rea te Rao Le DE TECNICAS DE LABORATORIO " MINISTERIO INSTITUTO ASOCIACION COLOMBIANA Dat) I XeroN Nay TU) Peel aan Deco en aLEL ESTUDIO NACIONAL DE SALUD constituye e! segundo esfuerzo realizado en Colombia para obtener un panorama de la morbilidad y mortalidad de la poblacién del pais, de la demanda, utilizacién y costos familiares de los servicios de salud y de los més importantes factores asociados de tipo ambiental, demogréfico, econdmico, social y cultural. El Estudio permite realizar un anélisis de los cambios ocurridos desde 1965, aio en el cual se Ilevé a cabo la primera investigacién de morbilided de eardcter nacional, en aquellos aspectos comunes a las dos investigaciones. Sus propdsitos principales son contribulr con sdlidos elementos de juicio @ los procesos de planificacién y administracién de fos servicios de salud, a fa orientacién de la educacién en salud y a la identificacién de problemas especiticos que requieran investigacién en profundidad. El Estudio se basé fundamentalmente en una encuesta por muestreo probabilistico de la poblacién civil no institucional de los departamentos del pals, representativa del 98.7% de la poblacién total; para el efecto, utilizd una de las submuestras de la Muestra Maestra del Sistema de Informacion en Salud. También revisa en anélisis complementarios informacion proveniente de los censos de poblacién, del sistema de estadisticas vitales, de los registros de las instituciones de salud y de investigaciones nacionales y locales sobre temas similares La encuesta de salud, llevada a cabo entre 1977 y 1980, comprendié una entrevista domiciliaria en 9.869 hogares con 52.762 personas, y un conjunto de exdmenes médicos, odontolégicos y de laboratorio en una submuestra aleatoria de 10.970 entrevistados. Para el disehio de la metodologia empleada en dicha encuesta fueron particularmente provechosos los materiales y documentos de la investigacién Nacional de Morbilidad de 1965-66 y las orientaciones de quienes tuvieron la responsabilidad de ejecutarla.REPUBLICA DE COLOMBIA ESTUDIO NACIONAL DE SALUD MANUAL DE TECNICAS DE LABORATORIO AUTORES: OSCAR JULIAO RUIZ GLORIA STELLA MORENO MORENO MINISTERIO. INSTITUTO ASOCIACION COLOMBIANA DE SALUD NACIONAL DE SALUD DE FACULTADES DE MEDICINAESTUDIO NACIONAL DE SALUD COMITE DIRECTIVO ALFONSO JARAMILLO SALAZAR Ministro do Salud * HERNANDO VIDALES NEIRA Director INAS ** ABEL DUENAS PADRON Director Ejecutive ASCOFAME “** DIRECCION DEL ESTUDIO LWIS CARLOS GOMEZ SERRANO Director General **** COORDINACION EJECUTIVA: OSCAR JULIAO RUIZ Recoleccisn JOSE AGUSTIN ARIAS Procesamiento AURELIO PABON RODRIGUEZ Analisis y Publicaciones * HAROLOO CALVO NUREZ, Miniso de Said de 1974 » 1976. RAUL OREIUELA BUENO, Minsro de Salud de 1976 » 1978, ‘** HERNANDO GROOT LIEVANO, Director INAS de 1974 » 1978. AUIS JOSE VILLAMIZAR, Director INAS 1978, ‘"** GUILLERNO RUEDA MONTANA, Director Ejecitive ASCOFAME hasta 1978. “*+* JORGE TORRES SANCHEZ y FRANCISCO YEPES LUJAN, Codiractoras del Estudio haste junio de 1978,INSTITUCIONES COLABORADORAS: Departamento Nacional de Planeacién — DNP Instituto Colombiano de Bienester Familiar — ICBF Insituto Nacional de Cancerologia — INC Servicios Seccionales de Salud Fondo Nacional de Proyectos de Desarrollo - FONADE Organizacién Panamericana de la Salud — OPSINSTITUCIONES EJECUTORAS DE LOS EXAMENES DE LABORATORIO Instituto Nacional de Salud — INS Instituto Colombiano de Bienestar Familiar — ICBF Instituto Nacional de Cancerologia ~ INCEJECUTORES DE LOS EXAMENES DE LABORATORIO INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Laboratorio de Andlisis Jefe - Examen realizad Hierro Sérico Laboratorio de Bioguimica Jefe - Exdmenes realizados: Acido Urico colesterol Protefnas totales y Electroforesis de Protefnas ‘Triglicé ridos Laboratorio de Microbiologfa Jefe ~ Exdmenes realizados: V.D-R-L, FTA-ABS Cultivo Faringeo Qufmico Leonardo Bolivar Zapata Quimico Ligia Nifio de Polanfa Bact. Beatriz Lee de Avilez Bact, Leonor Cipagauta Galvis Bact. Patricia Diaz Anzola Doctor Ernesto Barbosa Montenegro Hasta julio 4/80 Biogufmico Moises Wasserman Lerner Desde julio 5/80 Bact. Nancy Naranjo Leal Bact. Gladys Villamil de Garcfa Quimico Enith Rivadeneira Nora Eic. Biol. Carmenza Alarcén Bi6loga Paula Marcela Mendoza Bact. Marina Molina de Sanchez Quimico Marfa Orfa Rojas de Rojas Doctor Miguel Guzman Urrego Bact, Rosa Stella vargas Bact. Piedad de ForeroLaboratorio de Parasitologta Jefe - Exdmenes realizados: Anticuerpos Toxoplasma Anticuerpos Serameba* Protozoos Coprolégicos Laboratorio Sanidad del Ambiente Jefe = Exdmenes realizados: capacidad de fijacién de Hierro Clorados Laboratorio de Virologia Jefe - Exdmenes realizados: Anticuerpos de Polio Anticuerpos Dengue Laboratorio de Aguas Jefe - Exmenes realizados: Color, Turbiedad, pil y Pluoruros * 19 U.P.M. Doctor Auguste Corredor Arjona Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Bact. Marfa Mercedes Santacruz Blvia Caceres Vega Sonia Péez Gomez Maria Mercedes Santacruz Consuelo Lépez Paez Consuelo Lépez Paez Sonia Paez Gémez Marfa Merdeces Santacruz Consuelo Lépez P&ez Elvia Céceres vega Graciela Diaz Doctor Enrique Guerrero Medina Bact. Elsa Riveros Rodriguez Quinico Luis Alfonso Cadena Quimico Marfa del Carmen Vallejo Doctor Oscar Juliao Ruiz Hasta octubre de 1978 Doctor Hernando Groot Lievano Desde el lo. de julio de 1980. Bact. Lucfa de Guznén Bact, Dora de Calvache Doctor Alfonso Roa Vanegas Quimico Marfa Orta Rojas de Rojas Quimico Jess E Parra Roz0 Bact. Isabel Higuera de Rozo Bact. Martha Gémez de FuentesDivisién Investigaciones Especial Jefe ~ Exdmenes realizados Antigeno Hepatitis B Anticuerpos Rubella Anticuerpos Serameba Doctor Oscar Juliao Ruiz Bact. Gloria Stella Moreno Moreno Bact. Gloria Stella Moreno Moreno Bact. Gloria Stella Moreno Moreno* Microb. Rural Jeannette Castillo INSTITUTO COLOMBIANO DE BIENESTAR FAMILIAR Laboratorio de Nutricién = Jefe - Exdmenes realizados: Vitamina A y carotenos Vitamina B12 y Acido Félico Nitrégeno Uréico y Creatinina en orina Todo Inorganico en Orina INSTITUTO NACIONAL DE CANCEROLOGIA Laboratorio de Citologfas Jefe - Exdmenes realizados: Citelogia vaginal * 43 U.P.M. Doctor Eberth Betancourt Quinico Olga 7. de Navarro Bact. Elizabeth Gémez Bact. Zulma Sarmiento Bact. Blanca de Gémez Lic. Biol, Luis Alfonso Lazaro Bact. Martha Inés Ramirez Bact. Victoria de Guacaneme Técnico Quim. Beactriz Londofio Doctor Aramando Santamaria Director Escuela de Citologias Bact. Rosalba Caceres de Renterfa.TABLA DE CONTENIDO AnAlisis Bioquimico. Acido Urico. ieee Capacidad de fijaci6n de hierro.. ‘Triglicéridos.. Vitamina Ay CALOteNcS....eeeeee eee Determinaciones Microbiol6gicas.... Acido F6lico.. Cultivo Farfngeo... Vitamina B12.. Henatologia. Hematocrito.....+ Pags. 1s uy a9 a 24 26 29 32 36 39 42 46 49 51 54 59 a. 66 69 15 195.le 5.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 6. 6.1. 6.2. Pruebas Serolfgicas.. Anticuerpos Dengue. Anticuerpos contra Entamoeba Histolytica.. Anticuerpos contra Polio.. Anticuerpos contra Rubella... Anticuerpos Fluorescentes contra Sffilis PIAMABS... Anticuerpos contra Toxoplasma. Antigeno de superficie Hepatitis B... Serologia para Sffilis VDRL. Pruebas Toxicol6gicas...+.seeeeeeeeee Actividad de Colinesterasa....... Clorados en SaNgres..esseeseeeeeeee Andlisis de Aguas. Cloro Residual. Citologfa Vaginal... Anexo No.1 Abreviaturas usadas en el Manual. Anexo No.2 Grado de Transmisi¢n y Extincign... Pégs. aL 83 90 93 7 104 12 ug 123 131 133 138 143 145 148 153 155 161 163 166 170 an 77 isi 183 185PRESENTACION Presentamos ala comunidad cientifica del pafs, particularmente a aquelia vinculada al Sector Salud, la primera edicién del Manual de Nacional de Salud, nicas de Laboratorio del Estudio 5 de laboratorio estandarizadas que se emplearon sangre, materia fecal, orina, frotis faringeo, citologia vaginal y aguas, tomadas por bacteridlogas, médicos y entrevistadores en las unidades primarias de muestreo seleccionadas para el Estudio Nacional de Salud. La recopilacin, traduccién, y estandarizaci6n de las técnicas significa una valiosa contribucién en el campo de andlisis de laboratorio puesto que facilita la evaluaci6n del alcance y limitaciones de los resultados y su comparacién con los de estudios de naturaleza similar, al igual que sive como documento de consulta para otros laboratorios. La publicacién estuvo a cargo del doctor Oscar Juliao Ruiz y Ia bacteriéloga Gloria Stella Moreno Moreno. Roconocimiento de excepcién hacemos al Sefior Ministro de Salud, Doctor Alfonso Jaramillo Salazar, por su decidido apoyo y permanente estimulo al garantizar la totalidad de los recursos requeridos y permitir la utilizacién de mecanismos de particular flexibilidad y agilidad para el desarrollo del trabajo con los més altos esténdares de calidad, y a los doctores Hernando Vidales Neira, Director del Instituto Nacional de Salud y Abel Duefias Padrén, Director Ejecutivo de la Asociacién Colombiana de Facultades de Medicina, quienes promovieron con magnifica visién la reiniciaci6n de Ia investigacién y propiciaron su fluida ejecucién, facilitando todos los Tecursos técnicos y administrativos de las dos instituciones. LUIS CARLOS GOMEZ SERRANO Directori1. INTRODUCCION EI presente manual es una recopilacién de las técnicas empleadas para ol examen de las muestras de laboratorio del Estudio Nacional de Salud. Su seleccién se hizo conjuntamente con los laboratorios responsables de cada determinacién buscando confiabilidad, exactitud y reproducibilidad. Las técnicas estandarizadas y consignadas en este manual se usaron sin variacién durante todo el proceso investigative para garantizar de esta manera la comparabilidad en los diferentes resultados dentro de esta investigacién y facilitar su comparacién con datos de otros estudios en ios cuales se utilicen técnicas diferentes. Los procedimientos estan agrupados on la siguiente form + Andlisis Bioquimico - Determinaciones Microbiolégicas + Homatologia + Pruebas Serolégicas ~ Pruebas Toxicolégicas - Parasitologia + Andlisis de“Aguas + Citologia Cada una de las técnicas se ajusta a un esquema definido en el siguiente orden: Técnice utilizada, fundamento, equipo y elementos, reactivos, calibracién, control de calidad, preparacién de reactivos y bibiliografia. Las técnicas fueron dosarrolladas en ios Laboratorios de las Instituciones ejecutoras y colaboradoras asi: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD: Laboratorio de Bioquimica Acido Urico, Colesterol, Proteinas Totales, Eloctroforesis. de Protei Laboratorio de Anélisis Hierro Séricé y Capacidad de Fijacién de Hierro. v7Laboratorio de Microbiologia Cultivo Faringso, Serologia (V.D-R.L.) y Anticuerpos Fluorescentes para Sifilis. Laboratorio de Virologia Anticuerpos contra Dengue, Anticuerpos contra Polio. Laboratorio de Parasitologia Coprolégico, Protozoos, Anticuerpos Toxoplasma, Anticuerpos para Entamoeba Histolytica. Laboratorio Sanidad de! Ambiente Organoclorados. Laboratorio de Aguas Anélisis Fisicoquimico: Color, Turbiedad, pH y Fluoruros. Divisién Investigaciones Especialos ‘Antigeno do Hepatitis B, Anticuerpos Rubella, Anticuerpos para Entamoeba Histolytica. INSTITUTO COLOMBIANO DE BIENESTAR FAMILIAR: Laboratorio de Nutricién . Vitemine A, Carotenos, Vitamina B12, Acido Félico, Nitrégeno Ureico, Creatinina y lodo Inorgénico en Orina. INSTITUTO NAGIONAL DE CANCEROLOGIA: Laboratorio de Citologia Gitologia Vaginal. LABORATORIO NIVEL LOCAL Clicomia Basal, Post-Prandial, Hemoglobina, Hematocrito, Actividad de Colinesterasa, Cloro residual y Andlisis bacteriolégico de Aguas. 82. ANALISIS BIOQUIMICOSi2.1. ACIDO URICO 21.4. Técnica Utilizada Test de Combinacién URICA-QUANT*. Método enzimético colori 24.2. Fundamento El Acido Grico existente en la muestra es cuantificado mediante 3 reacciones enziméticas. transformado a 1. El écido rico en reaccién catalizada por la uricasa alantoina produciendo ademas peréxido de hidrégeno y CO2. 