‫ميكروبيولوجيا المياه ‪water microbiology‬‬

‫========================‬
‫إن مجموعه األمراض التي تسببها مجموعه القولون نفسها‪:‬‬
‫=============================‬

‫‪ Escherichia‬والتي يفرز منها اإلنسان حوالي ‪ 200‬مليون خلية وتسبب التهاب للجهاز البولي لإلنسان ‪،‬كما تسبب‬
‫اإلسهال عند األطفال والجراء االختبارات نقوم بما يلي ‪:‬‬
‫أوال‪ :‬عد البكتيريا الكلية في عينة المياه بطريفة التخفيفات ‪:‬‬
‫طريقة اخذ عينة المياه‪:‬‬
‫===========‬
‫طريقة العمل‪:‬‬
‫‪ -1‬ترج عينة المياه جيدا ‪ 25‬مرة (وذلك لضمان توزيع البكتيريا في العينة)‬
‫‪ -2‬ينقل بماصة معقمة ‪ 1‬مل من عينة المياه إلى أنبوبة محتوية على ‪ 9‬مل ماء مقطر معقم فيصبح التخفيف ‪10/1‬‬
‫‪ -3‬يرج التخفبف‪ 10/1‬جيدا وبواسطة ماصة معقمة جديدة ينقل ‪ 1‬مل إلى ‪ 2‬طبق بتري معقم يمثل التخفيف‪1 /10‬‬
‫وبنفس الماصة ينقل ‪1‬مل أخرى من األنبوبة ‪ 10/1‬إلى أنبوبة ماء مقطر معقم ‪9‬مل لنحصل على التخفيف ‪100/1‬‬
‫‪ -4‬يرج التخفيف ‪ 100/1‬جيدا وبواسطة ماصة معشقة جديدة ينقل ‪ 1‬مل إلى ‪ 2‬طبق بتري معقم يمثل التخفيف ‪100/1‬‬
‫وبنفس الماصة ينقل ‪ 1‬مل أخرى من األنبوبة ‪ 100/1‬إلى أنبوبة ماء مقطر فيها ‪ 9‬مل لنحصل على التخفيف ‪100/1‬‬
‫‪ -5‬رج األنبوبة جيدا ثم انقل ‪ 1‬مل بواسطة ماصة معقمة جديدة من التخفيف ‪ 100/1‬إلى ‪ 2‬طبق بتري معقم لتمثل‬
‫التخفيف ‪100/1‬‬
‫‪ -6‬توزع عينة المياه في االجار المغذي وتترك حتى تتصلب‬
‫‪ -7‬تحضن اإلطباق مقلوبة في الحضان على درجة حرارة ْ‪37‬م لمدة ‪48‬ساعة‬
‫‪ - 8‬تحسب عدد المستعمرات في الطبق الواحد لكل تخفيف"تعتمد الخفيفات التي تتراوح عدد المستعمرات فيها مابين ‪-30‬‬
‫‪ 300‬مستعمرة" ومنه احسب عدد الخاليا الحية في ‪ 1‬مل من عينة المياه األصلية‪ ،‬وذلك بضرب متوسط عدد‬
‫المستعمرات‪ S‬في الطبق في مقلوب التخفيف المستخدم‬
‫‪ -9‬نستخدم القانون التالي ‪:‬‬
‫============‬
‫عدد الخاليا الحية في ‪1‬مل من عينة المياه األصلية=‬
‫متوسط عدد المستعمرات في الطبق×مقلوب التخفيف المستخدم‪S‬‬
‫‪ -1‬تعد المستعمرة ( أقل من ‪ 30‬مستعمرة تستبعد وأكثر من ‪) 300‬‬
‫إن تقدير العدد الكلي للبكتريا في عينة المياه التكفي في الحكم على صالحية المياه لالستهالك اآلدمي وذلك لسببين‪ :‬إن‬
‫التجربة السابقة"عد البكتيريا الكلية عينة المياه بطريقة التخفيفات" التعطي سوى جزء من العدد الكلي للبكتيريا إذ إن معظم‬
‫الميكروبات الموجودة في الماء التنمو على البيئات المعملية‪ ,‬وكما أن هذه األعداد ليس بالضرورة إن تكون ممثلة‬
‫للميكروبات الممرضة وليست معيارا مثاليا لسالمة مياه الشرب حيث يمكن إن توجد عينة ماء محتوية على عدد قليل من‬
‫األحياء الدقيقة ولكنها ممرضة‪..‬ولذلك فان االعتماد على تقدير العدد الكلي للميكروبات في تقييم صالحية المياه لالستهالك‬
‫اآلدمي يكون غير مجدي‪...‬‬

‫واشعر أفراد مجموعة القولون بكتريا ‪. E.coli‬وهي عبارة عن ميكروبات عصوية الهوائية غير متجرثمة سالبة بجرام‬
‫‪،‬تخمر سكر الالكتوز مع إنتاج حمض وغاز ‪،‬ونظرا لوجود هذه المجموعة بكميات كبيرة في مياه المجاري فان وجودها‬
‫يدل على المياه بمياه المجاري‪.‬‬
 ‫وإلثبات وجود بكتيريا‪ E.coli‬في المياه يجب إجراء الفحوص التالية وبالترتيب‪:‬‬

‫=====================================‬

‫‪ .1‬الفحص االحتمالي ‪:Presumptive‬‬

‫‪ .2‬الفحص التأكيدي ‪:Contirmed Test‬‬

‫إذا كان هناك تشابه بين مستعمرات‪ S‬صغيرة‪ ،‬دائرية ومرتفعة قليال وقطرها من ‪2-3‬مم ذات مركز اسود ولمعان معدني‬
‫مخضر‪.‬فهذا يدل على وجود بكتيريا ‪ E.coli‬إما إذا كانت المستعمرات‪ S‬المشكوك فيها أظهرت أشكال مختلفة عن ‪E.coli‬‬
‫أي لم يحدث تشابه بين مستعمرات‪ S‬المشكوك فيها ‪E.coli‬‬

