IPEN-CNENISP - 00.402.552/0005-50 NAL DE ENERGIA NUCLEAR NORMA ABNT NBR BRASILEIRA 15470 Segunda edigzo 25.11.2013 Vélida a partir de 25.12.2013, Ecotoxicologia aquatica — Toxicidade aguda e crénica — Método de ensaio com Hyalella spp (Amphipoda) em sedimentos Aquatic ecotoxicology — Acute and chronic toxicity — Method for assessing the toxicity of sediment using Hyalella spp (Amphipod) Ies 13.020.40 ISBN 978-85-07-04667-7 Nimero de referéncia associacho ii BRASILEIRA ABNT NBR 15470:2013 DENORIMAS i TECNICAS ee © ABNT 2013, Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 © ABNT 2013 eserto da ABNT. ARNT ‘Av-Treze de Maio, 13 - 28° andar '20031-901 - Rio de Janeiro - PU Tel. + 55 21 9974-2300 Fax: +55 21 3974-2346 abnt@abnt.org.br ‘wwwabnt.org bt ‘Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00,402.552/0005-50 ii Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM) ‘Todos 0s direitos reservados. A menos que especiticado de outro modo, nenhuma parte desta publicagdo pode ser ‘eproduzida ou utiizada por qualquer meio, eletrdnico ou mecénico, incluindo fotocdpia e mierofilme, sem permissao por (© ABNT 2013 - Todos 8 direitos reservados2 § a & q 2 < s o 2 8 z 3 g 8 3 a Exempl ABNT NBR 15470:2013 Sumario Pagina Prefécio .. 1 Escopo 2 Referéncia normativa 3 Termos e definigées. 4 Requisitos.. 44 Lavagem de material 42 Agua de diluigao e cultivo 43 Organismo-teste... 44 Ensaio com substancia de'referéncii 5 Método de ensaio «is 54 Principio... 52 Reagentes, materiais e equipamentos 53 Preparo e preservagao das amostras. 54 Procedimentos 6 Validagao dos resultados . 7 Expresso dos resultados. 8 Relatério.. Bibliograti ‘Anexos Anexo A (normative) Sensibilidade dos organismos-teste AA Geral... A2 Ensaio de sensibilidade preliminer..... A3 Ensaio de sensibilidade definitivo.. A4 Expresso dos resultados. Anexo B (informativo) Preparo do meio MS (Metal ‘Solution .. Anexo C (informative) Cultivo de Hyalella spp. cA c2 do organismo ca Condigées de cultivo dos organismos. C4 Alimentag cs Manutengao dos cultivos. ce Obtencao de organismos para o ensaio. Anexo D (informativo) Carta-control Anexo E (informativo) Preparo de Ea Geral. imento composto. £2 Alimento composto a partir de racdo de peixe 18 E3 Alimento composto a partir de Artemia 18 Anexo F (informativo) Determinagao do crescimento 19 FA Geral... 19 F2 Massa seca . 19 (© ABNT 2013 - Todos 0s sirotos reservados iit Impresso por: Mery Piodad Zamudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 ‘Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.552/0005-50 iv Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.) (© ABNT 2013 - Todos os direitos reservados:'vo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.552/0005-50 Exemplar para uso exci ABNT NBR 15470:2013 Prefacio 4 Associacao Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) é o Foro Nacional de Normalizacéo. As Normas Brasileiras, cujo contetdo é de responsabilidade dos Comités Brasileiros (ABNT/CB), dos Organismos de Normalizagao Setorial (ABNT/ONS) e das Comissées de Estudo Especiais (ABNT/CEE), sao claboradas por Comissdes de Estudo (CE), formadas por representantes dos setores envoividos, delas fazendo parte: produtores, consumidores e neutros (universidades, laboratorios @ outros) Os Documentos Técnicos ABNT sao elaborados conforme as regras da Diretiva ABNT, Parte 2. A Associagao Brasileira de Normas Técnicas (ABNT) chama atengdo para a possibilidade de que alguns dos elementos deste documento podem ser objeto de direito de patente. A ABNT nao deve ser considerada responsdvel pela identificacdio de quaisquer direitos de patentes. A ABNT NBR 15470 fol elaborada pela Comissao de Estudo Especial de Andlises Ecotoxicolégicas (ABNT/CEE-106). O Projeto circulou em Consulta Nacional conforme Edital n? 03, de 11.03.2013 4 09.05.2013, com o ntimero de Projeto ABNT NBR 15470. Esta segunda edi¢ao candela e substitui a edicdo anterior (ABNT NBR 15470:2007), a qual foi tecnicamente revisada. © Escopo desta Norma Brasileira em inglés é o seguinte: Scope This Standard specifies a method for the determination of the lethality and/or inhibition of growth of the freshwater amphipod by whole sediment. (© ABNT 2013 - Todos 0s dretos reservados v Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami(ADM.)—<—— cS) NEY (05-$0001285 ZO¥ 00 - dSIN3NO-NAdl - HYITONN VIOWIN3 30 TWNOIOWN OYSSINOD - onSNF2x9 o8n ered JeWIO |Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM)Uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 0.402.552 Exemplar par NORMA BRASILEIRA ABNT NBR 15470:2013 ——_—. Ecotoxicologia aquatica — Toxicidade aguda e crénica — Método de ensaio com Hyalella spp (Amphipoda) em sedimentos 1 Escopo Esta Norma especifica um método de ensaio para determinacdo da letalidade e/ou inibigao do crescimento de anfipodos de agua doce do género Hyalella em sedimento integral ATENCAO Usuarios desta Norma devem estar familiarizados com as praticas de laboratorio, Esta Norma nao contempla todos os problemas de segurangasE de responsabilidade do usuério estabelecer praticas de Seguranga e sauide de acordo com os féquisitos regulatérios nacionais, IMPORTANTE E essencial que os ensalos conduzidos sejam realizados por um técnico capacitado. 