2. Elperéxido de hidrégeno formado en la reaccién anterior, es utilizado por la enzima catalasa para oxidar motanol a formaldehido. 3. El formaldehido reacciona directamente con acetilacetona y amonfaco para dar el producto coloreado 3.5 diacetil 1.4 dihidrolutidina que absorbe luz de longitud de onda a 410 nm. y permite ser cuantificado espectrofotométricamente. Esta técnica es del tipo reaccién parada en la que se incuba la muestra con las enzimas durante un periedo fijo al cabo del cual se interrumpe la reaccién enzimatica midiendo el producto final formado. Acido urieo + 2Ha0 + of —XE2%%e giontoine + Hy Op + COp H202+ CHs0H —S8191980, You 4 oH, HCHO + 2 acetilacetone + NHs—————» 3, 5- diacetil- 1, 4 - diidrolutidina + 3H20% 2.1.3. Equipo Empleado Espectrofotémetro Pye-Unicam modelo SP 1.700 Longitud de onda: 410 nm. * Boehringer Mannheim Cat, #124761 x 180 det. a21.4. Reactivos Buffer* 2. Acetil acetona metanol* 3, Estandar Acido Urico 6 mgr% 4, Uricasa* 5. Reactive de Acido Urico. 24.5. Calibracién Se hace introduciendo un patrén de concentracién conocida 6 mg%e. 2.4.6. Deseripcién de la Técnica Coloque dos hileras de tubos, uno para el blanco de la prueba y el otro para la pruebe Pipetee on el fondo del tubo. Reactivos Blanco Prueba Prusba Suero Reactivo #5 0.5 ml. 5 ml. Mezcle bien el contenido de los tubos y pase 2.5 ml. al tubo de atras Mezcle e incube 1/2 hora 37°C (prueba) Preserve de la luz directa y haga la lectura de cada prucba frente al blanco P = E prueba. Célculos E Prueba x 24.6** = mgr% Acido Urico. * bos reactivos vienen preparados en un Kit de la casa Boehringer Mannhein. ** Factor: 24.6. Este factor es para la lectura a 410 nm basado en la absorbancia del producto final coloreado y calculado por la casa Boehringer Mannhein. 22os cAlculos ol resultado da Si no emplea factor sino el patrén para hat mediante la férmula: EPruebs x6 — mgr de Acido Urico E Patrén 2.4.7. Control de Calidad Desviacién estandar promedio Precinorm Rstandar ++ 0.25 mgr% 0.19 mgr% Coeficiente de variacién: Precinorm ..... 4.09% Estandar ..... 3.13% 21.8. Preparacién de Reactivos ‘Se utilizé el sistema de kits donde los roactivos vienen preparados por la casa productora, Preparacién diaria de Acido Urico No. 5: Mezcle las soluciones 1 y 2 segdn ol nimero de muestras asf: Nimero de Muestras Solucién L 2.1.9. Bibliografia ~ Kageyama, N. Clin, Chim, Acta 31 (1971) 421. ~ Thefeld W, y Cols, Dtsch. Med. Wechr. 98 (1973) 380. 232.2. CAPACIDAD DE FIJACION DE HIERRO 2.21. Técnica Utilizada Método para determinacién de hierro por espectrofotometria de absorcién atémica. 2.2.2, Fundamento Las molécules de proteina del euero se saturan mediante la adicién de cloruro férrico; el exceso se elimina por medio de Carbonato de Magnesio. Bl hierro se libera de las moléculas de proteina precipiténdolas con Acido tricloroacético y calenténdolas posteriormente. Su cuantificacién se hace por el método de absorcién atémica descrito en hierro sérico. 2.2.3. Equipo Empleado (ver hierro sérico) 2.2.4, Reactivos Acido tricloroacético 20% Solucién valorada de hierro 1.000 ppm Carbonato de magnesio Cloruro férrico 500 microgramos %e Mezcla sulfocrémica {ver hierro sérico) 2.2.5, Calibracién (ver hierro sérico) 2.2.6. Descripcidn de la Técnica En tubo plastico coloque: Teacla y je on Fepors olies () ninaton Cnebonato te Ba ome | Om See HS SUS, Garena trations a seo tae pifeucey | [neta ericloroacdetco 208 | 2.0 nl.Agite y tape con papel de aluminio, Caliente en el bafio maria 90°C. durante 15 minutos. Enfrie, centrifugue y determine la cantidad de hierro en el sobrenadante por absorcién atémica. Célculos. 2.2.7. 2.2.9. (Lectura muestra — Lectura blanco) x 2 x 100=microgramos Control de Calidad Se efectéa con pull de sueros. Diario. Desviacién estandar = 13.50 ug% Coeficiente de variacién = 3.11% Interdiario. Desviacién estandar 32.82 ug%e Cooficiente de variacién 6.28% Preparacién de Reactivos Acido tricloroacético 20% p/v Acido tricloroacético 20 gr, Agua destilada complete 100 ml. Cloruro férrico 500 microgramos % Propérelo a partir del titrisol de 1.000 ppm. Bibliografia ~ Herbert Kahn. Instrumentacién para espectrofotometrfa de absorcién atémica. ~ Olson A.D. & Hamlin W.B. Perkin Elmer : Analitical Methods atomic absorption 1973. ‘ 22.3, COLESTEROL 2.3.1. Técnica Utilizada ‘Test combinacién Colesterol. Método CHOP-PAP test color enzimético*. 2.3.2. Fundamento Los ésteres de colesterol existentes on la muestra son cuantificados mediante una serie de tres reacciones enzimétics 1. Los ésteres de colesterol son hidrolizados a colesterol y 4cidos grasos en reaccién catalizada por la enzima colesterol esteras 2. La enzima colesterol oxidasa oxida el colesterol utilizando el oxigeno atmosférico pata dar la 4 delta colostenona y peréxido de hidrégeno. : 3. El peréxido de hidrégeno formado reacciona con ol substrato incoloro (4 aminofenazona) y el fenol para dar el producto 4 (P-benzoquinonamonoimino) fenazona que absorbo luz de longitud de onda de 600 nm. y permite su cuantificacién espectrofotométrica. eta determinacién es del tipo reaccién parada en que so incuba la muestra en unién de las enzimas en un periodo fijo al cabo del cual se interrumpe la actividad enzimética midiendo el producto final formado. terol + Ho —ldlesterolesterss@y Colpstero! + acidos grasos Esteres do c Colesterol+ 0, —2clesteralonidasey 4* -coisatenona + He Or roxidona 20,4 4onintenezonatooi PASSES, 4 g-rnzoguinone-naoinine)-fonazona + 4H 0 Equipo y Elementos Espectrofot6metro Pye-Unicam modelo SP 1.700 longitud de onds 500 nm. Cubeta 1 om. paso de luz Pipeta automAtica 20 microlitros Puntas para pipeta automatica * De 1a casa Boehringer Mannheim.2.3.4, Reactivos* 1. Buffer fosfato de potasio Fenol . Metanol 2. Buffer fosfato de potasio e 4 aminofenazona Metanol Hidroxipolietoxidodecano 3. Colesterolesterasa Colesterol oxidasa Peroxidasa Reactivos estables: +2 a 8°C hasta la fecha de caducidad 4. Reactive de colestorel Resultado de mezclar los anteriores (ver preparacién de reactivos). 2.3.5. Calibracién . Se efectiia introduciendo patrones de concentracién conocida y con base en los resultados se calcula el factor. : 2.3.8. Descripcién de la Técnica Pipetee en tubos de tapa rosca. Plasna Bstandar Precilip - Solucién 4 2.0 ml. Mexcle e incube el blanco reactivo, musstras,estandar y precilip 30 minutos a 20-25°C 0 15 minutos a 37°C. * Vienen preparados en cada Kit de Boehringer Mannheim. § Lea la extincién de la prueba frente al blanco reactivo dentro de 2 horas. ae. = Struotee, E) 7 am ost”Géleulo: Colesterol mgr®% = factor 585* por extincién prueba. 2.3.7. Control de Calidad Precilip Desviacién estandar promedio: 6.5 mg% Coeficiente de variacién promedio: 5% Preciset Desviacién estandar promedio: 8.43 mg% Coeficiente de variacién promedio: 3.58% 2.3.8. Preparacién de Reactivos Reactivo No. 4 ‘Sol Beeebee |> ag Conserve en frasco émbar, mana a 4°C, 24 horas a 15-20°C. Los reactivos vienen proparados por la casa productora. 2.3.9. Bibliografia = Roschlau P., E. Bernt y W Gruber: 9 th Int. Congr. on Clin, Chemis try. Toronto 1975, Abstr. #1. = Trinder P., Ann Clin. Biochem (24). 1969. = Schetter G. y E. Nussel. Arbeitsmde. Sozialmed. Praventiumed 10 (25) 1975. * Pactor 585 calculado en base al coeficiente de extincién determinado para el producto final por la casa Boehringer Mannheim, 282.4. CREATININA 24.1. Técnica Utilizada Método de Folin y Wu. Reaccién Jaffé. 2.4.2. Fundamento La creatinina en un filtrado libre de proteinas reacciona con una solucién Pricrato alcalina para formar un complejo coloreado (Reaccién do Jaffé) cuya intensidad es medida fotométricamente. 2.4.3. Equipo y Elementos Espectrofotémetro 488 nm, Balones aforados 50 ml. 100 ml. y 1.000 ml. Tubos de ensayo 16 x 150 Reloj alarma 60 minutos 244, Reactivos Acido Pierico iréxido de Sodio 10% Picrato Alcalino Solucién estandar (A) Indicador Fenolftaleina Acido clorhidrico 0.1N 2.4.5. Descripcién de la Técnica Diluya la orina 1:50 6 1:100, segiin el caso. Tome de esta icién § mililitros: agregue 2.5 mi. de picrato alcalino. Para el blanco, use 5 mi itros de agua destilada. Deje en reposo 25 minutos, agite y lea on el espoctrofotémetro a 488 nm., en la curva de calibracién observe la concentracién correspondiente, dividala por mil para expresario en miligramos por ciento. 292.4.6, Curva de Calibracién De la solucién estandar (A), tome las cantidados anotadas abajo; agregue 5 mililitros de Acido clorhidrico 0,1N y diluya a 50 mililitros con agua. De estas diluciones ‘tome 5 mililitros para desarrollo de color. 2.4.7. Control de Calidad 0.55 mgr" Coeficiente de variacién: 0.83% Error estandar: 0.12 2.4.8, Preparacién de Reactivos Hidr6xido de sodio 10% Hidréxido de sodio lentejas 10 gr. ‘Agua dostilade complete 100 ml. Acido Picrico Acido Picrico 10.31 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Disuelva completamente Titule con hidréxido de sodio 0.1N adicionando 1 gota de Indicador fonolftaleina. La normalidad del écido Picrico debe estar entre 0.043 y 0.044. En caso contrario, ajéstela. 7 * concentracién dada con base en el volumen final tomado para desarro- Llo de color. 30Picrato alcalino (uso diario) Mezclo en el momento de usar Acido Pierico 9 partes Hidréxido de sodio 1 parte Solucién estandar creatinina 0.1 mg/ml. (A). Creatinina 0.1 gr, Acido clorhidrico 0,1N complete 1 litro Indicador de fenoftaleina 1% Fenolftaleina indicador 1 gr. Etanol complete 100 mi. Acido clorhidrico 0.1N Acido clorhidrico* 0.83 ml. Agua destilada complete 100 mi. 2.4.9. Bibliografia ~ “Manual of Clinical Methods for the Coleman Junior Spectrophotometer” pag. 25 (1965). ~ 1. Davidsohn y J.B. Henry. Diagnéstico Clinico por el Laboratorio. Todd-Santor, Barcelona 6a. ed. Editorial Salvat 1978. * Acido Clorhidrico concentrado 12N. 32.5. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS 2.84. Técnica Utilizada Hlectroforesis on acetato de celulosa. 2.8.2. Fundamento Se basa on el despazamiento de partfcules cargadas en un campo eléctrico. Los divorsos tipos de proteinas muestran diferentes gradoe de migracién relacionados con su tamafio, forma y carga. El pH del buffer en el cual se introducen las proteins jus tn papel muy importante on lo que so refiere al tipo y cargas do cada particule coloidal protéica, ‘Al colocer un suero en una membrana para electroforesis y crear un campo eléctrico, se inicia una migracién de las proteinas séricas separéndose en bandas. : 2.5.3, Equipo y Elementos Celda electroforética (Shandon Southern) Fuente de energia (Shandon Southern) SAE 2761 Horno 90°C Densitémetro (Cosmo Co Digital D101B) Filtro 500 nm. Cubetas (6) Caucho en soporte Aplicador de muestras con soporte ‘Vidrio del tamafio de les membranas Frasco lavador Membranas acetato de colulosa* No. 324330 Papel secante Rétulos para identificacién 2.5.4. Reactivos Acido Acético 5% Buffer veronel pH 8.6 (0.063M) Ciclohexanona 30% en etanol Colorante rojo de Ponceau S Btanol 95% * Beckman. 