en ai ee ¥ Py wy Industria y Comercio SUPERINTENDENCIA SUPERINTENDENCIA DE INDUSTRI CONERCIO DELEGATURA DE P crm: 2015.0228 160347 Dep 2320913 Fett PaTeNTEivi =” evelrd 1, < 400 > 2, efc..La secuencia de listado, en formato legible para computadora escrito (CFR), se incorporan por referencia en su totalidad. ARTE ANTERIOR. Cultivo de tejido se utiliza en la propagacién de nuevas variedades de plantas, a producoién de dobles haploides, crlopreservacién, conservacion de rara y plantas en peligro de extincién, cultivo de plantas de dificl-a-se propagan y la produccién de metaboltos secundarios y las plantas transgénicas. Cultivo de tejido se centra en la produccién de ata calidad, materiales de planta libre de enfermedad para et crecimiento de las plantas de cultivo y arboles frutales. Sin embargo, los principales desafios son atin asociados con la produccién y distribucién de materiales vegetales de alta calidad para el fitomejoramiento y la rapida produccion de plantas mejoradas. Actualmente, se utiliza tejido de cultivo particularmente para fa multiplicacion de plantas a gran escala y micropropagacién, técnicas que tienen amplias aplicaciones en agricultura y silvicutura. Cientos de laboratorios de micropropagacién en todo el mundo‘muttiplican actualmente gran ndmero de clones de variedades deseadas y fa flora focal (OIEA, 2004), Se han establecido diferentes opiniones entre los miembros del publico en. general con respecto @ la transformacién de la planta, particularmente por su preocupacion por temas ambientales. Por el contrario, Jos cientificos reconocen {a planta que da como resultado de una alteracién genética dirigida especifica es indistinguible de ta planta que ha sido desarrollada por un proceso de oria y seleccién. La tinica diferencia es que el proceso de modificacién de una planta de destino puede acelerar grandemente porque las modificaciones genéticas pueden ser dirigidos en lugar de al azar. Dirigida a ta modificacién por recombinacién homéloga ha sido probada con ia recombinacion homologa dependiente gene focalizado (hrdGT) (Doetschman et al, 1987) (Gupta y Dhugga, 2010). e! problema con este enfoque es que la tasa rolativa de recombinacién homéloga en comparacién con la tasa de insercién al azar por la recombinaci6n ilegitima es inferior en las células vegetales esté en las células animales. Esfuerzos para resolver esta limitacién por la expresién de genes extrafios en tas células vegetaies se han hecho. Estos métodos han tenido poco 6zito en la produccién gene efectivo focalizado. Por otra parte, atin cuando estas células modificadas se ufiizan para efectuar ta recombinacién homéloga, la célula modificada resultante todavia contienen un gen exdgeno utiizado para seleccionar los homélogos recombinantes y atin asi ser considerada una planta genéticamente modificada por reguladores y entidades preocupadas con el medio ambiente. También se han desorito otros métodos en que la recombinacion homéloga no estd implicada y la utilizacién de sitios de recombinacion espectfica y tecombinaciones derivadas de transposones en WO 01/85969 y WO '99/25821.E! problema con este enfoque es que la estructura mixta de los oligonuclestides evitaria probablemente la verdadera recombinacién por Integracion genomica.Una de las técnicas mas comunes para hibridar genéticamente las plantas es el uso de plésmidos portadores Agrobacterium tumefaciens, Una parte del ciclo de vida de la A. tumefaciens plésmido involucra infeccién de las plantas. A. tumefaciens introduce el plasmido en los nicleos de células de la planta en forma de _—_filamentos__individuales. Un recombinante ‘A. tumefaciens plésmido puede utlizarse para introducit ADN exégeno en una célula vegetal. También se han utiizado diferentes plasmido bacteriano gen tratamientos, Por ejemplo, ha utiizado un plésmido recombinante ADN simple o plasmido sosteniendo cintas gen especifico para garantizar la recombinacién homdloga, Plantas hibridadas mediante este método serlan clasifiadas como ‘organismos modificados genéticamente (OMG) y seguiria siendo un problema para las industras alimentarias y farmacéuticas. Métodos para aumentar el tamafio de ta planta transgénica y rendimiento, ‘asi como retrasar la floracién en las plantas, usando los acidos nucleicos que codifican factores de transeripcion de planta, se han establecido (US patent N° 7.858.848). Sin embargo, estos métodos también implican transformar genéticamente las plantas. Ademds, la extraccion de metebofilos secundarios generaimente requiere altas cantidades iniciales de biomasa vegetal o material. En general, se realiza la extraccién de metabolitos de planta de grandes cantidades de material de biomasa ‘resca, que requiere las practicas agronémicas, el uso de productos quimicos, el tiempo perdido y los métodos de extraccién costosos. BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS. Los dibujos adjuntos, que se incorporan y constituyen una parte de esta ‘especificacién. ilustran varios aspectos que se describen a continuacion,La figura 1 muestra un ADN construido descrito incorporado en un piasmido. La figura 2 muestra las colonias de B. pumilus dispositive y control (B. ‘pumilus Sin ADN fendlico). Colonias incorporando la B. pumilus dispositivo (fila inferior) muesiran més altas poblaciones de Colonia que el control (arriba). Las colonias en la parte inferior derecha Petri son la 8. pumilus dispositivo que ccontienen la proteina fenilalanina amoniaco lyase del (PAL), que demostré mayor poblacién bacteriana, La figura 3 muestra la expresién de proteinas en un gel bidimensional 20- DIGE, en el que una proteina del gel de &. pumilus dispositive ha sido superpuesto con un gel de control (no-transformado en bacteria). La ilustracion muestra la mayor expresion de proteinas reguiatas por arriba (puntos de fluorescencia de mayor intensidad) correspondientes a B. pumilus dispositive que contiene el fendtico ADN con proteinas de PAL (véase el panel C) contrasté con un control (véase el panel B), que demostré las proteinas regula y reduce la TWuorescencia. El andlisis fue realizado con MALDI-MS. La figura 4 muestra las colonias de E. coll dispositivos. B: control (bacterias sin ADN fendlico) muestra menos formacién de la colonia que A y C, que son dispositives bactetianos que contienen ADN fendiico. En A y C, las poblaciones de Colonia cubren completamente las placas de agar. La figura 5 muestra cacao callos embrionarias cultivadas en medio Murashige-Skoog (MS). Los. callos comparativos embrionarios representan diferentes tratamientos para producir compuestos fendlicos, en comparacion con ‘un control, Algunos calles fueron inoculados con el dispositive bacteriano con 0 sin el ADN fenélico en diferentes concentraciones y con diferentes tipos de dispositivos bacterianos que contienen ADN fendlico, Las dos bacterias utlizadas fueron E. colly B. purilus.La figura 6 muestra cacao (Theobroma cacao) los callos de ensayos de cutive de tejidos. Induccién de aumento de tamafio de los callos tratados con quitosano y dispositives biolégicos también se muestra, DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION. Antes de que los presentes compuestos, composiciones, articulos, ispositivos © métodos son revelados y descritos, es de entenderse que los aspectos desartos a continvacion no se limiten a compuestos espaciticos, métodos de sintesis, 0 usos como tales, por supuesto, varian. También deben entenderse que la terminologia utlizada en el presente es con el propésito de describ aspectos particulares solamente y no pretenden ser limitantes. En esta especificacion y en las reivindicaciones que siguen, se hard referencia a un niimero de los términos que deberdn definirse para tienen los siguientes significados: Debe sefialarse que, como se utiliza en la especificacién y los reclamos anexados, las formas singulares “a," “an” y “el” incluye plurales referentes a ‘menos que el contexto claramente dicta lo contrario. Asi, por ejemplo, referencia “un agente bicactivo" incluye mezclas de dos o mas agentes y similares. “Opcional” o “opcionalmente” significa que el evento posteriormente descrite 0 la ireunstancia puede o no puede ocurir, y que la descripcién incluye instancias donde se produce et evento o circunstancias ¢ instancias donde no lo hacen. Por ejempto, la frase “ingrediente opcional" significa que el ingrediente puede o no puede estar present Rangos se pueden expresar en este documento a partir del “acerca de” un valor particular, 0 de “acerca de” otro valor particular. Cuando se expresa una gama, otro aspecto incluye desde el valor particular uno o el otro valor determinado. Del mismo modo, cuando los valores se expresan como‘aproximaciones, por et uso del antecedente “sobre”, se entender que et valor particular forma otro aspecto, Se entenderd que los extremos de cada una de fas, gamas son signficatives tanto en lo referente al ol extremo @ independientemente del otro extremo. Revelados son materiales y componentes que pueden ser utlizados, pueden ser usados en la preparacién, junto con, © son productos de los divulgados composiciones y métodos. Estos y otros materiales son revelados en este documento, y se entiende que cuando fas combinaciones, subconjuntos, interacciones, grupos, etc. de estos materiales se revelan, mientras las referencias especificas de los diversos individuos, ia combinacion colectiva y la Permutacién de estos compuestos pueden no ser explicitamente divulgados, cada uno es especificamente contemplado y desorio. Por ejemplo, si una bacteria es divulgada y discuida y un nimero de diferentes bacterias compatible los piésmidos se discuten, cada combinacion y permutacién de bacteria y plasmido bacteriano que es posible se contempia especificamente indique especificamente lo contratio. Por ejemplo, si una clase de moléculas A, B y C es revelada como una clase de moléculas D, E y F y un ejemplo de una molécula de combinacion, ‘Acd es revelada, entonces incluso si cada uno individualmente no se recita, cada uno se contempla individuaimente y colectivamente. Asi, en este ejemplo, cada tuna de las combinaciones Ae, AF, B, D, BEF, B,C, D, CE y CF se ‘contemplan especificamente y debe ser considerado divulgada de la divulgacion dela A, B y C;D, E, y la combinacién de ejemplo A-d y F; Asimismo, cualquier subconjunto 0 combinacion de éstos también especificamente es contempiado y divulgado. Ast, por ejemplo, el grupo sub del AE, B-F, y C-E se contempla especificamente y debe considerarse divuigada de Ia divulgaciin de la A, By CD, Ey Fy la combinacién de ejemplo A-d. Este concepto se aplica a todos los aspectos de esta divulgacién, incluyendo, pero sin limitarse a, los pasos de los métodos de fabricacién y el uso de las composiciones divulgadas. Asi, si se Puede realizar una gran variedad de medidas adicionales, se entiende que cada tune de estos pasos adicionales puede realizarse con cualquier encamaciin &‘especifico © combinacién de encamaciones de los métodos de revelado, y que cada tal combinacién se contempla especificamente y debe considerarse divulg6. Las referencias en la especificacién y concluyendo las, reivindicaciones a las partes por peso de un elemento en particular o componente de una composicién o articulo, denota la relacién peso entre el elemento o componente y cualesquiera otros elementos o componentes de fa composicién o el articulo para el cual se expresa una parte por peso. Asi, en un compuesto que contiene 2 partes por peso de componente X y partes de componente de peso Y. X @ Y estan presentes en una proporcion de 2:5 y estan presentes en dicha relacion independientemente de i los componentes adicionales estén contenidos en el compuesto, Un porcentaje del peso de un componente, salvo manitestacion expresa en contrario, se basa en el peso total de la formulacién 0 composicion en la que se incluye el componente. Deserios son métodos- para mejorar. el_—fisioldgico de Theobroma cacao, que es también contemplada en el presente como cacao. El término «propiedad fisiolégicay como definido en el presente documento inclye cualquier caracteristica fisica, quimica, bioquimica o biolégica que es mojorado mediante los métodos descritos en este documento. En uno de Jos aspectos, los métodos pueden mejorar la produccién de compuestos fendlicos producides por Theobroma cacao. En otros aspectos, los métodos pueden ‘mejorar la tasa de crecimiento de Theobroma cacao. |. Estructura de ADN y dispositivos biolégicos. Como se usa en este documento, “planta” se utiliza en un sentido amplio Para incluir, por ejemplo, cualquier especie de arbolado, omamental, cuttives, cereales, fruta, 0 planta vegetal, asi como algas fotosintéticas. "Planta" también se refiere a una pluralidad de las célules vegetales que se diferencian en una estructura que esta presente en cualquier etapa de desarrollo de la planta, Estas yestructuras inciuyen, pero no se limitan a, frutos, brotes, tallos, hojas, pétaios de flores, ‘aices, tubérculos, bulbos, bulbos, semillas, gametes, cotiledones, hipocotiles, radiculas, embriones, gametoftos, turores y similares. “Célula de la planta’, "las células de la planta", o "planta de tejido como en este documento se fefiere al distinguido y telidos indiferenciados de plantas inciuyendo aquelias presentes en cualquiera de los tejides descritos anteriormente, asi como en ‘cuanto a las células en cultivo tales como, por ejempio, solo cétulas, protoplastos, ‘embriones, callos, etc.. “Heterblogos" genes y las proteinas son los genes y proteinas que han ‘sido experimentalmente en una célula que normaimente no se expresan por esa célula, Un gen heterélogo puede ser reproducido 0 derivado de un tipo diferente de la célula 0 especie que el receptor de la célula o el organismo. Genes heterdlogos pueden introducirse en las células por transduccién o transformacin. Un Acido nucieico “aisiado" es aquel que se ha separado de otras moiéculas de dcido nucleico o material celular (péptidos, proteinas, lipidos, sacéridos y similares) normalmente presente en la fuente natural de dcido hucleico. Opcionalmente puede ser libre de las secuencias flanqueantes se encuentran a ambos lados del Acido nucleico como ocurre naturaimente un Acido hhucleico “aislado". Un Acido nucleico aislado puede ser natural, pueden ser Sintetizado quimicamente 0 puede ser una molécula de cADN (es decir, se sintetiza a partir de una plantila de mARN utilizando la transcriplasa inversa y las enzimas ADN polimerasa). “Transformacién” 0 “transfeccién” en este documento se refiere a un proceso para introducir ADN heterdlogo a una célula huésped. La transformacién puede ocurtir bajo las condiciones naturales 0 puede ser inducida utlizando diversos métodos conocidos en el arte. Muchos métados de transformacién son conocidos en el arte y al practicante experto sabré como elegir el mejor método de transformacién basado en él tipo de células se transforman. Los métodos de transformacién incluyen, por ejemplo, infeccion viral, electroporaciOn, fipofection, transformacién quimica y bombardeo de particulas.Las célvias pueden ser establemente transformadas (es decir, el ADN heterdlogo es capaz de reproducit un plasmido auténomo © como parte del cromosoma del host) o puede ser transitoriamente transformadas (es decir, e! ‘AON heterdlago se expresa solo por un periodo limitada de tiempo). “Células competentes” se refieren a las células ricrobianes capaces de ‘ccupar heterdloga ADN. Células competentes pueden adquiritse una fuente ‘comercial, 0 las células pueden estar competentes utilizando procedimientos conocidos en el arte. En los ejemplos se proporcionan procedimientos ejemplares para la producci6n de calulas competentes. Los dispositivos biotégicas descritos pueden utilizarse para mejorar jas propiedades fisiolégicas de Theobroma cacao. En un aspecto, el dispositive blolégico puede aumentar la producclén de compuestos fendlicos por Theobroma cacao. El dispositvo se compone generaimente de las células del huésped, donde se transforman las células hospedadoras con la estructura de ADN descrita que promueve Ia produccién de compuestos fenclicos en Theobroma cacao. Se entiende que hay una manera para definir las variantes y derivados de los componentes genéticos y estructuras de ADN desaritas es a través de definir las variantes y derivados en cuanto a fa homologia de identidad a secuencias ‘especificas de conocidos. Los de habilidad en el arte de comprender faciimente como determinar la homologia de dos dcidos nucleicos. Por efemplo, se puede caleular la homologia después de alinear las dos secuancias asi la homologia es su més alto nivel. Otra forma de célculo homologia puede realizarse mediante algoritmos publicados (véase Zuker, M. Ciencia 244:48-52, 1989, Jaeger ot al. USA proc. nacional Acad. et al, 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Métodos Enzymol, 183:281-306, 1989, que se incorporan en el presente documento de referencia para ia alineaciOn de acido nucleico relacionados con menos material). 