‫وفكرة هذا االختبار هو تكوين البيئة من معقد صبغي من ‪Eosine‬و‪ Methylene blue‬اليمتص إال في الوسط لحامضي‬
‫الذي توفره ‪ E.coli‬من تحليلها لسكر الالكتوز الموجود بالبيئة إلى حامض يوفر الظروف المناسبة المتصاص المعقد‬
‫الصبغي‪.‬‬

‫‪ .3‬الفحص النهائي ‪:completed Test‬‬

‫====================‬
‫س)) استخدام بيئة مرق الماكونكي؟‬
‫وذلك الن بيئة مرق الماكونكي تحتوي على دليل‪،‬هذا الدليل أو الكاشف في الوسط القاعدي يكون لونه احمر إما في الوسط‬
‫لحامضي يكون لونه اصفر (تغير االون من األحمر إلى االصفريدل على إنتاج الحمض ‪،‬هذه البيئة أيضا تحتوي على‬
‫سكر الالكتوز الذي يتخمر بواسطة بكتيريا ‪ E.coli‬وينتج حمض ‪+‬غاز‬

‫‪)2‬استخدام أنبوبة درهام؟‬

‫يتم قلب أنبوبه درهام داخل األنبوبة المحتوية على بيئة امرق الماكونكي وذلك لالستدالل على إنتاج الغاز‬

‫‪)3‬استخدام بيئة ‪ E.M.B‬في اختبار الفحص التأكيدي؟‬

‫إن فكرة االختبار هو تكوين البيئة من معقد صبغي من‪ Eosine‬و ‪ Methylene Blue‬اليمتص إال في الوسط لحامضي‬
‫الذي توفره ‪ E.coli‬من تحليلها لسكر الالكتوز الموجود بالبيئة إلى حامض يوفر الظروف المناسبة المتصاص المعقد‬
‫الصبغي‬

‫الفحص التأكيدي ‪:Completed Test‬‬

‫====================‬

‫من للمستعمرات المشكوك فيها و التي أظهرت تشابها مع ‪ E.coli‬نقوم بتلقيح أنبوبة تحتوي على بيئة مرق ماركونكي و‬
‫أنبوبة آجار مغذي مائل و تحضن على ‪37‬درجة مئوية لمدة ‪ 48‬ساعة فإذا أعطانا بيئة مرق الماركونكي حامض ‪+‬غاز‪.‬‬
‫و من النمو على اآلجار المائل نعمل فحص ميكروبي إذا كانت البكتيريا عصوية قصيرة سالبة الصبغة جرام غير‬
‫متجرثمة نجزم أن الصبغة ملوثة بمياه المجاري ‪ ،‬و غير صالحة للشرب و ال اإلستعماالت‪ S‬األخرى‪.‬‬

‫‪http://elte.prompt.hu/sites/default/files/tananyagok/PracticalMicrobiology/book.pdf‬‬

‫‪https://www.gov.uk/government/uploads/system/uploads/attachment_data/file/316838/m‬‬
‫‪dwpart1.pdf‬‬
‫‪http://www.env.gov.nl.ca/env/waterres/training/adww/qualitydist/distribution_sys2_micro‬‬
‫‪_march.pdf‬‬

‫‪http://users.rowan.edu/~wagnerf/efgb/h2omicrolab.pdf‬‬

‫‪/http://microbiollogy.blogspot.com‬‬

‫* العوامل المؤثرة على نمو البكتيريا ونشاطها ‪:‬‬

‫========================‬
‫‪ -1‬درجة الحرارة‪:‬‬
‫==========‬
‫تم تقسيم البكتيريا تبعا لتحملها لدرجات الحرارة الى مجاميع مختلفة هي‪:‬‬

‫ا‪-‬محبات البرودة ‪ : Psychrophililes‬وتعتبر درجة الحرارة بين‪10-15‬م هي المثلى لنمو افراد هذه المجموعة‪.‬‬

‫ب‪ -‬متحمالت البرودة ‪ : Psychrotrophic‬و لهذه المجموعة القدرة على النمو في درجات الحرارة المنخفضة كاجهزة‬
‫التبريد‪.‬‬

‫ج‪-‬وسطية (معتدلة) الحرارة ‪ : Mesophiles‬تنمو افراد هذه المجموعة بصورة جيدة في درجة حرارة ‪ 37-25‬درجة‬
‫مئوية وتعتبر درجة حرارة ‪ 32‬درجة مؤية هي المثلى لنموها‪.‬‬

‫د‪-‬محبات الحرارة ‪: Thermophiles‬الدرجة المثلى لنمو ميكروبات هذه المجموعة هي ‪ 45‬درجة مئوية او فوقها‪.‬‬

‫‪-2‬الغذاء ‪:‬‬
‫=====‬
‫البكتيريا كأي كائن حي يحتاج للغذاء من أجل البقاء وتأدية النشاطات المختلفة ‪.‬‬

‫‪-3‬الرطوبة ‪: Moisture‬‬

‫============‬

‫يطلق مصطلح النشاط المائي )‪Water Activity (aw‬لمعرفة مدى تيسر الماء للميكروبات والذي يعتمد على نسبة‬
‫الرطوبة في المادة الغذائية ونسبة المواد الذائبة فيه كالسكريات واألمالح ‪.‬‬

‫‪ -4‬تركيز األس الهيدروجيني ‪: pH‬‬

‫===================‬
‫عندما يكون األس الهيدروجيني ‪ 7‬هو التركيز المفضل لمعظم األحياء الدقيقة ‪.‬‬
‫‪ -5‬مدى توفر األكسجين ‪:‬‬
‫=============‬

‫أ‪ -‬هوائية ‪ : Aerobes‬وهذه تحتاج لوجود األكسجين وبتركيز كاف لنموها ‪.‬‬

‫ب‪ -‬الهوائية ‪ : Anaerobes‬وهي تعيش وتنشط تحت الظروف الالهوائية ‪.‬‬

‫ج‪ -‬الهوائية إختيارية ‪ : Facultative Anaerobs‬وهذه المجموعة تعيش في وجود األكسجين أوغيابه ‪.‬‬
 ‫د‪-‬محبة للهواء الطفيف ‪ : Microaerophiles‬وهذه تتطلب نسبة قليلة من األكسجين لكي تعيش ‪.‬‬