2 Referéncia normativa O documento relacionado a seguir 6 relevante aplicagao desta Norma. Para referéncias datadas, aplicam-se somente as edigbes citadas. Para referéncias no datadas, aplicam-se as edicoes mais recentes do referido documento (ineluindo emendas), ABNT NBR 15469, Ecotoxicologia aquatica — Preservacao e prepare de amostras 3. Termos e definigées Para os efeitos deste documento, aplicam-se os seguintes termos e definigdes. 34 gua de diluicao gua utilizada para preparar as solugdes-estoque, solugdés-teste e controle 32 Agua natural gua coletada em campo, sem ajustes de pH e/ou sais 3.3 agua processada gua com condutividade menor que 10 uS/om, apés tratamento por destilaca ou ultrapurificagaio deionizagao 34 gua reconstituida gua processada com adi¢ao de sais ou agua natural ajustada para as condigdes exigidas pelos organismos-teste 35 amostra volume ou massa definido utilizado para 0 ensaio ecotoxicolégico (© ABNT 2013 - Todos os rots reservados 1 Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 36 carta-controle representagao grafica da avaliacaio periédica dos resultados do ensaio com uma determinada substancia de referéncia 37 controle reprodugao das condi¢des do ensaio onde nao ha presenga de amostra 38 ensaio de viabilidade ensaio realizado para avaliar a qualidade da agua de diluic&o 39 ensaio semiestatico ensaio realizado com renovacao da solugao-teste 3.10 ‘organismo-teste corganismo utilizado na fealizagao do ensaio ecotoxicolégico 3.11 solugdo-estoque mostra diluida ou sem diluigdo, a partir da qual é preparada a solucdo-teste 3.12 solucao-teste amostra diluida ou sem diluigao, na qual so expostos os organismos-teste 3.13 substancia de referéncia substancia quimica utilizada para avaliacdo da sensibilidade dos organismos-teste 3.14 sedimento-controle substrato natural ou artificial utilizado na validagao do'ensaio 3.15 toxicidade aguda efeito deletério causado pela amostra na sobrevivéncia dos organismos-teste, no periodo de exposigao do ensaio 3.16 toxicidade crénica (subletal) eteito deletério causado pela amostra no crescimento dos organismos-teste, no perfodo de exposi¢o do ensaio 4 Requisitos 4.1, Lavagem de material 4.1.1 Omaterial novo, exceto os descartaveis, utlizado no ensaio ou no cultivo dos organismos-teste, eve ser lavado com solugao de acido nitrico 10 % ou solugao de Acido cloridrico 10 %, Agua de torneira e gua processada. Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 0.402.552 2 (© ABNT 2013 - Todos 08 siretos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM)ara Uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENY/SP - 00,402.552/0005-50 e ABNT NBR 15470:2013 4.1.2 A vidraria utilizada com amostras deve ser lavada com detergente neutro, agua de torneira, acetona, Agua de torneira, solugdo de Acido nitrico 10 % ou solugdio de dcido cloridrico 10 % e, Para o processo de enxague, utilizar agua de torneira e agua processada, ou maquina para lavagem de vidraria, 4.1.3 © material utiizado com substancias quimicas deve ser lavado com solugdes adequadas para @ remogao dos contaminantes especificos e Agua processada. NOTA A limpeza inadequada dos materiais utilzados no ensaio ecotoxicolégico e na manutengao das culturas pode influenciar no resultado do ensaio. 4.2 Agua de diluicao e cultivo 4.2.1 A agua pode ser agua reconstituida ou natural, (de superficie ou subterranea). Esta agua deve apresentar pH entre 7,0 € 7,6, dureza total entre 40 mg CaCOg/L e 48 mg CaCOs/L, condutividade entre 190 a 250 e oxigénio dissolvido acima de 5,0 mg/L. 4.2.2 A agua natural (superficial ou subterranea), quando utilizada)\deve ser filtrada para remogao de material particulado e organismos. NOTA Para fitrago, pode ser utiizada rede com abertura de malha entre 60 um @ 80 um. 4.2.3 Caso a dureza total da agua natural seja inferior a 40 mg CaCOy/L, adicionar volumes ade- quados das solugdes 1 @ 2 (Tabela 1) para alingit a faixa de 40 mg CaCOg/L a 48 mg CaCOa\L. Calcular os volumes destas solugées, considerando que, para cada miligrama de dureza a ser aumentado, deve ser acrescentado 0,5 mL da solugao 1 ¢ 0,25 mL da solugao 2 e completar para 1000 mL. EXEMPLO Dureza total da agua: 4 mg CaCOa/t Dureza total desejada: 40 mg CaGogt Volume da solugao 1: 18 mL Volume da solugao 2: 9 mL. Tabela 1 - Solugées para ajuste da dureza total da égua natural Solugao Reagente Quantidade Preparo mg Dissolver ¢ completar 1 Sulfato de calcio dihidratado (CaSO4.2H20) | 1 500 ara 1 000 mL com gua processada Cloreto de potassio (KCI) 200 Dissolver e completar e Bicarbonato de sédio (NaHCOs) 4800 ara GOO RA born ‘Sulfato de magnésio heptahidratado enon ‘gua processada (MgSOq.7H20) ‘© ABNT 2013 - Todos os aretos reservados 3 Impress