cccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccccc
cc

p

    
  ! "#

BӜ Y p$%&'(&)*+(,p- NHÓM TQTP

Tӂ p(78*1&,9:p(&;p
./p'0p1p2
<=(>(?@@A'
33345/336Có hiӋu
R
  R
 
lӵc tӯ ngày 25 tháng
R
 
3 năm 2003
R
   R 
pBC*p(D'2()@

4#EF
G H

Sӱ dөng kӻ thuұt đә đĩa, đӃm khóm nҩm trên môi trưӡng thҥch
Sabouraud sau khi ӫ hiӃu khí ӣ nhiӋt đӝ 28 ± 1 o C trong thӡi gian 5
ngày. Sӕ lưӧng bào tӱ nҩm mӕc có trong 1g(1ml) mүu kiӇm tra đưӧc
tính tӯ sӕ khóm nҩm đӃm đưӧc tӯ các đĩa nuôi cҩy theo các đұm đӝ pha
loãng.

Sau đó, đӇ xác đӏnh tên (đӏnh danh) nҩm mӕc (đӃn nhóm) phҧi tiӃn hành
qua nhұn xét đҥi thӇ vӅ đһc điӇm khuҭn lҥc nҩm mӕc (colony characters)
và nhұn xét vi thӇ vӅ hình thái hӑc cӫa khuҭn lҥc nҩm mӕc
(morphology).

2. Phҥm vi áp dөng

Đӏnh danh nҩm mӕc R
R

 R

 trong các sҧn phҭm
lương thӵc thӵc phҭm.

6#>IIJ
K L M

6#4#>II MN
´өng cө và thiӃt bӏ chuyên dөng trong phòng kiӇm nghiӋm vi sinh vұt.

6#/#@J
 L M

- Thҥch Sabouraud

- Thҥch Czapeck

- Nưӟc thҥch 1 0 / 00

- ´ung dӏch Lactofenol Amann

O#' "NJ
KP Q

O#4#' "NJ


Môi trưӡng nuôi cҩy, nưӟc pha loãng và dung dӏch cҫn thiӃt đưӧc điӅu
chӃ theo công thӭc. Các môi trưӡng đưӧc đóng sҹn vào bình cҫu, bình
nón, ӕng nghiӋm và đưӧc hҩp tiӋt trùng (110 o C/30 phút hoһc 121 o
C/15 phút).

O#/#' "NPK P Q

4.2.1 Chuҭn bӏ mүu

Mүu thӵc phҭm đưӧc cҳt nhӓ hoһc xay nhuyӉn bҵng máy trong điӅu kiӋn
vô trùng cho tӟi khi đưӧc thӇ đӗng nhҩt.

4.2.2 Chuҭn bӏ dung dӏch mүu thӱ 10 -1

Cân chính xác 25g thӵc phҭm đã đưӧc chuҭn bӏ (hoһc hút 25ml thӵc
phҭm lӓng), cho vào bình nón chӭa sҹn 225ml nưӟc thҥch 1 0 / 00 . Lҳc
đӅu 2-3 phút, thu đưӧc dung dӏch mүu thӱ 10 -1.

4.2.3 Chuҭn bӏ dung dӏch mүu thӱ 10 -2 , 10 -3, 10 -4 «

- Hút chính xác 1 ml dung dӏch mүu thӱ 10 -1 cho sang ӕng nghiӋm
chӭa sҹn 9 ml nưӟc thҥch 1 0 / 00 . Lҳc đӅu trong 2-3 phút, thu đưӧc
dung dӏch 10 -2 .

- TiӃp tөc làm tương tӵ như vұy, ta thu đưӧc các dung dӏch mүu thӱ
tương ӭng 10 -3 , 10 -4 « .

O#6#2
G HM K 

x
[ Nuôi cҩy mүu

- Ghi ký hiӋu mүu và nӗng đӝ dung dӏch mүu thӱ lên hӝp lӗng.

- ´ùng pipet 1 ml vô trùng, hút chính xác 1 ml tӯ dung dӏch mүu thӱ ӣ
tӯng đұm đӝ cho vào giӳa mӛi hӝp lӗng. Mӛi mүu thӵc phҭm phҧi đưӧc
nuôi cҩy ít nhҩt 3 đұm đӝ pha loãng. Mӛi đұm đӝ pha loãng phҧi đưӧc
nuôi cҩy trong 2 hӝp lӗng vô trùng và dùng 1 pipet 1 ml vô trùng riêng.

- Đun nóng chҧy thҥch sabouraud, đӇ nguӝi đӃn 45 ± 1 o C. Trong điӅu

kiӋn vô trùng chӍnh pH cӫa thҥch đӃn 4,5 ¸ 5,5 bҵng dung dӏch axit lactic
20 % , hoһc 40 % , hay bҵng dung dӏch axit xitric 20 % .