‫‪http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/shape.htm‬‬

‫بيئـات الزرع البكتريولوجي‬

‫===============‬

‫‪CULTUR MEDIA‬‬

‫*******************‬
‫إن غالبية الدراسات‪ S‬والبحوث البكتيريولوجيه تتطلب استعمال بيئات زرع مختلفة تحضر بالمعمل‪ ,‬وهذه البيئات وإن لم‬
‫تكن متماثلة تماما ً مع البيئات التي تعيش فيهـا أو عليهـا هذه الكائنات في الطبيعة إال أنها قريبة الشبه منها قربا ً قد يوفر‬
‫االحتياجات‪ S‬والمتطلبات الغذائية الالزم لتنميتها‪ .‬لذا يمكن تعريف البيئة بأنها أوساط زراعية مناسبة لنمو األحيـاء‬
‫المجهريـة تتوفر فيها متطلبات النمو األساسية‪ ,‬أو أي مادة يمكن أن تنمو عليها الكائنات الدقيقة‪.‬‬
‫قد تصنف أحيانـا ً البيئـات إلى ‪..‬‬

‫‪ -1‬بيئات محددة التركيب الكيميائي ‪: Chemically defined media‬‬

‫=====================================‬
‫وهي التي تتكون من مواد ذات تركيب كيماوي محدد "بتركيزات معروفة" وعلى ذلك فهي تتكون من أمالح غير‬
‫عضوية‪ ,‬أو مخلوط من األمالح غير العضوية ومركبات غير عضوية‪ ,‬ونظراً ألن التركيب الكيماوي لكل مكونات البيئة‬
‫التركيبية يكون معروفـا ً ومحدداً ‪ ,‬فإنه يمكن تكرار تجهيز مثل هذه البيئات بنفس الدقة في كل مر ٍة من مرات التحضير‪.‬‬

‫‪ -2‬بيئات غير محددة التركيب الكيماوي ‪: Chemically nodefined method‬‬

‫===========================================‬
‫هي التي تحتوي على مايلزم نمو الميكروبات من مواد بشكلها الخام‪ ,‬مثل البيئـات التي يدخل في تركيبها المواد الطبيعية‬
‫كمستخلص اللحم‪ ,‬الدم‪ ,‬أو مستخلص األنسجة النباتية‪ ,‬ولما كان التركيب الكيماوي الدقيق لمثل هذه المواد غير محدد‬
‫بمعنى أن جميع مكونات البيئة وكمياتها غير معروفة بالضبط وتختلف باختالف المادة الطبيعية المستعملة كان من الصعب‬
‫تكرار تحضيرها عمليـاً‪.‬‬
‫ويمكن تقسيمهـا على أسـاس قوامهـا إلى‪:‬‬
‫======================‬

‫‪ -1‬بيئات صلبة "طبيعية" ‪: Solid media‬‬

‫=====================‬
‫مثل شرائح البطاطس أو الجزر‪.‬‬

‫‪ -2‬بيئـات صلبة قابلة لإلسالة ‪: Solid-reversible to liquid‬‬

‫================================‬
‫مثل البيئات التي يدخل في تركيبها اآلجار أو الجيالتين‪ ,‬وتستخدم لتمييز المستعمرات‪.‬‬

‫‪ -3‬بيئـات نصف صلبة ‪: Semisolid media‬‬

‫========================‬
‫وهي التي تحتوي على كمية من اآلجار ال تزيد عن ربع الكمية التي تضاف إلى البيئـات الصلبة القابلة لإلسالة‪.‬‬

‫‪ -4‬بيئـات سائلة ‪: Liquid media‬‬

 ‫==================‬
‫مثل بيئة اللبن أو بيئة المرق المغذي‪ ,‬وتستخدم لتنمية الميكروبات المعزولة بصورة نقية‪ .‬باإلضـافة إلى ذلك توجد بيئات‬
‫ذات أغراض خاصة لسهولة تنمية وعزل مجموعات معينة من البكتيريا مثل‪:‬‬

‫‪ -1‬األوساط الغنية ‪: Enriched media‬‬

‫=====================‬
‫وهي أوساط عادية بسيطة مضافاً‪ S‬إليهـا مواد غذائية غنية مثل الدم‪ ,‬المصل‪ ,‬مستخلصات‪ S‬النباتات أو الحيوانات لمواجهة‬
‫متطلبات النمو الصعب اإلرضـاء مثل‬

‫‪Serum agar – Milk agar – Blood agar‬‬

‫‪ -2‬األوسـاط االختيارية ‪: Selective media‬‬

‫=======================‬
‫مثل إضافة بعض المواد بتركيز معين كالصبغات‪ ,‬أمالح الصفراء‪ ,‬المضادات الحيوية‪ ,‬األحماض للسماح بنمو مجموعة‬
‫من البكتيريا دون غيرهـا كإضـافة صبغة الكريستال البنفسجي بتركيز معين يؤدي إلى نمو مختلف أنواع البكتيريا السالبة‬
‫لصبغة جرام ويمنع نمو البكتيريا الموجبة‬

‫‪ -3‬األوساط المفرقة ‪: Deferential media‬‬

‫======================‬
‫هي األوساط التي تسمح بنمو نوعين من البكتيريا يمكن التمييز بينهما‪ ,‬مثل بيئة آجار الـدم فبإضافة‪ S‬الدم إلى الوسط‬
‫الزراعي يسمح بتمييز البكتيريا المحـللة للدم وغير المحـللة‪ ,‬حيث تظهر حلقة فارغة حول المستعمرة المحـللة‪ ,‬وبذا تلعب‬
‫األوسـاط المحتوية على الدم دور الوسيط الغني المفرق في الوقت ذاته‪.‬‬

‫‪ -4‬بيئـات التقدير الحيوي ‪Biological assay media‬‬

‫‪ -5‬بيئـات عد البكتيريا ‪Media for eneumeration of bacteria‬‬

‫‪ -6‬بيئـات التعرف على البكتيريا ‪Media for characterization of bacteria‬‬

‫المكونات األساسية لألوسـاط الزراعية‪:‬‬

‫===================‬
‫تشترك معظم األوسـاط الزراعية في احتوائهـا على المواد التاليـة‪:‬‬
‫الببتـون‬
‫====‬
‫يعتبر مصدراً هامـا ً للنتروجين العضوي في البيئـات المعدة لتنميـة البكتيريـا غير ذات التغذيـة‪ ,‬يحضر من اللحم الخلي من‬
‫الدهون بعد تحلله بـإنزيم الببسين‪.‬‬