19Como se usa en este documento, mutaciones “conservatives” son mutaciones que resultan en un cambio de aminodcido en la proteina producido a partir de una secuencia de ADN. Cuando se produce una mutacién conservativa, el nuevo aminodcido tiene caracteristicas simitares como el aminoacido de tipo salvaje y generalmente no drasticamente cambia la funcién o el plegamiento de la proteina 5 (por ejemplo, conmutacién isoleucina, valina es una mutacién conservativa ya que ambos son pequefios, ramificado, aminodcidos hhidrofébicos). "Mutaciones silenciosas”, mientras tanto, cambian ia secuencia de 4cido nucleico de un gen que codifica una proteina pero no cambia la secuencia de aminoacidos de la proteina, Se entiende que la descripci¢n de las mutaciones conservativas y homologia pueden combinarse juntos en cualquier combinacién, como ‘encamaciones que tienen al menos un 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 0 98% de homologia a una secuencia particular en donde las variantes son mutaciones conservativas. Queda entendido que cualquiera de las secuencias descritas en este documento puede ser una variante 0 derivado de disponer de la homologia de los valores enumerados anteriormente. En un aspocto, las estructuras de ADN descritas acd (denominado en el presente "AON fendlico") puede promover la expresion de uno o mas compuestos fendlicos de Theobroma cacao. El término “compuesto fendlico” se define como ‘cualquier aromatico compuesto de tener al menos un grupo hidroxilo presente en Un anillo aromatico. Ejemplos de tales compuestos fendiicos inciuyen, pero no se para, Acido gélica, acida p-hidroxivenzoico, Acido cafelco, acido p-cumatico y taninos. En uno de los aspectos, la estructura del ADN es de 5’ a 3' los ‘componentes genétices en ef orden siguiente: (1) un promotor PAL, (2) un gen que expresa histidinalfenilalanina amonio-liasa, (3) un sitio de Unién ribosémico y (4) un terminador. En ciertos aspectos, la estructura de ADN consta mas de un Interruptor entre el gen que expresa histidina/fenilalanina amonio-tasa y el sitio de aUnién ribosémico que puede mejorar a expresién de fa proteina y traduccién ribosomal En un aspecto, el gen que expresa liasa histidina/tenilalanina amoniaco esté aisiado de la bacteria En un aspect, las bacterias son ‘especies Pseudomonas. En otro aspecto, las bacterias son P. aeruginosa, P, dentriicans, P. resinovorans, P. protegens, p. fluorescens, u otras ‘especies Pseudomonas. En otro aspecto, el gen que —expresa histidinaffeniialanina unmmOnia liasa se aista de las plantas. En un aspecto, las plantas son Arabidopsis thaliana. En otro aspecto, las plantas son Selaginclla moellendorffi, Physcomitrella patens, maiz (Zea mays), o (sorgo 0 miloSorghum bicolor). En otro aspecto, el gen que expresa tiasa de Fenitalanina amontaco en le estructura del ADN tiene SEQ ID n? 5 0 derivado de la variante de éstos. En otro aspecto, el gen que expresa liasa de amoniaco de fenilalanina en la estructura del ADN tiene SEQ ID n° 6 0 7 0 un derivado o variante de éstos. En otro aspecto, la estructura del ADN adicional incluye (5) un gen que cconfiere resistencia @ un antibidtico (un "Marcador selectivo"), (6) una proteina ‘Feportero, o una combinacién de estos. En un aspecto, una secuencia regiamentaria ya incorporada en un vector como, por ejemplo, un plasmido, antes de la manipulacién genética del vector. En ‘otro aspecto, la secuencia de reglamentacion puede incorporarse en el vector mediante el uso de enzimas de restricci6n 0 cualquier otra técnica conocida en el arte, En un aspecto, la secuencia regulatoria es un promotor. E! término “promotor” se refiere a una secuencia de ADN capaz de controlar la expresién de luna secuencia de codificacién. En un aspecto, la secuencia de codiffcacion para controlarse es localizado 3' al promotor. En otro aspecto, el promotor se deriva de un gen nativo. En un aspecto altemativo, el promotor se compone de varios elementos derivados de diferentes genes promotores. Un promotor puede ser montado de elementos encontrados en la naturaleza, de elementos artficiales 0 42 1Gsintéticos, 0 de una combinacién de éstos.Se entiende por aquellos especializados en el arte que diferentes promotores pueden dirgir la expresi6n de Un gen en diferentes tejidos 0 tipos celulares, en diferentes etapas de desarrollo, en respuesta a diferentes condiciones ambientales o fisiologicas, o en diferentes especies. En un aspecto, las funciones del promotor como un interruptor para activar fa expresion de un gen. En un aspecto, el promotor es “constitutive. Un promotor constitutivo es lun promotor que cause un gen para expresarse en la mayoria de tipos cetulares ‘en la mayoria de veces. En otro aspecto, ef promotor es “regular.” Un promotor regulado es un promotor que llega a ser activo en respuesta a un estimulo specifica. Un promotor puede ser regulado quimicamente, como, por ejemplo, en respuesta a Ia presencia o ausencia de un metabolto determinado (por ejemplo, lactosa o triptofano), un ion de metal, una molécula secretada por un patégeno, 0 algo asi. Un promotor podra regularse también fisicamente, como, por ejemplo, en respuesta al calor, frio, estrés hidrico, estrés salino, concentracién de oxigeno, iluminacién, hiriendo o similares. Promotores que son utiles para la expresion de la unidad de las seouencias de nuclestidos descritos son numerosas y familiares a los entendidos en la materia. Promotores adecuados incluyen, pero no se limitan a lo siguiente: promotor PAL, 73 promotor, promotor T7, promotor de la Fe y GALt promotor. También se contemptan las variantes de estos promotores. El artesano podré utilizar mutagénesis sitio-drigida 0 otras técnicas de mutagénesis para modificar los promotores para promover la funcién mas eficiente. El promotor puede colocarse, por ejemplo, de 10-100 nuclettidos de un sitio de Unién ribosémico, En un aspecto, el promotor es un promotor PAL. En un aspecto, el promotor PAL en la estructura del ADN es SEQ 1D n° 1 0 derivado de la variante mismos. En otro aspecto, el promotor PAL es SEQ ID n° 2, 3, 0 4 0 un derivado 0 variante mismos. 13En otro aspecto, ef gen que expresa histidinaffenilalanina unmmOnia- liasa en la estructura del ADN es SEQ ID n° 5 0 derivado de la variante mismos, En otfo aspecto, el gen es SEQ ID n° 6 0 7 0 un derivado 0 varianto ismos. La seleccién det sitio de Unién ribosémico (y optional) ribosomal del interruptor puede variar dependiendo de la seleccién de las células hospedadoras. En un aspecto, el sitio de Unién ribosémico en ta estructura del ADN es SEQ ID n? 8 0 9, 0 un derivade o variante mismos (por ejemplo, donde n en SEQ ID n® 8 puede ser A, T, G0 C). En ciertos aspectos, cuando la estructura de ADN adicional incluye un interruptor ribosomal. En un aspecto, el interruptor ribosomal es SEQ ID no. 11, 12, 13.0 14, derivado o la misma variante. En otro aspecto, fa secuencia de reglamentacion es una secuencia de terminador 0 parada. Como se utiliza en este documento, un terminador es una secuencia de ADN que marca el final de un gen o de un operén a transcribir. En otro aspecto, el “terminador’ es un terminador intrinseco 0 un terminador de transcripcién Rho-dependiente. Como se utiiza en este documento, un “terminador intinseco” es una secuencia en donde puede formar una estructura de horquilla en fa transoripcién naciente y en donde la horquitla interrumpe ef MARNIADN/ARN polimerasa compleja. Como se utiliza en este documento, un terminador de transcripcién "Rho-dependiente” requiere una proteina factor Rho ‘compleja interrumpir el mARN/ADN/ARN polimerasa compleja.. En offo aspecto, el terminador en la estructura del ADN es SEQ ID n° 10 © derivado la variante mismos. En otfo aspecto, la secuencia regulatoria incluye tanto un promotor y una secuencia de terminador o patada.En un aspecto atin més, la secuencia Fegulatoria puede incluir varios promotores 0 terminadores. También se contemplan ottos elementos regulatorlos, como potenciadores. Potenciadores pueden ubicarse de alrededor de 1 a 2000 nucledtides en sentido §' desde el codén de inicio de la ADN a ser transerto, © puede ser localizado 3' del ADN a 14transcribir. Potencladores pueden sor “cis-actuar,” es decir, situado en ta misma molécula de ADN como el gen cuya expresion afectan. En ciertos aspectos, la estructura del ADN puede incluir un gen que expresa una proteina reportada. La seleccién de fa proteina reportada puede variar. Por ejemplo, la proteina reportada puede ser una proteina fuorescente amaritla, proteina fluorescente roja, una proteina verde fluorescente o una proteina fluorescente cian. En uno de los aspectos, el gen que expresa la proteina reportero tiene SEQ ID n° 15.ta cantidad de fluorescencia que es producida por el aparato blolégico puede correlacionarse con la cantidad de la estructura de ADN incorporada en oMlulas de le planta. La fluorescencia producida por et aparato puede ser detectada y cuantificado utilizando técnicas conocidas en el atte. Por ejemplo, espectro fluorimetros se utiizan tipicamente ara medir fluorescencia. Los ejemplos proporcionan procedimientos ejemplares era medir la cantidad de fluorescencia como resultado de fa expresion det ADN. La estructura de ADN descrita puede ser parte de un vector. En un especto, el vector es un plésmido, un Fagémido, un césmido, un cromosoma artificial de levadura, un cromosoma artificial bacteriano, un virus, un virus 0 un transposon. En general, se utiizan vectores plésmidos que contienen replicon y secuencias control que se derivan de especies compatibles con la célula huésped ‘en relacién con estos hosts. Vectores capaces de altos niveles de expresion de los genes recombinantes y proteinas son bien conocidos en el arte. El vector lleva hormaimente un origen de replicacién, asi como marcar las secuencias que son capaces de proporcionar seleccién fenotipica de las células transformadas. Plasmido vectores utiles para la transformacion de una variedad de células hospedadoras son bien conocidos y comerciaimente disponibles. Estos vectores incluyen, pero no se limitan a, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBSK, pBR322, pYES, pYES2, pBSKII y vectores de la puC. as.Los plésmidos son elementos bicatenario, replican auténomamente, genéticos que no estén integrados en los cromosomas de la célula huésped. ‘Ademds, estos elementos genéticos generatmente no forman parte del metabotismo central de la célula huésped. En las bacterias, los plésmidos pueden variar de 1 kilobase (kb) de mas de 200 kb. Los plasmidos pueden disefiarse para codificar un numero de caracteristicas utiles, incluyendo ta produccién de metabolites secundarios, resistencia a los antibidticos, la produccién de proteinas tiles, 1a degradacion de moléculas complejes 0 toxinas medioambientales y otros. Plasmidos han sido objeto de mucha investigacién en el campo de la Ingenieria genética, como los plésmidos son vectores de la expresion conveniente para ADN extrafio en, por ejemplo, microorganismos. Los plasmidos Contienen generaimente elementos reguladores come promotores y terminadores y también suelen tener origenes de replicacién independientes. dealmente, los plasmidos estarén presentes en multiples copias por célula huésped y contendran marcadores seleccionables (tales como los genes de resistencia a los antibiéticos) para permitir que el artesano ordinariamente seleccione las células del huésped que han sido exitosamente transfectadas con fos plasmids (por ejemplo, al cultivo de las células hospedadoras en un medio que contione el antibiético), En uno de Jos aspects, el vector codifica un marcador de seleccién. En otro aspecto, el marcador de seleccién es un gen que confiere resistencia @ un antibidtico. En clertos aspectos, durante la fermentacion de las cétulas del huésped transformadas con el vector, las oélulas son en contacto con el antibiético, Por ejemplo, el antibidtico puede incluirse en la cultura medio, Las células que no se han transformado con éxito no pueden sobrevivir en presencia del antibidtiog; Sdlo las células que contienen el vector que confiere resistencia a Jos antibiéticos pueden sobrevivir. Opcionalmente, solamente las células que ‘contienen el vector que se expresaran a ser cultivadas, como esto resultaré en la mayor eficiencia de produccién de los productos génicos deseada (por ejemplo, péptidos impticados en la sintesis de compuestos fendlicos).Células que no ‘contengan el vector lo contrario competirian con las células transformadas por los recursos. En uno de ios aspectos, el antibiético es tetraciciina, neomicina, 16kanamicina, ampicilina, Higromicina, cloranfenicol, anfotericina B, bacitracina, carbapenam, cefalosporina, etambutol, fuoroquinolonas, isonizid, meticiina, oxacilina, la vancomicina, estreptomicina, quinotinas, nfampicina, rifampicina, sulfamidas, cefalotina, eritromicina, gentamicina, estreptomicina, penicilina, otro comiinmente-utiizado antibiéticos, o una combinacion de éstos. En uno de los aspectos, cuando el vector es un plésmido, el plésmido también puede contener una clonacién mutipies sitio o politinker. En otro aspecto, el poliinker contiene sitios de reconocimiento para mittiples enzimas de ‘estriccion. El poliinker puede contener hasta 2,3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 44, 15, 16, 17, 18, 19, 20 0 mas de 20 sitios de reconocimiento para las enzimas de restriccion. Ademés, la restriccién de sitios puede ser afiadida, desactivados 0 eliminados como sea necesario, utiizando técnicas conocidas en el arte. En un aspecto, el plésmido contiene sitios de restriccién para cualquier enzima de restricci6n conocida como, por ejemplo, Hindll, Kpnl, Sacl, BamHi, BstX!, EcoRI, BsaBl, Noll, Xhol, Sphi, Sbal, del litoral, vela, Cial, EcoRV, Pstl, Smal, Xmal games, Eagl, Sacil 0 cualquier combinacién de éstos.En otro aspecto, el plésmido contiene més de un sitio de reconocimiento para la misma enzima de restriceién, En un aspecto, la enzima de restriccién puede hender la ADN en un sitio de restriccién asimétrica oun palindrémico. En otro aspecto, la enzima de restriccion segmenta el ADN para dejar extremos embotados; en un aspecto alterativo, fa enzima de restriccién segmenta e! ADN para dejar los extremos salientes 0 "pegajosos”. En otro aspecto, la enzima puede hender el ADN a una distancia de 20 bases de a més de 1000 bases lejos del sitio de la restriccién. Una variedad de enzimas de restriccién