- Rót vào tӯng hӝp lӗng 12 ¸ 15 ml thҥch sabouraud, trӝn đӅu dung dӏch
mүu thӱ vӟi thҥch bҵng cách xoay tròn sang phҧi và sang trái 3 lҫn.

- ĐӇ các đĩa thҥch đông tӵ nhiên trên mһt phҷng ngang. Sau đó đӇ các
đĩa thҥch vào tӫ ҩm 28 ± 1 o C hoһc nhiӋt đӝ phòng thí nghiӋm tương
ӭng trong 5 ngày. Không lұt ngưӧc các đĩa.

Lưu ý[ Thӡi gian tӯ khi bҳt đҫu pha loãng mүu thӱ đӃn khi rót thҥch vào
hӝp lӗng không đưӧc quá 30 phút.

x
[ Sơ bӝ nhұn đӏnh kӃt quҧ

- Chӑn các đĩa có không quá 50 khóm nҩm đӇ sơ bӝ đӑc kӃt quҧ.

- ĐӃm và ghi lҥi sӕ khóm nҩm nghi ngӡ là R
 (có màu xanh lөc
hoһc vàng lөc) ӣ tӯng đұm đӝ. Sau đó dùng que cҩy nhӑn đҫu lҩy mӝt ít
bào tӱ cҩy ba điӇm cách đӅu nhau trên đĩa thҥch Czapek, ӫ ҩm 28 ± 1 o
C trong 5 ngày. Không lұt ngưӧc các đĩa.

- ĐӃm và ghi lҥi sӕ khóm nҩm nghi ngӡ là R

 (có màu đen, hoһc
nâu thүm lҩm tҩm như bã cafe) ӣ tӯng đұm đӝ. Sau đó dùng que cҩy
nhӑn đҫu lҩy mӝt ít bào tӱ cҩy ba điӇm cách đӅu nhau trên đĩa thҥch
Czapek, ӫ ҩm 28 ± 1 o C trong 5 ngày. Không lұt ngưӧc các đĩa.

- ĐӃm và ghi lҥi sӕ khóm nҩm nghi ngӡ là R


 (có màu xanh lá
cây đұm hay còn gӑi màu ám khói) ӣ tӯng đұm đӝ. Sau đó dùng que cҩy
nhӑn

đҫu lҩy mӝt ít bào tӱ cҩy ba điӇm cách đӅu nhau trên đĩa thҥch Czapek,
ӫ ҩm 28 ± 1 o C trong 5 ngày. Không lұt ngưӧc các đĩa.

x
[ Đӏnh danh

ĐӇ xác đӏnh tên nҩm mӕc, tӯ nhӳng khóm nҩm trên thҥch Czapek tiӃn
hành nhұn xét đҥi thӇ, vi thӇ.

<R S5Bҵng mҳt thưӡng, hay dùng kính lúp cҫm tay ta nhұn xét vӅ
kích thưӟc, màu sҳc « cӫa khóm nҩm.

T S5ĐӇ nhұn xét nҩm mӕc vӅ vi thӇ phҧi làm tiêu bҧn nҩm mӕc, rӗi
quan sát hình thái hӑc dưӟi kính hiӇn vi ӣ vұt kính 10, 40. Có thӇ chӑn 1
trong 2 cách sau đӇ làm tiêu bҧn nҩm mӕc[


[ Lҩy mӝt lam kính sҥch, trong, đã sҩy khô. Nhӓ 1 giӑt
Lactophenol Amann lên giӳa lam kính. ´ùng que cҩy nhӑn đҫu lҩy mӝt
phҫn khóm nҩm mӑc trên đĩa thҥch Sabouraud (cҧ phҫn mӑc trên và
dưӟi mһt thҥch) đӇ vào giӑt dung dӏch Lactophenol Amann. ´ùng kim
có cán hay que cҩy nhӑn dìm nҩm vào giӑt dung dӏch Lactophenol
Amann đӇ thҩm ưӟt. Khi nҩm bӏ thҩm ưӟt hoàn toàn thì đұy lá kính lên
trên và ép nhҽ.

 
- Khi đұy lá kính đӯng đӇ có bӑt khí, nӃu có sӁ gһp khó khăn trong khi
soi kính.

- Khi ép nhҽ lá kính, nên dùng giҩy thҩm bӟt dung dӏch Lactophenol
Amann thӯa đӇ dung dӏch không tràn lên trên mһt lá kính.