‫خالصـة اللحم ‪Beef extract‬‬

‫================‬
‫تحضر من اللحم البقري الخـالي من الدهـون بعد غليـه وترشيح الخالصـة وتركيزهـا‪ ,‬يحتـوي المستخلص على بعض‬
‫األحمـاض غيـر العضويـة وبعض المواد العضويـة مثل األحمـاض األمينيـة‪ ,‬الجلوكوز‪ ,‬اليوريـا‪ ,‬حامض اللكتيـك‪,‬‬
‫الفيتـامينـات‪ ,‬عوامـل النمـو األخرى‪.‬‬

‫خالصة الخميـر ‪Yeast extract‬‬

‫==================‬
 ‫تحتوي على بعض األحمـاض األمينيـة‪ ,‬وبعض العوامـل المسـاعدة للنمو‪ ,‬وأمالح معدنيـة‪.‬‬

‫المـاء ‪-Water‬‬

‫========‬
‫تحتـاج الخاليـا الحيـة إلى المـاء لنموهـا وإلتمـام عملياتهـا األيضيـة‪ ,‬وعالوة على استخدامه كمـادة مذيبـة للمواد الغذائيـة‪,‬‬
‫ويفضـل استخـدام المـاء المقطر لخلوهـا من األمالح المعدنيـة‪.‬‬

‫المواد التصليبيـة ‪: Solidifying agents‬‬

‫======================‬
‫تضاف إلى بيئـة الزرع السـائلة بعض المواد لتسـاعدهـا على تحولهـا إلى بيئـة صلبـة تسـاعد على تكويـن مستعمرات‬
‫فرديـه‪.‬‬
‫وفيمـا يلي بعض المواد التصليبية التي تضـاف إلى بيئـات الزرع ‪..‬‬
‫الجيالتيـن‬
‫======‬
‫أول ما استعمل كمـادة تصليبية في بيئـات الزرع‪ ,‬وهو عبـارة عن مادة بروتينيـة تحضر بمعاملة عظام الحيوانات‪ ,‬ويندر‬
‫حاليـا ً استعمـال الجيالتين كمادة تصليبية في البيئـة نظـراً ألن كثيـر من البكتيريـا يمكن تحليله مائيـاً‪ ,‬وألنـه ينصهـر عند‬
‫درجـات التحضيـن‪.‬‬

‫اآلجار آجار ‪Agar agar‬‬

‫==============‬
‫مادة كربوهيدراتيه تستخلص من بعض الطحالب البحريـة الحمراء‪ ,‬والتي تنمو بوفرة على سواحل بعض الدول مثل‬
‫اليابـان‪ ,‬وهو يتصلب عند درجـة حرارة من ‪45 -42‬م‪ ,‬ويمكن إسـالته مرة ثانيـة عند درجـة حرارة ‪98‬م‪ ,‬ويتميـز عن‬
‫الجيالتيـن كونـه ال يمكن تحليلـه بيولوجيا ألن عدد الكائنـات المحللة له قليلـة جداً‪.‬‬

‫السليكـا ‪-Silica‬‬

‫=======‬
‫ال تعتبر مادة غذائيـة فهي عادة تستعمل في تحضير البيئـات الالزمـة لتنميـة الكائنـات الذاتيـة التغذية‪ ,‬وذلك لمنع نمو‬
‫البكتيريـا غير ذاتية التغذيـة معهـا‬
‫*عزل األحياء الدقيقة من بيئاتها الطبيعية*‬
‫من المعروف أن الكائنات الحية الدقيقة التي تستوطن هذة البيئة التي نعيش فيها‪ ،‬على درجة كبيرة من التعقيد من حيث‬
‫اختالف أنواعها إضافة إلى أعدادها الهائلة‪ ،‬اذ يقدر عدد أنواع الميكروبات التي تستوطن مختلف أجزاء جسم اإلنسان مثل‬
‫سطح الجلد‪ ،‬الفم‪ ،‬األمعاء…الخ بعدة مئات‪ .‬وينتشر كل نوع من هذة األنواع بأعداد كبيرة جدا تصل لآلالف فعلى سبيل‬
‫المثال عندما يعطس الفرد منا‪ ،‬فانه يطلق مع الرذاذ المتطاير بضعة اآللف من الخاليا البكترية‪ ،‬كما أن جراما واحدا من‬
‫الفضالت اآلدمية (البراز) يحتوي على مئات اآلالف من خاليا البكتريا‪ .‬وبخالف جسم اإلنسان فان مكونات البيئة التي‬
‫نعيش فيها مثل الماء‪،‬و الهواء‪ ،‬والتربة تعج بأعداد هائلة جدا من مختلف أنواع هذة الميكروبات ‪ .‬ويرجع انتشارها الكبير‬
‫إلى صغر حجمها‪ S‬المتناهي مما يسهل حملها بالتيارات الهوائية مع جزيئات البيئة الموجودة فيها‪.‬‬
‫عمل شريحة بصبغة جرام ‪:‬‬
‫=============‬
‫‪ . 1‬نعقم تعقيم فيزيائي كيميائي (غسل الشريحة ومن ثم تجفيفها بتمريرها على اللهب)‬
‫‪ .2‬نضع نقطة ماء لتحطيم الغشاء‬
‫‪ .3‬نعقم اإلبر ونأخذ مسحة من المستعمرة‪.‬‬
 ‫‪ .4‬نضع ونفرد المسحة على الشريحة وهذا يسمى عمل غشاء‪.‬‬
‫‪ . 5‬نمرر الشريحة على اللهب حتى يجف الماء وهذا يسمى تثبيت الغشاء‪.‬‬
‫‪ . 6‬نغمر الشريحة في صبغة كريستال البنفسجية لمدة دقيقة واحدة حتى نصبغ الغشاء‪.‬‬
‫‪ .7‬نغسل الشريحة حيدا بالماء حتى يزول اللون البنفسجي‬
‫‪ . 8‬نضع الشريحة في اليود لمدة دقيقة واحدة ( يعتبر مرسخ للصبغة)‬
‫‪ .9‬ثم نغسل بالماء‪.‬‬
‫‪. 10‬ثم نغسل الشريحة بالكحل جدا إمالة الشريحة حتى تزول الصبغة ‪:‬الكحول عامل مزيل للون الصبغة‪.‬‬
‫‪ .11‬نغسل بالماء‬
‫‪ .12‬نضع الشريحة على الصفرانين ‪ :‬وهي الصبغة المضادة‪.‬‬
‫‪ .13‬نغسل بالماء‪.‬‬
‫‪ .14‬نجفف بورق الترشيح بالضغط‪.‬‬
‫‪ .15‬نجفف على اللهب حتى تجف تماما‪.‬‬
‫‪ .16‬نضع نقطة من زيت السدر‪.‬‬
‫‪ .17‬نفحص على ميكروسكوب على ‪ 10‬حتى نرى الغشاء‪ S‬ثم ‪100‬عدسة زيتية بطريقة مالصقة للعدسة‪.‬‬
‫معلومة ‪:‬‬
‫أن البكتيريا السالبة لصبغة جرام تظل باستمرار سالبة لهذه الصبغة‪ ,‬إال أن البكتيريا الموجبة يمكنها‬
‫تحت ظروف خاصة أن تفقد ايجابيتها لبعض األسباب التالية ‪:‬‬
‫‪ .1‬عندما تتقدم الخاليا في العمر‬
‫‪ .2‬عند ارتفاع حموضة البيئة‬