por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 4.2.4 As solugdes da Tabela 1 devem ser preparadas em bales volumétricos e estocadas ao abrigo da luz. 4.2.5 Caso a dureza total da agua natural seja maior que 48 mg CaCOs/L, deve ser adicionada 4gua processada 4.2.6 Para o preparo de agua reconstituida a partir de Agua processada, adicionar 20 mL da solugao 1@ 10 mL da solugao 2 em 970 mL de agua processada, conforme Tabela 1. Anexo B descreve © preparo do meio MS (Metal Solution), que também pode ser utiizado como gua reconstituida, 4.2.7 A agua deve ser aerada, no minimo 12 h antes da sua utilizago, para solubilizagao total dos sais, saturagao do oxigénio dissolvido e estabilizagéo do pH. 4.2.8 Caso 0 pH da agua ndo esteja entre 7,0 ¢ 7,6, ajustar com solugdes de Acido cloridrico (HCI) ou hidréxido de sédio (NaOH), 42.9 A qualidade da agua de diluigéio pode ser comprovada por meio do ensaio de viabilidade, Este ensaio pode ser realizado: @) expondo 10 organismos-teste de Hyalella spp por réplica, durante 96 hy utilizando no minimo duas réplicas, nas condigoes de temperatura e fotoperiodo da Tabela 2. O lote de agua de diluicao 6 aceitavel para uso se a porcentagem de letalidade nao exceder 20 %; ou ») com outro organismo-teste mais sensivel. Neste caso, as condicoes do ensaio, bem como © critério de aceitabilidade, dependem do organismo-teste selecionado. NOTA Caso haja suspeita sobre a qualidade da Agua, recomenda-se que sejam realizadas andlises uimicas para detecgéo de possiveis contaminantes. 4.3. Organismo-teste 4.3.1 No ensaio, devem ser utilizatios organismos-teste jovens com 7 dias a 14 dias de idade, que podem ser obtidos conforme Anexo\G, NOTA — Recomenda-se selecionar organismos com tamanho homogéneo. 4.3.2 O lote de organismos-teste pode ser ut acima de 20 % (C.7). zado no ensaio, desde que nao apresente letalidade 4.3.3 Os organismos-teste podem ser aclimatados na qua de diluig&o, caso sejam cultivados em agua diferente da utllizada no ensaio. Antes da realizagao do ensalo, recomenda-se a substituigao de aproximadamente 25 % do volume de agua a cada 24 h 4.4 Ensaio com substancia de referéncia 4.4.1 Asensibilidade do organismo-teste deve ser avaliada mensalmente por meio de um ensaio com uma substancia de referéncia, como cloreto de sédio (NaCl) ou cloreto de potassio (KCI), expressa pela CL(1)50-96 h (Anexo A). A escolha da substancia de referéncia deve ser realizada com critério levando em conta potenciais riscos a satide humana e ao meio ambiente. 4.4.2 Alternativamente, o ensaio com a substancia de referéncia pode ser realizado em paralelo a0 ensalo com a amostra. Caso 0 resultado nao esteja dentro dos limites da carta-controle, repetir ambos os ensaios com novo lote de organismos-teste, Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 4 (© ABNT 2013 - Todos 08 rotos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP-- 00.402.552/0005-5 4.4.3 No caso dos organismos-teste ndo serem provenientes de cultivo do proprio laboratério, © procedimento descrito em 4.4.2 deve ser adotado. 4.4.4 © ensalo com a substancia de referéncia deve ser realizado conforme A.2. A CL()50-96 h deve ser determinada conforme A.3. Esses valores devem ser utilizados na elaboragao da carta-controle (Anexo D). 4.4.5 O valor obtido no ensaio de sensibilidade deve estar compreendido em um intervalo de + 2 desvios-padrao em relagdo aos valores médios anteriormente obtidos para a mesma espécie, que correspondem a carta-controle (Anexo D).. 4.4.6 Caso 0 resultado do ensaio com a substdncia de referéncia esteja além dos limites da carta-controle, realizar novamente .owensaio dé~sensibilidade, utilizando um novo lote de organismos-teste, 4.4.7 Todos os procedimentos relationados ao ensaio devem Ser reavaliados, quando: a) dois resultados consecutivos da CL(|)50-96 h nao estiverem dentro dos limites definidos nna carta-controle; ou b) sete resultados eonsecutivos da CL()50-96 h estiverem em um mesmo lado da linha de tendéncia central 4.4.8 Durante o periodo de reavaliacao dos procedimentos, no realizar os ensaios com amostras, até que se obtenha um resultado dentro dos limites da carta-controle. 5 Método de ensaio 5.1 Principio Este método de ensaio consiste na-exposi¢ao de jovens de Hyalella spp & amostra de sedimento, durante um periodo de 10 dias em/sistema semiestatico, A toxicidade & determinada pela letalidade 2/0u inibi¢ao do crescimento dos organismosstestey'sob as condigdes de ensaio. 5.2 Reagentes, materiais e equipamentos Todos os reagentes ut ados na realizacdo do ensaio devem ser de grau analitico p.a. (Os materiais utilizados no ensaio devem ser de vidro ou quimicamente inertes. Os materiais e equipamentos utilizados na realizagao do ensaio sao: a) balanga analttica; b) _balao volumétrico; ©) medidor de oxigénio dissolvido; )_-medidor de condutividade; e) medidor de pH; © ABNT 2013 - Todos o8 rtos reservados 5 Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM)ABNT NBR 15470:2013 ) _pipeta graduada, volumétrica ou micropipeta; 9) _pipeta ou conta-gotas com diémetro adequado para manuseio dos organismos; h) proveta; i) recipiente-teste; i) termémetro; k) _incubadora ou sala com controlador de fotoperiodo e de temperatura; ') _ Substancia de referéncia, por exemplo, cloreto de sédio (NaC) ou cloreto de potdssio (KCl); ™m)_pingas ou um instrumento similar. 