Lҩy mӝt lam kính sҥch, trong, đã sҩy khô. Lҩy mӝt đoҥn giҩy
bóng kính có kích thưӟc rӝng khoҧng 1cm, dài khoҧng 2-3cm, rӗi chҥm
vào khóm nҩm mӑc trên đĩa thҥch Sabouraud sao cho lҩy đưӧc toàn bӝ
hình thái cӫa nҩm (tӯ tӃ bào chân đӃ đӃn hҥt đính). Sau đó trҧi dài giҩy
bóng kính trên lam kính.



pE <R S T S


R
 Khóm nҩm mӕc có
đưӡng kính d = 3 ¸ 5 cm
(hình 2) trên thҥch Czapek sau 5
ngày. Khóm nҩm lúc
đҫu hơi vàng, cuӕi cùng
trӣ nên xanh lөc hoһc
vàng lөc, đôi khi hoá
nâu khi già.
R
Bông lӟn hình cҫu, hình tia,
đôi khi tҥo thành nhӳng cӝt
không rõ rӋt. Bӑng hình cҫu
đӃn gҫn cҫu. ThӇ bình 1 hoһc
2 tҫng, ӣ đa sӕ loài thӇ bình 2
tҫng. Vách cuӕng conidi xù
xì. Hҥt đính hình cҫu đӃn gҫn
cҫu, trơn hoһc có gai.

 Khóm nҩm mӕc có Bông hình cҫu có màu đen.
đưӡng kính 4 ¸ 5 cm Bӑng hình cҫu. ThӇ bình 1
(hình 3) trên thҥch Czapek sau 5 hoһc 2 tҫng, ӣ đa sӕ loài thӇ
ngày. Khóm nҩm mӕc bình 2 tҫng, Metulae dài gҩp
màu đen hoһc nâu đen đôi tҫng Phialides. Vách
lҩm tҩm như bã cafe. cuӕng conidi trơn. Hҥt đính
hình cҫu đӃn gҫn cҫu, có gai
rõ.
R

 Khóm nҩm mӕc có Bông hình cӝt (hình trө) dày
đưӡng kính 3 ¸ 5 cm đһc, điӇn hình có đưӡng kính
(hình 4) trên thҥch Czapek sau 5 chӛ nào cũng đӅu nhau ( vì
 ngày. Khóm nҩm có chuӛi conidia kӃt lҥi tҥo thành
màu xanh lá cây đұm như nhӳng khúc trө
hay còn gӑi là màu ám columnar). Bông non không
khói. có hình cӝt, thưӡng có dҥng
gөc xuӕng mӝt bên. Trên
cùng mӝt khóm nҩm mӕc ta
thҩy đưӧc cҧ 2 loҥi hình ҧnh
bông này. Vách cuӕng conidi
trơn. Bӑng hình chuǤ rõ. ThӇ
bình dӭt khoát mӝt tҫng.

 !"
ĐӇ xác đӏnh tәng sӕ bào tӱ nҩm mӕc có trong 1g (1ml) mүu kiӇm
nghiӋm, chӑn nhӳng đĩa có không quá 50 khóm nҩm cӫa 2 đұm đӝ pha
loãng liên tiӃp. Sӵ phân bӕ các khóm nҩm phҧi hӧp lý[ đӝ pha loãng
càng cao thì sӕ khóm nҩm càng ít. KӃt quҧ đưӧc tính theo công thӭc sau[

N = C / ( n 1 + 0,1 x n 2 )x d

 

  


 

  !" 

 
! 

#$%!" 
 !" ! 

1. NӃu chênh lӋch các giá trӏ ӣ 2 đұm đӝ lӟn hơn 2 lҫn thì lҩy giá trӏ ӣ
đұm đӝ pha loãng thҩp hơn đӇ tính kӃt quҧ bҵng cách tính trung bình
cӝng.

2. NӃu 2 đĩa cӫa đұm đӝ pha loãng ban đҫu có ít hơn 5 khóm nҩm thì
tính kӃt quҧ theo trung bình cӝng.

2  MJ


4#
U R 
Thҥch 1g

Nưӟc cҩt 1000 ml

Pha chӃ[ Đun nhӓ lӱa, quҩy đӅu đӃn khi sôi đӇ hoà tan thҥch. Rót vào
các bình nón có dung tích 500 ml mӛi bình 225 ml môi trưӡng và vào
các ӕng nghiӋm 18 mӛi ӕng 9 ml môi trưӡng. TiӋt khuҭn trong nӗi hҩp ӣ
nhiӋt đӝ 120 o C/15 phút.

Môi trưӡng đưӧc bҧo quҧn trong tӫ lҥnh ӣ nhiӋt đӝ tӯ 0 đӃn 5 o C không
quá 30 ngày.

/#p R VN 

Pepton 10g
Glucose 20g
Thҥch 15-20g
Nưӟc cҩt 1000 ml
Pha chӃ[ Đun nhӓ lӱa, quҩy đӅu đӃn khi sôi đӇ hoà tan các chҩt. Rót vào
bình cҫu có dung tích 250 ml mӛi bình 150 ml môi trưӡng. TiӋt khuҭn
trong nӗi hҩp ӣ nhiӋt đӝ 110 o C/30 phút.