‫‪ .3‬عند المعاملة بإنزيم ‪Ribowclease‬‬

‫‪ . 4‬إذا سحقت الخاليا مع برادة الزجاج لتكسير جدرها فإن بقايا الخاليا المهشمة تفقد إيجابيتها‪.‬‬
‫*عزل البكتريا في مزارع نقية‪:‬‬
‫================‬
‫توجد طريقتين رئيسيتين يمكن بواسطتها الحصول على مزرعة نقية من أخرى مختلطة وهما‪:‬‬

‫أوال‪ :‬طريقة األطباق المخلوطة ‪. Streak-plate method‬‬

‫‪ -1‬عقم سطح البنش باستعمال قطعة قطن مبللة بالديتول ‪.%70‬‬

‫‪ - 2‬اصهر أنبوبتين من االجار المغذي العميق على درجة الغليان ثم بردها حتى ‪50‬م ‪.‬‬
‫‪ -3‬صب االجار المغذي في أطباق ثم اتركها حتى تتصلب‪.‬‬
‫‪ - 4‬من المزرعة المختلطة وبطريقة معقمة لقح بإبرة تلقيح معقمه الطبق رقم (‪ )1‬ثم لقح اآلخر بنفس اإلبرة بدون تعقيمها‬
‫وبدون وضعها في المزرعة المختلطة مرة أخرى وذلك في التخطيط البسيط‪.‬‬
‫‪ -5‬حضن على درجة الحرارة المناسبة وادرس صفات المستعمرات المزرعية‪.‬‬

‫ثانيا‪ :‬طريقة األطباق المصفوفة ‪.Pour plate method‬‬

 ‫‪ -1‬اصهر ‪ 2‬أنبوبه من االجار المغذي واتركها لتبرد حوالي ‪50‬م‪.‬‬
‫‪ - 2‬بطريقة انقل ملء عقدة من المزرعة المختلطة مستخدما إبرة تلقيح معقمة إلى أنبوبة رقم (‪ )1‬ثم رجها بين راحتي اليد‪.‬‬
‫‪ - 3‬بطريقة معقمة مستخدما إبرة تلقيح جديدة انقل ملء عقدة من األنبوبة رقم (‪ )1‬إلى األنبوبة رقم (‪ )2‬ثم رجها بين‬
‫راحتي اليد‪.‬‬
‫‪ -4‬صب األنبوبة رقم (‪ )1‬في طبق رقم (‪ , )1‬ثم صب األنبوبة رقم (‪ )2‬في الطبق رقم (‪.)2‬‬
‫‪ - 5‬اترك األطباق حتى تتصلب وحضنها مقلوبة على درجة حرارة مناسبة‪.‬‬
‫‪ -6‬من المحتمل بعد فترة التحضين أن يظهر بالطبق رقم (‪ )1‬عدد كبير من المستعمرات بينما الطبق رقم (‪ )2‬يظهر عدد‬
‫قليل من المستعمرات‪ S‬المفردة المنعزلة عن بعضها بطريقة تمكننا من عزل كل نوع في صورة نقية ‪.‬‬

‫وقد لوحظ أن البكتريا التي تنتج مستعمرات مخاطية ‪ Mucoid‬يكون فصلها صعب عن غير المخاطية ‪Nonmucoid‬‬
‫بطريقة األطباق المخلوطة ‪,‬ولكن يمكن فصلها بطريقة األطباق المصبوبة‪.‬‬
‫الصفات المزرعية لمستعمرات البكتيريا‬
‫===================‬
‫تشمل الصفات المزرعية للكائن البكتيري المظهر المرئي بالعين المجردة للنمو فوق أو في بيئات مختلفة ‪ .‬والهدف من‬
‫دراسة الصفات المزرعية لمستعمرات البكتيريا هو التعرف على أنواع البكتيريا المختلفة‪.‬‬
‫ويمكن تقسيم الصفات المزرعية للبكتيريا إلى‪:‬‬
‫أوال ‪ :‬الصفات المزرعية عند نمو البكتيريا على البيئات الصلبة‬
‫‪ .1‬شكل المستعمرة‪S‬‬
‫• نقطية‬
‫• دائرية‬
‫• خيطية‬
‫• غير منتظمة‬
‫• جذرية‬
‫• مغزلية‬
‫‪ .2‬ارتفاع المستعمرة‬
‫• مسطحة‬
‫• مرتفعة‬
‫• محدبة‬
‫• كثيرة التحدب‬
‫• مرتفعة المركز‬
‫‪ .3‬شكل حافة المستعمرة‬
‫• كاملة‬
‫• مموجة‬
‫• مفصصة‬
‫• مسننة‬
 ‫• مجعدة‬
‫• خيطية‬
‫‪ .4‬سطح المستعمرة‬
‫• ناعم‬
‫• خشن‬
‫‪ .5‬الصفات الضوئية للمستعمرة‬
‫• معتمة‪ :‬ال تسمح للضوء بالمرور خاللها‪.‬‬
‫• نصف شفافة‪ :‬تسمح للضوء بالمرور خاللها ولكن التسمح بالرؤية الكاملة لألشياء خلفها‪.‬‬
‫‪ .6‬قوام المستعمرة‬
‫• زبديا‬
‫• لزجا‬
‫• غشائيا‬
‫• هشا‬
‫‪ .7‬لون المستعمرة‬
‫(أ) تفرز بعض البكتيريا صبغات غير ذائبة في الماء تلون المستعمرات‪ S‬والتلون البيئة وقد تكون لون المستعمرات أصفر‬
‫أو أحمر أو‪........‬الخ ومن أمثلتها البكتيريا‪ Xanthomonas‬التي تظهر مستعمراتها باللون األصفر‪.‬‬