son comercialmente disponibles y sus secuencias de reconocimiento, asi como las instrucciones de Uso (e.g. cantidad de ADN necesaria, precisos volimenes de reactivos, técnicas de purificacién, asi como informacién sobre la concentracién de sales, pH, temperatura ptima, tiempo de incubacién y similares) estan a su disposicion por proveedores comerciales enzima. ay pasEn un aspecto, un plésmido con un polllinker que contiene uno o mas sitios de restriceién puede ser digerido con una enzima de restriccién y una secuencia de nucledlidos de interés puede ser ligada en el plésmido con una ADN ligasa enzima comercialmente disponible. Varias de estas enzimas estén disponibles, a menudo como kits que contienen todos los reactivas y las instrucciones necesarias para su uso. En olf aspecto, un plasmigo con un pollinker que contengan dos o mas sitios de restriccién puede ser digerido simulténeamente con dos enzimas de restriccion y una secuencia de nuclestidos de interés puede ser ligada a utilizando una enzima ligasa de ADN del plésmido. El uso de dos enzimas de restriccién proporciona un corte asimétrico en el ADN, lo que permite la insercién de una secuencia de nucledtidos de interés en una direccién determinada o en un filamento particular det plasmido bicatenario. Puasto que la sintess de ARN de una plantila de ADN procede de 5° 4 3', @ menudo a partir s6lo después de un promotor, el orden y direccién de los elementos que se inserta en un plasmido es especialmente importante. Si es un plasmido que se digerirén simulténeamente con mittiples enzimas de restriccién, estas enzimas deben ser compatibles en términos de biter, concentracién de sales y otros parémetros de incubacién. En algunos aspectos, antes de la ligadura utiizando una enzima igasa, un plasmido que tiene sido digerida con una enzima de restriocién es tratada con una enzima fosfatasa alcalina para quitar 5' grupos fosfato terminal. Esto evita que la ligadura del piésmido y facilta asi la ligadura de fragmentos de acido nucleico heterdloga en el plasmido. En uno de los aspectos, los acidos nucleicos (por ejemplo, genes que expresan liasa de amoniaco histidina/fenilalanina) utilizando en el ADN pueden ser amplficadas las construcciones descritas usando la reaccion en cadena de polimerasa (PCR) antes de ser ligada a un plasmido u otro vector. Tiploamente, las téonicas de amplificacion por PCR hacen uso de carillas 0 corto, oligonuciedtides sintetizados quimicamente que son complementarios @ las regiones en cada flamento respective Nanqueando el ADN 0 el nucledtide de la secuencia amplificado. Una persona que tiene habilidad comin en el arte seré 18 22ccapaz de disefar 0 elegir iniciadores basados en las condiciones experimentales deseadas. En general, los iniciadores deben dise‘ierse para proporcionar la replicacion eficiente y fel de los acidos nucleicos de destino, Dos iniciadores son necesarios para la amplificacién de cada gen, uno para la cadena con sentido (es decir, el flamento que contione el gen de interés) y otro para ta hebra antisentida (es decir, el flamento complementario para el gen de interés). Pares de iniciadores deben tener temperaturas de fusion similares que estan cerca de la reaccién de la temperatura de recocide PCR, Para faciltar la reaccién de PCR, se deben evitar las siguientes caracteristicas en cartilas: repite mononuclestido, complementariedad con otros iniciadores. en la mezcla, uno mismo- complementariedad y horquillas intemas 0 lazos. Los métodos de disefio de cartila son conocidos en el arte; Ademés, existen programes que puede ayudar al practicante ordinariamente calificado con el primer disefio. La preparacion opcionalmente puede incorporar sitios de reconocimiento de la enzima de restriccién en sus 5' extremos para ayudar a la ligadura posterior en plasmids u otros vectores. PCR puede levarse a cabo utiizando ef ADN purficado, no purificando el ADN que ha sido integrado en un vector, 0 genémico ADN no purificado. El proceso de amplifcacion de ADN mediante PCR consiste en introducir un exceso de dos cartilas con las caracteristicas descritas anteriomente a una mezcia que contenga la secuencia a ser amplifcada, destino seguido por una serie de cicios tétmicos en presencia de tolerantes al calor 0 ADN terméfilo polimerasa, tales como, por ejemplo, cualquiera de Tag, Pfu, Pwo, TA, rTth, TH © Tma polimerasas. Un “ciclo” de PCR implica desnaturalizacion del ADN por calentamiento, seguido de recocido de los iniciadores en ef ADN de destino, seguido por la extensién de los cebadores mediante el ADN polimerasa termofila y un suministro de Deoxinucledtidos tifosfatos (es decir, ¢CTP, 4 durante una hora a 30 °C y plateado en el agar de Muller Hilton con ampicilina, Las oélulas se hicieron competentes mediante la preparacién de un nuevo tratamiento quimico ‘con un tamp6n de electroporacién que contiene 0,5 M HEPES, 0,5 M sacarosa, glicerol al 80% y 25 mM de MgCI2-E! buffer ha sido afadido a las células sedimentadas después de crecimiento durante la noche en condiciones asépticas ‘@ una temperatura de 4° C. El diabolo fue centrifugado y lavaron tres veces con el tapén, alicuotado y utilizado inmediatamente 0 almacenado 2-80 °C. Expresion de ADN y la eficacia de la transformacion fueron determinados por fluorescencia de las células transformadas, expresado en unidades de fluorescencia (tas), segtin un protocolo proporcionado por el fabricante, utlizando Lun luminémetro 20/20 (Promega). El médulo de fluorescencia azul utilizando las longitudes de onda de 450/600 nm se utiliz6 para evaluar la eficacia de la transformacién. La purificacién de la extraccién de ADN plasmidico, PCR y electroforesis en gel también fueron utilizados para confirmar la transformacién. Se obtuvieron diversos dispositives transformados. Diferentes tipos de reporteros fluorescentes de proteinas fueron destinados (proteina fluorescente amarilla, proteina fluorescente roja, proteina fluorescente verde y proteina fluorescent cian) para todas las células transformadas. Sin embargo, la proteina luorescente cian fue preferida. Cuando ninguna proteina fluorescente reportada fue montada, no observé ninguna fluorescencia Quitosano. EI quitosdn es un compuesto polisacdrido lineal natural compuesto 0 distribuido al azar B-{/-4)- ligado residuos de D-glucosamina y nvacetitD- Glucosamina. Para producit el quitosano, quitina primero fue exttalda de los exoesqueletos de crustéceos (por ejemplo, camarones y cangrejos). Las muestras fueron tratadas varias con acido inorganico (desmineralizar), hidréxido de sodio 34{para eliminar tas proteinas) y solventes organicos (para eliminar (os lipidos y ‘otros componentes hidrofébicos). La quitina fue desacetilada para producir quitosano (grado de acetilaci6n aproximadamente 70-80%), con hidréxido de sodio. Aqui, el quitesano se disolvié en acido acético glacial y se utiliza como un ‘concentrado de 1%. ‘Cacao maduro (Theobroma cacao) Frutas fueron utitizados como fuente de cétulas embrionarias para el desarrollo de los callos. El cacao maduro de frutas fue el primero sometido @ la desinfeccion de superficies mediante el uso de una solucién de agua jabonosa y seguidas por el tratamiento con solucién de yodo (3 mg/L) durante 15 minutos. Entonces, la desinteccién de las semillas de cacao (granos) fue realizada ai tratar las semillas con solucién de etanol (70%) durante 3 minutos, seguido por el tratamiento con solucién de hipaciorite de sodio (1%) por 10 minutos. Finalmente, las semillas se lavaron tres veces con agua destilada estéril El proceso de desinfeccién de superficies se realizé dentro de un flujo laminar del gabinete bajo condiciones asépticas. Después de la esterlizacion superficial, tas semillas (granos) fueron sometidas a induccién de calls en medios especificos para cultivas de tejidos ‘como sigue (véase Murashige, T. y Skoog, F. "Un medio de rapido crecimiento y bioensayos con cultivos de tejkios de tabaco, revisado" Physiologia Plantarum, 1962, Vol. 15: 473-495). La desinfeccién de las semillas de cacao fue enviada a la extraccién de células embrionarias en condiciones asépticas y transferidas al medio de cutive (MS), el cual conliene sales minerales y microelementos, se enriquece con el myo-inositol (100 mg/L) y sacarosa (30 g/L), con goma gellan (2,4 g/L) como gelificante. Los explantes de cacao se incubaron en condiciones oscuras por Tdias a 22-24 ° C.Después del perlodo de Incubacién, las células embrionarias cacao fueron subcultivadas en medios nutrtivos con los mismos tipos de ingredientes como los medios de comunicacion mencionados arriba, pero que contienen diferentes concentraciones de auxinas 35(hormonas de crecimiento 2, 4-D), con cuatro diferentes concentraciones (0, 0.1, 05, 1.0 y 2.0 mg/l). Se utilzé un disefio experimental al azar con tres repeticiones y 10 unidades experimentales durante 100 dias 2 22-24 * C. Los medios esténdar para el cuttivo de callos se utlizan durante la Investigacion (tabla 1). Los principales medios de comunicacion se elaboraron en medios esténder, MS suplementados con sacarosa (30 g/L). Los medios de comunicacién incluyeron una base de goma gellan (2.4 g/L) y se prepararon a pH 5.8. Los callos cuttivados se incubaron en condiciones de oscuridad a 25 * C. Los datos fueron sometidos a andlisis estadisticos incluyendo ANOVA y nivel de significancia, Tabla 1: Composicion de los medios de comunicacién induocion de callos de cacao. ‘Soluciénde] Valorde | Volumen | Concentracion 21 |concentracion| de Vater | Final gon | muy | mat Wns [8250 po 1856 RNOS Bo 70 FBS Ta E em krapos | 38.00 170 «i 0.168, 0.88 0.05 026 0.005 0.005 Heo 0 | __ aoe F 308 3.38 168 wn 2 0.008 o.026 NaeDTA [TS B He Fesoe7 yo | 5:57 2785 Tyowostal [a ry 36Aumento de la masa celular de los callos mediante el uso de reguladores de! crecimiento. Diferentes concentraciones entre 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, 4, mg/L de cinetina fueron evaluadas. También, la cinetina fue utiizada con o sin 2, 4D en concentracién de 2 mg/L. Se evalué el crecimiento de callos después de 100 dias, y los diferentes pardmetros fueron utilizados pare determinar los efectos de los reguledores de crecimiento sobre ol crecimiento de callo incluyendo el % de desagregacién, altura y diémetro del callo. Se utilize un disefo bifactorial de rescate con 10 unidades experimentales. Cada experimento fue replicado tres veces. Todos los experimentos se realizaron siguiendo los mélodos esténdar de cuitivo de telidos, como se describié anteriormente. Se utllizaron tres diferentes clones de cacao en diferentes edades (tabla 2) durante la investigacién con el fin de determinar sus efectos sobre el desarrollo de callos en relacién con el potencial de producién de compuestos polifendiicos, La tabla 2. Diferentes clones de cacao en diferentes “edades utlizado para inducr el dosartalo de callos. 37 A15 efectos de fenotipo y edad de la fruta de cacao en ef desarrollo de calllo. La tabla 3 muestra el efecto positive de 2, 4-D en estimular el crecimiento de cacao callos en las primeras etapas de desarrollo, El regulador de crecimiento de 24-D en concentracion de 2 mg/L inducida por ef mayor crecimiento en cacao callos. Este efecto fue observado por todos los tres fenotipos de cacao, Ademds, este efecto positive fue mayor en frutas maduras de cacao (20 dias). Tabla 3. Efectos de regulador de crecimiento de 2.4-D solo o en combinacién con quitosano en el desarrollo de callo inicial de tres distintos fenotipos de cacao. Tratamiento mah | ¥% de davarao de calo AD AY rao TS85 TR" BET Error sande SHREVE “QUTTOSANO TB) Es TEE DOR BBS DEW a Ten pees eOsse ivr esiandar Bao a Wales TaTEET was SRS Was ES Er entndor CAST OT TH FORTE 1S TSE con BOaTeT 38FE aB6Tez Facior® oS Favors oS Facare oS Faced we Tnieraccn de AT oS Uso del quitosano para inducir a los compuestos fenélicos durante el temprano crecimiento de callo, El tratamiento de Quitosano solo se induce por una mayor produccién de Compuestos polifenslicos en las primeras etapas de crecimiento de callo. Este efecto se observé en el agar del medio donde crecia el callo. Este efecto fue més observado, sin embargo, durante las ultimas etapas del desarrollo de calio (por ejemplo, después de tres semanas). E! quitosano se utiiz6 en la induccién de callos de una semana y ol ‘crecimiento de callos y la produccién de compuestos fendlicos después de 2 semanas de desarrollo de los callos. El quitosano fue aplicado por primera vez durante {a indueci6n del crecimiento del callo y durante la primera semana con el fin de estimular la agregacion de las células del callo. La concentracion del uitosano utilizado dependia de! tipo de clon y el tamaiio del call. Por lo tanto, se utilzaron diferentes concentraciones de quitosano: 0, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5 y 1.0 ppm. Et quitosano se afiadio al medio en placas de Petri. QUITOSANO también fue utlizado con o sin el convencional regulador de crecimiento de 2, 4-D cen as concentraciones mencionadas anteriormente (0, 0.1, 0.2, 1 y 2 mgft). El quitoseno también fue utlizado después de 2 semanas de desarrollo de callo con el fin de mejorar la produccién de compuestos fendlicos. Este se aplioé por difusién o por inyeccién. Se utilizaron diferentes volimenes de les soluciones 39de quitosano incluyendo 10 J, L, 50 15 J, L, 100 |J, Ly 1 mL, dependiendo del ‘tamano det callo, Inoculacién de callos con dispositivos fendlicos. A las tes semanas de edad, los callos de células somaticas de cacao (Theobroma cacao) se inocularon con dos dispositives fendlicos. Los callos fueron pretratados con quitosano en 0.1% antes del tratamiento con tos ispostvos de fendlicos. Se uliizaron en diferentes etapas de crecimiento, incluyendo 1. 2, 3, 4, 5 y 6 semanas desde el primer dia de crecimiento, cuando tienen 5 semanas de edad los callos son escogidas. Los callos seleccionados fueron inoculados con los dispositvos fendlicos por 48 horas. Diferentes diluciones de dispositivos fendlicos (i, e. 10°, 10°, 10°, 10."y 10° célulasimL) fueron utilizados, con 10°, 10%y 10° células/mL. La inoculacién de dispositivos: bacterianos en los calles se realizé mediante se separan o por inyeccién usando diferentes volimenes del dispositivo, incluyendo 10, 50, 100, 300 0 500 WJ, L, con {a ineculacion por inyeccién usando un volumen de 150 J, L. Se evaluuaron dos ispositivos bacterianos: (1) transformado B. pumilus que contiene el promotor de la seouencia PAL + PAL + sitio de Unién ribosémico + tapén transcripcional (dispositive fenético M1) y (2) igual que el #4 mas una proteina fluorescente, pero montado en E. coli (dispositive fendlico}. Después de la inoculacién de los callos con los dispositives fendiicos, los callos se sometieron a la evaluacién de la produccién de compuestos fendlicos incluyendo compuestes polifendlicos. Se ufilizaron diferentes parémetros. para ‘evaluar la produacion de compuestos polifensiicos en callos: 1. Crecimiento de callos, determinado por peso tamario y biomasa. 2. Color y textura de los callos. Estos fueron determinados por observaci6n directa con el ojo desnudo y por la observacién fotogréfica 403. Produccién de —compuestes fendlicos -_incluyendocompuestos polifendlicos. Estos fueron determinados por la presencia de compuestos fendlicos en los medios de agar donde callos fueron creciendo y quimica analitica por la extraccién y cuantificacion de HPLC siguiendo los procedimientos esténdar como se describe a continuacién. 