NӃu môi trưӡng sӱ dөng ngay, đӇ nguӝi đӃn 45 ± 1 o C ӣ nӗi cách thuӹ,
nӃu chưa sӱ dөng thì bҧo quҧn trong tӫ lҥnh ӣ nhiӋt đӝ tӯ 0 đӃn 5 o C
không quá 30 ngày.

6#p R 'W 
NaN0 3 3,5g
K 2 HP0 4 1,5g
MgS0 4 0,5g
KCl 0,5g
FeS0 4 0,1g
Đưӡng kính 30g
Thҥch 20g
Nưӟc cҩt 1000ml
 pH = 4,5 ¸ 5,5

Pha chӃ[ Đun nhӓ lӱa, quҩy đӅu đӃn khi sôi đӇ hoà tan các chҩt. ĐӇ
thҥch nguӝi đӃn 45 ± 1 o C rӗi chӍnh pH đӃn 4,5 ¸ 5,5. Rót vào bình cҫu
có dung tích 250 ml mӛi bình 150 ml môi trưӡng. TiӋt khuҭn trong nӗi
hҩp ӣ nhiӋt đӝ 110 o C/30 phút. Thҥch đӇ nguӝi đӃn 45 ± 1 o C rӗi đә
vào các hӝp lӗng, mӛi hӝp 15 ¸ 18 ml thҥch. ĐӇ đĩa thҥch đông tӵ nhiên,
bҧo quҧn trong tӫ lҥnh ӣ nhiӋt đӝ tӯ 0 đӃn 5 0 C không quá 15 ngày.

O#> X Y 

Axít fenic tinh 10g
khiӃt
Axít lactic 10g
Glyxerin 20g
Nưӟc cҩt 10g

Pha chӃ[ Các thành phҫn trên đӅu cân chӭ không đong. Trӝn đӅu và lҳc
kӻ 3 chҩt axít lactic, glyxerin, nưӟc cҩt, rӗi cho axít fenic vào lҳc đӅu.
Sau đó đӵng hӛn hӧp dung dӏch trên trong lӑ thuӹ tinh có nút mài tӕi
màu, bҧo quҧn nơi khô ráo, trong bóng tӕi ӣ nhiӋt đӝ phòng. ´ung dӏch
Lactofenol Amann khi mӟi pha thì không màu, nhưng đӇ lâu dung dӏch
chuyӇn sang màu nâu nhưng vүn dùng đưӧc.

p(78*1&,9:p(&;p
<=(pZ(T+[\<=(X7]*<^'pAT$?@
XpC_$

4#EF`
G H5

Aflatoxin đưӧc chiӃt tách tӯ mүu thӱ bҵng clorofoc. ´ӏch chiӃt đưӧc lӑc
và mӝt phҫn dӏch lӑc đưӧc làm sҥch qua cӝt silicagen. Làm bay hơi dung
dӏch rӱa giҧi và hoà cһn vӟi clorofoc hoһc hӛn hӧp benzen axetonitril.
Sau đó chҩm mӝt phҫn xác đӏnh mүu thӱ lên bҧn mӓng,chҥy sҳc ký và
so sánh Rf, màu sҳc vӃt sҳc ký cӫa mүu phân tích vӟi vӃt aflatoxin chuҭn
dưӟi đèn tӱ ngoҥi có bưӟc sóng 365nm. Lưӧng aflatoxin có thӇ xác đӏnh
bҵng mҳt hay bҵng máy đo mұt đӝ huǤnh quang.

/#<
aHI`
G H[ Xác đӏnh hàm lưӧng

aflatoxin B1, B2, G1, G2 trong các sҧn phҭm ngũ cӕc, đұu đӛ, hҥt có
dҫu.

6#>II H   Q5

6#4#>II5

3.1.1. Máy xay nghiӅn mүu

3.1.2. Máy lҳc hoһc máy khuҩy tӯ

3.1.3. Cân phân tích.

3.1.4. Máy cҩt quay chân không.

3.1.5. BӃp cách thuӹ.

3.1.6. Đèn tӱ ngoҥi có bưӟc sóng 365nm.

3.1.7. Quang phә kӃ UV-VIS.

3.1.8. Máy đo mұt đӝ huǤnh quang.

3.1.9. Các trang bӏ cӫa sҳc ký lӟp mӓng.

3.1.10. Cӝt sҳc ký thuӹ tinh, đưӡng kính trong 22mm, dài 300mm, có
khoá nút mài thuӹ tinh hoһc teflon và bình đӵng dung môi phía trên,
dung lưӧng 250ml.

3.1.11. Bình nón nút mài 250ml, 500ml.

3.1.12. ӕng đong 50ml, 100ml.