3225.5. Calibracién Eltiempo y voltaje vienen dados por la técnica por tanto no es necesario hacer calibracién adicional 2.5.6. Descripcién de la Técnica Llene seis (6) cubstas con 100 ml. de cade reactivo ast: Buffer Veronal pH 8.6 (0.063M) Colorants fijador Red Ponceau $ Acido Acético 5% (Sol-Lavadora) Acido Acético 5% (Sol.Lavadora) Etanol absoluto (Sol.deshidratante) . Ciclohexanona 30% (Sol.Aclaradora) Hidrate la membrana en Buffer veronal pH 8.6 (0.063M); con pinze plana, limpia {nunca con los dedos). retire la membrana y coléquela en la cubsta No. 1, de manera que flote sobre el Buffer hasta que se humedezca completamente, luego con agitacién suave permita que se cubra completamente con el Buffer. Remueva la membrana con pinzas, séquela suave y répidamente entre papel secante para quitar el exceso de Buffer. Coloque la mombrana en el soporte de electroforesis y aplique la muestra con el dispositive teniendo cuidado de no presionarlo mucke sobre la membrana. Use una corrionte constante de 250V durante 20 minutos. Al concluir el tiempo de corrida desconecte la fuente de poder. Remueva la membrana con pinzas y permit que flote on la cubeta 2, para fijarla y colorearla con el colorante Rojo Ponceau S por 17 minutos, Lave la membrana una vez en cada una de las cubetes 3 y 4, para quit colorante, si no es suficiente dé una tercera lavada hast queden coloradas las fracciones alectroforétict Acido acético. Tal que en la membrana solo Quite con papel secante el exceso de Sumerja la membrane en etanol para deshidratarla (cubeta No. 5), durante un minuto. Sumérjala en le soluciéa aclaradora ciclohexanona 30% (cubeta No. 6) durante 1 minuto, coléquela sobre un vidrio y con el caucho en soporte quite el exceso. Inmediatamente coloque ol vidrio con la membrana en el horno a temperatura de 80°-100 *C y déjela allt aproximadamente 3 minutos, hasta que la membrana se torne transparente. 33Remueva la membrana, rotilela de acuerdo a las muestras procesad: coléquela an acetato transparente* que permita manejarla bien en el densitémetro y Jea a 500 nm. Lectura en el Densitémetro ‘Antes de realizar la lectura ajuste a “0” el aparato con la parte de le membrana de acetato de celulosa donde no hay muestré Luego para controlar el pico més alto utilice la banda més concentrada y por consiguiente con una intensidad de color mayor. Una vez haya realizado los correspondientes ajustes proceda a leer las muestras, el resultado es dado por el densitémetro directamente on porcentaje, si al sumar las fracciones no obtiene 100% aplique el factor de correccién distribuyendo porcentualmente ol excedente o faltante entre las fracciones correspondientes (solo si Ia variacién osté entre 98-102%). Para el colorante usado Rojo de Ponceau, use un filtro de lectura de 500nm. 2.5.7. Control de Calidad Se efectué con Precilip** de velores teéricos. 2.5.8. Preparacién de Reactivos Acido Acético 5% Acido acético 5 mi. ‘Agua destilada complete 100 ml. Buffer Veronal pH 8.6 0.063 M Acido Dietil Barbitirico 1.7 gr. Barbital de sodio 10.30gr. Azida de sodio 0.65 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Conserve on refrigeracién Ciclohexanona 30% Ciclohexanona 30ml. Etanol complete 100 ml. * El acetato debe estar libre de rayaduras. +* control sera Boehringer Mannheim. 34Colorante Rojo de Ponceau $ Rojo de Ponceau $ 0.5 gr. Acido Tricloroacético 7.5 gr. Acido Sulfosalicilico 7.5gr. Agua destilada complete 250 ml. NOTA: se conserva a tomperature ambionte en frasco color mbar. 2.5. ~ I. Davidsohn J.B, Henry. Diagndstico clfnico por el Laboratorio, Barcelona 6a. ed. Fditorial Salvat 1976. Bibliografia - 8.7, Neremberg M.D. Ph. D.A practical laboratory Manual Electrophore- sis. Philadelphia pd. F.A, Davis Company 1966. 352.6. GLICEMIA (BASAL Y POSTPRANDIAL) 2.6.1, Técnica Utilizada Método enzimético glucosa-oxidasa en tiras reactivas*. 2.6.2. Fundamento La tira reactiva esté impregnada de glucosa oxidasa, peroxidasa, un sistema cromégeno y amortiguadores. La muestra se coloca en el 4rea reactiva y alli la glucosa-oxidasa se convierto en gluconolactona que se combina con el oxigeno atmosférico para formar poréxido de hhidrégeno que oxida los indicadores cromégenos de la tira reactiva produciendo la gama de colores que van desde el gris hesta ol ezul pérpura. Este color se mide fotométricamente en un colorimetro de reflectancia EYETONE* 26,3. Equipo Empleado Colorimetro de reflectancia EYETONE* Botella de lavado 2.8.4. Reactivos Tiras reactivas Dextrostix* Tiras para calibracién set 1 y set 2* Controles Dextro-check estendar 90 mg%, 130 mg% y 250 mg%* Dexpack* 2.6.5. Calibracién de Equipo 1. Haga le primera calibracién con las tiras set 1 y set 2. 2. Es indispensable para la calibraci6n completa que efectie una segunda con una solucién que contiene una cantidad de glucosa predeterminada; use 3 Controles con concentracién de 90, 130 y 250 mgr de glucosa. (Dextro-Check). 7 * pe 1a casa Miles Laboratories Divisién Ames Company. 36Esta calibracién se hace; Antes de i jar el trabajo. Al comenzar un nuevo frasco de Dextrostix. Cuando cambio la persona que efectiia las determinaciones y de rutina calibre el equipo cada 10 determinaciones con el control de 130 mgr% para control de calidad Para la calibracién con los controles de concentracién conocida proceda asi: Haga reaccionar una gota de Dextrocheck estandar de 130 mgr% con una tira de Dextrostix durante 1 minuto, luego lave por dos segundos con agua empleando una botella de lavado, seque la tira con papel absorbente y lea; las ospecificaciones anotan que si la lectura esté entre el rango 91-169 mgr% el aparato esté funcionando correctamente; por medio del control de estandarizacién lleve la aguja rapidamente a 130 mgrt%, Si la lectura no cae dentro de este rango el equipo requiere revisién por parte del fabricante, Luego proceda a usar la solucién Dextro-Check estandar de 90 y 250 mgr% sceptendo las lecturas con una variacién de*+10 mgr% con relacién al valor del control respectivo. Estos dos controles sirven pare chequear el reactivo (tiras reactivas) y la técnica, 2.6.6. Descripcién de la Técnica En Ia muestra de la persona proceda a efectuar la determinacién de la siguiente forma: No toque con los dedos ni contamine el drea reactiva, revise la fecha de expiracién de todas las tiras y controles, no saque el desecante que viene en los frascos. Tome la muestra de la persona con EDTA o por puncién digital obtenga una gota de sangre de buen tamaiio y coléquela en et érea reactiva de la tira de Dextrostix. Es indispensable que use reloj con segundero o un cronémetro. Deje la sangre sobre la tira para que reaccione exactamente 1 minuto, luego lavela répidamente (1 0 2 segundos} con un chorro constante de agua ayudado del frasco lavador pléstico que viene con el equipo. Seque la tire con una toalla desechable o papel de filtro e inmediatamente lea en el colorimetro EYETONE presionando la tablilla en la parte frontal con la tira 7colocada y lea en la escala; ol resultado se obtiene directamente en miligramos por ciento. Una vez obtenido ol resultado solicite del médico autorizacién para suministrar ala persona una sobrecarga de glucosa (100 gramos) Dexpak*. Explique a le porsona le importancia del examen y el porqué de la né ingestion de alimentos dentro de las 2 horas siguientes. Citelo dos horas después de la ingesta de Dexpak para practicar la glicemia post-prandial. Por puncién capilar obtenga una gota de sangre pare la segunda determinacién de glicemia y reporte los 2 resultados. 2.8.7. Control de Calidad Ver calibracién. 2.6.8. Preparacién de Reactivos Vienon listos para el usi 2.6.8. Bibliografia ~ ofativa A y Colaboradores: Estudio comparativo entre la cinta _reac~ tiva Dextrostix dosada ocular y reflectométricamente y los _métodos Sonogy-Nelson y de la Ortotoluidina. Comunicacién Instituto de Endo~ Grinologia y Nutricién, Salta, Argentina, 1974. casa Miles Laboratories Divisién ames Company. Literatura Dextros~ tix BYETONE. = colonbia Ministerio de Salud Piblica. Ascofame. Evidencia Clinica Bogoté, (Estudio de Recursos Humanos para la Salud y la Educacién Médica en Colombia). investigacién Nacional de Morbilidad 1969- * anote el resultado de 1a glicemia basal y hora de ingestién de 1a sobrecarga. 382.7. HIERRO SERICO 27.1. Tecnica Utilizada Método para determinacién de hierro por espectrofotometria de absorcién atémica. 2, Fundamento La absorcién atémica se describe como el inverso de los métodos de emisién para la determinacién de elementos metélicos, se basa en que el elemento de interés en la muestra se disocia de sus enlaces quimicos y se coloca on un estado no excitado, no ionizado y en su estado minimo de energfa: \s condiciones el elemento es capaz de absorber radiacién emitida en lineas discretas de ancho de banda angosta (Las mismas Iineas que serfan omitidas por el elemento al excitarse). 2.7.3. Equipo Empleado Espectrofot6metro de absorcién atémica Perkin - Elmer modelo 403. Lémpara de cétodo hueco de hierro Perkin-Elmer Longitud de onda: 248.3 nm ultravioleta, Slit: 3 aire/acetileno : 0.12 microgramos/ml. 2.7.4. Reactivos Acido tricloroacético 20% Solucién valorada de hierro 1.000 ppm. Lave todo el material con mezcla sulfocrémica. 27.8. Calibracién A partir de la solucién valorada de 1.000 ppm prepare patrones de concentracién 5-2 y 1 ppm para calibrar el equipo. ‘Multiplique Ja lectura de los patrones por 2 con el objeto de compensar el factor de dilucién de la muestra. 392.7.6. _Descripcién de la Técnica Acido Tricloroacético 208 guero Agua destilada Caliente los tubos al baiio marfa 90°C tapados con papel de aluminio durante 15, minutos. Enfrie, centrifugue, decante y determine la cantidad de hierro existente en ol sobrenadante por espectrofotometria de absorcién atémica. Célculos: (Lectura muestra - Lectura blanco) x 100 - microgramos % 2.7.7. Control de Calidad Diario Desviacién estandar: 10.25 microgramos *% Coeficiente de variacién: 7.06% Interdiario Desviacién estandar : 12.14 microgramos *% Goeficiente de variacién - 10% 27.8. Preparacién de Reactivos NOTA: No use espatula metélica para pesar los reactivos. Acido tricloroacético 20% p/v Acido tricloroacético 20 gr. ‘Agua destilada libre de hierro complete 100 ml. Solucién valorada de A partir de ésta prepare patrones de 1, 2, y 5 ppm pare ef calibracién. ro (viene preparada comercialmente) ictuar la curva de Mezcla sulfocrémica Bicarbonato de Potasio 18 gr. Agua destilada 30 ml Acido sulfirico concentrado complete 1.000 ml. 40Afiada el écido lentamente agitando con varilla de vidrio hasta completa disolucién. 2.7.9. Bibliografia - Herbert Kahn. Instrumentacién para espectrofotometrfa de absorcién atémica. - Olson A.D. & Hamlin W.B. Perkin Elmer : Analitical Methods atomic absorption 1973, See at28. 2.8.1. 2.8.2. reduct presente. Es dificil sin un dispositive de registro Ja determinacién fotométrica de la pérdida de color del ion leyenda en el fotémetro. adicién de sulfato ferroso amoniacal, los iones férricos resultant directamente proporcionales a los iones céricos remanentes, producen un complejo de ql color 2.8.3. 2.8.4. {0D0 INORGANICO Técnica Utilizada Método Fotométrico para andlisis de agua edaptado a orina. Fundamento 0 de catalizar le El método se basa en la capacidad que tiene el Acido arser .ci6n de los iones céricos. El efecto es proporcional, aunque no en forma lineal, a la cantidad de iodo 0, pues se desvanece répidemente miontras se esté Si se detiene la reaccién, después de un intervalo especifico, mediante la que son con el tiocianato de potasio que es relativamente estable. Se adiciona cloruro de sodio en exceso para eliminar interforencias. Equipo y Elementos Baiio maria ajustable a 30°C. + 0.5°C. Espectrofotémetro 510 nm Cronémetro, con aproximacién de + 5 segundos Tubos de ensayo de 2 x 15. cm. Reactivos ‘Agua desmineralizada, que tenga menos de 0.3 microgramos de yodo/litro Solucién de cloruro de sodio 20% Solucién de Scido arsenioso Acido sulférico concentrado Solucién de sulfato cérico amoniacal 0.02 N Solucién de sulfato ferroso amoniacal ee Solucién de Tiocianato de potasio 4% Solucién patrén de Yoduro de potasio, concentracién 200 microgramos por ml. Utilice frascos color Ambar, para almacenar los reactivos. 