prefiadas. VAGINOSCOPIA: los pliegues de la mucosa se tornan delgados, lisos y Mlacidos. El mucus es de color amarronado y filamentoso. 1.2.4.- Anestro Fase de reposo del ciclo reproductivo canino. La perra no atrae al macho y no esta receptiva. La vulva es pequefia y la descarga vaginal es minina o esté ausente. En la hembra no prefiada no existe una demarcacién clinica obvia entre el diestro y el anestro, Las concentraciones de progesterona sérica alcanzan niveles basales. En el anestro tardio se produce la liberacién pulsétil desde el hipotélamo de GnRH que induce la liberacién de FSH y LH, cuyas concentraciones aumentan en ondas pulsatiles con a proximidad del proestro. Las concentraciones de estradiol sérico fluctian durante el anestro, aumentando luego en el proestro con el desarrollo folicular. VAGINOSCOPiA: los pliegues estén delgados, flacidos y pdlidos. La duracién del anestro depende de la edad, salud, raza y otros factores. En la perra promedio durar aproximadamente 4,5 meses. 2.-CITOLOGIA VAGINAL La citologia vaginal es un método complementario econémico y de simple realizacién, orientativa para determinar en que etapa del ciclo estral se encuentra la perra. Otras utilidades incluyen la prediccién de la fecha probable de parto, ayuda en la determinacién de problemas de infertilidad, diagnéstico de vaginitis, tumores vaginales, pidmetra y metritis aguda, y orientacién para la utilizacién de anticonceptivos en el momento adecuado del ciclo, ‘Tener presente que la técnica también tiene sus limitaciones, entre las que podemos citar: ‘> No identifica el dia de ovulacién. No diagnostica preitez. No sustituye la observacién de la conducta animal (siempre la citologia vaginal debe ser evaluada en conjunto con la observacién visual de la actitud de la perra hacia el macho).2.1.-Fundamento de la citologia vaginal El principio de la citologia vaginal exfoliativa se basa en determinar el tipo y cantidad de células de las diferentes etapas del ciclo estral, ya que los cambios hormionales que sufte la mucosa vaginal durante el ciclo estral se reflejan en la morfologia de sus eélulas epiteliales. Al inicio del ciclo, la cétula epitelial esti en contacto con la inrigacién sanguinea. Conforme los niveles de estrégenos se incrementan, el epitelio vaginal se va engrosando ocasionando que Ia célula epitelial se vaya separando del aporte sanguineo dando como resultado una transforma: anucleada o escama, n celular que va de célula parabasal a célula 2.2-Toma de muestras: Para tomar muestras para una citologéa vaginal se recomienda el uso de guantes. Se introduce un hisopo estéril por la comisura dorsal de los labios vulvares (previa limpieza de estos). Se debe hacer suavemente hasta atravesar el cingulum (unién vestibulo - vaginal) para Hlegar a la porcién caudal de la vagina, en la cual, mediante movimientos circulares del hisopo, se colectard el material celular. Hecho esto, se retira el hisopo y se hace un frotis por rodamiento en un portaobjetos (cominmente se realizan tres frotis lineales), se fija en aleohol al 95 % durante 5 a 10 minutos y se tiie para observarla al microscopio. Existen téenicas de tincién como la de Papanicolau, Diff-Quick, Giemsa, Wright y Shorr ‘que pueden ser utilizadas para tefir muestras de citologfa vaginal Fig.1.1 Secuencia del correcto hisopado de la vagina en las perras. Nétese ue el hisopo contacta la pared caudal dorsal de la vagna. 2.3.-Clasificacién de las células vaginales En cuanto al tipo de células vaginales estas se clasifican en: Célula parabasal: Es una célula de forma oval o redonda con niicleo aparente y pequefia cantidad de citoplasma. Esta célula se desprende de la capa de células germinales cercana a los vasos sanguineos y predomina en el anéstro y principios del proestro. Célula intermedia: Fs una célula grande de bordes irregulares con micleo mds pequefio o mas grande que la parabasal pero con mayor cantidad de citoplasma, La presencia de esta célula indica la ctapa anterior a su transformaci6n a superficial, predomina a ta mitad del proestro. Céluta superfici Es una célula de bordes angulosos, con nicleo de menor tamafio que las anteriores. Es caracteristica del final del proestro y todo el estro, que es cuando la vagina se encuentra bajo la influencia del pico estrogénico.Célula anucleada: También se le conoce como escama, es una célula, sin niicleo, de bordes angulosos irregulares que predomina en el estro y marca el final del proceso de descamacién de la ccélula parabasal Anuclear Superficial @ Intermdiate @ Parabasal Fig.2 Tipos celulares epiteliales @ reconocer durante un hisopado vaginal. Mnemotecnia PISA 2.4,-Observacién e interpretacién de los resultados La interpretacién de los extendidos se realiza de acuerdo al predominio de los distintos tipos celulares presentes, los cuales pueden ser orientativos de los diferentes momentos