5.3. Preparo e preservagao das amostras 5.3.1 O preparo e a preservagao das amostras devem seguir o descritona ABNT NBR 15469. 5.3.2 Remover os organismos e as particulas > 1 cm, utilizando pingas ou um instrumento similar. Nao € recomendado peneirar o sedimento para esta finalidade, porque os contaminants soliveis €m agua e as particulas finas de argila nao sedimentadas podem ser perdidos. 5.4 Procedimentos 5.4.1 A amostra deve ser previamente homogeneizada e colocada no re 5.4.2 Adicionar 100 mL. do sedimento, de maneira que se obtenha 1 cm a 2 cm de altura e, cuidado- samente, 175 mL a 200 mL. de agua de diluigao, evitando-se ao maximo a ressuspensao do sedimento. Os recipientes-teste devem ser cobertos. 5.4.3 Preparar quatro a cito recipiéntes-teste por amostra. Em pafalelo, preparar a mesma quantidade de recipientes-teste para o sedimento-controle. NOTA Alternativamente ao substrato natural, outros substratos semelhantes aos utilizados nos cultivos podem ser utilizados como controle. 5.4.4 O ensaio deve ser mantido & temperatura de 24 °C + 2 °C, com fotoperiodo de 12h a 16h de luz difusa. 5.4.5 Manter os recipientes-teste em repouso, no minimo durante 12h. 5.4.6 Medir 0 oxigénio dissolvido, 0 pH @ a condutividade da agua dos recipientes-teste 2 h antes {da adigao dos organismos. Caso o oxigénio dissolvido esteja abaixo de 2,5 mg/L, aerar todas as répli- cas da amostra até 0 término do ensaio, tomando-se 0 cuidado de medir novamente o teor de oxigénio dissolvido antes de inserir os organismos-teste. NOTA 10 oxigénio dissolvido ¢ o pH podem ser determinados em recipientes-teste extra ou em uma amostra composta por uma alfquota de agua de cada recipiente-teste. NOTA 2 Recomenda-se a determinagtio da concentragao de aménia total (NH4*) ou no ionizada (NH3) no inicio do ensaio, uma vez que pode causar efeito nos organismos ao final do ensaio. Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 6 (© ABNT 2013 -Tedos 08 siretos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 ABNT NBR 15470:2013 5.4.7 Manter a aeragao a aproximadamente 2 cm abaixo da superficie da Agua, garantindo que nao ocorra ressuspensao do sedimento. 5.4.8 Adicionar 10 organismos-teste (C.8) em cada recipiente-teste. 5.4.9 Durante 0 ensaio, renovar aproximadamente 2/3 da dgua de diluigéo no minimo trés vezes, com intervalo de, preferencialmente, 48 h a 72 h. 5.4.10 Evitar a ressuspenséo do sedimento, a perda de organismos-teste a diminuigéio do volume inicial da égua de diluigao. 5.4.11 No inicio do ensaio e nos dias de renovacao da Agua, alimentar os organismos-teste com 1,0 mL a 1,5 mL do alimento composto (Anexo E). 5.4.12 Diariamente, medir 0 oxigénio dissolvido da agua dos recipientes-teste. Caso a concentragéio de oxigénio dissolvido seja inferior a 2,5 mg/L, aerar todas as réplicas até o término do ensaio. NOTA Quando for utilizada aeracao, verificar diariamente o seu funcionamento. 5.4.13 O ensaio deve ser encerrado aps 10 dias. 5.4.14 Determinar 0 pH € 0 oxigénio dissolvido da agua dos recipientes-teste. 5.4.15 Separar os organismos-teste da amostra, Contar e registrar os organismos vivos @ considerar mortos os desaparecidos. 5.4.16 Caso necessério, separar 0s organismos peneirando a amostra em rede com abertura de malha de 148 um a 300 um utilizando agua de torneira. 5.4.17 Quando nao ocorrer toxicidade aguda, pode-se avaliar a toxicidade cronica mento dos organismos vivos de cada recipiente-teste e do controle (Anexo F). ando 0 cresci- 5.4.18 A Tabela 2 apresenta umjrestimo dos requisitos para\@’ensaio de Hyalella spp com amostra de sedimento integral Tabela 2 - Resumo dos requisitos para o ensaio Condigses Semiestatico Duragao do ensaio 10 dias Organismo-teste Jovens de 7 dias a 14 dias de idade Agua de diluigéo. Agua reconstituida ou natural Controle Substrato natural ou artificial Volume de agua de diluigzio 175 mL a 200 mL Volume de amostra 100 mL Numero de réplica Minimo de quatro Numero de organismos-teste por réplica 10 (© ABNT 2013 - Todos os dios reservados 7 lmpresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 Tabela 2 (continuagao) Requisitos Condigdes 1,0 mL a 1,5 mL de alimento composto no inicio Almantacs0) @ a cada renovagao de aqua de diluigao Temperatura 24°C42°C Fotoperiodo| 12ha 16h de luz difusa Renovagao do volume da égua de diluigao Aproximadamente 2/ da agua de diluigao, no minimo trés vezes, com intervalo de, preferencialmente, 48h a 72h Efeito observado Letalidade e/ou crescimento Expresso dos resultados Nao téxico ou téxico (toxicidade aguda e/ou crénica) 0005-50 6 Validacao dos resultados 7 Expressao dos resultados “nao t6xico". NOTA na USEPA 600/R-99/064, 8 Relator = COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.55: a) referéncia ao método e a espécie ut ©) data e hora da coleta da amostra; ) data do inicio e término do ensaio; Exemplar para uso exclusivo 8 Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igamni (ADM) \dos; Os resultados dos ensaios so, considerados validos quando, ao término do periodo de exposicao, 4 porcentagem de organismos-teste mortos no controle for inferior ou igual a 20 °%. 