3.1.13. PhӉu lӑc, đưӡng kính 8 10 cm.

3.1.14. Micropipet Hamilton[20 m l, 50 m l

3.1.15. Bҧn mӓng kích thưӟc 20 x 20 cm tráng sҹn lӟp mӓng Silicagel
60-G

6#/#( H   Q5

Tҩt cҧ các hoá chҩt đӅu phҧi là loҥi tinh khiӃt phân tích (TKPT) nӃu
không có các chӍ dүn riêng nào khác.

3.2.1. Axêtôn

3.2.2. Clorofoc

3.2.3. n Hexan

3.2.4. Ete êtylic khan

3.2.5. Metanol

3.2.6. Axetonitril

3.2.7. Toluen

3.2.8. Natri sunfat khan

3.2.9. Celite 545, đҩt điatomit

3.2.10. Axit sunfuric 50% (v/v)

3.2.11. Axit trifluoraxectic

3.2.12. Khí nitơ

3.2.13. Bông hút nưӟc (đưӧc loҥi béo bҵng clorofoc) hoһc bông thuӹ
tinh.

3.2.14. Các hӋ dung môi khai triӇn sҳc ký.

Clorofoc/ axeton[ 9/1 (v/v) ( theo tӹ lӋ thӇ tích)

- Ete êtylic/ metanol/ nưӟc[ 94/4, 5/1,5/1 (v/v/v/v)

- Clorofoc/ axeton/ isopropanol/ nưӟc[ 88/12/1, 5/1 (v/v/v/v)

- Toluen/ êtyl axetat/ axit focmic[ 6/3/1 (v/v/v)

3.2.15. Silicagel G 60 dùng cho sҳc ký cӝt, cӥ hҥt 0,063 ¸ 0,2 mm.
Hoҥt hoá bҵng cách sҩy khô ӣ 105 o C trong mӝt giӡ, sau đó trút vào
bình tam giác nút nhám, thêm nưӟc vӟi tӹ lӋ 1ml nưӟc cho 100g
silicagel, đұy nút, lҳc đӃn khi trӝn hoàn toàn đӅu, bҧo quҧn 15 giӡ trong
bình kín.

3.2.16. Chuҭn bӏ dung dӏch aflatoxin chuҭn (điӅu kiӋn tiӃn hành[ trong
phòng mát, tránh ánh sáng)[

3.2.16.1. ´ung dӏch aflatoxin chuҭn gӕc (dung dӏch A)[

´ùng ӕng chuҭn 1 mg, mӛi loҥi aflatoxin chuҭn B1, B2, G1, G2 lҫn lưӧt
cho vào 4 bình đӏnh mӭc 100ml và đӏnh mӭc đӃn vҥch bҵng hӛn hӧp
toluen axetonitril 98[ 2 (v/v) (nӗng đӝ dung dӏch aflatoxin chuҭn là 10
m g/ml).

3.2.16.2. ´ung dӏch aflatoxin chuҭn làm viӋc (dung dӏch B)[

Cho vào mӝt bình đӏnh mӭc 10ml lҫn lưӧt 0,5 ml aflatoxin B1; 0,5 ml
aflatoxin G1; 0,1 ml aflatoxin B2, 0,1 ml aflatoxin G2 (tӯ dung dӏch A ӣ
trên), đӏnh mӭc đӃn 10ml bҵng hӛn hӧp toluen axetonitril 98[ 2 (v/v),
nӗng đӝ dung dӏch là 0,5 m g/ml đӕi vӟi B1, G1, và 0,1 m g/ ml đӕi vӟi
B2, G2.

3.2.16.3. Cҫn kiӇm tra lҥi nӗng đӝ dung dӏch aflatoxin chuҭn (dung dӏch
A m g/ml) bҵng quang phә hҩp thө phân tӱ UV-VIS, bưӟc sóng 350nm,
tính kӃt quҧ theo công thӭc[

C ( m g/ml) = 1000.m.A / e
p  b5

m Khӕi lưӧng phân tӱ aflatoxin

A Mұt đӝ quang ӣ bưӟc sóng hҩp thө.

e - Đӝ hҩp thө phân tӱ cӫa aflatoxin

Aflatoxin m ´ung m i l max e

(nm)
benzen axetonitril
(v/v)
B1 312 98[ 2 350 19800
B2 314 98[ 2 350 20900
G1 328 98[ 2 350 17100
G2 330 98[ 2 350 18200

Bҧo quҧn[

Bҧo quҧn ӣ nhiӋt đӝ thҩp hơn 0 0 C, dung dӏch A đӇ đưӧc 6 tháng và

dung dӏch B đӇ đưӧc hai tuҫn trưӟc khi dùng hoҥt hoá ӣ 110 0 C trong 1
giӡ.