4, Concentracién de las bacterias transformadas utiizado para inocular los callos eran también determinada por métodos microbiolégicos esténdar {ales como conteo de Colonia formando unidades de (colonias UFC) y medir la densidad éptica (OD) utilizando un espectrofotémetro UV/isible situado a 600 longitud de onda nm. Todos los experimentos se realizaron en 3-6 repeticiones. Desviacion media y estandar (SD) se calcularon para cada experimento. Los principales parametros utiizados para evaluar fa produccién de compuestos polifenélicos en callos fueron: 1. Crecimiento de callos. Esto fue hecho para determinar el peso de ta biomasa y el tamafio del call. 2. Textura del callo por tacto bajo condiciones aséplicas. 3. Color del callo. Esto se hizo una escala relativa de observacién arbitraria ‘entre martén @ marrén oscuro, ya que los calles son de color marrén durante la fase de desarrollo. Las fotos fueron tomadas durante esta fase. 4. La produccién de compuestos fendlicos incluyendo compuestos polifendlicos fue determinada por la extraccién'o ta digestién y cuantificada por HPLC. Ademas, la observacién de la presencia de color pardusco en fos medios de agar donde crecieron los callos se regisé como una indicacisn de la produccién de compuestos fendlicos incluyendo ‘compuestos polifendticos 5. La determinacién de la concentracién de las células bacterianas de los dispositivos fendlicos utilizades para inocular los callos. Esto fue realizado 41Por métodos microbiolégicos esténdar, con la dilucién, cuando fue necesario, para determinar la Colonia formando unidades (UFC) 0 densidad optica (OD) espectrofotométricamente a 600 nm. 6 Evaluacién de estos parémetros se llevd a cabo diariamente o semanalmente. También, el total de ADN y ARN, y la fluorescencia de los, dispositivos se determing, con el fin de evaluar la aptitud genética de los ispositives que contienen las proteinas ADN PAL fenélicas u otros genes que codifican para las proteinas responsables de la produccién de los Compuestes fendlicos, inciuidos los compuestos polifendiices. Se utlizaron los esténdares de biologia molecular y los procedimientos de biologia sintética (Cuero et al. *Constructred Microbial Sensor to Enhance Detection of Metals" Journal of Biotechnology 2012, Vol 158: 1 - 7) La Expresién de las protefnas y enzimas responsables de ta produccién de compuestos polifendlices fue determinada por ambos PCR en tiempo reat (qPCR 2D DIGE separactén y seguida de un andlisis de espectrometria de masa Las figuras 2-5 y la tabla 4 muestran la eficacia de la Asamblea del gen PAL y otras piezas genéticas en vector pYES en las bacterias E. colly B. pumilus, respectivamente. Las cifras muestran crecimiento abundante de los dispositivos fendlicos que eventualmente podria ser inoculado en los callos. Por lo tanto, el mayor crecimiento de ios dispositivos de fendiicos (es decir,colonias) representan una mayor expresion de la proteina PAL. que es la responsable para la produccion de compuestos polifendlicas. Figura 3 y tabla 4 corroboraron la alta Produccién de proteinas relacionadas con la produccién de compuestos polifendlicos. Las manchas brillantes en la figura 3 representan la expresion de algunas proteinas; Estas proteinas se enumeran en la tabla 4. Los dispositives fenétices | y II mostraron mayor induccién de compuestos poltfendlices que el controt (E. coli o B. pumilus sin transformacién). Los resultados de qPCR, corroboran la correlacién entre una mayor produccién de compuestos fenélicos y una mayor expresiin génica en los dispositivos 42bacterianos (bacterias transformadas) en comparacién con tos controles (bacterias no transformadas) La Figura 3 y las tablas siguientes muestran la ata correlacién entre el gen y la expresion de la proteina y la mayor produccién de compuestos fendlicos en callo inoculan con dispositives bacterianos montados con la proteina PAL y otras, piezas genéticas en comparacién con el control (calla inoculado con bacterias que no contienen genes PAL u otras plezas ensambladas genéticas). Las tablas de abajo también muestran un mayor ADN expresado en dispositives fendlicos que contienen la proteina PAL, especialmente de los genes que codifican para proteinas relacionadas con la produccién de compuestos fendlicos. Asimismo, la figura 3 y tabla 4 muestran una mayor expresién de proteinas relacionadas con la produccién de compuestos fendlicos. Tabla 4. Proteinas que fueron altamente expresd e identificadas en los dispositivos fendlicos montado con proteina PAL en relacién con ia produccién de compuestos fendlicos en callos de cacao sin trata. rotainelentinna ‘unelon roe omplejo de la proleina que participa en ests en plantas. BnTSTA \Proteasa inespecifica que rompe enlaces pepliicos of participa on fa sintesis de otras proteinas. aialza Ib hidrolsis de los ésteres y los grupoq| fa; también ests involicrada en el metabotsma de rborlostarasa RFE Tioesterasa implicados en la mleraccon plante-becteias| ssimbios's. verbal y egulacién genética ‘ao 3-dooxy-D- atalze Ia mielacion de la biosintosis de aminoacid abinoheptulosonate-7 aromstices 9 aves de condonsacién del ci ela sintase jrivico y Eris 4-fostato. lrpt6fano: una molécula de Sosfornbosi-a-pirolostato una molécula de antranialo se condensa y loera fost inorgéico Tarabinosidase Gicosidasa que Wdrolza a1 -arabinofuranosiGes, am Partcipan en ei mecanismo ce respuesta de una planta Iricroarganismes. iimase putaivo Twolucrado en romper glucosidicos y_permitiendo Uberacion de hidratos de carcono de las células vegetset len relacién con produccian de metabolites secundarios. Cataize una reaccién temprena de sintesis E fal 43 4Tabla 5. Produccién de ARN 8. Pumilus dispositive fendlico como comparado con el control (Non-transformados B. pumilus). Las mediciones se realizaron en un espectrofotometro. ‘a 260/280 NM. Muestra_ | ARNein diluir(ngiity) | Azéo | Aveo | 2607280 Conver 743 oes | one | 188 Experimental 2885 oat | o2es [207 Tabla 6. Resultados del tempo de polimerizaciin en cadena (@PCR) mostrando la expresion de los genes que codifican para proteinas PAL (estandarizades). Gea] Cantor | Experimental Pat TT Efecto de la concentracién de fendlico dispositive sobre la induccién de compuestos fendlicos en cacao callo. La eficacia de los métodos divulgados se observa claramente al usar las diferentes pobiaciones de dispositivos fendlicos. Se uliizaron_ diferentes concentraciones de dispositivos bacterianas, incluyendo 6 x 10°, 2x 104, 1 x 10° y 100 célulasimL. Sin embargo, las primeras tes ciluciones fueron las cconcentraciones més eficaces en la induccién de la produccién de compuestos fendlicos en cacao callo. Las figuras 2, 3 y 5 muestran el fuerte efecto de ta B. pumilus dispositive fendlico con la secuencia PAL y en concentraciones de 10° 10° y? 10 célulasimL, en el crecimiento y la produccién de compuestos fendlicos en cacao callos. Asimismo, la E. coli y el dispositive fendlices que contiene la secuencia PAL en una concentracion de 10° células/mL mostraron un fuerte efecto en el crecimiento de callos de cacao y la produccién de compuestos fendlicos. La presencia de compuestos fendlicos es visto por el ojo desnudo en fa superficle del agar, y las concentraciones en callos faciimente pueden ser cuantificadas por HPLC. “4 43Extraccién y cuantificacin de compuestos polifendlicos de cacao callos. Los protocolos estandares para la extraccién de compuestos fenélicos incluyen compuestos polifendlicos. E! Folin-Ciocalteau (Singleton, VL, R, Orthofer Lamuela-Raventos, RM.,1999, "Analysis of total phenols and other oxidation substances and antioxidants by mean of Folin-ciocalteau reagent,” Methods enzymol., 299:152-178; Ebel, J., 1986, “Phytoalexin synthesis: the biochemical analysis or the induction process,” Ann Rev. Phytopathol. 24:236-264; Mansfield, J.W., 1983, “Antimicrobial compounds,” In: Biochemical Plant Pathology, Ed: J.A. Caliow, New York:John Wiley and Sons, Ltd. Pp, 237-265). Un método HPLC fue utilizado para identificar y cuantificar los compuestos fendlicos, incluyendo polifendlicos compuestos (C. Stalikas, 2007, “Extraction, Separation, and Detection Methods for Phenolic Acids and Elavonoids,”. /. Sep SCI, 30:3268- 3295), La extraccion y cuantificacién de compuestos fendlicos/polifendlicos se lievé @ cabo en calios después de 15 dias de tratamiento con o sin dispositivos bacterianos, como tos 10 siguientes: 1. Maceracion de callo biomasa mezclado con diferentes concentraciones de acetona en un 50%, 60%, 70%, 80%, 95%, con un 70% preferiblemente 2. El liquide extracto de arriba fue objeto de homogeneizacién eléctrica a diferentes velocidades de agitacién incuyendo 50, 90, 100, 200 y 300 rpm, ‘con 90 rpm de preferencia, 3. La fitracién y centrifugacién. Centrifugacién se evo a cabo a 9000 rpm a 4°C por 10 minutos. 4, La roto evaporacién fue realizada con el fin de eliminar la acetona restante de la solucién, obteniendo asi una solucion acuosa para al andlisis final de compuestos fendlicos/polifendticos por HPLC. 5. La identificacion y cuantificacién de compuestos fendlicos/polifendiicos por HPLC. 45 aqLos compuestos polifendlices extraides primero fueron cuanttficados mediante ef método de Folin - Ciocalteau utiizando un espectrofotémetro Uvivisible, y los resultados se expresaron en Acido galico (GA) en el peso seco de fa biomasa y sin materia grasa. Identificacién y cuantificacién de compuestos polifendlicos mediante HPLC de fase inversa. Los compuestes fendlicos extraidos fueron somelidos a la identificacién de ‘compuestos polifendlicos utiizando un método de HPLC. Diferentes niveles de compuestos fendiicos fueron ullizados para el andlisis HPLC. Los tiempos de retencion de los estandares en la HPLC fueron comparados con fos tiempos de retencién de los compuestos fendlicos extraidos, que también fueron inyectados en el HPLC en condiciones operativas similares de HPLC. Luego, se compararon los resultados cuantitativos entre las normas de los compuestos fendlicos y ‘compuestes fendlices extraidos de calles, Se utlizaron diferentes estindares de compuestos polifendiicos, incluyendo: Acido cafeico, catequinas, acido p- ‘cumérico, cid gélieo, acido p-hidroxibenzoico y Acido vanilico, Los compuestos fendlicos mencionados fueron utiizados para la curva de calibracién intema de la HPLC siguiendo un procedimiento esténdar para la calibracion de HPLC. Las muestras fendlicas y los esténdares fueron fitrados antes de inyectar en el HPLC. A 10 volimenes de inyeccién de [IL se utiliz6; se inyectaron dos repeticiones de cada muestra. El caudal fue 1 mL/min y la fongitud de onda detector era 210 nm. Fase mévil A: desionizada agua con acido fosférico (0,1%); la fase mévil B: acetonittilo con acido fosforico (0,1%). El tiempo total de funcionamiento fue de 35 minutos, distribuides de la siguiente manera: 0-22 minutos 95% A 5% B; 22-29 minutos 90% A 10% B; 29-30 minutos 80% A, 20% fase B; 30-35 minutos 95% A, 5% B. 46Extracci6n, identificacién y cuantificacion de compuestos polifendlicos de cacao callos. La extraccion de compuestos polifendlicos de los callos era més facil y mas rentable en comparacion can los métodos convencionales que utlizan semillas de cacao, donde hay necesidad de eliminar mas biomasa vegetal y material ‘9ras0. La mayoria de las semillas de cacao o granos contienen entre 13-55% de materia grasa, que requiere el uso de mas solventes quimicos para la extraccién. Sin embargo, la extraccién de compuestos polifendlicos de callos cacao mediante los métodos descritos en este documento no requiere la eliminacién de los materiales grasos. Ademas, la biomasa del callo es més pequefia y mas suave que las semilas de cacao. Asi, los métodos actuales son ‘mas costo-eficiente, mas eficaces y més eficientes energeticamente (el calor no ‘se requiere para la extraccién de compuestos polifendlicos). También el andlisis de los compuestos polifendlicos de semillas de cacao 0 granos fue levado a cabo por el método de Folin-Clocalteau utiizando un espectrofotémetro UVivisible, basado en equivalentes de dcido galico (EAG). Por lo tanto, los datos proporcionados son basados en el equivalente a acide gélico/100 g de masa seca de la muestra, donde los callos se secan y son pulverizados antes de ser sometidos a andlisis de compuestos polifendlicos, siguiendo los protocolos estandar. Las Semillas 0 granos de cacao primero fueron sometidas a la eliminacién de material graso (compuesto por 45-65% de las semillas). El proceso se realizo mediante disolvente n-hexano. La extraccién de material graso se realizé tres ‘veces con el fin de eliminar la suficiente grasa para evitar interferencias con la cuentificacién de compuestos polifendlicos empleando tos. procedimientos estandar. ‘A continuaoién se utiliza una descripcién de un proceso de extraccién ‘ejemplarizado en este documento: a1, Extracci6n de polifenotes compuestos de semillas de cacao con mezcla de acetonalagua (70: 30, 60, 50: 50), con 70: 30 preferiblemente. 2. Agitacion a temperatura ambiente (26 * C). 3. Firo; e! ftrado se lava con agua desionizada y se guarda para el siguiente paso. 4, El material obtenido se somete a rotoevaporation para eliminar residuos de acetona y producir una solucion acuosa, 5. Todas las soluclones fueron estandarizadas por el volumen, luego sometidas a la prueba Folin Ciocalteau y analizadas en el ‘espectrofotémetro como se desoribié anteriormente, 6. Las muestras purificadas fueron cuantificadas en espectrofolémetro a 765 nm, una curva esténdar basada en dcido gélico en concentraciones de entre 2 y 14 ppm usando la ley de Beer se realiz6 con el fin de realizar el andlisis de compuestos polifendlicos de Folin-Ciocalteau Las Concentraciones de compuestos polifendticos fueron determinados espectrofotométricamente basado en absorbancia (A) utlizando la ecuacion de ‘abajo con un coefciente de correlacion de 25 (1°) de 0.99915 y el constante kl es igual a 10.099. Aes ta absorbancia de las muestras: C=KLXA Los resultados finales se expresan en porcentaje de compuasios polifendiicos, utilizando la siguiente ecuacién: ‘concentracion (mpfL) x Volumen (L) x FD % Polifencios= 100 peso de la muestra (mg) 48. 2‘Se expresa el porcentaje de compuestos polifendlicos en EAG / 1009 de muestra como se describié anteriormente. La concentracién final se obtiene cuando la absorbancia de las 5 muestras obtenidas se cruza con la curva estindar de acido galico descrito anteriormente. FD es el factor de dilucién, el volumen (L) es la alicucta utiizada para el andlisis de Folin- Ciocatteau. Resultados se offecen en la tabla 7. ‘Tabla 7. Concentracién de compuestos polifendlicos en cacao callos después de andlisis espectrofotometro. Tratamiento ‘Vatiedad Peso dela [Fenoles totales] 8D de eseao muestra % (m9) (€AG 11009) Calo CONTROL | ICS pid S oes Disposiive con fis ya ‘o0Teas (constiuis PAL 10° 8. purus Cacao fuias T froaoo—_|Tr6 oaser Cacao Fuses rosea fia a7 Toes Nota: Después de 20 dias de crecimiento, callos de cacao fueron inoculados: ‘con dispositivos fenéiicos (B. pumilus). 15 dias después de la inoculacion se realizan andlsis. Cuantificacién de compuestos polifendlicos por HPLC de fase inversa. El andlisis de HPLC y la cuanlificaci6n de los compuestos polifendlicos se realizé usando una curva esténdar basada en estandares puros de compuestos polifendlicos y se determino el tiempo de retencién {RT). Los resultados muestran Ia alta produccién y la pureza de los compuestos polifendlicos libres de las muestras de cacao calios. a9 5334 ‘Ginco concentraciones diferentes para cada compuesto polifendlico se utilizaron durante el andlisis de fase inversa HPLC, como se muestra a ccontinuacién: 1. Tiempo de retencién para cada estandar se determind por la HPLC. 2. Las mezclas de estandares de compuestos polifendiicos también se ejecutaron a través de la HPLC para cerciorarse de que los compuestos olifendlicos de interés no estaban ocultes por otros compuesios, ya que algunos de ellos muestran similitudes moleculares. 