7.1 Quando a porcentagem de letalidade na amostra for significativamente maior do que a ob- servada no controle, o resultado deve ser expresso como “toxicidade aguda’. Caso a porcentagem de latalidade nao seja significativamente diferente do controle, 0 resultado deve ser expresso como 7.2 Para analise dos dados, recomenda-se.o uso de método estatistico que permita avaliar os efei- tos da amostra em relacdo ao controle, como teste de hipéteses. Alem do método estatistico proposto, outros podem ser utilizados, se preenchidos os requisitos Recessarios para a sua aplicagdo. Algumas andlises estatisticas so recomendadas e descritas relatério de ensaio deve conter no minimo as seguintes informagdes: b) todos os dados necessarios para identificar a amostra; ©) _dados biolégicos (porcentagem de letalidade e/ou medida de crescimento); (© ABNT 2013 - Todos o8 dots reservadosABNT NBR 15470:2013 f) _ dados fisicos quimicos referentes ao ensaio; 9) resultado do ensaio e método estatistico utilizado; h) _ modificagdes introduzidas e as eventuais ocorréncias durante a realizagao do ensaio. Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 © ABNT 2010 «Todos os dratos reservados: 9 Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013, Anexo A (normativo) Sensibilidade dos organismos-teste Aj Geral A sensibilidade dos organismos 6 avaliada pela exposicao de jovens de Hyalella spp, com 7 dias 14 dias de idade, a varias diluigdes da substancia de referéncia, durante 96 h. A.2 Ensaio de sensibilidade preliminar A2.1 | Um ensaio preliminar pode ser realizado para estabelecer um intervalo de solugdes-teste a ser utilizado no ensaio definitivo. A22 Preparar as solucSes-teste com intervalos amplos de dilvicdo, ndo sendo necessério © preparo de réplicas. A.2.3 Ao final do ensaio, determinar a menor concentracao da solugao-teste que causa letalidade @ 100 % dos organismos-teste e a maior concentrago na qual no se observa letalidade, A24 — Condu: © ensaio de sensibilidade preliminar nas mesmas condigdes do ensaio definitivo. A.3_ Ensaio de sensibilidade definitivo 3.1 Dentro do intervalo de coneentragdes estabelecido no ensaio preliminar, Preparar no minimo cinco concentragées diferentes das solugées-teste, com razio de diluigao entre 1,2 a 2, Na Tabela A.1, hd um exemplo com razdo de diluigéo de 1,3. A3.2 Para cada solugdo-teste, preparar 10 recipientes-teste com 20 mL de solugdo-teste © um organismo-teste por réplica ou quatro recipientes-teste com 200 mL e 10 organismos-teste por ‘éplica. Em paralelo, preparar a mesma quantidade de recipientes-teste para o controle, 3.3 Alimentar os organismos-teste no inicio do ensaio @ apés 48 h. O alimento composto deve apresentar 0 teor de sélidos totais entre 3,4 g/L e 4,1 g/L. Nessas condigées, adicionar 0,05 mL de alimento composto por organismo-teste (Anexo E). 3.4 Manter os recipientes-teste & temperatura de 24 °C + 2 °C e fotoperiodo de 12 ha 16h de luz difusa, durante 96 h. 3.5 — Apés 96 h, contar os organismos-teste vivos utllizando um microscépio estereoscépico, se necessario. Considerar mortos os organismos-teste nao encontrados. Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.552/0005-50 10 (© ABNT 2013 - Todos 0s crotos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM)Para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.552/0005-50 ABNT NBR 15470:2013 Tabela A.1 - Exemplo de preparo de solugdes-teste a partir de uma solugdo-estoque de 10,0 g/L aa | rn er mg/L mL mi 1000 100 900 1000 800 80 920 1000 620 62 938 1000 480 48 952 1000 370 37 963, 1000 290 29 971 1000 220 22 978 1000 170 7 983 1000 (ae 100 10 990 1000 A4 Expresso dos resultados A.4.1' Os resultados s4o considerados validos se, no periado de ensaio, a porcentagem de letalidade dos organismos-teste no controle for inferior ou igual a 20 %, AA2 Calcular a porcentagem de letalidade dos organismos-teste para cada concentracao €m relagao ao numero total de organismos-teste utilizados. 