‫(ب) كما تفرز بعض البكتيريا األخرى صبغات \ائبة في الماء تلون البيئة وال تلون المستعمرات مثل بعض أنواع الجنس‬
‫‪ Pseudomonas‬والتي تفرز صبغة فلوريسينية ذائبة في الماء لونها أخر مصفر‪.‬‬

‫ثانيا‪ :‬وصف النمو البكتيري على بيئة األجار المغذي المائل‬

‫‪ .1‬كمية النمو البكتيري‬
‫• ضئيل‬
‫• متوسط‬
‫• غزير‬
‫‪ .2‬شكل النمو‬
‫• محزز‬
‫• شجري‬
‫• غشائي‬
‫• جذري‬
‫• مفكك‬
‫• شوكي‬
‫‪ .3‬الرائحة‬
‫أ‌‪ -‬ليس له رائحة‬
‫ب‌‪ -‬اذا وجدت رائحة يذكر مدى تشابهها ألي روائ معروفة‬
 ‫ت‌‪-‬‬
‫ثالثا‪ :‬وصف النمو البكتيري في بيئة المرق المغذي‬
‫========================‬
‫‪ .1‬النمو على سطح المنبت‬
‫أ‌‪ -‬اليوجد نمو سطحي‬
‫ب‌‪ -‬حلقة محيطة بالسطح‬
‫ت‌‪ -‬قشرة رقيقة تغطي السطح‬
‫ث‌‪ -‬نمو سطحي متجمع (كتل بكتيرية ملتتصقة ببعضها تطفو على السطح)‬
‫ج‌‪ -‬نمو غشائي سميك‬
‫ح‌‪-‬‬
‫‪ .2‬النمو تحت السطح‬
‫• اليوجد نمو‬
‫• عكر‬
‫• حبيبي‬
‫‪ .3‬النمو المترسب‬
‫• اليوجد راسب‬
‫• راسب حبيبي‬
‫• راسب متكتل‬
‫• راسب لزج‬
‫• راسب قشري‬
‫الخواص المزرعيه لمستعمرات البكتيريا‬
‫عمر الزرع‪....................‬‬
‫النمو‪ :‬بطيئ_سريع_متوسط‬
‫أوال‪:‬وصف النمو البكتيري على بيئه االجار المغذي‬
‫‪-1‬شكل المستعمره‬
‫أ‪ -‬نقطية ب‪ -‬دائريه ج‪ -‬خيطيه د‪-‬غير منتظمه هـ ‪ -‬جذرية و‪ -‬مغزلية‬
‫‪_2‬ارتفاع المستعمره‬
‫أ‪ -‬مسطحه ب‪ -‬مرتفعه ج‪ -‬محدبه د‪ -‬كثيرة التحدب هـ ‪ -‬مرتفعه المركز‬
‫‪_3‬شكل حافة المستعمره‬
‫أ‪ -‬كاملة ب‪ -‬مموجة ج‪-‬مفصصة د‪-‬مسننة هـ ‪ -‬مجعدة وخيطية‬
‫‪_4‬سطح المستعمره‬
‫أ‪ -‬ناعم ب‪ -‬خشن‬
 ‫‪ _5‬الصفات الضوئيه للمستعمرة‪S‬‬
‫أ‪ -‬معتمة ب‪ -‬نصف شفافة‪S‬‬
‫‪ _6‬قوام المستعمره‪S‬‬
‫أ‪ -‬زبديا ب‪ -‬لزجا ج‪-‬غشائيا د‪-‬هشا‬
‫‪_7‬لون المستعمرة‪...............‬‬
‫ثانيا‪:‬وصف النمو البكتيري على بيئه االجار المغذي المائل‬
‫‪-1‬كمية النمو البكتيري‬
‫أ‪ -‬ضئيل ب‪ -‬متوسط ج‪-‬غزير‬
‫‪_2‬شكل النمو‬
‫أ‪ -‬محزز ب‪ -‬شجري ج‪ -‬غشائي د‪ -‬جذري هـ ‪ -‬مفكك و‪-‬شوكي‬
‫‪ _3‬الرائحة‬
‫أ‪ -‬ليس له رائحة ب‪-‬اذاوجدت رائحه يذكر مدى تشابهها ألي روائح معروفة‬
‫ثالثا‪:‬وصف النمو البكتيري في بيئه المرق المغذي‬
‫=========================‬
‫‪_1‬النمو على سطح المنبت‬
‫ا‪-‬اليوجد نمو سطحي ب‪ -‬حلقه محيطة بالسطح ج‪-‬قشرة رقيقه تغطي السطح‬
‫د‪-‬نمو سطحي متجمع(كتل بكتيريه ملتصقه ببعضها تطفو على السطح)‬
‫هـ ‪ -‬نمو غشائي سميك‬
‫‪_2‬النمو تحت السطح‬
‫أ‪-‬اليوجدنمو ب‪-‬عكر ج‪ -‬حبيبي‬
‫‪_3‬النمو المترسب‬
‫أ‪-‬اليوجد راسب ب‪-‬راسب حبيبي ج‪ -‬راسب متكتل د‪-‬راسب لزج هـ ‪ -‬راسب قشري‬