3. Las muestras extraidas de cacao callo que fueron purificadas fueron luego analizados por HPLC. 4. Los datos fueron analizados teniendo en cuenta la dilucion de los extractos de los callos, la concentracién obtenida por HPLC y la dilucién de las muestras que fueron inyectados. Utilzando la siguiente ecuacién: ‘concentracion de HPLC (magi) x Volumen (L) x FO % Acido fentlico® x 100 peso de fa muestra (mg) Los resultados se expresaron en relaci6n con las normas correspondientes y se proporcionan en la tabla 8. Tabla 8. Cuantificacién de compuestos polifendlicos del cacao callos mediante HPLC de fase inversa, ‘Tratamiento | Cacao [p-cumarico| Acido Pp Cateco! | Promedio Variedad Acide galico | Hydroxybenzoil| Total Hy i Acido Ope [80 foie | 80h TB] Two ie sara es aro pap bar pb saul Cone par seo porns — hr pa ire fies # pmol POP PEP OP OP PP 50PAL 108. mils (4) PAL 10"B |CCMat BST PP ro087 pros pumilus (3) sACAO 2 [COMS1 ese pos [202 pose p i153 008 poe owes feacaos [ics 4 ao por pis fee poi prrp pas |rstos} 1UITOSANO | TS P f 8 i i 18 [oars 4). Control det tratamiento 1 = ICS cao sol sin tratamiento, , (2) Tedtamionto Contol2 = §1 CCM calla soo in Watemtionto (3) Calo + dispositive B. pumius (10°) (4) Cato + dispositive B. pumitus (10°) + quitosano: (5) Callo + dispositivo B. pumius (10°) Nota: También se determing la produccién de compuesios fendlicos en agar utiizando solamente la variodad ICS, Solamente el acide p-hidroxibenzoico fue producido en agar, 1.47% (SD = 5.05). En vivo prueba antimicrobiana de compuestos polifendlicos en frutos de cacao, El objetivo fue demostrar la eficacia de los compuestos polfendlicas aistada de los callos de cacao para el control de las enfermedades comunes en plantas do cacao, incluyendo Ios frutos. Los frutos de cacao con cuarenta dias de edad fueron inoculados con el hongo Moniiophthora roreri, que es un compatégeno de los cultivos de cacao. Las diferentes concentraciones de compuestos polifendlicos extraidos de cacao callo, como se describié anteriormente, fueron uilizadas para el control de M. roreriinfectando en los frutos de cacao; Los frutos de cacao fueron desinfectados con alcohol (70%) y el hipoctorito de sodio (1%) de la superficie y se lavaron con agua estéril siguiendo los siguientes procedimientos estandares, cacao frutas fueron inoculadas con soluciones de M. roreri usando una dilucién de 10° esporasimL, como sigue: Tratamiento 1: Cacao sin tratamiento (Control). Tratamiento 2: Frutos de cacao + solucién fungicida 91 EaTratamiento 3: Frutos de cacao + solucion fungicida polifendlicos sotucion. ‘Tratamiento 4: frutos de cacao + polifendlicos solucion sola, Tratamiento 5: Frutos de cacao + solucion fungicida aplicado después de tres dias de aplicacién de la solucion fendlica. Todas las soluciones de hongos se mezclaron con solucién de 20 polisorbato como portador, garantizando a eficacia de difundir la solucién fungicida sobre las superficies de los frutos de cacao. Se realizé tratamiento por inmersién de los frutos de cacao en soluciones de compuestos polifendlicos en concentracién equivalente a 0,028 EAG/g de muestra. Jodos los tratamientos fueron colocados en desecadores estériles y se incubaron en una camara ambiental situado a 26 °C y el 99,7% de humedad relativa durante diez dias. Los compuestos polifendlices producides por cafos utilizando los dispositivas de fendlicos controla eficazmente el crecimiento de hongos, incluyendo M. rorerien frutos de cacao. EI tratamiento inhibe completamente cualquier crecimiento fangico en los frutos de cacao y también se ha mejorado las caracteristicas fisicas de las frutas, tales como la frescura y turgencia. Asi, los compusstos fendlicos producides por los dlispositives fenélicos mejoran as propiedades organolépticas de los frutos de cacao. Por lo tanto, los compuestos polifendlicos pueden utiizarse para mejorar la calidad de almacenamiento en el cacao y cualquier otra fruta por mejorar fa frescura 0 propiedades organolépticas de la fruta, Absorcién de dispositivos fendlicos de Theobroma cacao. La Figura 6 y las tablas 10 y 11 debajo del resumen dan los resultados de! Uso de los métodos descritos para la produccién de los compuestos fendlicos de! ‘cacao, La figura 6 muestra el cacao (Theobroma cacao) los callos de ensayos de cultivo de tejidos. El dispositive fenélico tl que fue utilizado en estos 52 Sbexperimentos (B. pumilus transformada con ADN fendlico). EI uso de quitosano y 21 dispositive It aumenta significativamente el tamafio de! callo cacao. dispositives fendiicos que | y Il inyectada en cacao (Theobroma cacao) callo en Comparacién can los callos no tratados con las células (control) La fluorescencia confirma que las céfulas microbianas eran transformadas y el ADN fendlico tomade en los callos cultvados. La Tabla 11 muestra las concentraciones de ARN y ADN extraidas de cacao (Theobroma cacao) callos tratados y no tratados (contro), cultivos de telidos medido por nano espectrometria. La diferencia en las Cconcentraciones demuestra la induecién genética relacionados con el crecimiento de telido de planta y produccién de fendlico compuestos despues del tratamiento con quitosano y/o dispositivos fendiicos | y Il. Los resullados también muestran los beneficios de usar B. pumilus como les células del anfirién, que es una bacteria natural presente en el cacao. ‘Tabla 10, Fluorescencia de la proteina de tas células transformadas inyectado en cacao (Theobroma cacao reportado} los cailos en comparacién con el callo no tratadas con as células transformadas (control). Control | Tratados con] Talados con dispositivoll | dispositive n+ reportero Fluorescenca (asy | 02+ 003] ai0 + T64 488 +145 promodio # SO. Tabla 11. Concentraciones de ARN y ADN extraides de cacao (Theobroma cacao) caltos de tratados y no tratados (control) cultivos de tejidos, medidos por nano espectrometria. Contral] Tratades con] __Tratados con Gispositive | dispositive fenélice 11 fenolicol AN igi) 6s deer = So] S420. SATS +15 Besa0e ABN (0g ut} decrsS0 [32+ 11) 383 22109 53A lo largo de esta aplicacién, se hace referencia a diversas publicaciones. Las revelaciones de estas fublicaciones en sus totalidades presentes estén incorporadas por referencia en esta aplicacién para describir completamente los compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento. Pueden hacer varias modificaciones y variaciones a los compuestos, composiciones y métodos descritos en este documento. Otros aspectos de los Ccompuestos, composiciones y métodos descrites en este documento serdn evidentes de la consideraciin de ta especificacion y ta practica de los compuestes, composiciones y métodos revelados en este documento, Se pretende que las especificaciones y ejemplos deben ser considerados como elemplos. 54REIVINDICACIONES. 4. Un método para aumentar la produccién de uno o més compuestos ‘endlicos de cacao callo, el método compuesto para ponerse en contacto con el callo mediante un dispositive biolégico compuesto por una estructura de ADN transformada en las células del huésped, en donde la estructura del ADN consta de 5' a 3' y los siguientes componentes genéticos en e! siguiente orden: (1) un PAL promotor teniendo SEQ ID n° 1 0 un derivado de la misma; un gen que expresa histidina/fenilalanina amoniosiasa teniendo SEQ ID n° 5 0 un derivado de la misma; un ribosomal interruptor RpoS teniendo SEQ 1D n° 11 0 un derivado de ta misma; un sitio de Unién ribosomal que tiene SEQ ID n? 8 0 un derivado de la misma; y un terminador SEQ ID n° 10 0 un derivado de la misma, 2. El método de la reivindicacion 1, en el cual la estructura del ADN esta en un vector. 3, El método de reivindicacion 2, en donde el vector es un plasmido. 4, El método de reivindicacién 3, en donde el vector es PBSKIl 5. El método de la reivindicacién 1, en el cual las células hospedadoras comprenden bacterias 0 levaduras. 6. El método de ta reivindicacién 5, en el cual se compone de las bacterias Bacilo pumilus o . coli 7. El método de las reivindicaciones 1-6, en donde se cultiva el callo en uitosano antes de ser contactado con el dispositivo biolégico. 8. El métode de la reivindicacion 7, en el cual el quitosano es de 60% a 100% acetiiado. 9. El método de ta reivindicacién 7, en donde el quitosano se compone de 3.@ 20 unidades de glucosamina 0 unidades de N-acetiliucosamina. 10.Una planta de cacao cultivada por el proceso compuesto para ponerse en. contacio con ies células gametos eacao 0 un érgano reproductive cacao ‘con un dispositivo biolégico compuesto por una estructura de ADN transformada en las células del huésped, en donde la construccién de ADN ‘consta de 5' a 3' y los siguientes componentes genéticos en el siguiente 55os orden: (1) un PAL promotor teniendo SEQ ID n* 1 0 un derivado de ta ‘misma; un gen que expresa histidinalfeniialanina amonio-liasa teniendo ‘SEQ ID n® 5 0 un derivado de la misma: un ribosomal interruptor RpoS: teniendo SEQ ID n° 11 0 un derivado de la misma; un sitio de Union fibosomal que tiene SEQ ID n° 8 0 un derivado de la misma: y un terminador SEQ ID n° 10 0 un derivado de la misma, 11.Un método para la prevencién de contraer una o mas enfermedades de tuna planta de cacao, e! método que comprende el cultivo de la planta de cacao de células de cacao que han sido contactados con un cispositivo biotégico compuesto por una estructura de ADN transformada en las ccélulas del huésped, en donde la construccién de ADN consta de S'a 3 y los siguientes componentes genéticos en el siguiente orden: (1) un PAL promotor teniendo SEQ ID n® 1 0 un derivado de la misma; un gen que expresa histidina/fenilalanina amonio-liasa teniendo SEQ ID n° 5 0 un derivado de la misma; un ribosomal interruptor RpoS teniendo SEQ ID n? 11 0.un derivado de la misma; un sitio de Unién ribosomal que tiene SEQ ID n® 8 0 un derivado de la misma; y un terminador SEQ ID n° 10 0 un derivado de la misma. 12.E1 método de la reivindicacién 11, en donde la enfermedad es una enfermedad fungica. : 43.E1 metodo de las reivindicaciones 10-12, en el cual la estructura del ADN es un vector. 14. £1 método de la reivindicacion 13, en donde el vector es un plésmido. 15.EI método de la reivindicacién 13, en donde el vector es PBSKIl 16.£1 método de tas relvindicaciones 10-12, en el cual las células hospedadores comprenden bacterias o levaduras. 17.£1 método de la relvindicacin 16, en el cual se compone de las bacterias Bacilo pumilus 0 E. col 366h AMPICILINA stb ff | vsnomarewacannn aMOMIAUASA ‘onicen Puc PROMOTORPAL FIGURA 1 97FIGURA 2Solicitad 220378: PLANEILIA DE VE CONTROL CY3 ¥ ‘PALDEV-C¥S pHa pH 10 VE Contralcys PalDev-cys 2H 10 ons ms t0 ae 59 3oo et6.FIGURA 6 62(02) INTERNATIONAL APPLICATION PUHLISHED UNDER THe PATENT: COOPERATION TREATY (PCT) 9) Wor ttle Prope : ee rgateaton i EN a (10) International Publication Number (3) tteraationa Pbication Date ‘Shama: 2014 30.01.2014) =WIPO|PCT WO 2014/018822 A2 (G2) Ioteratiosl Patent Clasieation: ‘BA, BB, BG, BH, BN, BR, BW, BY, CaN T8942 G05) (CN, CO. CR, CU, CZ, DE, DK DM EES, E.G, Gb cic cr (21) Interoationl Applicaton Number: pcrustoisesni74 NOCH, MELINA HOWL NG, 82, Pi, PL, PT, QA, RO, RS, RU, RW, SC, Sb. 8086. SE- SU SM STU, SY, TL, TMT, TTR. TT.TZ, AUG, US, UZ, VC. VN.ZA, 2M, ZW. (22) loteraatlons Plog Die: 26 hiy 2013 26.012013) (25) ng Langoage: eee tan bapa Bones tna fry Cee See: US UG. 2M; 2), Biri (AM, AZ, BY. KG, KZ, RU, TT, an pyectcuscaniras emcees, pRB ge aC (2 tt saa GB “Apptiace "CUERO RENGIO, Raut (USS. 7219 x oie Vilage, pees TES (US) AG AL NE SN FD, FO (74) Agent: VILLANUKVA, Lewroaee, A Gardoer Gro’ Pabshed: ‘Grecevall& Villinwors, 2018 Powers Feny Row Suite — witow ineraonal search report and tobe republished 00, Alaa, GA 31839 (US), pon recep af at repo ale 483.2) Designated States (ais auerwise indented fr every — wit sequence Usting pat of description ule 5:2@)) ind of national proecion vale) AK, AG, AL, AN, a < a s & e s {60 Tite METHODS FOR INCRIASING THD PRODUCTION OF PHENOLIC COMPOUNDS FROM THEOBROMA CACAO 5 Gn Abstract: Deserted nena ato maths fo enhancing the prodston of phenole compass fom Theobroma cast, Roe ok {FR Gaps, ts devices and tds deel hen nsreas the action of photic comps own cota an, which Msi © thst sad eccror val,The phon enous rode bythe devs sod eth o nt rege then purenion SS aS cotmon corel orc mtd Tn et on eds eile ees owt of plansWo 2014701882 PeT/usz013i0s2174 METHODS FOR INCREASING THE PRODUCTION OF PHENOLIC ‘COMPOUNDS FROM THEOBROMA CACAQ ‘CROSS-REFERENCE TO RELATED APPLICATIONS, if This application claims the priority benefit of U.S, Provisional Patent Application No. 61/675,869 filed July 26, 2012, which are hereby incorporated herein by reference in their entireties, CROSS REFERENCE TO SEQUENCE LISTING ‘The genotic components described herein are referred to by @ sequence 10. identfior number (SEQ ID NO), ‘The SEQ ID NO corresponds numerically to the sequence identliers <400>1, <400>2, etc. ‘The Sequence Listing, in written computer readable format (CFR), is incorporated by reference in its entirety. BACKGROUND Tissue culturing is used in the propagation of new plant varieties, the 15 production of doubled haploids, cryopreservation, conservation of rare and ‘endangered plants, cultivation of difficult-to-propagate plants, and the production of secondary metabolites and transgenic plants. Tissue eulturing focuses on the production of high quality, disease-free plant materials forthe growth of erop plants 20 and distribution of high quality plant materials for plant breeding and the rapid production of improved plants. Curreatly, tissue culturing is boing used particularly for large-scale plant multiplication and micro-propagation, techniques which have ‘wide applications in forestzy and agriculture, Hundreds of eommerci propagation laboratories worldwide are currently multiplying large numberof clones, 25 of desirod varioties and local Nora (IAFA, 2004), Different opinions among members of the general public have been cstablished regarding plant transformation, particularly by those highly concerned about environmental issues. By contrast, soientists recognize Une plant that results 1Wo 2014/018822 PCT/US2013/052174 10 1s 25 from a specific targeted genesic aheration is indistinguishable from the plan that has beon developed by a provess of breeding and selection. ‘The only difference is thatthe process of altering a target plant canbe greatly accelerated because the genetic ‘modifications can be directed rather than random. Directed motifcation by homologous recombination hs been tested with homelogous-recombiation dependent gone targeting (hxdGT) (Doetschman etal, 1987) (Gupta & Dhugge, 2010), The problem with this approach is that the relative rate of homologous recombination compared to the rate of random insertion by illegitimate recombination is lower in plant cells than is in enimal cells. Efforts to address this limitation by the exprossion of foreign genes in plant cols have boon made. ‘These methods heve had i sucecss in producing effective gene targeting. Moreover, even when these ‘modified cells are used to effect homologous recombination, the resultant modified cel] would still contain an exogenous gene used to select the homologous secombinants and thus sil be considered a genetically modified plant by regulators and environmentally concerned entities. (Other methods in which homologous recombination is not involved and the utlization of specific recombination sites and recombinases desived from transposons hhave also been described in WO 01/85969 and WO 99/25821. ‘The problem with this approach isthe mixed structure of the oligonucleotide would likely prevent true recombination by genomic