4.3 ACL(|)50-96 h deve ser determinada por método estatistico apropriado @ o resultado deve ser expresso em unidade de peso poriitro,,para a substancia quimiea avaliada, e o periodo de exposicao. NOTA Interpolagao grética, Probitas, Trimmed Spearman-Karber so de célculos. (© ABNT 2013 - Todos o8 dretos reservados " Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM)Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00,402.552/0005-50 ABNT NBR 15470:2013 © meio MS € uma Agua reconstituida ecotoxicolégicos com Hyalella spp. Est Anexo B (informativo) Preparo do meio MS (Metal Solution) das solugées descritas na Tabela B.1. Tabela B.1 ~Solugdes para preparo do meio MS? que pode ser utilizada tanto no cultivo como nos ensaios te meio pode ser preparado conforme a Tabela B.2, a partir - ‘Quantidade ‘Armazena- | Solugaéo Reagente 9 Preparo mento Nitrato de sédio (NaNO) 10,0 Dissolver e Silicato de sédio (NazSi 17183} jcompletar 1 Seems) [= ————| ‘para 1000 Fosfato monabasi¢o de potdssio (KHePOA) | 71,8125 | mt com agua Fostato di-basico de potassio ssada a a ss = Até trés Cloreta de potassio (KC!) 20 Dissolvere | sec en completar temperatura 2 Sulfato de magnésio heptahidratado 51455 para 1000 | ambiente @ (MgSO4,7H50) ‘1455 || mL com agua | “2 aprige processada | “en's Dissolver e ‘completar 3 Cloreto de calcio dihidratado (CaClz.2H20) | 24,4769 para 500 mL com agua Processada EDTA (Acido etilenodiaminotetracético sal 25 dissédico) 2 Acido bérico (H3BOs) 28 Cloreto de ferro hexahidratado (FeCls.6H20) cae Cloreto de manganés tetrahidratado 0,38 (MnClz.4H120) 5 Dessherie) |Pa : completar | Até um més ” Cloreto de litio (LIC!) 0,3035 para ‘ao abrigo Cloreto de rubidio (RbCl!) 0,071 2.000 mL da luz, sob Cloreto de estréncio hexahidratado 0.1817 com agua | refrigeragao (SrClp.6H20) i Processada Brometo de sédio (NaBr) 0,0321 Molibdato de sédio dihidratado a (NagMo04.2H20) “ Cloreto de cobre dihidratado (CuClz.2H20) | _0,0336 Cloreto de zinco (ZnCl2) 0,026 12 ©ABNT 2013 - Todos 08 dretos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)Tabela B.1 (continuagao) ABNT NBR 15470:2013 ‘Quantidade Armazena- Solugéo Reagente Preparo | oe Cloreto de cobalto hexahidratado oon Dissolver (CoCle. 6H20) : @ completar | Até um més a para a0 abrigo 2000mL | da luz, sob lodeto de potassio (Ki) 0,0033 | com agua | retrigeragdo processada Dissolver ecompletar | Até um 5 de selénio (SeQ2) 0.0014 | para 500 mL | més, sob com gua | refrigeracao processada Dissolver ecompletar | Até 12 6 Metavanadato de aménio (NHgVO3) 0,0011 | para 500 mL | meses, sob com agua | refrigeragao processada Dissolver ecompletar | Maximo 7 Clanocobalamina (Vitamina 82) 0,0010 | para 500 mL | de 15 dias, com agua | congelada processada ® Meio MS elaborado por Keating - modificado. ®Néo expor a solugdo 4 & luz Solar oU radiagao ulravileta, por conter EDTA, que ¢ fotodegradve. ‘Tabela B.2 ~ Volumes das solucées e de Agua processada para preparo de 1 L de meio MS Solugéo | 1 2 3 4 5 6 7 _ | Agua processada voume 50 | 50] 10 | 40 | 10 | 10 | 10 982,0 Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00,402.55210008-50 ‘© ABNT 2013 - Todos os direitos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.) 13Exemplar para uso exclusive - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.52/0005-50 ABNT NBR 15470:2013 Anexo C (informativo) Cultivo de Hyalella spp C1 Geral Diferentes procedimentos de cultivo de Hyalella spp podem ser adotados. O procedimento descrito neste Anexo 6 adequado para o cultivo de Hyalella azteca. €.2 Descrigao do organismo Hyalella é um anfipodo de gua doce de habito epibenténico, com ampla distribuigao geogratica. Devido 20s seus habitos herbivoros e detritivoros, constitul um elo importante nas cadeias alimentares dos corpos de agua e possibilita a transferéncia de energia, produzida pelas algas e vegetais superiores, Para consumidores de nivel tréfico mals elevado. Este género apresenta reproducao sexuada. dimorfismo sexual e comprimento entre 5 mm ¢ 20 mm. O ciclo de vida de Hyalella pode ser dividido em trés fases: imaturo (estagios 1 a 5), juvenil (estagios 6 e 7) & adulto (a partir do oitavo estagio — Figura C.1), Nos primeiros estagios, nao ha dimorfismo Sexual aparente, Nos estagios 6 e 7, 08 sexos podem ser diferenciados da seguinte forma: no macho (Figura C.2 A), 0 segundo par de gnatépodos apresenta-se mais desenvolvido que nas fémeas (Figura C.2 B). As fémeas. apresentam lamelas finas na superficie mediana da coxa das pernas dois, {rés, quatro e cinco, terminando em longas cerdas e situadas internamente as branquias. Estas lamelas (Costegitos) formam uma larga bolsa (marstipio) contendo os ovos em desenvolvimento. Os oostegitos no existem na fase jovem. Em condigdes de cultivo, o dimorfismo sexual pode ser notado a partir da quarta e quinta semanas de vida, sendo que a proporgao de machos ¢ fémeas 6 de aproximadamente 1:1 antena 2 = pereidpodos Fonte: Bares (1990) Figura C.1 — Estrutura externa de um anfipodo, em vista lateral 14 © ABNT 2013 - Todos 08 dretos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudlo Igami (ADM)N-CNENISP - 00.402.552/0005-50 vo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR -IP% ABNT NBR 15470:2013 Gnatopodos els oostegitos b) Femea Fonte: Narchi (1973), modificado, Figura C.2 ~ Aspectos gerais, em vista lateral, de Hyalella azteca. Macho (a) e Fémea (b), com destaque para os gnatépodos (a) e embrides protegidos pelos costegitos (b) C.3 Condigées de cultivo dos organismos €.3.1 A Agua de