22.8.5. Curva de Calibracién Solucién intermedia: (concentraci6n 1 ug ml.) Diluya 1 ml, de solucién madre (200 ug) a 200 ml, Solucién de trabajo. Soluci6n — Sol.Intermedia_ Volumen final Micrograms/10 ml. 1 1 100 m. 0.1 2 Ls 100 mL. 0.15 3 2.0 100 ml. 0.20 4 2.5 100 mi. 0.25 5 3.0 100 ml. 0.30 6 4.0 100 mL. 0.40 2.8.6. Descripcién de la Técnica Diluya la orina 4:50* de esta dilucién tomo en cada uno de dos tubos 10 ml. (1 tubo es el blanco y otro el desconocido). Desconocidos: Agregue los reactivos a la muestra, en el siguiente orden estricto: Cloruro de sodi Solucién Acido Arsenioso Acido Sulfiérico concentrado . 20% - 1 mk 0.5 mi. 0.5 ml. Coloque la mezcla de reaccién, lo mismo que la solucién de sulfato cérico amoniacal, en bafio maria a 30°C y espere cinco minutos para que alcancen un equilibrio de tempreratura. Agregue 1.0 ml. de sulfato cérico amoniacal, mezcle por inversi6n y ponga en marcha el cronémetro para medir el tiempo de reaccién; durante la mezcla use tapén inerte y limpio, uno para cada tubo. Después de 15 minutos retire la muestra del baiio maria y agregue inmediatamente 1.0 ml. de solucién de sulfato ferroso amoniacal, mezclando hasta la desaparicién del color amarillo del ion cérico. A continuacién egregue 1.0 mi. de solucién de tiocianato de potasio, mezclando cuidadosemente. Dentro de la hora siguiente a la adicién del tiocianato, lea el color Tojo, como por ciento de transmitancia en un colorimetro; tanto la temperatura de la solucién como la del compartimiento de la celda se mantione a 30°C+0.5°C. Si analiza simultneamente varias muestras, inicie las reacciones a intervalos de 1 minuto, para dar tiempo a las adiciones de suifato ferroso amoniacal. * 4 ml, de orina y 46 ml, de agua destilada. aProcese los patrones de lodo que tienen 0.1 - 0.15 - 0.20 - 0.30 y 0.40 microgramos de Jodo por 100 ml. de igual forma que las muostras. Haga una curva de calibracién para cada serie de muestré Blancos: a. Blanco de reactivo (méxima coloracién) 10 ml. de agua destilada excenta de iodo. b. Blanco de cada punto de curva, 10 ml. de solucién de trabajo. c. Blanco de muestras, 10 ml. de dilucién de orina. ‘Agregue @ los tubos blancos b y ©, todos los reactivos en su orden y reemplace la cantidad de sulfato cérico amoniacal por 1.0 ml. de agua destilada. Lectura Longitud de onda: 510 nm. Establezca el 100% de transmisién (0 “0” de densided éptica) con agua destilada y lea a continuacién en % de transmisién (blancos y desconocides) tando las soluciones de Jodo como muestras de orina. Pase las lecturas a densidad éptica y reste de cada muestra el blanco correspondiente. Haga la curva de calibracién (gréfica en papel milimetrado) graficando concentracién contra densidad éptica corregida*, Determine en la curva le cantidad de Jodo por alfcuota de dilucién y finalmente calcule el valor por 100 ml. de orina. 2.87. Control de Calidad Desviacién estandar 7.14 mg% Coeficiente de variacién 17.03% Error estandar 1.60 2.8.8. Preparacién de Reactivos Solucién cloruro de sodio Cloruro de Sodio 200 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. + se considera densidad Sptica corregida; 1a densidad éptica de 1a muestra menos la densidad 6ptica de su blanco. “4Solucién Acido Arsenioso Oxido arsenioso 0.4946 gr. Hidréxido de sodio 0.35 gr. Agua destilada 10 ml. : Disuelva perfectamente y diluya a 40 ml. aproximadamente con agua destilada. Fenolftaleina 1 gota Neutralice con Acido Sulftrico concentrado . ¥ afiada Acido Sulfdrico concentrado 0.02 ml. ‘Agua destilada comple 50 ml. Guarde en frasco color émbar. Sulfato Cérico amoniacal (0.02 N) Ce (NH.) 4 (SO,) 4 220 13.38 gr. ‘Agua destilada 50 ml. Acido Sulfirico concentrado 44 ml. ‘Agua destilada complete 1 litro Guarde en frasco Ambar. Sulfato ferroso amoniacal: proparacién diaria Fo (NH.) 2 (S0,) 2 6 H20 1.5 gr. Agua con 0.6 ml. de H,SO, concentrado 100 ml. Guarde en frasco émbar. Potasio tiocianato 4% Tiocianato de potasio 4 gr. i Agua destilada complete 100 ml. Guarde en frasco color émbar. Ioduro de potasio Patrén (200 microgramos/ml.) Solucién madre. Ioduro de potasio anhidro 0.2616 gr. Agua destilada complete 1.000 ml. Antes de completar a 1.000 ml., disuelva completamente. Guarde en frasco color émbar. 2.8.9. Bibliografia ~ APHACAWWR. Métodos Bstandar para el examen de aguas y aguas de dese cho. Pag. 260. Adaptado para andlisis de orina. New York 13 ed. i971, 52.9. NITROGENO UREICO 2.91. Técnica Utilizada Método de la DIACETIL Monoxima 2.9.2. Fundamento La urea reacciona directamente con la diacetilmonoxims (2-3 butanodiona-2 oxima) en presencia de una solucién dcida de alumbre férrico como reactive sensibilizante. La urea reacciona con ol radical diacetilo liberado en solucién écida, para formar derivados coloreados cfclicos por una reaccién oxidativa de condensacién. 2.9.3. Equipo y Elementos Espectrofotémetro 475 nm. Balanza analitica Baiio de agua hirviendo Erlenmeyer 50 ml. Tubos de ensayo 16 x 150 Balones aforados 100 ml. y 2.000 ml. 2.9.4. Reactivos Diecetil Monoxima Alumbre Férrico-Acido Solucién estandar de urea (A) 50 mgr% 2.9.8. Curva de Calibracién cConcentracién ug/100 mil.De la solucién estandar de Urea (A) tome alfcuotas y aférelas @ 100 mililitros eon agua; use dos mililitros para desarrollo de color. Trate estas diluciones igual que las muestras de orina. 2.8.6. Descripcién de la Técnica - Diluya la orina 1:100 con agua destilada En erlenmeyer de 50 mi. coloque y agite constantemente Dilucién de orina 2. ml. Agua destilada 10 ml. Mezcla DAM y alumbre Férrico Acido* 20 ml. ‘Tape con tapa de vidrio. Hove a bebo de agua hirviente exactamente 15 minutos, saque del baio y dejo a lemperatura ambiente 15 minuto: Luego bafio de agua fria 15 minutos. Durante el calentamiento y enfriamiento proteja de la luz directa. Para el blanco utilice 12 ml. de agua destilada, Lea 475 nm. El color es estable una hora cuando no so expone a la luz directa, 2.9.7. Control de Calidad Dosviacién estandar 10.40 mg% Cosficionte de variacién 4.34% Error estandar 2.40 2.9.8. Preparacién de Reactivos Diacetil-Monoxima solucién Solucién 1 Diacetil Monoxima 10 gr. Agua dostilada aprox. 1.000 ml. Solucién 2 Cloruro de sodio 300 gr. Agua destilada 600 ml. Mezcle solucién 1 y solucién 2. Agua destilada complete 2 litros Filtre, guarde en frasco oscuro; la solucién es estable indefinidamente. * Mezcle Diacetil Monoxima y Alutbre Férrico Acido en proporcién 1:1. ”‘Alumbre Férrico Acido ‘Alumbre férrico Fe (NH) 2 12H,0 5 sr. ‘Agua destilada 500 ml. Lentamente agregue: 7 Acido Fosférico 85% 500 ml. ‘Acido Sulfirico concentrado 500 ml. 4 Enfrfe en ol chorro de agua, reactivo estable indafinidamente. Solucién estandar de Urea 50 mg% Urea seca 0.1072 gr. Disuelva en agua y complete a 100 ml. 2.9.9. Bibliografia - "clinical Methods Manual". Spectronic 20, 79 (1965) = 0, simple Method for the determination of bload Urea Nitrogen, With special reference to automatic colorimetric analysis", N- 3- Lapinte, Chemistry 5, 617-620 (1959).2.10. PROTEINAS TOTALES 210.1 Técnica Utilizada MicroBiuret. 2.10.2, Fundamento Se basa en la reaccién de el ion cuprico en medio alcalino con los enlaces peptidicos de la proteina produciendo un complejo de color violeta. 2.10.3. Equipo Empleado Espoctrofot6metro Pye Unicam Modelo SP 1.700, longitud de onda: 540 nm. Tubos de ensayo de 16 x 150 2.10.4. Reactivos Hidréxide de sodio 2.5 N Reactivo de Biuret Patrén Precilip 5.8 gr. 2.10.5. Calibracién Se hizo con patrones de concentracién conocida*. 2.10.6. Descripcién de la Técnica Reacti vos Muestra Patrén R. de Biuret 4 Suero 0.05 mee = Patrén - * precilip Boehringer Mannheim. ** se aumenté el volumen de suero utilizado con el objeto de disminuir el error producido por medicién de voltmenes pequefios. 49Reposo 30 minutos. Lea en espectrofotémetro a 540 nm. Célculos: ‘As Muestré x Concentracién patrén = gre 240.7. Control de Calidad 8, Diario: Determinacién en suero procesado ol mismo dia Desviacién estandar: 0.2 grt Coeficiente de variacién: 2.9% b. Interdiario: Determinacién en diferentes dias con precilip Desviacién estandar: 0.2 gr% Coeficiente de variacién: 3.4% 2.10.8. Preparacién de Reactivos Hidréxido de sodio 3.5 N Hidréxido de Sodio Lentejas 100 gr. Agua destilada complete a 1 litro Reactivo de Biuret Disolver por separado: Sulfato de cobre CuSO 5 H30 1 gr. Tartrato do sodio y potasio (Naktartrato 41120) 6 gr. Agua 500 ml. Afiada lentamente y con agitacién constante. NeOH 2.5 N. 300 ml. Toduro de Potasio 1.0 gr. Agua destilada complete 1 litro Almacene en botella de polietileno Estable indefinidamente. 2.10.9. Bibliografia - I. Davidson, J.B. Henry. Diagnstico clfnico por el Laboratorio. 5a. ed. 1975 Editorial Salvat. Barcelona.2.11. TRIGLICERIDOS 2414. Técnica Utilizada Determinacién enzimética después de hidrélisis enzimética, método cinético ultravioleta. 241.2. Fundamento La técnica esté basade on cuatro reacciones enziméticas: 1. Los trigliceridos existontos on 1a muestra son hidrolizados por las enzimas lipasa/estearasa para dar glicerol y 4cidos grasos. 2, EL glicerol es fosforilado a glicerol 3 fosfeto mediante la enzima slicorol-kinasa, para el efecto una molécula de ATP es usada por el glicerol dando como producto ADP. 3. EL ADP producido anteriormente reacciona con el fosfoenolpiruvato on reaccién catalizada por la enzima piruvato kinase para dar piruvato y ATP. 4. El piruvato formado es reducido por medio de la enzima lactato deshidrogenasa a lactato, esta enzima utiliza el cofactor NADH que es oxidado a NAD en esta misma reacci6n. El producto final absorbe luz de longitud de onda de 340 nm y se puede cuantificar espectrofotométricamente, EI NAD formado se mide por un método cinético de medicién continua; la prueba conteniendo enzimas se incuba con todos los participantes en la reaccién midiendo a intervalos de tiempo regulares la oxtincién originada por la coenzima que recibe y libera hidrégeno. ipasa / est Triglicéridos —HiPOS@ 7 esterase, cyicgro) + dcidos grasos Glicero! + aTP ——SX » guicoro!-3-fostoto + ADP Pk ADP +PEP ———~—® piruvato + ATP Piruvato + NADH + Ht 4» 1 ractato + NAD+ 512.11.3. Equipo Empleado Espectrofotémetro Pye-Unicam modelo SP 1.700 longitud de onda 340 nm. Cubeta 1 em de paso de luz Micropipeta automética 50 Puntas para pipeta automética -olitros 241.4. Reactivos* 4. Tampén Tampén de fosfato Sulfato de magnesio Dodecit sulfato sédico 2, NaDH ATP/PEP 3. LDH PK/Lipasa Esterasa 4. GK 241.5. Calibracién Se efectéia introduciendo un patrén de concentracién conocida. 2.11.6. Descripcién de la Técnica En la cubeta del equipo pipoteo. Reactivos Blanco Material de Prueba Mezcla de reaccién 2.5 2.5 Plasma = 0.05 i Incubacién 1/2 hora para hidr6lisis a 20-25% Efectée la primera lectura Soluci6n #4 0.010 0.010 mi. Incube 10 minutos a 20-25°C Efectie 1a segunda lectura * Vienen preparados en el Kit de la casa Boehringer Mannheim. 82Céleulo: (Primera lecture - Segunda lectura - Blanco) x 711*=mg% triglicéridos. 241.7. Control de Calidad Desviacién astendar promedio: 12.5 mgt% Coeficiente de variacién promedio: 10.38% 241.8. Preparacién de Reactivos Mozcla de Reaccién En el momento del uso esta mezcle debe tener una temperatura de 20-25°C. Estabilidad de la mezcla de reaccién: a 4°C, 30 horas; entre 15 y 25°C, 8 horas. Los reactivos vienen listos para el uso 241.9, Bibliografia ~ Modificacién segin Wahlefeld A.W. en H.U. Bergmeyer: Methoden der Enzimatischem, Analyse, 3a. Ba. tomo II verlag Chemie, Weinheim 1974 Pag. 1.878. * Factor dependiente del coeficiente de extineién de NAD calculado por 1a casa Bochyinger Mannheim,2.12. VITAMINA A Y CAROTENOS 22.1, Técnica Utilizada Método del tricloruro de antimonio de Carr Price. 