integration. ‘One of the most common techniques to genetically hybridize plants isthe use of plasmid-carrying Agrobacterium tumefaciens. A past of tbe life eyele of the A. ‘umefeciens plasinid involves infection of plants. A. wmefaciens introduces the plasmid into the nucle of plant cells inthe form of single strands. A recombinant A. wmefaciens plasmid can be used to imroduce exogenous DNA into a plant eet Different bactcrial plasmid gene treatments have also been used. For example, 4 simple DNA recombinant plasmid or plasmid holding specific gene cassettes 10 censure homologous recombination has been used, Plants hybridized by this method would be classified as genetically-modified organisms (GMOs) and would still be a Awo 20140018822 PCTIUS2O1352174 10 15 25 problem for the food and pharmaccutical industries. Methods for increasing the transgenic plant size and yield as well as delaying flowering in the plants, using nucleic acids thal encode plant transcription facto have boen established (US Patent No, 7,858,848). However, these methods also involve geneticelly ransfomning the plants. Moreover, the extraction of secondary ‘metabolites usvally requires high inital amounts of plant biomass or material. In ‘general, the extraction of plant metabolites is carried out from large amounts of fresh ‘biomass material, which requires agronomic practices, the use of chemicals, and time ‘consuming and expensive extraction methods. SUMMARY Described herein are methods for enhancing the production of phenolic ‘compounds from Theobroma cacao. For example, the devices and methods described herein increase the production of phenolic compounds from cocoa plants, which has industrial and economic value. ‘The phenolic compounds produced by the devices and ‘methods de not require the ultra purifieation that is common i ‘commercial methods, ‘The devices and methods described herein also enhance the growth rate of plants conventional or “The advantages ofthe invention will be set forth i part in the description ‘which follows, and in part will be obvious from the description, or may be leamed by practice ofthe aspects described below. ‘The advantages described below will be realized and attained by means ofthe clements and combinations particulary pointed ‘ou. in the appended claims. Itis tobe understood that both the foregoing general description and the following detailed description are exemplary and explanatory only and are not restrictive. BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS "The accompanying drawings, which are incomporated in and constitute a part (ofthis specification, Mustrate several aspects described below, igure | shows « DNA construct doseribed herein incorporated in a plasmid. 3Wo 2014/018822 PCTIUS2013¢052174 Tigure 2 shows colonies of B. pumitus device and control (B, punilus without phenlie DNA). Colonies incorporating the B. punitus device (bottom row) show higher colony populations than the contrf (top). Colones in the bottom right Petr dish are the B. pumilus device containing the protein phenylalanine-amnonia lyase (PAL), which showed higher bacterial population, Figure 3 shows the expression of proteins in two-dimensional 2D-DIGE gel, in which a protein gel of B. pumilus device has been overlapped with a contol gel (oon-transformed bacterium). Picture shows higher expression of up-regulated proteins (higher intensity fuorescence points) comesponding to B. punilus device ‘containing the phenolic DNA with PAL protein (see panel C) contrasted with a ‘control (see panel B), which showed down-regulated proteins and reduced uorescence. The analysis was done with MALDI-MS, Figure 4 shows colonies of F colf devices. B: contso] (bacteria without phenolic DNA) shows less colony formation than A and C, which are bacterial devices containing phenolic DNA. fa A and C, the colony populations completely ‘cover the ager plates. Figuce 5 shows cocon embryonic ealluses grown in Murashige-Skoog (MS) ‘medium, ‘The comparative embryonic calluses represent different reatmenis (0 ‘produce phnotie compounds, as compared to a contiol. Some calluses were ‘nogulated with the bacterial device with or without the phenolic DNA at different ‘concentrations, and with differen types of bacterial devices containing phenolic DNA. The two bacteria used were E. col and B. pumilus. Figure 6 shows cocoa (Theobroma cacao) callus from tissue culture assays. Induction of size increase in the calluses treated with chitosan and biological devices is also shown, DETAILED DESCRIPTION Before the present compounds, compositions, aticles, devices, andor methods tue disclosed and described, itis to be understood that the aspects described below are 4wo 20147018822 PCTIUS2OL9/OS2174 10 25 ‘not limited to specific compounds, synthetic methods, or uses as such may, of course, ‘vary. [tis also to be understood thatthe terminology used herein is for the purpose of describing particular aspects only and is not intended to be limiting. In this specification and inthe claims that Follow, reference wit! be made to a ‘number of terms that shall be defined (o have the following meanings: It must be noted that, a usod in the specification and the appended claims, the singolar forms “a,” “an” and “the” include plural referents unless the context clearly dictates otherwise. ‘Thus, for example, reference to "a bioactive agent” includes mixtures of two or more such agents, and the Tike, “Optional” or “optionally” means that the subsequently deserbed event or circumstance can or cannot occur, and that the description includes instances where the event oreitcumstance occurs and instances where it does not. For example, the ‘phrase “optional ingredient” means that the ingredient may or may not be present. Ranges may be expressed herein as [rom “aboot” one particular value, and/or 'o “about” another particular value, When such a range is expressed, another aspect includes from the one particular value and/or to the other particular value, Similarly, ‘whon values are expressed as approximations, by use ofthe antecedent “about,” it will be understood that the particular value forms another aspect. Itwill be futher ‘understood that the endpoints of cach ofthe ranges are significant both in relation to {he other endpoint, and independently of the other endpoint. Disclosed are materials and components that canbe used for, can be used in conjunction wit, ean be used in preparation for or arc products ofthe disclosed compositions and mothods. These and other materials are disclosed herein, and iis understood that when combinations, subsets, interactions, groups, et. of dese imatesials are disclosed that while specific reference of ench varios individual and collotive combination and penmutation of thse compounds may not be explicitly disclosed, cach is specifically contemplated and described herein. For example, if @ bacterium is disclosed and discussed and a number of diferent compatible ceri plasmids are discussed, euch and every combination and permutation of bacterium 3‘Wo 2014015822 PCTIUSZOI3MS2174 and bacterial plasmid that is possible is specifically contemplated unless specifically indicated tothe contrary. For example, iFa clas of molecules A, B, and C are disclosed as well as a cass of molecules D, and F, and an example of a combination molecule, A-D is disclosed, then even if each is not individually recited, 5 eachis individually and collectively contemplated, ‘Thus n this example, each ofthe combinations A-E, A-F, B-D, B-R, BAF, C+D, C-E, and C-F are specifically ‘contemplated and shouldbe considered disclosed fom disclosure of A,B, and C; Dy and F and the example combination A-D. Likewise, any subset or combination of these is also specifically contemplated and disclosed. Thus, for exaniple, the subs 10 group of A-E, B-P, and C-E is spoifically contemplated and should be considered disclosed from disclosure of A, B, and C; D,E, and P; andthe example combination A.D. ‘This concept applies to all aspects ofthis to, steps in methods of miaking and using the disclosed compositions. Thus, Ifa varity of additional stops ean be performed, it is understood that each of these 15 additional steps can be performed with any sposific embodiment or combination of embodiments ofthe disclosed methods, and tnt each such combination i specifically contemplated and should be considered disclosed. isclosure including, but not limited ‘References inthe specification and concluding claims to pans by weight, of & particular element or component ina composition or antcle, denotes the weight 20 relationship between the clement or component and any other elements or componens in the composition or ancl for which a past by weight is expressed. “Thus, ina compound containing 2 parts by weight of component X and 5 pans by weight component ¥, X and Y are prosent ata weight ratio of 25, and are presen in such ratio egardless of whether additional components ure contained inthe 25° compound. ‘A weight percent ofa component, unless specifically stated tothe contrary, is based on the total weight ofthe Formlation or composition in which the component is included Deseribed herein are methods for enhancing the physiologicsl of Theobroma 30 cacao, which is also referred to herein as cocoa. ‘The term “physiological property” us 6Wo 2014018822 PCTUS2O13/052174, 10 15 8 ‘defined herein includes any playsical, chemical, biochemical, or biological feauure that {s improved using the methods described herein. In one aspect, the methods can ‘enhance the production of phenolic compounds produced by Theobroma cacao. In ‘other aspects, the methods can enhance the growth rate of Theobroma cacao. 1, DNA Constructs and Biological Devices ‘As used herein, “plant” is used in a broad sense t include, for example, any species of woody, omamental, crop, cereal, frit, or vegetable plant, as well as photosynthetic green algae. “Plant” also refers toa plurality of plant cells that are differentiated into a sircture that is present at any stage ofa plant's development. ‘Such structures include, but are not Himited to, fruits, shoots, stoms, leaves, Hower petals, roots, tubers, coms, bulbs, seeds, gametes, cotyledons, hypocotyls, radicles, embryos, gametophytes, tumors, and the like. “Plant cell,” “plant cells,” or “plant tissue" as used herein refers to differentiated and undifferentiated tissues of plants including those present in any ofthe tissues described above, as wall as to ells in cclture such a, for example, single eels, protoplasts, embryos elses ete “Heterologous” genes and protsins are genes and proteins that have been «experimentally put into a cel that are not normally expressed by that cell A hoterlogous gene may be cloned ox derived from a different cell type or species than the recipient cell or organism. Heterologous genes may be introduced into cells by tsansduetion or transformation. ‘An “isolated nucleic acid is one that has been separated from other nuclele acid molecules and/or celular material (peptides, proteins, lipids, saccharide and the ike) normally present in the natural soure ofthe nucleic acid. An “solte” nucleic acid may optionally be free ofthe lanking Sequences found on ether side ofthe nucleic acid as it naturally occurs, An isolated nuclei acid ean be naturally occurring, can be chemically syothesized, or can bea cDNA molecule (i, is synthesized from an mRNA template using reverse transcriptase and DNA polymerase enzymes). “Lransformation” or “transfection” as used herein refers toa process for ccan occur under introducing heterologous DNA into host cell. Transform: 7aS Wo 20141018822 PCTIUS2013/052174, 25 natural conditions or may be induced using various methods known inthe art. Many ‘motos for transformation are known inthe artand the skilled practitioner will know how to choose the best transformation method based on the type of cells being transformed. Methods for transformation include, for example, vi ‘lectroporetion, lipofetion, chemical transformation, and panicle bombardment. Cells may be stably transformed (ie, the heterologous DNA is capable of replicating 1 infection, 4 an autonoxmous plasmid or as par ofthe ost chromosome) or may be transiently transformed ((e. the heterologous DNA is expressed ony for limited period of time) “Competent cells” refers to microbial cells capable of taking up heterologous DNA. Competent cells can be purchased from 2 commercial source, or eas may be nade competent using procedures known in the ast. Exemplary procedures for producing competent eels are provided in the Examples. physiological propertias of Theobroma cacao. In one aspect, the biological deviee ‘can inezease the production of phenolic compounds by Theobroma cacao, The device is generally composed of host cells, where the hos cells are transformed with a DNA construct described herein Unat promotes the production of phenolic compounds in Theobroma cacao. Its understood that one way to define the variants and derivatives of the genetic components and DNA constructs described herein is through defining the ‘variants and derivatives in terms of homology/idemity to specific known sequences. ‘Those of skill inthe art readily understand how to determin the homology of two aucleic acids. Forexample, the homology can be calculated after aligning the two sequences 90 thatthe homology is at its highest level, Another way of calculating hhoniology ean be performed by published algorithms (see Zuker, M. Science 244:48- 52, 1989, Jaeger otal. Prac. Natl. Acad. Set. USA 86:7706-7710, 1989. Jucger et a. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989, which are hervin incorporated by reference for at Jeast material related to nucleic acid alignment).Wo 2014/018822 pCrruszo13/0s2174 10 Is 25 ‘As used herein, “conservative” mutations are mutations that rest in an amino «cid change inthe protein produced from a sequence of DNA. When a conservative ‘mutation occurs, the new amino acid has similar properties as he wildtype amino ‘cid and generally does not drastically change the function or folding ofthe protein eg. switching isoleucine for valine is a conservative mutation since both are small, ‘branched, hydrophobic amino acids), “Silent mutaions;” meanwhile, change the ‘nucleic acid sequence of a gene encoding a protein but do not change the amino acid sequence ofthe protein, tis understood that the description of conservative matations and homology ‘can be combined together in any combination, such as embodiments that have atleast Wi, 15%, 80%, 85%, 90%, 95%, oF 99% homology to a particular sequence wherein the variants are conservative mutations. ILis understood thal any of the sequences ‘described herein can be a variant or decivative having the homology values listed above: In one aspect the DNA construct deseribed herein (referred to herein as “phenolic DNA”) can promote the expression of one or mare phenolic compounds from Theobroma cacao, ‘The tenn “phenolic compound” is defined as any aromatic ‘compound having atleast one hydroxyl group present on an aromatic ring. Examples 4d, p-hydroxybenzoic cof such phenolic compounds inlude, but are not to, gall seid, case acid, catchin, and p-eoumatie acid. Tone aspect, dhe DNA consiruet is from 5! to 3" the genetic components in the following onier (1) @ PAL. promoter, (2) a gene that expeesses histdine/phenylalanine amavonia-lyase, (3) a ribosoml binding sito, and (4) a terminator. In certain aspects, the DNA construct futher comprises ribosomal switels berween the gene that ‘expresses histidine/phenylalanine ammonia-lyase and the ribosomal binding site that ‘can enhance uanslation and protein expression. In one aspect, the gene that expresses histidine/phenylelanine ammonia lyase is isolated from bacteria, In one aspect, the bacteria are Pseudomonas species. In a further aspect, the bacteria are P. aeraginasa,P.cenarificans, P.resinovorans, P. protegens, P. fluorescens, or another Pseudomonas species. In another aspect, the 9Wo 2014/018822 PCT/USROISNS2174 _gene that expresses histidine/phenylalanine arm i lyases isolated from plants. Ia ‘one aspect, the plants are Arabidopsis thaliana. In another sspect, the plans are Selaginela moellendargit, Physcomirellapatens, corn (Zea mays), sorghurn oF milo (Sorghum bicolor) Ina further aspect, the gene that expresses phenylalanine 5 ammonia tyase in the DNA construct hes SEQ ID NO. 5 or u derivative or variant ‘hereof. In another expect, the gene that expresses phenylalanine ammonia Iya in the DNA construct has SEQ ID NOS. 6 7 ora derivative or variant thereof. In nother aspect, the DIVA construct further includes (5) a gone that confers resistance to an antibiotic (a “selective marker"), (6) a reporter protein, ora 19 combination thereof none aspect, a regulatory sequence is already incorporated into a vector such as, for example, a plasmid, prior to genetic manipulation ofthe vector. In another aspect, the regulatory soquence can be incorporated into the vector through the use of restiction enzymes or any other technique known in the a 15 Tin one aspect, th regulatory sequence isa promoter. The term “promoter” refers to a DNA sequence capable of conuoing the expression af a eaing sequenee. In one aspect, the coding sequence o be controlled is loested3'1o the promoter. In another aspect, the promoter is derived from a native gene, In an altemative aspect, te promoter is composed of muhiple elements derived from different genes andor 20 promoters. A promoter can be assembled from elements Found in nature fom ani and/or synthetic elements, or from a combination thereof, 1s understood by those skilled in the at that difforent promoters can direct the expression of a gene indifferent tissues or eel! types, a different stages of development, in response to lifferent environmental or physiological conditions, and/orin different species, In 25 one aspect, the promoier functions as a switch w activate the expression of a gene. Tn one aspect, the promoter is “constitutive” A constitutive promoter isa Promoter that causes a gene fo he expressed in most cell types at most times. Tn another aspect, the promoters “regulated” A regulated promoter is @ promoter that becomes active in response toa specifi stimulus. A promoter may be regulated 30 chemically, such as, for example, in response to the presence or absence of a 10‘Wo 20147018822 PCTUS2013¢052174 10 particular metabolite e.g, lactose or typlophan), a meta ion, a molecule secreted by ‘pathogen, orth like. A promoter may also be regulated physically, such as, for ‘example, in response to heat, cold, water stress, sal stress, oxygen concentration, illumination, wounding, or the fike, Promoters that are useful to drive expression of the mucleotide sequences described herein are numerous and familiar to those skilled in the art. Suitable promoters include, but are not limited (0, the follewing: PAL. promoter, T3 promotes, 'T7 promoter, Fe prontoter, and GAL promoter. Variants ofthese promoters are also contemplated. The skilled artisan will be able to use site-directed mutagenesis and/or other mutagenesis techniques to modify the promoters to promote more efficient function. ‘The promoter may be positioned, for example, from 10-100 nucleotides ‘away from a sibosomel binding site, In one aspect, the promoter is @ PAL promoter. In one aspect, the PAL. Promoter in the DNA construct is SEQ ID NO. 1 ora derivative or variant thereof. In another aspect, the PAL. promoter is SEQ ID NOS. thereof. 3, 0rd or derivative or variant In another aspect, the gene that expresses histidine/phenylalunine ammonia. lyase in the DNA construct is SEQ TD NO. 5 or a derivative or variant thereof. In another aspect, the gene is SEQ ID NOS. 6 or 7 or a derivative or variant thereof ‘The selection of the ribosomal binding site (and optional) sibosomal switeh ‘can vary depending upon the selection of the host cells. In one aspect, the ribasomal binding site in the DNA construct is SEQ ID NOS. 8 or 9, ora derivative or variant thereof (e.g, where n in SEQ ID NO. 8 can be A, T, G, or C). In certain aspects, ‘when the DNA constmiet further includes a ribosomal switeb. In one aspect, the ribosomal switch is SQ ID NOS. 11, 12, 13 oF 14, or a derivative or variant thereof In another aspect, the regulatory sequence is @ terminator or stop sequence. ‘As used herein, a terminator is 8 sequence of DNA that marks the end of a gene or ‘operon to be transcribed. In a further aspect, the terminator is an intrinsic terminator ‘ora Rho-dependent transcription terminator. As used herein, en “intinsic terminator” isa sequence wherein a hairpin structure can form in the nascent transcript and uWo 2014018822 PCTIUS2O13/052174 15 ‘wherein the haimpin disrupts the mRNA/DNA/RNA polymerase complex. As used herein, a “Rho-dependent” transcription terminator requires a Rho factor protein ‘complex to disrupt the mRNA/DNAJRNA polymerase complex. In another aspect, the terminator in the DNA construct is SEQ ID NO. 10 ora derivative oF variant thereof. In a further aspect, the regulatory sequence includes both a promoter and & {orminator or stop sequence. In a sill further aspect, the regulatory sequence can include mubiple promoters or teminators. Other regulatory elements, such as enhancers, are also contemplated. Fnhancers may be located from about | to about 2000 nucleotides inthe 5* direction from the stat codon of the DNA to be transcribed, ‘or may be located 3’ o the DNA to be transcribed. Enhancers may be “cis-acting.” that is, located on the same molecule of DNA as the gene whose expression they affect. Im certain aspeets, the DNA construct can include # gene thet expresses & reporter protein. ‘The selection ofthe reporter protein can vary. For example, the reporter protein ean bs a yellow Muorescent protein, red fluorescent protein, « green ‘Auorescent protein, ora cyan fluoresvent protein, In one aspect, the gene that ‘expresses the reporter protein has SEQ ID NO. 15, The amount of fluorescence that is produced by the biological device can be correlated to the amount of DNA ‘construct incorporated into the plant cells. The fluorescence produced by the device ccan he detected and quantified using tech spectrofluorometers are typically used to measure fluorescence, ‘The Examples provide exemplary procedures for measuring the amount of fluorescence as 2 result of the expression of DNA, “The DNA construct described herein can be part of a vector, In one aspect, the vector isa plasmid, x phagemid, a cosmid, « yeast anificial chromosome, a bacterial artificial chromosome, a virus, a phage, ora transposon. In general, plasmid vectors containing replicon and control sequences that are Jes known in the at. For example, desived from species hhosts. Vectors capable of high levels of expression of recomibinant genes and protoins ible with the host ell are used in connection with these 2Wo 20141018822 PCTUS2013»S2174 10 are well known inthe art. The vector ordinarily cartes a repli tion origin as well as muarking sequences that are capable of providing phenotypic selection in transformed cells. Plasmid vectors useful forthe transformation of a variety of host cells are well ‘known and are comunercially available. Such vectors include, but are not limited to, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTI, pSG (Stratagene), pSVK3, pBSK, pBR322, YES, pYES2, pBSKH, and pUC vectors Plasmids are double-stranded, aulonomously-replicating, genetic elements that are not integrated into host cell chromasomes. Further, these genetic clements are ‘usually not past oF te host cel’s central metabolism. In bacteria, plasmids may range from { kilobase (Ki) t9 over 200 kb, Plasmids can be engineered to encode « number of useful traits including the production of secondary metabolites, antibiotic resistanoo, the production of useful proteins, degradation of complex molecules andlor environmental toxins, and others. Plast the field of genetic engineering, as plasmids are convenient expression vectors for foreign DNA clemenis such as promoters and terminators and also usually hve iadependent have been the subject of much research in for examnple, microorganisms. Plasmids generally contain eegulatory replication origins, Idealy, plasmids will be present in multiple copies per host cell ‘and will contain selectable markers (such as genes for amibiotic resistance) to allow the ordinarily skilled artisan to select host cells that have been successfully transfected ‘with the plasmids (For example, by calturing the host cells in « medium containing the antibiotic). {In one aspect, the vector eacodes a seloction matker. In a further aspect, the selection markeris a gene thet confers resistance to an anibiotie. In certain aspects, during fermentation of host cells transformed with the vector, the cells are contacted with the antibiotic. For example, the antibiotic may be included in the culture ‘medium. Cells that have not been successfully transformed eannot survive in the presence of the antibiotic; only cells containing the vector that confers antibiotic resistance can survive. Optionally, only cells containing the vector to be expressed! will be cultured, as this will result in the highest production efficiency of the desired ‘gene products (.g., peptides involved in the synthesis of phenolic compounds). Cells 3Wo 2014018822 PCT/ANS2013/082174 10 25 30 ‘hat do not contain the vector would otherwise compete with transformed cells For resources. In one aspect, the antibiotic is teraeyeline, neomycin, kanamycin, mpicilin, hygromycin, chloramphenicol, amphotericin B, bacitracin, earbapenam, cephalosporin, ethambutol, fluoroquinolones, isonizid, methicillin, oxacillin, vancomycin, streptom cephalothin, erythromycin, streptomycin, gentamycin, penicillin, other commonly. used antibiotics, or a combination thereof [none aspect, when the vector is « plasmid, the plasmid can also contain & rmalipte lor in, quinolines, rifampin, rifampicin, sulfonamides, site or polylinker. In a further aspect, the polylinker contains recognition sites for multiple restriction enzymes. ‘The polylinker can contain up to 2, 3,4,5,6,7,8,9, 10, 1, 12,13, 14, 15, 16,17, 18, 19,20, or more than 20 recognition sites for restriction enzymes. Farther, restriction sites may be added, disabled, or removed as required, using techniqucs knowin in the art. In one aspect, the plasmid contains restriction sites for any known restriction enzyme such as, for ‘example, Hindllf, Ken, Sacf, Bamill, BSiXI, FeoRI, Bsa, Notl, Xho, Sph, Spal, ‘Api, Sall, Clal, EcoRV, Pst, Smal, Xmal, Spel, Eagl, Sacll, or any combination thereof. In further aspect, the plasmid contains more than one eecognition site for the same restriction enzyme, none aspect, the restriction enzyme can cleave DNA at a palindromic or an asymmetrical restriction site. In a further aspect, the estiction enzyme cleaves DNA to leave blunt ends; in an alternative aspect, the restriction enzyme cleaves DNA to leave “sticky” or overhanging ends. In another aspect, the enzyme can cleave DNA & distance of from 20 bases to over 1000 bases away from the restriction sic. A variety of restriction enzymes are commercially available and their recognition sequences, as ‘well as instructions for use (eg. amount of DNA needed, precise volumes of reagents, purification techniques, as well as information about salt concentration, pH, optimam temperature, incubation ime, andthe like) are made available by commercial enzyme suppliers Inone aspect, « plasinid with polylinker containing one or more restriction sites can be digested with one restriction enzyme and a nucleotide sequence of interestWo 20141018822 PCTmus2013/082174 20 30 ‘can be ligated into the plasmid using a commercally-available DNA ligase eazyme. ‘Several such enzymes are available, often as kits containing all reagents and instructions required for use. In another aspect, a plasmid with a polylinker cconiaining two or more resirietion sites can be simuliancously digested with two restriction enzymes and a nucleotide sequence of interest can be ligated into the plasmid using @ DNA ligase enzyme. Using two restriction enzymes provides an asymmetric cut in the DNA, allowing for insertion of a nucleotide sequence of interest in a pantcular direction and/or on a particular sirand of the double-stranded plasmid, Since RNA synthesis from » DNA template proceeds from 5° to ¥, often suarting just after a promoter, the order and direction of clements inserted into & plasmid is especially important, [fx plasmid is to be simultaneously digested with multiple restriction enzymes, these enzymes must be compatible in terms of buffer, salt ‘concentration, and other incubation parameters {In some aspeets, prior to ligation using a ligase enzyme, a plasmid that hus been digested with a restetion enzyine is treated with an alkaline phosphatase ‘enzytne to remove 5" terminal phosphate groups. This prevents sel-lgation of the plasmid and thus facilitates ligation of heterologous nucleic acid fragments into the plasmid, In one aspect, the nveleic acids (e,, genes that express histidine/phenylalanine ammonia lyase) used in the DNA constructs described herein can bo amplified using the polymerase chai roaction (PCR) prior to being igatod into 4 plasmid or other vector. Typically, PCR-amplification techniques make use of primers or short, chemically-synthesized oligonncleotidks tha. are complementary to regions on cach respective stand flanking the DNA or nucleotide sequence to be amplified. A person having ordinary skil jn the ant wil be able to design or choose primers based on the desired experimental conditions. In general, primers should be designed to provide forefficient and faithful replication ofthe target nucleic ac "Two primers are required for the amplificetion of each gene, one forthe sense strand (that i, the strand containing the gene of interest and one forthe antisense stra! (that is, the strand complementary fo the gene of interest). Puirs of primers should 15& Wo 20147018822 PCTAIsz013/052174 10 25 30 ‘ave similar melting temperatures that aro close to tho PCR reaction’s annealing ‘omperatnre, In onder to facilitate the PCR reaction, the following feetures should be avoided in primers: monomucleotide repeats, complementarity with osher primes in the mixture, sel-complementarity and internal hairpins and/or loops. Methods of primer design are known in the art sldtionlly, computer programs exist that can assist the ordinarily skilled practitioner with primer design. Primers can optionally incorporate restiction enzyme recognition sites at thor 5" ends to assis in lator Ligeion ito plasmids or other veetors PCR ean be caried out using purified DNA, unpurified DNA that has been integratad into a vector, or unpurified genomic DNA. ‘The process for amplifying target DNA using PCR consists of introducing an excess of two primers having the characteristics described sbove to a mixture containing te sequence tobe amplified, followed by a series of thermal cycles inthe presence of «heat tolerant or thermophilic DNA polymerase, such as, for example, any of Taq, Pru, Pwo, TH, 7th, ‘Ti or Tia polymerases. & PCR “cycle” involves denaturation ofthe DNA through beating, followed by annealing ofthe primers tothe target DNA, followed by ‘extension ofthe primers using the thermophilic DNA polymerase