cultivo pode ser a mesma que a agua de diluigdo (4.2). €.3.2 _Utilizaro material do cultivo apenas para este fim. Lavar com agua de torneira e gaze ciruirgica ara remogao dos materiais aderidos as suas paredes. Em seguida, enxaguar novamente com agua de torneira. Repetir este procedimento trés vezes e, por tiltimo, enxaguar com agua processada, €.3.3 Iniciar os cultivos com jovens com idade entre 7 dias e 14 dias. (© ABNT 2013 - Todos o8 crates reservados 15 Impresso por: Mery Piedad Zamudio igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 C.3.4 Manter os cultivos na proporgao minima de um adulto para cada 25 mL de dgua de diluicéo, Sob aeragao branda, temperatura de 24 °C +2 °C e fotoperiodo de 12 ha 16 h de luz difusa. NOTA ___Recomenda-se iniciar o cultivo com no minimo 100 organismos, para garantir a diversidade genética da populagao, ©.3.5 — Manter os cultivos em local limpo isento de vapores toxicos e substancias quimicas. C4 Alimentacao C.4.1 A alimentagao pode ser constituida por ragéo de coelho ou ragdo de peixe, suspensao algacea e alimento composto (Anexo E). 4.2 Recomenda-se fornecer diariaimente 0,025 mL de alimento composto por organismo e, trés vvezes por semana, racao de coelho ou de peixe (0,15 mg a 0,25 mg por organismo). C.43 Como substrato, podem ser utlizadas plantas aquéticas (Elodea sp ou Salvinia sp) u substrato artificial, como rede de nallon com abertura de malha de 150 um a 600 jm. C5 Manutengdo dos cultivos ©.5.1 Realizar a manutengao Sémanalmente. C.5.2 Comauxiliade uma pipeta, transferir o substrato ¢ os organismos dos cultivos para recipientes limpos contendo agua de diluigao. C.5.3Apés 4 ou 5 semanas, transferir somente os organismos adultos. C.5.4 A diferenga entre a temperatura da égua de diluiedo e do novo lote de Agua n&o pode ser maior que 2 °C. €.5.5 Os organismos jovens podem seruutiizados nos ensaios; no inicio de novos cultivos, ou podem ser descariados, ©.5.6 Contar e registrar o nimero de ofganismos vivos € observar a presenca de jovens. C.5.7 Registrar qualquer alteragéo nas condigées de cultiv, como, por exemplo, mudanga na coloragao dos organismos. C.5.8 — Manter 0 cultivo durante trés meses, aproximadamente. ©.5.9 Iniciar novos cultivos sempre que necessério ou quando a mortalidade dos organismos de um mesmo cultivo, entre duas trocas de agua, for superior a 20 %. Neste caso, descartar este cultivo. isivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 C.6 Obtengao de organismos para 0 ensaio C61 Uma semana antes da realizado do ensaio, retirar os organismos jovens (0 a 7 dias), com auxilio de pipeta ou vertendo a Agua dos cultivos, em uma rede com malha de + 145 jm, Transferir Cuidadosamente para um recipiente com agua de cultivo e manter durante uma semana nas mesmas condigdes de cultivo, ©.6.2 _ Veritficar a sobrevivéncia do lote de jovens produzido apés uma semana, sob as mesmas Condiedes de cultivo. Caso a mortalidade seja inferior ou igual a 20 %, os organismos podem ser utilizados nos ensaios. Registrar esse dado. 16 © ABNT 2013 - Todos 08 eretos reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudlo Igami (ADM.)Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.55210005-50 ABNT NBR 15470:2013 Anexo D (informativo) Carta-controle D.1_Acarta-controle inicial pode ser elaborada manualmente, em papel milimetrado ou em programa de computador. D2 Apés 20 resultados de ensaio ecotoxicolégicos com substancia de referéncia, utilizando diferentes lotes de organismos, calcularo valor médio (X) da CL50, o desvio-padrao (a) e o coeficiente de variagao (CV) 0.3 Na inexisténcia de20 resultados de ensaio, elaborar provisoriamente a média com no minimo cinco resultados, até que se completem os 20 resultados e se obtenha a média definitiva, D.4 _ Calcular dois desvios-padrao (2a), superior ¢ inferior, & média obtida. Estes valores devem ser gratados na carta-controle através de linhas Perpendiculares ao eixo que apresenta os resultados dos ensalos ecotoxicolégicos, D.5 A cada 20 resultados de ensaio, recaleular 08 valores para estabelecer a carta-controle. D6 Nao .utlizaros resultados dos ensaios que ultrapassarem os limites de controle (+20), ao longo do tempo, para os célculos mencionados em D.2, (© ABNT 2013 - Todos os dreitos reservados 7 Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)ara uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 ABNT NBR 15470:2013 Anexo E (informativo) Preparo de alimento composto E1 Geral © alimento composto pode ser preparado a partir de ragdo de pelxe ou Artemia. Ele deve apresentar Peso seco na faixa de 3,4 g/L a 4,1 g/lve pode ser utiizado durante uma semana, se conservado em goladeira. E.2 Alimento composto a partir de ragao de peixe E21 Colocar 10 g/de:racdo de peixe em 1 000 mL de agua processada e agitar durante 1 h, aproximadamente. No final desse petiodo, deixar decantar durante 1h e filtrar 0 sobrenadante em rede com maiha de abertura de + 60 um, A solucdo assim obtida pode ser congelada em