O#2
G HM K 5

(ĐiӅu kiӋn tiӃn hành[ ӣ phòng mát, tránh ánh nҳng )

O#4#' "NP5

NghiӅn mүu sao cho có thӇ qua đưӧc rây có lӛ cӥ 1mm.

Chú thích[ Vӟi các mүu thӱ có hàm lưӧng chҩt béo lӟn hơn 5%, cҫn loҥi
chҩt béo bҵng cách chiӃt vӟi dung môi ête dҫu hoҧ (đӝ sôi 40 60 0 C)
sau khi đã hoàn thành công đoҥn nghiӅn mүu.
O#/#pM K cd e5

4.2.1. ChiӃt suҩt[

Cân 50g mүu đã nghiӉn nhӓ cho vào bình nút mài 500ml. Cho tiӃp 25ml
nưӟc, 25g celite 545, 250ml clorofoc, đұy nút chһt. Lҳc trong 30 phút
bҵng máy lҳc quay tròn hay máy khuҩy tӯ (hoһc lҳc kӻ bҵng tay) rӗi lӑc
qua giҩy lӑc gҩp cҥnh, bӓ 10ml dӏch lӑc đҫu, sau đó lҩy 50ml dӏch lӑc
tiӃp theo (tương đương 10g mүu thӱ). NӃu tӕc đӝ dӏch lӑc xuӕng chұm,
chuyӇn sang phӉu Bucher có chӭa 1 lӟp celite 545 dày 5mm trên giҩy
lӑc và lӑc hút chân không.

4.2.2. Làm sҥch mүu bҵng cӝt sҳc ký[

Chuҭn bӏ cӝt sҳc ký[

Cho mӝt ít bông vào đáy cӝt sҳc ký, thêm 5g natri sunfat khan. Đә
clorofoc đӃn 2/3 cӝt, sau đó cho 10 g silicagel dùng cho sҳc ký cӝt (3 -
15), vӯa cho vӯa gõ nhҽ thành cӝt cho silicagel lҳng đӅu, dùng đũa thuӹ
tinh khuҩy nhҽ đӇ tránh bӑt khí. Mӣ khoá cho clorofoc chҧy xuӕng tӯ tӯ.
Khi tӕc đӝ lҳng cӫa silicagel chұm lҥi, rút hӃt clorofoc chӍ đӇ lҥi mӝt lӟp
5cm phía trên lӟp silicagel. Thêm tӯ tӯ 15g natri sunfat khan, sau đó rút
bӟt clorofoc đӃn gҫn sát lӟp natri sunfat khan trên. Cӝt silicagel thu
đưӧc phҧi mӏn, không có bӑt khí và chú ý không đӇ cӝt bӏ khô kӇ tӯ lӟp
natri sunfat khan trên.

Trӝn 50ml dӏch lӑc trên (5 - 2) vӟi 150ml n hexan, đә cҭn thұn vào cӝt
sҳc ký đã chuҭn bӏ như trên. Loҥi bӓ dung dӏch chҧy ra. Cho tiӃp 150ml
ête êtylic khan, loҥi bӓ dung dӏch chҧy ra. Chú ý không đӇ cӝt bӏ khô,
lưu lưӧng dòng chҧy khoҧng 8 12ml /phút.

´ung dӏch rưҧ giҧi aflatoxin trên bҵng 150ml hӛn hӧp metanol
clorofoc (3 [ 97). Lҩy toàn bӝ dӏch chҧy ra tӯ khi bҳt đҫu cho dung dӏch
rӱa giҧi cho đӃn hӃt. Lưu lưӧng dòng chҧy như trên. Làm bay hơi dung
dӏch rӱa bҵng máy cҩt quay chân không ӣ nhiӋt đӝ thҩp hơn 50 o C cho
đӃn khi còn khoҧng 2 3 ml. ChuyӇn sang ӕng nghiӋm 10ml, tráng rӱa
bình cҫu bҵng clorofoc và làm bay hơi đӃn khô trên nӗi cách thuӹ ӣ
nhiӋt đӝ thҩp hơn 50 0 C, tӕt nhҩt dưӟi luӗng khí nitơ nhҽ cһn còn lҥi
trong ӕng nghiӋm là mүu phân tích. Đұy kín ӕng nghiӋm có cһn đӇ chҥy
sҳc ký lӟp mӓng.

4.2.3. Sҳc ký lӟp mӓng mӝt chiӅu[

Chuҭn bӏ[

Hoà cһn thu đưӧc ӣ trên bҵng 0,5ml hӛn hӧp benzen axetonitril (98[ 2)
và lҩy dӏch này đӇ chҩm lên bҧn sҳc ký.