‫)‪ Bacterial Growth curve (cycle‬اطوار النمو البكتيري‬

‫‪ .1‬طور الركود او التأقلم‪Lag phase‬‬

‫ويبدأ هذا الطور عند وصول البكتيريا الى بيئة جديدة ‪ ،‬فال تبدأ الخلية البكتيرية في االنقسام والتكاثر ‪ ،‬بل تعمل على‬
‫التاقلم مع هذا الوسط الجديد فيكون عددها ثابتا ‪.‬‬

‫‪ .2‬طور النمو اللوغارتيمي (النمو السريع) ‪Logarithmic Growth Phase‬‬

‫وخالل هذا الطور تكون البكتيريا قد تأقلمت مع البيئة الجديدة ‪.‬‬

‫‪ .3‬طور االنقسام الثابت ‪Stationary phase‬‬

‫يكون االنقسام محدوداً وتكون أعداد البكتيريا الميتة متساويا ً مع أعداد البكتيريا الحية ‪.‬‬

‫‪ .4‬طورالموت او االنحدار ‪Death (Decline) Phase‬‬

‫و في هذا الطور يستمر نقص الغذاء مع ازدياد المواد السامة‪ S‬في البيئة المحيطة بالبكتيريا‪.‬‬
 .‫ طورالركود‬-1
. ‫ طور النمو السريع‬-2
.‫ طور االنقسام الثابت‬-3
.‫ طور الموت او االنحدار‬-4

:‫الميكروبية العالمية‬
==========
‫ صبغة الجرام التفاعل واشكال الخاليا‬،‫ البكتيرية‬S‫المستعمرات‬
===============================

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/shape.htm

========================================

…http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/myxococc.htm

==============================================

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/xanthan.htm#Top

============================================

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/bt.htm#Top

=======================================

…http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/airborne.htm

============================================

…http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/winograd.htm

=============================================

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/cyano.htm#Top

===========================================

…http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/index.htm

============================================

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/proteus.htm#Top

============================================

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/control.htm#Top

============================================

…http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/penicill.htm

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/thermo.htm#Top

http://archive.bio.ed.ac.uk/jdeacon/microbes/nitrogen.htm
 ‫دراسة عن جودة مياه الشرب بمدينة الرياض‬
‫========================‬

‫‪http://www.building-tech-mag.com/researches/14/derasat-an-jawdat-meyah.pdf‬‬

‫تحاليل الماء بكتريولوجيا‬

‫============‬
‫طريقة االنبوب المتعدد‬
‫=============‬
‫تعتبر واحدة من أقدم الطرق المستخدمة‪ .‬في هذه الطريقة العينة (تقريبا ‪ 10‬ميلي) يتم تخفيفها بإضافة ‪ 100‬ميلي من‬
‫وسط زراعي معقم‪ .‬يتم اخذ عينة من هذا المحلول (‪ 10‬ميلي) وتوضع في عشرة انابيب‪ .‬العشرة ميلي األخيرة يتم‬
‫تخفيفها وتم عمل نفس العملية مجدداً ‪ .‬بعد االنتهاء من تكرار هذه العلية ل خمس مرات سيصبح عدد الالنابيب ‪ 50‬انبوب‬
‫والتخفيف سيبدا من ‪ 1:10‬إلى ‪ . 1:10000‬بعد ذالك‪ ،‬تتم عملية حضانة لالنابيب في درجة حرارة معينه ووقت محدد ثم‬
‫يتم حساب‪ S‬عدد االنابيب التي حصل في نمو‪ .‬باستخدام الجداول االحصائية يتم تحديد تركيز الميروكبات في العينة االصلية‬
‫(قبل التخفيف)‪ .‬هذه العملية يكمن أن تطور باستخدام وسط زراعي يحدد إنتاج الحمض بتغير لون الوسط وأيضا باستخدام‬
‫انبوبة مقلوبة لالكتشاف الغاز المنبعث‪ .‬الغاز المنبعث يعتبر محدد قوي لوجود إشريكية قولونية‪.‬‬
‫اختبار ثالثي فوسفات األدينوسين ثالثي فوسفات األدينوسين‬
‫=============================‬
‫اختبار ثالثي فوسفات األدينوسين يكون عملية قياس سريعة للميكروبات النشطة في الماء عبر الكشف عن ثالثي فوسفات‬
‫األدينوسين أو ‪ .ATP‬ثالثي فوسفات‪ S‬األدينوسين هو جزيء يوجد فقط في وحل الخاليا الحية وهو يعطي قياس مباشر‬
‫للتركيز الحيوي والصحي‪.‬يتم قياس كمية ‪ ATP‬عن طريق الضوء الصادر عبر تفاعله مع انزيم ليوسيفيريز ‪Luciferase‬‬
‫عن طريق ‪ . Luminometer‬كمية الضوء الصادر تعبر عن كمية الطاقة الحيوية الموجودة في العينة‪ .‬الجيل الثاني من‬
‫اختبارات ‪ ATP‬صممت خصيصا للماء‪ ،‬مخلفات الماء واالستخدامات الصناعية‪.‬‬