212.2. Fundamento Las proteinas del suero se precipitan con alcohol, ol caroteno y Ja vitamina A se extraen con éter de petréleo. La concentracién del caroteno se determina midiendo la absorcién del extracto a 450 nm. El éter de petréleo se evapora bajo nitrégeno y la vitamina A se determina leyendo la intensidad del color azul producido al agregar tricloruro de antimonio en cloroformo o écido trifluoroacético en cloroformo. Se efectiia la correccién para la cantided de caroteno presente ya que éste contribuye al color total. 2.12.3. Equipo y Elementos Espectrofotémetro Coleman Jr. Cubetas, 10 x 75 mm y adaptador Befio de agua temperature 40-50°C Pipetas de caida répida de 1.0 ml. Tubos de ensayo con tapa de vidrio, 16 x 150 mm o 14 x 125 mm. Un cilindro de nitrégeno (opcional) Pipetas de 0.1, 2.0 y 3.0 ml. 2.12.4. Reactivos Alcohol etflico 95% Eter de petréleo (20-40°C) Cloroformo Solucién cromégena Tricloruro de Antimonio en cloroformo 20% Anhidrido Acético Sulfato de Sodio Anhidro Acido Clorhidrico 6N 242.8. Calibraci Curve estandar.Como los factores dados para vitamina A varian de un instrumento a otro, haga una curva estandar para ceroteno y vitamina A y calcule los factores para cada instrumento. Estandar de referencia para Vitamina A. Una solucién de acetato de vitamina A (estandar de referencia USP) en act de algodén contiene 34.4 mg de acetato de trans-vitamina A por gramo de solucién. La €\%, para el acetato de vitamina A en etanol a 328 nm. es 1.730 (expresado como vitamina A alcohol). Estandar de referencia para Caroteno. Viene en ampollas de B-caroteno puro o de una mezcla de 90% de B-carotena y 10% de gamma caroteno. Abra las ampollas inmediatamente antes de usarlas y una vez abiertas guérdelas en un desecador bajo nitrégeno. La E\%, para carotenc cristalino en hexano a 452 nm. es 2.250. El caroteno es inestable y no es raro encontrar que el estandar se deteriore. Preparacién de la Curva estandar de Caroteno. Pese con exactitud 50 mg del estandar de B-caroteno; disuélvalo en unos pocos mililitros de cloroformo, (grado reactivo) y lleve a 100 ml. con éter de petréleo en un balén volumétrico; prepare esta solucién on el momento de hacer la curva. Diluya esta solucién 1 a 100 con éter de petréleo para preparar el estandar intermedio. Prepare los esténdares de trabajo diluyendo el petréleo como sigue: ‘Transfiera por duplicado alfcuotas de 2 ml. de estos esténdaros a las cubsta de 10 x 75 mm del espectrofotémetro Coleman y lea sus densidadas épticas contra éter de petréleo a 450 nm. Haga la curva estandar y calcule el factor. 58.Preparacién de la Curva estandar de Vitamina A. Pese con exactitud 100 mg del estandar de referencia de Vitamina A. USP. (Acetato de trans-vitamina A en aceite de algodén). Esta cantidad contiene 3.44 mg de acetato de vitamina A. Disuelva en cloroformo y diluya a 50 ml. en un balén volumétrico. Para preparar los estandares de trabajo diluya este patrén con cloroformo en balones volumatriccos de 10 ml. como sigue: ‘Acetato de Vitamina A Para preparer Ja curva, coloque por duplicado alicuotas de 0.1 ml., de estos ostandares en las cubetas de 10 x 75 mm del espectrofotémetro Coleman y agregue la solucién cromégena como se indica en la descripoién de la técnica. Coloque los valores de la densidad éptica en la ordenada y la concentracién en microgramos (por tubo) de acetato de vitamina A en la abscisa, en papel de coordenadas rectangulares y calcule ol factor. 2.12.6. Descripcion de lo Técnica Goloque 2.0 ml. de suero en un tubo de ensayo con tapa de vidrio, 16 x 150 ml., agregue 2 ml. de alcohol de 95% y mezcle. Agregue 3.0 ml. de éter de petréleo, agite fuertemente por 2 minutos, contrifugue lentamente por tres minutos. Saque cuidadosamente con une pipeta volumétrica 2.0 ml. de éter de petréleo y coléquelos en una cubeta de 10 x 75 mm. Lea el caroteno a 450 nm., emplee un blanco de éter de petréleo. Evapore a sequedad en un baiio de agua a 40°-50°C. ‘Tome el residuo inmediatamente en 0.1 ml. de cloroformo; agregue una gota de anhidrido acético con una aguja No. 25; tape el tubo para evitar la evaporacién. 56Goloque el espectrofotémetro Coleman Jr. a 620 nm. y ajuste la densidad éptica @ cero, utilizando como blanco un tubo quo contenga 0.1 ml. de cloroformo y 1.0 ml. de la solucién cromégena. Retire el tubo blanco y coloque el tubo con la muestra en el aparato, aiada 1.0 ml. de solucién cromégena con una pipeta de caida répida; anote la lecture de le densidad en el punto de pausa (3-5 segundos después de afiadir ol reactivo). Inmediatamente después de leer la densidad quite el tubo y observe el color. La solucién debe ser clara y el color azul detectable. Precauciones: El SbCl; no debe contener humedad. (Guarde tapado mientras no se esté usando) Seque la muestra antes de agregar el SbCl, remoje la vidrieria que tenga SbCl; en una solucién 6N de HCl; enjuague y lave con detergente segin lo acostumbrado. La vidrierfa que se usa con 4cido trifluoroacético puede lavarse de la manera usual. Si no observa color azul en el tubo de la muestra (densidad menor de 0.04). 03 porque la muestra contiene menos de 14 ug por 100 ml. de vitamina A. Si més del 25% del grupo de las muestras da lecturas de menos de 0.04, incremente 1a muestra de suero 23.0 mi. Cuando saque el extracto de éter de petréleo, tenga cuidado de no tomar las particulas de proteinas de las paredes del tubo. 2.12.7. Control de Calidad Vitanina A Desviacién estandar Coeficiente de variacién Exror estandar ‘Carotenos Desviaci6n estandar Coeficiente de variaci6n Error estandar 212.8. Preparacién de Reactivos Tricloruro do Antimonio en Cloroformo 20% Disuelva: Tricloruro de Antimonio (SbC1,) 113.4 gr. en Cloroformo 455 ml. 87Filtre a través de un embudo acanalado que contenga sulfato de sodio (Na,S0,) anhidro y reciba el filtrado en frasco oscuro, Si la solucién es turbia continde la filtracién a través de sulfato de sodio hasta que aclare. Guarde en frasco oscuro y con sulfato de sodio. No exponga esta solucién al aire. porque absorbe humedad. 2.12.9. Bibliografia ~ Laboratory Manual for use in Nutrition Surveys 1963. Febrero. tnter- departamental Commitee on Nutrition for National Defense. 583. DETERMINACIONES MICROBIOLOGICAS3.1, ACIDO FOLICO 344. Técnica Utilizada Método microbiolégico. (Lactobacillus Casei). 3.41.2, Fundamento La determinacién de Acido félico se basa en Ia propiedad que tienen les bacteria de alimentarse con vitamina, aminodcidos y otros nutrientes, a pH éptimo. Se usa un medio basal carente de écido félico, 1 cual es suministrado por la muestra, a fin de completar los nutrientes necesarios ‘el crecimiento del microorganismo; el crecimiento es directamente proporcional e la cantided de 4cido félico suministrado. 3.1.3. Equipo y Elementos Espectrofotémetro longitud de onda 640-700 nm. Pipotes volumétrices 1, 2 y 5 ml. Tubos de ensayo de 19 x 150 mm. Tubos de rosca Pyrex No. 9826 Gradillas metélicas, tapas motélicas para gradilles Balones aforados 100, 500 y 1.000 ml, Erlenmeyers de 500 y 1,000 ml. Frascos de vidrio con tapa esmerilada .sc08 de polietileno con tapa Pipotas de 1 ml. (serol6gicas) estériles Pipetas Pasteur (¢30 gotas/1 ml.) 3.4.4. Reactivos Medio Iiquido de cultivo: (Difco 0320-02) Medio agar para cultivo: (Agar Difco 0319-02) Modio para anélisis de Folatos. BBL No. 11267 Streptococcus Fascalis (A.T.C.C. 8043) Acido Pélico Libre Lactobacillus Casei (A.T.C.C. 7469) Acido Félico Total Estandar: Acido Pteroyl glutémico Polisorbato 80 (Tween 80) Fosfato de Sodio Monobésico (NaH , PO, H.0) Fosfato de Sodio Dibésico (Naz HPO. 12 H20) Acido Ascérbico Bicarbonato de Sodio (NaHCO) Acido Clorhidrico (HCl) oaPreparacién del Material: Es indispensable el uso de material de vidrio totalmente limpio. Lévelo con detergente, luego enjuague con agua destilada y seque. Una vez seco sumerja toda la noche en Acido Clorhidrico 5.0 N. Al dia siguiente enjuague con agua dostilada y seque. Una vez seco esterilice a 121°C durante 15 minutos, a ‘excepcién del material aforado y las pipetas volumétricas. 3.1.5. Calibracién Esté inclufda en la descripcién de la técnic 3.41.6. Descripcién de la Técnica Para doterminar Acido Félico Libre, utilice cepa Streptococcus Faecalis, Para determinar Acido Félico Total, utilice cepa Lactobacillus Casei. ‘Muestra: Plasma o Suero. Muestras hemolizadas no sirven para efectuar la determinacién. Congele los sueros o plasmas si la determinacién no se puede efectuar inmediatamente. Extraccién: En tubo de rosca Pyrex No. 9826 coloque: 1.0 ml. de plasma o suero y 9.0 ml. de Buffer de Fosfato Ascorbato, lleve la muestra @ hidrélisis en autoclave a 121°C durante 2 minutos 30 segundos. Después de retirar las muestras del autoclave, enfrie a temperatura ambiente y centrifugue durante 15 minutos pasando el Iiquido sobrenadante a un tubo de 75 x 12 ma. Para efectuar le doterminacién Acido Félico utilice alicuotes de 0.5 ml. de extracto en cada uno de tres tubos de ensayo de capacidad 19 x 180 mm. Ai la 1.5 ml. de agua y 2.0 ml. de medio para anélisis de Acido Félico. Curva de Calibracién. Prepare una serie de tubos de capacidad de 19x150 mm. afectuando los blancos y puntos de la curva por triplicado. Es conveniente hacer un blanco de suero el cual se prepara utilizando 0.5 ml. do extracto de suero, 1.5 ml. de agua y 2.0 ml. de medio para anélisis de Acido Félico. Prepare dos tubos adicionales colocando en cada uno 5.0 ml. de medio para ensayo de Acido Félico y 5.0 ml. de agua (Concentracién 50%). Utilice un tubo para preparar la suspensién del inéculo y ol otro pare ajustar el cero de densidad éptica del colorimetro en la lectura final. 6Agua . 1.0m. 2.0m. 2Oml. Esterilizaci6n: Coloque todos los tubos en gradillas metélicas, después de taparlos lévolos a esterilizacién en autoclave 10 minutos a 121°C. Baje la presién del autoclave déjelos onfriar a temperatura ambiente. Inoculacién: Usando une pipeta Pasteur estéril inocule todos los tubos afiadiendo una gota de la syspensién del inéculo, No inocule el blanco de suero ni el tubo adicional. Incubacién: Incube en le oscuridad a 37°C durante 16-18 horas. Lectura: Lea la turbidez producida por el crecimiento en Espectrofotémetro en la banda de 640-700 nm. Antes de leer agite fuertemente los tubos y deje en repose 20 minutos para que dosaparezcan las burbujas. Ajuste el cero en densidad 6ptica con el tubo adicional incubado pero no inoculade y lea todos los demés tubos contra éste. Tome el promedio de los valores por triplicedo, si un resultado ee discordante descértelo y promedie los otros dos. Célculo: Page las lecturas obtenidas en la curva estandar a papel milimetrado, levando valor de la densided éptica a la ordenada y la concentracién de vitamina @ la abscisa. Lea los valores de los desconocides on la curva, para convertirlos en Acido Folico/1 ml. a3.1.7, Control de Calidad Desviacién estandar 0.998 ug/ml. Cosficiente de variacién 14.91% Error astandar 0.182 3.1.8. Preparacién de los Reactivos Solucién Patrén de Acido Félico: Propare una solucién de Acido Ptoroy! Glutémico en concentracién de 1 miligramo/1 ml. use para disolver una solucién de bicarbonate de sodio 0.4% el pH final de le solucién debe sor 7.5. Guardo esta solucién a - 20°C utilizando frascos de polietileno color émbar. Esténdares de Trabajo: Propare en agua destilada diluciones de la solucién patrén para obtener concentracién de: 10 ng/ 1 ml. (Solucién A) 1 ng/ 1 ml. (Solucién B) 0. 4 ng/ 1 ml. (Solucién C) 0.1 ng/ 1 ml. (Solucién D) Prepare los esténdares de trabajo diariamente. Buffer de Fosfato Ascorbato: Disuelva 13.8 gramos de NeHz PO.H20 0 15.6 gramos de NaH PO, 2H20 en agua destilada, Heve esta solucién a un volumon final de 500 ml. (Sol. 1). Disuelva 35.85 gramos de NazHPO,. 