and a supply of deoxynucleotide triphosphates (.e., ACTP, dATP, dGTP, and TTP), along, with bulfess, salts, and other reagents as needed, In one aspect, the DNA segments created by primer extension during the PCR process can serve as templates for additional PCR cycles. Many PCR cycles ean be performed to generate a large concentration of target DNA or gene. PCR ean optionally be performed jn 4 deviee or machine with programmable temperature cycles for denaturation, anncaling, and extension steps. Further, PCR ean be performed oa multiple genes simultaneously in the same reaction vessel or mieracentifuge tnbe since the primers chosen will be specific to selected genes, PCR produets can be purified by techniques known in the art such as, for ‘example, gel electrophoresis followed by extraction from the gel using commercial its and reagents, Ine Jumher aspect, the vector can include an origin of replication, allowing it ouse the host cell's replication machinery to create copies of itself, 16‘Wo 20141018822 PCTIUS2013/052174 5 30 ‘As used herein, “operably linked” refers to the association of nucle acid sequences on a single nucleic acid fragment so thatthe Function of one affeets the function of another. For example, ifsquences for multiple genes are inserted into & single plasmid, their expression may be operably linked. Alternatively, a promoter is said to be operably linked wih « coding sequence when iis capable of affecting the expression ofthe coding sequence. As used herein, “expression” refers to transcription and/or accumulation of an ‘mRNA derived from a gene or DNA fragment. Expression may also be used to refer ‘0 translation of mRNA into a peptide, polypeptide, or protein, Exemplary methods for producing the DNA consiruts deseribed heroin are provided in the Examples. Restriction enzymes and purification techniques known in he art can be used to prepare the DNA constructs. After the vector incorporating the DNA construct has been produced, it can be ineorporsted into host cells using the ‘mothods described below. IL Biological Devices, Tn one aspect, a “biological device” is Formed when a microbial cell is transfected with the DNA construct described herein. ‘The biological deviees are ‘generally composed of microbial host eels, where the host cells are transformed with DNA construct deseribed herein, In one aspect, the DNA construct is eartied by the expression vector into the cell and is separate from the host cell's genome. In another aspect, the DNA construct is ineorporated into the host cell's genome, In still nother aspect, incorporation of the PNA construct into the host cell enables the host cell to produce phenolic compounds. ‘The host cells as referred to herein include their progeny, which are any and all subsequent generations formed by cell division. This understoo that all progeny ‘may not be identical due to deliberate or inadvertont mutations. A host cell may be “transfected” or “transformed,” which refers to a process by which exogenous nucleic cid is ransfered or introduced into the host cell. A transformed cell includes the primary subject cell and its progeny. ‘The host eels ean be naturally occurring ces ”Wo 20147018822 PCT/US2019/052174 or ‘occurring cells in that they do not contain nucleic acid sequences introduced using, molecular biology techniques. In one aspect, host cells that naturally associate with jecombinant” cells. Recombinant cells are distinguishable from naturally ‘Theobroma cacao can be used herein. In onc aspeet, the host cell isa prokaryotic 5. cell, such as, for example, Bacillus pumilus ot E coli. In other aspects, the bost cell is 1 yeast such as, for example, Saccharomyces cerevisiae. Host cells wansformed with the DNA construct described herein ane refered to as biological devices, ‘The DNA construct is frst delivered into the host cell, This delivery may be accomplished in vitro, using well-developed Ishoratory procedures for transforming, 10 cells lines. ‘Transformation of bacterial cell lines can be achieved using a variety of techniques. One method includes caleium chloride, The exposure tothe caleium ions renders the cells able to ake up the DNA eonstruet. Another method is electroporation. In this technique, a high-voltage electri feld is applied briefly co cells, producing transient hols inthe cell membrane through which the vector 15 containing the DNA construct enters, Exemplary procedures for transforming yeast and bacteria with specific DNA described herein are provided in the Examples. In ceria aspects, two or more ypes of DNA can be incorporated into tho best ells. “Ts, different metabolites ean be produce rom the same plant at enhanced aes. COnce the DNA constuc has been inconported into the host cell, he cll are 20) clare such hat to cols multiply, A ststactory microbiological clr contains available sources of hydmgen donors and acceptors, carbon, stogen ule, shosphons, inorganic sais, and, in cetin cscs, vitamins o othr growth promoting substanees, The tdtvon of peptone provides «readily avilable source of niogen and exibon. A vaity of oler carbo soures are contemplated inching, bul ot 25 limited o: monosaccharides such a glucose and fructose, disaccharides sch as lactose and sucrose, oligostecharides, polysaccharides suchas Sach, and minores thereo. Unparfed mixtures extracted from fsdstocks ae ao contemplated and can include molasses, barey na, nd tfted compounds and compositions. Other lyooty 20 sources, sare one-caon subsites suchas carbon dioxide and/or meth in the 18 and uicarboxylie seid eyele intermediates are also contemplated as carbonWo 2014018822 PCr/uszo1s0s2174 15 25 cases of compatible organisms, ‘The carbon source ullize is limited only by the particular organisin being cultured Farthermore, the use of different media results in diferent growth rates anc different slationary phase densities, Secondary metabolite production is highest when cells unin stationary phase. A rieh media results ina short doubling time and higher cell density at stationary phase. Minimal media results in slow growth and low final cell densities. Efficient agitation and aeration increase final cell densities. A skilled isan willbe abe to devermine which type of media is best suited to cuore a particular species and/or strain of host cell CCultoring or fermenting of host cells may be accomplished by any technique ‘known inthe ax. Ia one aspect, batch fermentation can be conducted. In batch fermentation, the composition of the culture medium is set atthe beginning of caltaring ar the systern limited form of batch fermentation can be carried out, wherein factors such as oxygen closed to future artificial alterations. In some aspects, a concentration and pH are manipulated, butaddlional erbon isnot added. Continous femtentation methods are also contemplated. Ia continuous fermentation, equal amounts of «defined medium are continuously added to and removed from 2 bioreactor. In other aspects, microbial host cells are immobilized on a substrate, Fermentation ca be carried out on any scale and may inclade methods in which itera “fermentation” is carried out as well as other culture medhods that are non- fermentative. LIL, Methods for Enhancing the Physiological Properties of Fhéobroma Cacao, Inone aspect, when Theobroma cacao calluses are contacted with the biological devices described above, the production of phenolic cdimpounds is enhanced. Exemplary procedures for growing Theobroma cacao calluses are provided in the Examples, In one aspect, Theobroma cacao calluses grown from 210 6 wooks, from 3 t9 6 wesks, from 4 to 6 weoks, oF for about $ wecks can be used herein. In one aspect, plant cells when conlacted withthe biological devices described above exhibit enhanced production of phenolic compounds. Recipient cell targets 19Wo 201418822 PCTTUS2013/052174 10 20 25 include, but are not limited to, meristem cells, Type I, Type U nd Type IL cals, immature embryos and gametie cells suchas mierospores, pollen, sperm, and cag cells. Lis contemplated that any cell from which a fertile plant may be regenerated is useful as recipient cll. Type, Type If, and Type II allus may be iitiated from tissve Sourees including, bot not limited to, immature embryos, immature inflorescenscs, scaling apical meristems, microspores, and the Tike, Those eels that _are capable of proiferating as callus also are also useful herein. Methods for growing plant cells are known in the art (see U.S. Patent No. 7,919,679). Exemplary procedures for growing plant calluses are provided in the Fi imples, In one aspoct, plant celluses grown from? to 4 weeks can be used herein. ‘The plant cells can also ‘ve derived from plants varying in age. For example, plants that are 80 days to 120 days old sfter pollination can be used to produce calluses useful herein “The Theobroma cacao calluses can be contacted with the biological device in ‘A number of different ways. In one aspect, the device can be added to a media containing the Thecbroma carao callus. Yn another spect, the device ean be injected i the Theobroma cacao callus via syringe. ‘The amount of device and the duration ‘of exposurto the deviee can vary s well In ons aspect, the concentration ofthe device is about 10, 10%, 10°, 10% 10, 108, or 10° cots of wate. In one aspect, ‘when the host cell is bacteria the concentration of the device is 10°. In another aspect, when the host cell is yeast, the concentration of the device is 10°. Different volumes of the bitogieal doves can be used as well ranging fom 25 to SOO. (Once the Treabroma cacao calls has been in conact with the biological deve fora sufficient tim to produce phenolic compounds, the phenolic compounds arc isnt, In one aspect, the phenolic compounds are extracted from the mesa contsning the biological device andthe Theobroma cacao callus. The section of the extraction solvent can vary depending pon the solubility ofthe metabolite. Exemplary procedures for extracting metabolites produced by the biological devices dsseribed herein are provided in the Txarples. With curent techniques, the extraction of metabolites produced from plants sally roquies high amouats of inital plat biomass or materia, wich a tn 2”Wo 2014018822 PCTIUSZNISINS2I74 10 20 30 requires larger amounts of extraction solvents, ‘The use of higher amounts of extraction solvents adds to the expense of producing phenolic compounds. The use of higher amounts of organie solvents presents environmental risks, as well, However, Ihe use ofthe biological devices described herein produce significantly hi amounts of metabolite such as pienotic compounds from Theobroma cacao, which ‘means smaller anioants of biomass are: required in onder to produce and isolate the ‘metabolites when compared with existing techniques. Additionally, as will be shown below in the Examples, the biological devices descpibed herein produce a number of different phenolic compounds, which i also desirable. ‘The extraction of plant Inetabolites using eurentteetnigues also requires fresh biomass, which entails agronomic practices, the use of chemiesls, and time consuming extraction methods ‘Therefore, the use ofthe biological devices described herein is more cost-effective and safer forthe environment than traditional methods for synthesizing and extracting Phenolic compounes. In one aspect, the methods described herein enhance the production of one or more phenolic compounds from Theobroma cacao, shorten the time required for production of phenolic compounds, and overcome the problem of Unpredictable production levels of phenolic compounds from natually-grown ‘Theobroma cacao dix to harsh environmental conditions. {In other aspects, the devices and methods described herein ean increase the ‘growth raw of a Theobroma cacao plant, In particular, the devices and methods eseribed herein are effective in accelerating Theobroma cacao plant development in the carly stages of tissue culturing. By acoclerating plant development in the early sages, its possible to harvest more metabolites from the plant, Additionally, the devices and methods described herein protect plant issue cultures against microbial contamination, which is a problem associated with issue culturing. Winall, conventional methods for tissue cultare involve the use of synthetic growth factors such as 2-4-D, which ean pose environmental concems. The deviees and methods described herein avoid the need for such compounds, Incertain aspects, the biological devices described herein can be used in combination with « polysaccharide to enhance one or more physiolog! properties of 2Wo 2014018822 10 the plant. In one aspect, Theobroma cacao cells are first contacted withthe biological dove, then subsequently contacted with the polysaccharide. in another aspect, the Theobroma caceo eels are frst contacted with the polysaccharide, then subsequently contacted with the biological device. Ina fuer aspect, the plan cells are only contacted with a polystecharide and not conteeted withthe biological device, In x still futher aspect, the plant cells ae contacted simultancously with the polysaccharide and the biological device. ‘In one aspect, the polysdecharid includes chitosan, glucosamine (GIcN), N- scctylghecosamine (NAG), oF any combination thereof. Chitosan is eperally ‘composed of glucosamine units and N-acetyiglacosamine units and eam be chemically ‘or encymutically extracted fom chitin, which is a component of arlaropod ‘exoskeletons and fungal and mierobial cell wall. In certain aspects, the ehitosan ean be acetylated toa specific degree of acetylation in order lo enhance tissue growth ‘uring culturing #5 well es metabolite production. In one aspect, the chitosan is from 60 to about 100%, 70% to 90%, 75% to 85%, or about 80% acetylated. Exemplary procedures for produting and isolating the chitosan are provided inthe Examples. In ‘one aspect, chitosan isolate from the sells of era, shrimp, lobster, andr kel is cseful herein ‘The molecular weight of the chitosan can vary, as well. For example, the chitosan coniprises about 3,4, 5,6, 7,89, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16,17, 18, 19, 0r20 glucosamine units and/or N-acatylglucosamine unis, In another aspect, the chitosan Inclades $107 glucosamine units and/or N-acetylglucosamine units. In one aspect, the chitosan is in a solution of water and acti acid at less than 1% by weight, less than 075% by weight, less than 0.$0% by weiht, less than 0.25% by weight, cr Ls than 0.10 % by weight In another aspect, amount of chitosan that i applied to the plant cells is from 0.10% to 01% by weight, from 0.075% to 0.025% by weight, or is about 105% by weight. ‘The polysaccharides used herein are gonorally natural polymers and thas present no cavironmental concerns. Additionally, the polysaccharide can be used in accaptably low concentrations, In certain aspocs, the polysaccharide can be used in combination with one or more growth regulators. 2go Wo 201018822 PCTIUS2013/052174 0 15s 5 In one aspect, the plant growth regulator isan auxin, a eytokinin, a gibberelin, abscisic acid, ora polyamine, In « further aspect, the auxin isa natural or synthetic auxin, Ina sill further aspect, the auxin is indole-3-nectic acid (IAA), 4 chloroindole-3-acetie acid (4-CLIAA),2-phenylacetic acid (PAA), indole-3-butyric acid (BA), 2,4dichlorophenoxyacctic acid (2,4-D), c-naphihalene acetic acid (a> NAA), 2-methoxy-3,6-dichlorobenzaie acid (icamba), 4-amino-3.5,6- \tichtoropicotinie seid (orden or picloram), 2,4,5-trchloropicolinic aid (245-7), or ‘combination thereof. In another aspect, the eytokinin is zeatn, kinetin, 6 benzylaminopurine, diphenylunea, didizuron (TDZ), 6-41