Vӟi bҧn mӓng tráng sҹn trưӟc khi chҩm sҳc ký phҧi cҥo sҥch lӟp
silicagel ӣ hai cҥnh bên tҩm sҳc ký vӟi chiӅu rӝng 0,5cm. Sau đó cách
cҥnh đáy 2 cm, dùng mao quҧn hay micropipet chҩm các vӃt dung dӏch
chuҭn aflatoxin và dung dӏch mүu thӱ như sau[

1. Lҩy 2; 5;10; 20 m l dung dӏch chuҭn B ( 3.17. 2).

2. Lҩy 10 m l dӏch chiӃt vӟi 10 m l dung dӏch chuҭn B (3 .17.2).

3. Lҩy 10, 20 m l dӏch chiӃt.

- Vӟi tӯng thӇ tích như trên, 4 dung dӏch aflatoxin B1, B2, G1, G2 chuҭn
có thӇ đưӧc chҩm chӗng lên nhau.

Khai triӇn bҧn sҳc ký ӣ chӛ tӕi vӟi hӋ dung môi clorofoc axeton

(9[ 1). Sau khi tiӃp tuyӃn dung môi chҥy lên khoҧng 10cm (khoҧng 30
phút), lҩy bҧn sҳc ký ra đӇ bay hơi dung môi ӣ nhiӋt đӝ phòng, tránh ánh
sáng. Sau đó soi dưӟi đèn tӱ ngoҥi vӟi bưӟc sóng 365 nm. Các vӃt
aflatoxin B1, B2 có huǤnh quang màu xanh da trӡi; G1, G2 có huǤnh
quang màu xanh lá cây. NӃu mүu thӱ có aflatoxin sӁ xuҩt hiӋn các vӃt
cùng giá trӏ Rf vӟi các vӃt aflatoxin chuҭn.
Rf cӫa các vӃt aflatoxin trong hӋ dung môi clorofóc - axêtôn (9-1) có trӏ
sӕ trung bình như sau[

Aflatoxin B 1 [ 0,72

Aflatoxin B 2 [ 0,67

Aflatoxin G 1 [ 0,59

Aflatoxin G 2 [ 0,54

4.2.4. Thӱ nghiӋm khҷng đӏnh sӵ có mһt cӫa aflatoxin[

-Phun dung dӏch axit sunfuric 50% (v/v) lên bҧn sҳc ký, huǤnh quang
cӫa các vӃt aflatoxin sӁ chuyӇn sang màu vàng dưӟi tia tӱ ngoҥi có bưӟc
sóng 365nm.

-Rót dung dӏch iӕt 5 10% trong ête lên mӝt tҩm thuӹ tinh 20 x 20cm,
dàn đӅu ӣ khu vӵc giӳa, đӇ cho ête bay hơi hӃt còn lҥi mӝt lӟp iӕt mӓng.
Đһt úp tҩm thuӹ tinh này lên bҧn sҳc ký đã triӇn khai, cách khoҧng 1 cm
trong thӡi gian 20 30 giây. Lҩy bҧn sҳc ký ra quan sát dưӟi đèn tӱ
ngoҥi, nӃu huǤnh quang cӫa chҩt chuҭn và dung dӏch thӱ không mҩt đi,
chӭng tӓ sӵ có mһt cӫa aflatoxin.

-Chia bҧn mӓng silicagel 20 x 20 cm làm hai phҫn bҵng nhau (cách
10cm ӣ giӳa), chҩm các vӃt dӏch chiӃt mүu thӱvà dung dӏch aflatoxin
chuҭn như sau[

Phҫn 1[ Bên trái, chҩm 4 vӃt như sau.

1. 10 m l dung dӏch aflatoxin chuҭn (3.17.2)

2. 10 m l dӏch chiӃt

3. 10 m l dӏch chiӃt vӟi10 m l dung dӏch aflatoxin chuҭn (3.17.2)

4. 10 m l dung dӏch aflatoxin chuҭn (3.17.2)

Phҫn 2[ Bên phҧi,chҩm 4 vӃt như sau.

5. 10 m l dung dӏch aflatoxin chuҭn (3.17.2)

6. 10 m l dӏch chiӃt

7. 10 m l dӏch chiӃt vӟi 10 m l dung dӏch aflatoxin chuҭn (3.17.2)

8. 10 m l dung dӏch aflatoxin chuҭn (3.17.2)

Chҩm xong dùng máy sҩy nhҽ đӇ dung môi bay hӃt. Nhӓ lên 4 vӃt chҩm
ӣ phҫn 1 bên trái, mӛi vӃt mӝt giӑt axít trifluoraxetic. Che phҫn 1 (bên
trái) bҵng mӝt tҩm thuӹ tinh khác, phun lên phҫn 2 (bên phҧi) dung dӏch
axitsunfuric 50% (v/v). ´ùng máy sҩy nhҽ làm khô các vӃt chҩm rӗi mӟi
cho vào bình khai triӇn.

´ung môi khai triӇn[ Nưӟc/metanol/ete etylic 1/3/96 (v/v).