porgdes menores, para uso posterior. £.2.2 — Colocar 1,0gde fermento | ‘biolégi¢o seco em 200 mL de agua Processada. Deixar em agitacao até a dissolugao total, E.2.3 Misturar partes iguais das solugdes obtidas em E.2.1 @ E.2.2 ¢ acrescentar 0,1 mL de de primula para cada 100 mL de solug&o composta, E.3 _Alimento composto a partir de Artemia E.3.1_ Colocar 80 g de Artemia adulta, lavada e peneirada;ém 1 000 mL de agua processada, sob aeragao, de forma que a Artemia fique em suspensao, Manter durante uma semana nestas condicoes, com reposigao da agua perdida por evaporacao. No final desse periodo, deixar decantar durante 24 h e filtrar em rede com malha de abertura de aproximadamente 60 jum. A Solugdo assim obtida pode ser Congelada em porgdes menores para uso posterior, E32 Colocar 0.5 9 de fermento biolégico seco em 100 mL de agua processada. Deixar em agitagao até a dissolugdo total, E33 Misturar partes iguais das solugdes obtidas em E.3.1 6 E.3.2. 18 (© ABNT 2013 - Todos 08 erates reservados Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM.)Exemplar para uso exclusivo - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00,402.562/0005-50 ABNT NBR 15470:2013 Anexo F (informativo) Determinagao do crescimento F1 Geral Quando nao for observado efeito agudo nos organismos-teste, pode-se proceder a avaliagao do efeito crénico, pela medida do crescimentosO ¢fescimento-dos organismos pode ser determinado pela massa seca ou pela medida do comprimento.. Independentemente da avaliagdo de crescimento adotada, é aconselhavel que o laboratério mantenha uma série continua de dados sobre o crescimento (peso e/ou comprimento), para que seja possivel validagao dos resultados obtidos no controle durante o ensaio ecotoxicoldgico. F.2 Massa seca F2.1 _O peso seco médio de Hyalella spp deve ser determinado no final do periodo de exposi¢ao Para cada recipiente-teste, utilizando balanca analitica com carga minima de 0,00001 g, F.2.2 _ Lavar os organismos-teste com agua processada no minimo duas vezes. F.2.3 _ Transferir os organismos-teste para recipientes previamente pesados e marcados. F2.4 — Colocar em estufa entre 60 °C e 90 °C, durante 24 h, aproximadamente. Deixar esfriar em um dessecador e pesar.Repelir este procedimento até que seja’atingido peso constante. F.2.5 _ Determinar o peso médio\em cada recipiente pela diferenca entre o recipiente vazio e com 0 organismos, F.3 Comprimento F31 O comprimento de Hyalella spp pode ser determinado utilizando-se um analisador digital de imagens acoplado a lupa esteoroscépica e computador com programa especifico ou outro método adequado, F3.2 No término do ensaio, preservar os organismos-teste de cada recipiente-teste em alcool 70 %. F3.3 — Realizar a medida dos organismos-teste, considerando desde a base da antena até a base do urossomo. F.3.4_ Determinar o comprimento médio dos anfipodos em cada recipiente-teste. F3.5__ E recomendado um lote de organismos-teste, o mais homogéneo possivel, para a avaliagao do efeito crdnico, com o objetivo de se evitar variagdes no comprimento/peso que possam afetar 05 resultados. © ABNT 2013 - Todos 0s dros reservados 19 Impresso por: Mery Piedad Zamudio Igami (ADM)ABNT NBR 15470:2013 F.4 Validagao dos resultados Sao considerados validos os resultados dos ensaios quando, ao término do periodo de exposicao, © crescimento dos organismos no controle for compativel com a idade dos organismos ao final do ensaio (17 dias a 24 dias), conforme dados previamente obtidos no laboratorio. F.5 Expressao dos resultados F.5.1 Quando o crescimento dos organismos na amostra for significativamente menor do que no controle, 0 resultado deve ser expresso como “toxicidade crénica’. Caso 0 crescimento nao seja significativamente diferente do controle, o resultado deve ser expresso como “no téxico”. F5.2 Para andlise dos dados, reécomenda-se 0 uso de método estatistico que permita avaliar 08 efeitos da amostra em relagao ao controle, como teste de hipdteses. NOTA — Além do método estatistico proposto, outros podem ser utilizatlos, se preenchidos os requisitos necessdrios para a sual aplicagéo. Algumas andlises estatisticas so recomendadas e descritas na USEPA 600/R-99/064, Exemplar para uso exclusive - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNEN/SP - 00.402.552/0005-50 20 (© ABNT 2013 - Todos 0s direitos resorvados Impresso por: Mery Piedad Zarnudio Igami (ADM.)ABNT NBR 15470:2013 liografia [1] ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (USA). USEPA 600/R-99/064:2000: Methods for measuring the toxicity and bioaccumulation of sediment-associated contaminants with freshwater invertebrates [2] BARNES, R. D. Zoologia dos invertebrados. 4* od. S4o Paulo: Roca, 1990. 1179 p. [3] NARCHI, W. Crustéceos: estudos praticos 1. S40 Paulo: Poligono, 1973. 116p. ‘Exemplar para uso exclusive - COMISSAO NACIONAL DE ENERGIA NUCLEAR - IPEN-CNENISP - 00.402.552/0005-50 (© ABNT 2013 - Todos 08 diretos reservados 21 Impresso por: Mery Piedad Zamucio Igami (ADM.)