12H20 en agua destilada, leve asta solucién a un volumen final de 500 ml. (Sol. 11). Pare obtener 500 ml. las siguientes instruccione: un Buffer de pH=6.1 mezcle las soluciones I y 1 segin 212.5 ml. Sol I 37.5 ml. Sol I 250 + ml. de agua destilada Agregue 2.0 miligramos de Acido ascérbico por cada mi. de Buffer, asi para un volumen de 500 ml. agregue 1.000 miligramos de Acido Agcérbico, prepare esta mezcla inmediatamente antes del uso, teniondo en cuenta le cantidad de muestras a anslizar. Medio para Anélisis de Acido Félico: ‘Suspenda 94 gramos de polvo en un litro de agua, aiiada 0.1 ml. de Tween 80, mezcle, caliente, agite con frecuencia y herva durante 1 minuto. Determine la cantidad 6de medio a utilizar para el trabajo dol dia, y prepare solamente este volumen. Use @ tomperatura ambiente Inéculo: La tarde anterior al dia de la prueba, efectie un cultivo de L. Casei en medio liquide de cultivo (caldo) agregando a 10 ml. de caldo 0.5 ml. de cultivo, incube 37°C 16-18 horas. La mafiana de la prueba prepare un cultivo de 6-8 horas adicionando 0.5 ml. de cultivo de 16-18 horas a 10 ml. de caldo e incube a 37°C. En la tarde afiada 0.5 ml. dol cultivo de 6-8 horas a 10 ml. de medio para anélisis de Acido Félico al 50% (tubo adicional). Use esta dilucién como inéculo. 3.1.9. Bibliografia Hoffbrand, Newcombe and Mollin (1966). J. Clin Path 19.17. stamp (1947) 3, gen Microbiolog. 1-25 (a modification). Waters and Nollin (1961) J. Clin Path 14,335. Clinical vitaminology, 1968 Herman y Oscar Frank pég.99.. 6s3.2. CULTIVO FARINGEO 3.21, Técnica Utilizada Cultivo bacteriolégico. 3.2.2. Fundamento Identificacién presuntiva del microorganismo por su actividad hemolitica ‘specifica sobre un medio sélido que contiene glébulos rojos de cordero. Identificacién definitiva del mismo fundamentada on la sensibilidad del gérmen ala bacitracina, antibiético utilizado como prueba diferencial. Identificacién confirmativa por método de inmunofluorescencia y reaccién de precipitinas de Lancefield. 3.2.3. Equipo y Elementos Horno incubadora 37°C Mecheros gas Asas Bacteriolégicas Lépiz de diamante Cajas de Petri Aplicadores con punta de algodén Tubos de ensayo 16 x 150 con tapa rosca Léminas para inmunofluorescenci 3.24. Reactivos Silica -gel con indicador de humedad Agar tripticase de soya (sangre de cordero) Caldo de Todd Hewitt Discos Taxo Bacitracine Antisueros para agrupaciones de Streptococcus, Control negativo F.A. para Streptococcus Grupo A. Reactivos de prueba F.A. para Streptococcus del Grupo A 3.2.5. Calibracién Debido a la naturaleza de le técnica no ne 663.2.6, Descripcién de Ia Técnica Tome la muestra de faringe con escobillén y coléquelo en el tubo que conti silica-gel con indicador de humedad. Sila silica-gel esté de color azul es indicio de ausencia de humedad, en estas condiciones se usa para la toma de la muestra. Une vez tomada la muestra consérvela a temperatura ambiente hasta la remisién a nivel central; porcésela inmediatamente sea recibida en el laboratorio. Haga la primera siembra simulténeamente en agar sangre de cordero y caldo de Todd Hewitt, incube por 24 horas a 37°C. Si el crecimiento Streptococcus B hemolitico descarte ol caldo de enriquecit en agar sangre de cordero es positivo para jonto. Si el crecimiento inicial os negative resiembre el caldo de Todd Hewitt sobre una placa de agar sangre cordero. Incube esta segunda siembra por 24 horas a 37°C. Aisle las colonias sospechosas de Streptococcus Beta homolitico en agar sangre cordero. Con ol cultivo puro proceda a efectuar la prueba de bacitracina. Si la prueba de Bacitracina es (4) para el microorganismo aislado haga la prueba de precipitinas de Lancefield, o agrupamiento con antisueros especificos de grupos A-B-CD-F.G. Efectée la prueba confirmativa por inmunofluorescencia para Streptococcus Beta hemolitico del grupo A. 3.2.7. Control de Calidad Efectie control de calidad interno haciendo prueba de esterilidad del medio y viabilidad con una cepa de Estafilococcus Aureus. 3.2.8. Preparacién de Reactivos Agar sangre cordero (10%) Tripticase Soya Agar 40 gr. Agua destilada complete 1 litro Autoclave 15 minutos 121°C y 22 Ib. de presién. Asada sangre de cordero 100 ml. orCaldo Todd Hewitt* Caldo Todd Hewitt 30 gr. Agua destilada complete 1.000 ml. Autoclave 121°C 18 minutos 3.2.9. Bibliografia - Lennette- Balows Hansler Truant. Manual of Clinical Microbiology. Second edition 1974. - Rotta J. and R.R. Facklam. Manual of Microbiological Diagnostic Methods for Streptococcal infection and theirsequelae 1977. Staphy- Tococeus and Streptococcus Section CDC Atlanta Georgia. * Marca Bioxén.3.3. VITAMINA B12 3.3.1, Técnica Utilizada ‘Método microbiolégico. (Lactobacillus Leichmanni). 3.3.2. Fundamento El fundamento de le determinacién de vitamina B12 se ba: que tienen las bacterias de alimentarse con aminoécidos, vitaminas y otros nutrientes a un pH éptimo, utilizando un medio do cultivo (basal) completo en todos sus nutrie: excepto la vitamina 0 aminodcido en estudio; se compara el crecimiento microbiano cuantitativamente con soluciones estandar, el nutriente faltante en el medio es provisto por la muestra a analizar, de esta forma la cantidad de nutriontes se revela en el crecimiento bacteriano. 3.3.3. Equipo y Elementos Autoclave Horno incubadora 37°C. Espectrofot6metro longitud de onda: 640-700 nm. Tubos de ensayo de 16 x 150 mm Tubos de ensayo 75 x 12 mm Tubos de ensayo 19 x 150 mm Tubos de ensayo tapa rosca Pyrex No. 9826 Pipetas volumétricas 1,2 y § ml. Pipetas de 1 ml. (seroldgicas) estériles Pipetas Pasteur (£30 gotas/ 1 ml.) Balones aforados 100 ml. 500 ml. 1.000 ml. Erlenmeyers Frascos de vidrio con tapa Gradillas metélicas, tapas metélicas para gradillas, 4.3.4, Reactivos Lactobacillus Leichmanni ATCC No. 7830 Medio para anélisis de vitamina B12 BBL No. 11001 Agar para cultivo (Difco 0319-02) Medio liquido de cultivo (Difco 0320-02) Estandar: Cianocobalamina (Vitamina B12) Etanol 25% ooAcetato de Sodio Anhidro (CH ;COO Ne) ynuro de Sodio (NaCN) Hidr6xido de Sodio (NaQH) Acido Acético (CH;COOH) Acido Clorhidrico (HC) Proparacién del material: Es indispensable el uso de material de vidrio totalmente limpio. Lévelo con detergents, luego enjuague con agua destilada y seque. Una vez seco sumérjalo toda la noche en Acido Clorhidrico 5.0 N. Al dia siguiente enjudguelo con agua destilada y seque. Una ver seco estorilice a 121°C durante 15 minutos, a excepcién del material aforado y las pipetas volumétricas. 3.3.5. Calibracién Ver descripcién de la técnica. 3.3.6. Descripcién de la Técnica Preparacién del Inéculo: Gultive el microorganismo en stab* utilizando Agar para oultivo. Ronueve somanalmente el cultivo. Para el ensayo siembre Lactobacilo en 10 ml. de medio liquide de cultivo (Caldo), haga una resiembra do Agar a Caldo ¢ incube a 37°C por espacio de 1618 horas. Finalmente al dia del ensayo, haga una siembra en medio liquido de cultivo de Ja siguiente manera: con pipeta seroldgica astéril pase de 0.5 ml. a 1 ml. de un sultivo efectuando el dia anterior, a un tubo que contenga 10 ml. de medio liquide de cultivo; incube 6-8 horas a 37°C. Lavo este cultivo una vez retirado de la incubadora tres veces con 10 ml. de medio para anélisis de Vitamina B12 al 50% (tubos adicionales Nos. 1, 2 y 3); al final del torcer lavado suspenda los microorganismos en 4.0 ml. de medio para andlisis de Vitamine B12 al 50% {tubo adicional No. 4.). Muestra: Plasma 0 Suero. No utilice muestras hemolizadas. Si la determinacién no se puede efectuar inmediatamente, congele los plasma! Extraccién: En un tubo de ensayo con tapa rosca Pyrex No. 9826 coloque: 0.5 ml. de suero 0 plasma y 2.5 ml. de Buffer de Acetato pH 4.6. Lieve las muestras al autoclave 15 * Inoculacién por puncién en tubo de ensayo con agar no inclinado. 70minutos @ 121°C. Terminada la Hidrélisie retire los tubos del autocla’ a cada muestra 2.0 ml. de Hidréxido de Sodia 0.0375 N. enfrie y aiiada Centrifugue durante 15 minutos, pase el liquide sobrenadante a un tubo de 75 X 12 mm. Pare efectuar la determinacién de Vitamina B12 utilice alicuotas de 1.0 ml. de extracto on cada uno de tres tubos de ensayo de capacidad de 19 x 150 mm. Afiada 4.0 ml. de agua y 5.0 ml. de medio para anélisis de vitamina B12, Curva de Calibracién: Prepare una serie de tubos de capacidad de 19 x 150 mm; tanto los blencos como los puntos de la curva se preparan por triplicado. t, Soluci6n B ml, 0.5 Solucién Aml. = Agua ml. 4.5, Picogrames de V.B12/tubo 10 Agregue a todos los tubos 5.0 ml. de medio para andlisis de vitamina B12. Al mismo tiempo que prepare los tubos para la curva, es necesario toner 5 tubos adicionales, Cuatro contienen 5.0 ml. de medio para anélisis de vitamina B12 y 5.0 ml. de agua. Utilice tres de ellos para lavar el inéculo y el cuarto para ajustar el cero del colorimetro en la lectura al final de la prueba. Un iltimo tubo preparado asi: 2.0 ml. de medio para anélisis de vitamina B12 y 2.0 ml. de agua para resuspender el inéculo después del lavado final. Estorilizacién: Goloque todos los tubos en gradillas metélicas, después de tapados esterilice en autoclave 5 minutos a 121°C. Baje la presién del autoclave lentamente, terminada la esterilizacién retire los tubos del autoclave y deje onfriar a temperatura ambiente. Inoculacién: Use una pipeta Pasteur ostéril, inocule todos los tubos suspensién de inéculo. lindo una gota de laNo inocule el tubo adicional con o! cual debe ajustar el cero del colorimetro. Incubacién: Incube a 37°C durante 16-18 horas. Lectura: Lea la turbidez producida por el crocimionto en Espectrofotémetro en Ie banda do 640 a 700 nm; antes de leer agite vigorosamente los tubos, deje en resposo 20 minutos. para que desaparezcan las burbuja: Ajuste el cero de densidad 6ptica con el tubo adicional incubado pero no inoculado y lea todos los otros tubos contra ésto. Tome el promedio de los tres valores, si un valor es discordante descértelo y promedie los otros dos. Céleuto: Pase las lecturas obtenidas en la curva estandar a papel milimetrado, lleve el valor de la densidad éptica a la ordenada y la concentracién de vitamina a la Abscis Lea los valores de los desconocidos en la curva, para convertirlos en vitamina B12/Im1. ‘Sueros Estandar: Incluya en cada prueba como minimo tres sueros de concentracién conocida los cuales han sido anelizados repetidamente. Ademés incluya una prueba do recuperacién de vitamina B12. Esta prueba se hace por adicién de cantidade conocidas de vitamina B12 (més o menos 200 pg/1 ml.) a uno o més sueros estandar. 3.3.7. Control de Calidad Desviacién estandar 34 pg/ml Coeficiente de variacién 8.97% Error estandar 6.32 3.3.8, Preparacién de Reactivos Solucién Patrén de Cianocobalamina (200 ug por mil). Vitamina B12 200 microgramos Btanol 25% — 1.000 mi. Guarde refrigerada Prepare las siguientes soluciones a partir de ésta asi: Solucién intermedia (2.000 pg/ml.) Solucién patrén de Cianocobalamina 10 ml. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. nSolucién A: (100 pg/ml.) Solucién Intermedia 5 ml. ‘Agua destilada complete 100 ml. Solucién B: (20 pg/ml.) Solucién A 20 mi. ‘Agua destilada complete 100 ml. Buffer Acetato pH 4.6 Acetato de sodio anhidro 2.0 gr. Agua destilada 500 ml. Ajuste @ pH 4.6 con Acido Acético ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Inmediatamente antes del uso afiada por cada mililitro de buffer: Gianuro de sodio 0.18 mgr. Hidréxido de Sodio 0.0375N Hidréxido de sodio anhidro 1.5 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Medio para andlisis de vitamin B12 (Basel) Medio para andlisis de vitamina B12, 60 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Caliente, agite frecuentemente y herva durante 30 segundos. Determine la cantidad de medio a usar diariamente y prepare solamente este volumen. 3.3.8. Bibliografia - Methods of vitamin Assay - Third Edition - Prepared and Edited by The Association of Vitamin Chemists. Inc. 1966 Pag. 268. ~ The Megaloblastic Anenias. 1. Chanarin, Blackwell Scientitic publi- cations. Oxford and Edinburgh 1969. P&g. 198-206. 