‫عد الطبق‬
‫======‬
‫طريقة عد الطبق تعتمد على نمو البكتيريا على شكل مستعمرة على وسط مغذي‪ .‬المستعمرة يمكن مشاهدتها بالعين‬
‫المجردة وبالتالي يتم عد المستعمرات‪ S‬الموجودة في الطبق‪ .‬للفاعلية‪ ،‬يتم تخفيف العينة لتصبح عدد المستعرات حوالي ‪30‬‬
‫‪ 300-‬مستعمرة في الطبق‪ .‬اقل من ‪ 30‬مستعمرة تعتبر غير كافية للعد وأيضا أكثر من ‪ 300‬مستعمرة تجعل من عملية‬
‫العد أكثر صعوبة‪ .‬لذالك عدة تخفيفات يجب أن تعمل للعينة للحصول على عدد مناسب من المستعمرات للعد‪ .‬التجربة‬
‫المخبرية تشمل تخفيف العينة بشكل تسلسلي (‪ )etc 1:1000, 1:100, 1:10‬في ماء معقم وتطعيمها على اجار مغذي‬
‫في طبق يكون مغلق ومن ثم تتم حضانته‪ .‬األوساط النموذجية تشمل اجار عد الطبق للعد العام ‪Plate count agar‬‬
‫وماكونكي اجار ‪ MacConkey agar‬لعد بكتيريا سالبة صبغة جرام على سبيل المثال إشريكية قولونية‪ .‬مجموعة أولى‬
‫من االطباق تحضن عند ‪ C° 22‬لمدة ‪ 24‬ساعة والمجوعة الثانية عند ‪ C° 37‬لمدة ‪ 24‬ساعة‪ .‬تركيب المغذي عاد ًة‬
‫يتضمن على مواد تقاوم نمو الميكروبات الغير مستهدفة ويجعل الميركوبات المستهدفة سهلة التعرف وعاد ًة بواسطة تغير‬
‫لون الوسط‪ .‬بعض الطرق الحديثة تحتوي على عامل مضيء والتي يجعل عملة العد بشكل آلي‪ .‬في نهاية فترة الحضانة‪،‬‬
‫يتم عد المستعمرات بالعين المجردة‪.‬‬
‫غشاء الترشيح‬
‫=======‬
‫يتم ترشيح االنابيب التي تحتوي على التخفيفات المتسلسلة على غشاء الترشيح ومن ثم هذه االغشية توضع على الوسط‬
‫المغذي داخل الطبق‪.‬هذه الطريقة تعير مشابهه‪ S‬ل طريقة عد الطبق الكامل التقليدية هذي االغشية تحتوي على شبكة من‬
‫الفتحات الصغيرة (ميليمتر)‪.‬ويمكن ان تعد مستعمرات أكثر باستخدام المجهر‪.‬‬
 ‫سكب االطباق‬
‫======‬
‫عندما يكون الهدف هو البحث عن أنواع البكتيريا التي تنمو بصورة ضعيفة في الجو‪ ،‬التحليل المبدئي يعمل بواسطة مزج‬
‫تخفيفات متسلسلة من العينة في اجار مغذي سائل وهو الذي يسكب في قوارير ثم يتم اغالقة ويوضعون على اجنابهم ليتم‬
‫تكون اجار السطح المائل‪.‬المستعمرات‪ S‬التي تظهر على الوسط يمكن عدها بواسطة العين المجردة‪ .‬العدد الكامل من‬
‫المستعمرات‪ S‬يمثل العدد الحيوي الكامل‪.‬وحدة القياس تكون ‪ cfu/ml‬أو وحدات المستعمرات‪ S‬المتكونة في ميلي متر وتربط‬
‫بالعينة األساسية‪.‬عملية الحساب تكون بضرب معامل التخفيف في عدد المستعمرات‪.‬‬
‫انواع األوساط المغذية المستخدمة في التحليل‬
‫=======================‬

‫اجار ماكونكي ‪MacConkey agar‬‬

‫=======================‬
‫عبارة عن وسط زراعي صمم لنمو بكتيريا سالبة صبغة جرام وتختلف لون المستعمرات وفقا ً إلى االستجابة إلى تخمر‬
‫االكتوز‪ .‬تحتوي أيضا ً على أمالح الصفراء (يثبط نمو بكتيريا موجبة صبغة جرام)‪ ،‬صبغة ‪( crystal violet‬أيضا يثبط‬
‫نمو بكتيريا موجبة صبغة جرام) ‪,‬صبغة ‪( neutral red‬يصبغ البكتيريا المخمره لالكتوز)‪ ،‬الكتوز وببتيد‪.‬‬

‫الوسط ‪ ENDO‬يحتوي على ببتيد والكتوز ‪ ،Dipotassium phosphate,‬اجار‪ ،‬كبريتيت الصوديوم‪basic fuchsin ،‬‬
‫وكان تم تطويره لعزل ‪ Salmonella typhi‬لكنه اآلن يستخدم في تحليل الماء‪.‬كما في اجار ماكونكي ‪,‬ميكروبات‬
‫‪ coliform‬تخمر االكتوز ولون المستعمرة يصبح احمر‪ .‬الميكروبات التي ال تخمر االكتوز يصبح لون المستعمرة عديم‬
‫اللون‪.‬‬

‫وسط ‪mFC‬‬

‫=======‬

‫يستخدم في عملية غشاء الترشيح الذي يحتوي على عوامل محددة ومفرقة‪ .‬أحد هذه العوامل يكون ‪ Rosolic acid‬الذي‬
‫يثبط نمو البكتيريا عدا ‪ coliforms‬البرازية‪ ،‬األمالح الصفراء تثبط البكتيريا ‪ non-enteric‬و ‪ Aniline blue‬يحدد‬
‫مقدرة ‪ coliforms‬البرازية على تخمير االكتوز وإنتاج الحمض الذي يغير من ‪ PH‬األس الهيدروجيني للوسط‪.‬‬

‫وسط ‪TYEA‬‬

‫========‬

‫يحتوي على ‪ Tryptone، Yeast extract‬وأمالح عامة و ‪.L-arabinose‬يعتبر ليس وسط اختاري وعاد ًة ما يتم‬
‫تصطيمه عند درجة حرارة( ‪ )22c and 36 °C‬لتحديد المستوى العام من التلوث‪.‬‬

‫األختبارات الواجب عملها فى عينة مياه الشرب حسب المواصفات القياسيه المصريه‪:‬‬
‫===========================================‬

‫‪Total plate count at 37°C/ 24h -1‬‬

‫‪Total plate count at 22°C/ 48h -2‬‬

‫‪Total Coliform -3‬‬

‫‪E.coli -4‬‬

‫‪Faecal streptococci -5‬‬

‫==================================‬
‫مشروع دعم قطاع مياه الشرب و الصرف الصحي‬
 http://pdf.usaid.gov/pdf_docs/Pnady300.pdf

‫تحليل المياه‬
======

https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/BR-70541-Water-Quality-Analysis-
BR70541-EN.pdf