del ciclo estral canino. No obstante, es imprescindible hacer un seguimiento de la evolucién del cuadro celular a través del ciclo estral, ya que un preparado aislado podria resultar compatible con distintos momentos del ciclo estral de la perra. Proestro: Duracién: 9 dias en promedio. Se observara un nimero variable de critrocitos junto con escasas células parabasales, numerosas células intermedias y escasas células intermedias superficiales. Se puede encontrar neutréfilos en bajo niimero y bacterias en pequefias 0 grandes cantidades. El fondo a menudo tiene aspecto sucio debido a Ia presencia de secreciones cervicales y vaginales viscosas, En el proestro medio desaparecen los neutréfilos (estas células entran a la luz vaginal a través del epitelio vaginal pero luego ya no pueden atravesar la pared vaginal de miiltiples capas inducida por los estrégenos). Los neutréfilos no deberian ser observados nuevamente hasta el diestro. El mimero de células parabasales e intermedias pequeias disminuye y son reemplazadas por células intermedias grandes ¢ intermedias superficiales, Los eritrocitos pueden o no estar presentes y cl fondo es sucio o claro. En el proestro tardio, mas del 80% de las células vaginales son superficiales con micleos piendticos o son superficiales anucleadas.- = mn OF Fig, 3 imagen citoligea de procstro. Céluas epitelales parabarales ¢ intermedias en presencia de ertroctos y algunos neutrfes. Las céluas eptliaies comienzan a formar angulosa media que ‘comienza la queratinizacion, Estro: No existen modificaciones que sugieran el pico de LH o de ovulacién 0 el momento de la fentilizacién. Las células superticiales nucleadas y anucleadas (queratinizadas) 0 con niicleo picndtico representan mas del 80% y a menudo alcanzan el 100% de las células observadas en le frotis. No se observan neutrofilos, los eritocitos pueden 0 no estar resentes y el fondo es limpio y libre de detritus celulares. Cuando se realizan frotis seriados durante el estro, un cambio abrupto en el nimero relativo del tipo de células epiteliales marca el comienzo del diestro. ov 2 f i e 1,4 imagen crt et, a bins ples specs no resent, hy preset inca) Spun eae emis senaes Diestro: Duracién: 56 a 58 dias. Durante dicho periodo el mimero de células superficiales disminuye mientras que las células parabasales e intermedias se _inerementan ‘marcadamente. Asimismo, en los 7-- 10 dias iniciales del diestro reaparecen los neutréfilos en niimero variable. Es importante reconocer como normal esta aparicién de neutréfilos en los extendidos de diestro temprano a fin de diferenciarlo de posibles cuadros infecciosos. En algunas perras pueden no observarse los neutréfilos en frotis del diestro. A veces pueden encontrarse células Metaestrales, que son células epiteliales vaginales con uno o dos neutréfilos en su interior. Puesto que los globulos rojos pueden presentarse en extendidos vaginales obtenidos durante principios del diestro, es imposible diferenciar el broestro del diestro basdindose exclusivamente en Ia citologia vaginal. Ademis, luego de los primeros dias del diestro, la citologia vaginal es similar a la del anestro con leueocitos ¥ etitrocitos en cantidades escasas y las células epiteliales corresponden a intermedias y parabasalesFig. 5 Diestro. Células epiteiales parabasales e intermedias. Las células presentan bores més redondeados, nicieo visible, presencia de ertrocltos y células epitelilales con neutréfies en su interior (células metestraies). Anestro: Se caracteriza por un predominio de eélulas parabasales y de eélulas intermedias pequefas. Si bien pueden hallarse algunos neutréfilos, su nimero es muy inferior al observado durante el principio del diestro. Pueden 0 no verse bacterias y la apariencia del fondo puede ser clara o sucia. EI conocimiento de las caracteristicas del ciclo reproductivo canino es de suma utilidad para: ¥ Determinar el dia de mayor fertilidad ya sea para implementar servicio natural o inseminacién artificial. ¥ Determinar el primer dia del diestro y asi aproximar la fecha probable de parto. ¥ Aproximar el diagnéstico y evaluar las posibilidades terapéuticas de las diversas enfermedades reproductivas. ¥ Realizar un adecuado manejo del cicio estral, ya sea para prevenir como para inducir ciclos fértiles. 3.- BIBLIOGRAFIA - FELDMAN, E.C.; NELSON, R. (1991). Ciclo Ovarico y Citologia Vaginal. En: endocrinologia y reproduccién canina y felina. Editorial Inter-Médica. Buenos Aires. Argentina - STORNELLI, M.A.; SAVIGNONE, C.A.; TITTARELI, C.M.; STORNELLI, MC. (2006). Citologia vaginal en caninos.: metodologia y aplicaciones clinicas. Revista Veterinaria Cuyana 1(1), 15-21 = STORNELLI, M.C; SAVIGNONE, C.A.; JIMENEZ, F.; TITTARELLI, CM; DELA SOTA, RL; STORNELLI M.A. (2006), Particularidades del Ciclo Estral Canino, Aspectos Clinicos y Endocrinolégicos. Revista Veterinaria Cuyana 1(2), 26-35