34, HEMATOLOGIA4.1. HEMATOCRITO 41.1. Técnica Utilizada Micrométodo. 4.1.2. Fundamento Se basa en la medicién de eritrocitos expresado en procentaje de volumen de sangre total existente en la muestra; se mide mediante la centrifugacién de sangre venosa dentro de un capilar. 4.1.3. Equipo y Elementos Microcentrifuga con carta de lectura incorporada jados Lancetas desechables 41.4, Reactivos Anticoagulante EDTA que viene incorporado en los capilares heparinizados. 4.4.5. Galibracién La microcentrifuge tiene incorporada una tabla de lectura que viene calibrada 0% y 100%, 4.4.6. Descripcién de la Técnica Mezcle cuidadosamente por inversi6n no menos de 10 veces ol tubo con sangre anticoagulada con EDTA y lene por capilaridad hasta la marca 2 capilares simples de 7 cm. con didémetro interior de 1mm. Selle los extremos con pl a. Coléquelos en los canales o surcos radiales de la microcentrifuga, con la parte sellada en contacto con el borde periférico del cabezote. El aire que queda en este extremo del capilar se desplaza con la centrifugacién. Balancee los capilares y asegurese de que estén correctamente identificados Contrifugue a 10.000 RPM durante 5 minutos. ”Lea on la escala de la microcentrifuga ajustando la parte del capilar donde empieza la capa de glébulos rojos a “0” de esta y el 100%" de la misma al borde donde termina el plasma. Con 1a ayuda de la lupa haga la lectura de la capa de glébulos rojos (no incluya 1a capa de glébulos blancos). Una vez leidos los hematocritos pares observe si hay diferencia entre los dos y si ésta es mayor de 2 unidades repita el procedimiento mezclando bien la muestra. Repita las determinaciones con valores por encima de 55 y por debajo de 30. Registre los resultados on el formulario LAB-1 (Las dos lectur: regultados de hematocrito. en el espacio 41.7. Control de Calidad Para controlar la técnice procese todos los microhematocritos por duplicado y repita los que no ofrezcan valores aceptables. Para controlar la microcentrifuge efectie una centrifugaci6n; loa ol resultado y vuelva @ centrifugar, él segundo resultado debe ser similar 0 maximo con 0.5% de variacién. 4.1.8. Preparacién de Reactivos No se necesita para la determinacién. 41.9. Bibliografia - I. Davidsohn, J.B, Henry. Diagndstico Clinico por el Laboratorio Sa, edici6n 1975, Editorial Salvat. = Lynch Rafael Mallor-Spare Hills Inwood. Métodos de Laboratorio 1965. 784.2. HEMOGLOBINA 421. Técnica Utilizada Cianometahemoglobina. 4.2.2. Fundamento El Ferricianuro de potasio convierte el hierro ferroso de la Hemoglobina en Férrico para formar Me! formar cianometahemoglobina estable. La concentracién de cianometahemoglobin medida fotométricamente a longitud de onda de maxima absorcién. 4.2.3. Equipo y Elementos Espectrofotémetro Pyo-Unicam SP 1.700 Longitud de onda: 540 nm. Factor: 375 Micropipeta automAtica de 20 microlitros Puntas para micropipeta automatica Pipotas de Sabli con boquilla ‘Tubos de ensayo con tapa 424, Reactivos Reactivo de Drabkin Patrén de cianometahomoglobina 4.2.5. Calibracién So usa un patrén Hemo-trol con concentracién teérica de 15 gr% de hemoglobina. Estabilidad del reactivo: Coeficiente de variacién 4.16% de hemoglobina = 0.62 gree.Descripcién de la Técnica Utilice sangre completa anticoagulada con EDTA, tome 20 ul. (microlitros) y diliyalos en un tubo que contiene exactamente 5 ml. de reactivo de Drabkin* (este procedimiento se hace por duplicado). Enjuague la pipeta 5 veces con el diluyente, tape y mezcle por inversién 5 veces. Los tubos conteniendo esta dilucién se deben preservar de la luz directa y conservar a temperatura ambiente hasta el momento de realizar la lectura. Identifique claramente cada tubo con el nimero de historia clinica y mimero de la muestra correspondiente a hemoglobina. Haga la lectura inmediatamente lleguen las muestras de nivel local. Al incorporarle al espectrofotémetro el factor** se obtiene digitalmente la lectura en concentracién de hemoglobine en gramos%. 4.2.7. Preparacién de Reactivos Reactivo de Drabkin: Bicarbonato de sodio (CO,HNa) 1 gr. Gianuro de Potasio (GNK) 0.05 gr. Forricianuro de Potasio {Fe (CN) .K,) 0.2 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Almacene en frascos color Ambar y guarde protegido de la luz, estable un mes. 4.2.8. Control de Calidad Control Hemotrol: Desviacién estandar: 0.207 gr.% Coeficiente de variacién 1.36% Coeficiente de variacién: 0.2 gr 4.2.9. Bibliografio ~ I. Davidsohn, J.B. Henry Diagnéstico Clinico por Laboratorio 6a. ed. Pag. 109, Editorial Salvat Barcelona 1978. * Haga’ la dilucién usando sangre capilar cuando no pueda practicar la venopuncidn. ** El factor determinado para la substancia medida a longitud de onda de $40 om.5. PRUEBAS SEROLOGICAS5.1. ANTICUERPOS DENGUE. 51.1. Técnica Utilizada Inhibicién de la hemaglutinacién (microtécnica). 5.1.2. Fundamento Se Hama Hi. la reaccién antigeno-anticuerpo por medio de la cual los anticuerpos especificos presentes en el suero inhiben la Hemaglutinacién H.A. id que tienen algunos virus de aglutinar eritrocitos 5.1.3. Equipo y Elementos Goteros calibrados 0.025 ml. ‘Asas de dilucién 0.025 ml. Microplacas con fondo en U Incubadora 37°C. 5.1.4. Reactivos Hematies de ganso Cloruro de eodio 1.5M. Acido Bérico 0.5 M. Hidréxido de sodio saturado Fosfato dibdsico de sodio 0.5 M. Fosfato monobésico de sodio 1.0 M. Solucién salina boratada pH 9.0 Ajustadores de pH. Albmina bovine (fraccién v) al 4% pH 9.0 Albdmina bovina (fraccién v) al 0.4% pH 9.0 Solucién Acido-Citrato-Dextrosa (ACD) Solucién dextrosa Gelatina-Veronal (DGV) Acetona 5.4.5. Colibracién Revisar la calibracién de las asas con papel secante diluter delibery tester). special (Microtiter 835.1.8, Descripeién de la Técnica Tratamiento de sueros con acetona En tubo de ensayo 100 x 13 mm coloque: Suero 2 gotas (0.05 ml.) NaCl 0.15M. 18 gotas Mozcle y afiada: Acetona fria_6 ml.* Centrifugue 30-60 segundos a 1.500 rpm. Decante con cuidado el sobrenadante y extienda ol sedimento on la parte inferior de la pared del tubo, deséquelo en una campana de vacio. Rehidrate el sedimento en 1.0 ml. de solucién salina boratada pH 9.0 con lo cual obtiene una dilucién 1:20 dol volumen original del suero, que queda lista para la Remocién de hemaglutininas de los sueros. A los sueros tratados adicione 1 0 2 gotas con gotero calibrado (0.025 ml.) de hematies de ganso 50% en DGV. Deje los tubos en bafio de hielo, agitando ocasionalmente, por 20 minutos. Centrifugue 10 minutos « 1.500 rpm. Decante ol sobrenadante que constituye el suero tratado con acetona en dilucién 1:20 listo para las pruebas. Los sueros ya listos se guardan congelados, Titulacién de los Antigenos. Prueba HA: Titule cada antigeno con todos los ajustadores de pH para determinar ol pH 6ptimo; incube todas las titulaciones a 37°C. Rehidrate el antigeno liofilizado 1:10 on albémina bovina 0.4%, repose durante 18-24 horas a 4°C para que se disperse. En una placa de microtitulacién coloque 1 gota (0.025 ml.) de albimina bovina en todos los orificios a excepcién de la primera columna. ‘A cada uno de los orificios de la primera y segunda columna agregue 1 gota (0.025 ml.) de antigeno diluido 1:10. Diluya con esa calibrada 0.025 ml. a partir del segundo orificio haste el sltimo. * Mientres el suero est& sometido a la accién de la acetona se coloca en bafio de hielo. 84Agregue a todos los orificios una gota (0.025 ml.) de albimina bovina 0.4%; agite suavemente para mozclar; a todos los orificios agregue 2 gotas (0.050 ml.) de hematies de ganso (0.25% on el respective ajustador de pH). Cubra la placa y coloque 30-40 minutos a 37°C. Efectie la lectura. Registre los rosultados asi Aglutinacién completa + Aglutinacién con anillo e Botén incompleto £ Bot6n bien formado ° Fl titulo del antigeno es decir 1 UHA es la més alta dilucién que produzca @ 0 + ol pH Sptimo, aquel donde se observa el titulo més alto, Inhibicién de la Hemaglutinacién (H.1.) Identifique las placas con los nimeros de las muestras @ examinar. Coloque une gota de albémina bovine 0. oxcopeién del segundo. "%0 en todos los orificios de la placa a Adicione 1 gota de suero (diluci6n 1:20) en el primero, segundo y tercer orificio. Con asa de dilucién calibrados 0.025 diluya a partir del tercer orificio hasta el iltimo. Adicione 8 todos los orificios a excepcién del primero 1 gota 0.025 ml. de dilucién do antigeno (que contenga 4-8 UHA). Titule el antigeno usado con HA en cada serie de sueros procesados. Cubra la placa y de 4°C por 18 horas aproximadamente. Saque y doje a temperatura ambiente por 15 minutos, adicione 2 gotas (con gotero 0.025) de suspensién de hematies de ganso (0.25% suspendidos en el ajustador de pH adecuado para el antigeno usado). Cubra la placa nuevamente ¢ incube a 37°C por 30-40 minutos. Efectie las lecturas correspondientes de acuerdo a los siguient: Aglutinacién completa Aglutinacién con anillo Bot6n incompleto Botén bien formado one+Primer orificio: Control de hemaglutininas del euero (debe mostrar botén bien formado); si no se presenta inhibicién de la hemaglutinacién el suero es considerado negativo, si aparece el titulo es dado por la dilucién mas alta que produzca botén formado. Coloque cada suero en tantas filas como antigenos use. En cada prueba incluya un suero control de titulo conocido y procéselo como si fuera muestra corriente. 5.1.7. Control de Calidad So controle el titulo del antfgeno mediante titulacién H.A. inclu! Control de hemaglutininas del suero on el primor orificio. Introduccién de un suero de titulo conocido con respecte al antigeno empleado. 5.1.8. Proparacién de Reactivos Hematies de Ganso. Obtenga méximo 20 ml. sangre de ganso macho, sangréndolos de la vena del ala o yugular con jeringa de 20 ml. y aguja No. 19 0 20 adicionada de 1.5 ml. de anticoagulante A.C.D. por cada 8.5 ml. de sangre. Lave tres veces los glébulos rojas con 3 volimenes de DGV (centrifugacién 1.500 rpm), después de la iltima lavada suspenda los glébulos en 3 voltimenes de D.G.V. y guarde a 4°C. Para utilizar los glébulos rojos centrifuguo la susponsién anterior on tubo de centrifuga graduado, lavéndolos 2 6 3 vaces con D.G.V. hasta que el sobrenadante no Prosente trazas de hemélisis, y diluya al 10% con DGV. Para las pruebas de HA y de HI prepare una dilucién al 0.25% con el ajustador do pH adecuado asi: Ajustador de pH 3.9 ml. ‘Suspensién glébulos rojos 10%, 0.1 ml. Gloruro de Sodio 1.5 M. Cloruro de sodio 87.675 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Guarde a 4°C. Acido Bérico (H3BO,) 0.5 M. Acido Bérico (HsBO3) 30.02 gr. ‘Agua destilada caliente 700 ml. Disuelva y enfrie a temperatura ambiente Agua dostilada complete 1.000 ml. Conserve a temperatura ambiente. 6Hidréxido de Sodio Saturado. Hidréxido de sodio 500 gr. ‘Agua destilada 500 ml. Disuelva, tape bien y deje on reposo varios dias para que sediments. el sobrenadante a un frasco con tapa hermética, titule y rotule anotando \contrada, esta os estable. Guarde temperatura ambiente. Fosfato dibésico de sodio (Na, HPO4) 0.5M Na, HPO, (anhidro) 70.99 gr. Agua destilada complete 1.000 ml. Disuelva en celiente y guarde a 4°C. Fosfato monobésico de sodio (NaH,PO,) 1.0M NaH,PO,.H,0 138.01 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Guarde Solucién salina boratada pH 9.0 Cloruro de sodio 1.5 M 80 ml, Acido Borico 0.5 M 100 ml. Hidréxido de sodio 1.0 M* 24 ml. Agua destilada complete 1.000 ml. ‘Vorifique el pH si no esté exacto ajastelo Guarde a 4°C. Albimina bovina (fraccién V) al 4% pH 9.0 Albimina bovina (fraccién V) 4 gr. Solucién selina boratada pH 9.0, 90 ml. Coloque la solucién salina boratada en un vaso y en la superficie la albimina bovina, deje en reposo hasta la disolucién de la albtimina, no agite, pu forma espuma. Ajuste el pH con NaH 2N y complete a 100 ml. con solucién salina boratada. Distribuya en volimenes de 10 ml. en 10 frascos de 100 a 120 ml. y cong Albdmina bovina (fraccién V) 0.4% pH 9.0 Albdmina bovina 4%, 10 ml. (un frasco del anterior) Solucién salina boratada pH 9.0, 90 ml. Guarde a 4°C. * Prepare el Hidréxido de sodio 1.0 Ma partir de e] hidréxido concen- trado. 