Khi dung môi lên khoҧng 13 cm, lҩy bҧn sҳc ký ra đӇ khô ӣ nhiӋt đӝ
phòng, tránh ánh sáng, soi dưӟi đèn tӱ ngoҥi ӣ bưӟc sóng 365 nm, cách
đèn 10 cm.

O#6#<H H Mf5

- Nӱa bên trái[ Các vӃt huǤnh quang aflatoxin cӫa dung dӏch aflatoxin
chuҭn và cӫa vӃt dӏch chiӃt (nӃu có) sӁ cùng có trӏ sӕ Rf ngҳn hơn bình
thưӡng, vүn giӳ nguyên màu huǤnh quang xanh .

- Nӱa bên phҧi[ Các vӃt huǤnh quang aflatoxin cӫa dung dӏch aflatoxin
chuҭn và cӫa vӃt dӏch chiӃt (nӃu có)sӁ cùng có trӏ sӕ Rf bình thưӡng, và
màu huǤnh quang xanh chuyӇn sang màu vàng.

O#O#< 
a

4.4.1. Bҵng mҳt[

Xác đӏnh hàm lưӧng aflatoxin trong dӏch chiӃt bҵng cách so sánh mұt đӝ
huǤnh quang cӫa vӃt dӏch chiӃt vӟi mұt đӝ huǤnh quang cӫa vӃt dung
dӏch chuҭn.

VӃt huǤnh quang cӫa vӃt chҩm dung dӏch aflatoxin chuҭn chӗng lên vӃt
dӏch chiӃt phҧi mҥnh hơn huǤnh quang cӫa vӃt 10 m l dӏch chiӃt và phҧi
trùng nhau. NӃu mұt đӝ huǤnh quang cӫa vӃt 10 m l dӏch chiӃt đұm hơn
mұt đӝ huǤnh quang cӫa vӃt 20 m l dung dӏch chuҭn thì phҧi pha loãng
dӏch chiӃt và tiӃn hành làm sҳc ký lӟp mӓng lҥi.

Tính kӃt quҧ

Hàm lưӧng aflatoxin (C) tính bҵng microgam trong 1 kilogam mүu đưӧc
tính theo công thӭc[

C = S xY x V / W x X

p  b5

S Nӗng đӝ aflatoxin cӫa dung dӏch chuҭn m g / ml ( ´ung dӏch B )

V ThӇ tích cuӕi cùng cӫa dӏch chiӃt kӇ cҧ nhӳng lҫn pha loãng nӃu có,
m l.

W Khӕi lưӧng cӫa mүu thӱ, ( tương ӭng vӟi thӇ tích dӏch chiӃt khi tiӃn
hành làm sҥch qua cӝt) g.

X ThӇ tích dӏch chiӃt có mұt đӝ huǤnh quang giӕng thӇ tích Y cӫa
dung dӏch chuҭn chҩm trên bҧn mӓng, m l.

Y ThӇ tích dung dӏch chuҭn có mұt đӝ huǤnh quang giӕng thӇ tích X
cӫa dӏch chiӃt chҩm trên bҧn mӓng, m l.

4.4.2. Bҵng máy đo mұt đӝ huǤnh quang.

Bưӟc sóng kích thích là 365nm và bưӟc sóng phát xҥ là 443 nm. Đӏnh
lưӧng aflatoxin trên các chҩm cӫa dӏch chiӃt bҵng cách so sánh mұt đӝ
huǤnh quang cӫa vӃt dӏch chiӃt vӟi mұt đӝ huǤnh quang cӫa vӃt dung
dӏch chuҭn.

Tính kӃt quҧ.

Hàm lưӧng aflatoxin (C), tính bҵng microgam trong 1 kilogam mүu thӱ
tính như sau[

C=AmxSxVxY/AsxWxX

Trong đó[

A m - mұt đӝ huǤnh quang cӫa vӃt mүu.

A s - mұt đӝ huǤnh quang cӫa vӃt chuҭn.

X ThӇ tích cӫa dӏch chiӃt chҩm lên bҧn mӓng ( m l ).

Y ThӇ tích cӫa dӏch chuҭn chҩm lên bҧn mӓng ( m l ).

S Hàm lưӧng aflatoxin cӫa dung dӏch chuҭn,( ng).

V ThӇ tích cuӕi cùng cӫa dӏch chiӃt kӇ cҧ nhӳng lҫn pha loãng nӃu có, (
m l).

W Khӕi lưӧng cӫa mүu thӱ, tương ӭng vӟi thӇ tích dӏch chiӃt khi tiӃn
hành làm sҥch qua cӝt,( g).

O#.0<g `
G H55 m g / kg (5 ppm)

- HӋ sӕ thu hӗi cӫa phương pháp [ 90 ± 5%.

- Sai sӕ trung bình cӫa phương pháp [ ± 10%.