07Solucién Acido-Citrato-Dextrosa (ACD) Acido Citrico (HyC,Hs07. H.0), 4 gr. Gitrato de Sodio (Na,C,H,0,. 2H;0), 11.26 gr. Dextrose, 11 gr. ‘Agua dostilada complete, 500 ml. Esterilice on autoclave por 10 minutos. Guarde a 4°C. Solucién Dextrose-Gelatina-Veronal (DGV) Acido dietil barbitérico (Veronel) 0.58 gr. Gelatina 0.60 gr. Barbiturato de sodio (Veronel Sédico) 0.38 gr. Cloruro de Calcio (CaCl,) anhidro 0.02 gr. Mg S0,. 7H20 0.12 gr. Cloruro de Sodio (NaCl) 85 gr. Dextrosa 10.0 gr. Disuelva el Veronal y le gelatina en 250 ml. de agua destilada (calor). Disuelva los otros reactivos en 650 ml. de agua destilada y ai @ la solucién de 1,000 ml. con agua destilada. en autoclave por 10 minutos. Guarde a 4°C. Ajustadores de pH. Prep4relos a partir de: a. Cloruro de sodio 1.5 M b. Fosfato dibdsico de sodio 0.5 M c. Fosfato monobésico de sodio 1.0 M Los pH resultantes anotados en el cuadro no son los valores de cada uno de los, ajustadores, sino los resultantes de mezclar un volumen del ajustador respective con un volumen igual de solucién salina boratada pH 9.0. Guarde a 4°C. lucién Madre pH RESULTANT (cantidades en ml.) 6.2 6.3 No Cl 15M 100 «100 Na, HPO, 0.5 M 62 92 Wol,PO, 1.0 M 169 154 Aguo destilada 1000 1000 885.1.9. Bibliografia = Clarke, D.H. and Casals, J. Techniques for hemagglutination and hema gglutination inhibition with arthropod-borne viruses, Amer. J. trop Med. Hyg. 7: 561-573, 1958. ~ Casals, J- Inmunological methods for animal viruses, in Methods in virology, Vol IIT Chapter 4, pags 113-198. K. Maramorosch and Hilary Koprowsky, Eds. Academic Press, New York and London 1967. - Hammon W. NeD and Sather, G.E, Arboviruses, in diagnostic procedures for viral and rickettsial infection, Chapter 6 pgs. 227-280. Bdwin H. Lennette and Nathalie J. Schmidt, Eds. American Public Health, Association, Inc. 1969. ~ Juliao Ruiz Oscar Primer Curso Internacional de Diagndstico Serolégi- co del Dengue. Instituto Nacional de Salud. Bogota, Sept. 1978. 895.2. ANTICUERPOS CONTRA ENTAMOEBA HISTOLYTICA Técnica Utilizada Prueba inmunoquimica de floculacién de Latex con antigeno de Entamoeba Histolytica*. 5.2.2, Fundamento Se basa en la aglutinacién de una suspensién de Latex; cuyas particulas so mezclan con el antigeno derivado del cultivo axénico de Entamoeba Histolytica. Esta susper contra E. Histolytica aglutina on presencia de suero con anticuerpos especificos Sensibilidad: Equivale a una titulacién 1:512 por el procedimiento de hoemaglutinacién indirect 5.2.3. Equipo y Elementos Bafio de maria 56°C Pipetas de Pasteur Peras de caucho* ‘Lémina para la reaccién 5.2.4. Reactivos y Elementos Suero control y negative Suero control positive Antigeno de Entamoeba Histolytica* Suspensién de Latex en solucién salina* Aplicadores de madera Muestra: Suoro claro; cualquier particula se remueve por centrifugecién; los pigmentos de hemoglobina o bilis no interfieren. * Miles Laboratories Divisién ames Company, el Kit viene con los reac~ tivos listos para uso.5.2.5. Calibracién La bacteriéloga calibra el tamaiio de las gotas para Ja reaccién; debe ser igual. 5.2.6. Descripcién de la Técnica Antes de efectuar la prueba proceda a calentar los sueros a examinar, en bafio. maria a 56°C durante 20 minutos. Marque la lémina de reaccién con control positivo (4), negative (-), y el nimero de cada suero. Coloque una gota de Latex-antigeno de 8 mm de didmetro, poniendo en contacto la pipeta con la Iémina para reaccién en cada orificio que va a usar para controles positive, negativo y cada suero. Con otra pipeta deposite una gota de suero, 0 control al lado de la anterior sin mezclarlos. Con un aplicador de madera mezcle las dos gotas completamente; manualmente rote la lémina de reaccién intermitentemente durante cinco minutos. Interpretacién de Resultados HOMOGENEA NEGATIVO AGLUTINACION POSITIVO Una reaccién positiva se obtiene cuando ol Latex aglutina durante cinco minutos posteriores a la mezcle (ver ilustracién). Una reaccién negativa se abtiene cuando el Latex no aglutina cinco minutos después de la mezcla (ver ilustracién). 5.2.7. Control de Calidad Se hace introduciendo en cada lote de muestras a examinar sueros de reactividad conocida5.2.8. Preparacién de Reactivos Preparacién de sueros control: Reconstituya los sueros control positivo y negetivo mezclando cada uno con 0.2 mi, de agua destilada on las ampolletas correspondientes. Preparacién de Antigeno: ‘Transfiera la suspensién de Latex a la ampolla que contione el antigeno amebiano liofilizado y mezcle completamente para disolverlo en su totalidad. Reconstituya los reactivos y déjelos reposar 5 minutos antes del uso. 5.2.9. Bibliografia = Morris M.N. Powell S.J. Elsdon ~ Dew R. Latex aglutination test for Invasive Amebiasis. The lancet 1 (1362-1.363) Junio 27 de 1970. ~ Monroe L.S. Korn E.R. Fitzwilliam, $.J. A Comparative study of the @iagnosis of amebic Liver Abscess; A.M. J. Gastro, 58-1 (52-57) Ju- lie 1972. ~ Sodeman W.A. y Dowda, NC. Rapid Serological Methods for the demostra, tion of Entamoeba Hystolitica Activity: Gastroenterology 65-4 (604 607) 1973. 25.3. ANTICUERPOS CONTRA POLIO 5.3.1. Técnica Utilizada Neutralizaci6n en células por ol método de microtitulacién 5.3.2. Fundamento Los virus de polio tipo 1, Il y III al ser inoculados y multiplicarse on cultivos celulares producen un efecto citopatogénico que demuestra su presencia. Al poner en contacto ol virus con un sueto que tenga anticuerpos neutrelizantes de Polio inocular esta mezcla de virus-suero en cultivos celulares no se produce efecto citopatogénico por haberse efectuado la neutralizacién del virus por los anticuerpos. Esta es la lamada neutralizacién en oélul 5.3.3. Elementos Empleados Bafio maria 56°C Incubadora 36°C Placas para microtitulacién fondo en U {estériles) Asas de dilucién calibradas 0.025 ml. Goteros calibrados 0.025 ml. Goteros calibrados 0.050 ml. 5.34. Reactivos Solucién salina balanceada (BSS) pH 7.27.4 Suero fetal bovino (SFB) Medio 199 Células LLCMK2 Dilucién de virus de Polio tipos I, II y IIT que contengan 100 TCID 50 Suero control positivo titulo conocido Suero control negativo 5.3.5. Calibracién Revise la calibracién de las asas con papel secante especial (Microtiter diluter delivery tester). 5.3.6. Descripcién de la Técnica Todo el matorial a usar en esta técnica debe estar perfectamente estéril y todos los pasos se efectian lo més asepticamente posible. 53Inactive los sueros y controles en bafic maria a 56°C durante 30 minutos. Haga diluciones de los sueros (muestras) y controles* positives y negativos con factor de dilucién 2 (1:2 @ 1:256) en solucién salina balanceada (BSS) usando asas de dilucién calibre 0.025 ml. (ver esquema). Este procedimiento de dilucién se efectaa por triplicado para cada tipo de polio I, fy IML Ademés, incluya un control de suero sin diluir de cada muestra para prueba de toxicidad de los sueros sobre las células. Adicione a cada orificio a excepcién del control de suero, 0.025 ml. de una dilucién de virus que contenga 100 TCID 50** determinados por titulacién previa de los virus polio tipo I. II y III en cultivo de tefidos y calculados segin el método de Reed-Muench. En el control de suero fetal bovino reemplace la adicién de dilucién de virus por 0.025 ml. de medio 199. Incube por una hora a 37°C. Suspensién de células: Suspenda las células LLCMK en medio 199 con (SFB) suero fetal bovino 5% para obtener una concentracién de 200.000 células por ml. Agregue a cada orificio 0.025 ml. de esta suspensién de células. Para confirmer el titulo del virus dentro de la prueba, titdlelo agregando 0.025 ml. de las diluciones del virus (que contengan 1.000, 100 y 10 TCID 50) 4 0.025 ml. de medio usando 6 orificios por dilucién. Adicione 0.05 ml. de medio 199 con 5% de SFB en cada orificio y 0.05 ml. de aceite mineral estéril para evitar alcalinizacién del medio por pérdida de CO2 producido por el metabolismo colular***. Coloque en estufa a 36°C por diez dias. Observe las placas al microscopio a las 24 horas para ver la morfologie celu- lary cada tercer dia para efecto citopatogénico; al décimo dia haga la lectura final y en base a éata, reporte los resultados. 8.3.7. Control de Calidad Esté incluido en doscripcién de le técnica. 5.3.8. Preparacién de Reactivos Solucién Salina Balanceada (BSS 10X): Solucién I. CL; Ga 1.85 gr. ‘Agua destilada 200 ml. * de tftulo conocido. #* 100 TCID 50 = 100 dosis infectantes 50 para cultivo de tejidos. ‘#* Si existe incubadora de CO, no es necesario agregar el aceite mine- ral. oA,QQQ0OOQ0QQO0: OOOOSOOOOOOO-Solucién Il. NeHPO: anhidro 0.47 gr. KH,PO, 06 ‘Agua destilada 400 ml. Solucién HI. Dextrosa 10 gr. Cloruro de sodio 80 gr. KCl 4gr. Mg $04.7 H,0 2 gr. Agua destilada 400 ml. Solucién IV. Rojo de fonol 1 gr. ‘Agus destilada 100 ml Prepare cada solucién por separado, luego mezcle la solucién II con la III y afiada la I lentamente y agitando, Adicione rojo de fenol, 20 mi. Complete a 2.200 ml. con agua destilada, afiada 6 a 8 ml. de cloroformo. Medio 199 Para la preparacién siga las instrucciones del fabricante. 5.3.9. Bibliografia ~ Lieras P. Alfredo MD; Juliao Ruiz Oscar MD. Estudio de Inmunidad para Polio tipo I, II y 111 por el método de neutralizecion en cultivo de tejidos_en microtéenica. Boletin de Laboratorio Ciinico 1968. = Lennette, 5.H., and Schmidt, N.J., eds. 1979. Diagnostic procedures for viral, rickettsial, and chlanydial infections. 5 th ed. Amer. Pub. Hith. Assoc. Washington, D.C. %65.4, ANTICUERPOS CONTRA RUBELLA 5.4.1. Técnica Utilizada Inhibicién de la homaglutinacién H.1. 5.4.2, Fundamento a HL. la reaccién antigeno-anticuerpo por medio de la cuel los jecificos presentes en el suoro inhibon la Hemaglutinaci6n H.A. Hemaglutinacién: Propiedad que tienen algunos virus de aglutinar eritrocitos de diferentes especies. 5.4.3. Equipo y Elementos Bafio serolégico 56°C Centrifuge Placas pare microtitulacién Goteros 0.025 ml. Asa: dilucién de 0.025 ml. ‘Tubos de centrifuga graduados ‘Tubos de ensayo pequetios Balones aforados 1.000 ml. Gradillas 5.4.4, Reactivos Kaolin suspensién 250 mgr HSAG Buffer Antigeno de Rubella Suero control nej Suero control positive {titulo conocido) titulo alto Suero control positivo (titulo conocido} titulo bajo Glébulos rojos humanos “0” Positivo 4% 5.4.5. Calibracién Ver descripcién de la técnica. 3.48. Descripeién de la Técnica Remocién de inhibidores inespecificos. 7‘Mezcle: Suero 0.1 ml. Kaolin 250 mg% 0.3 ml. Reposo 20 minutos a temperatura ambiente. Centrifugue a 3.000 RPM durante 10 minutos. Transfiera el sobrenadante a otro tubo, inactive incubando en bafio maria a 56°C durante 30 minutos. El suero asf tratado queda en dilucién 1:4 y puede guardarse hasta 2 semanas de 4°C a 6°C, sin disminuir ol titulo de anticuerpos. Antes de iniciar la prueba de titulacién de anticuerpos H.I. es indispensable titular el antigeno quo se va a usar para obtener 4 unidades hemaglutinantes que se utilizan en la prueba, para esto se hace la prueba de hemaglutinacién (H.A.). Titulacién del Antigeno (H.A. test): Roconstituya el antigono liofilizado bajo condiciones estérilos con 1 ml. de agua destilada inyecténdola con una jeringa a través del tapén de caucho sin destapar el frasco. Si esté bien tapado la suspensién puede guardarse hasta 14 dias conservada de 46°C, sin variacién on el titulo. El correcto resultado de la prueba depende de la edad de los eritrocitos. El test HA se puede hacer por macro o micrométodo con volimenes de 0.2 ml. y 0.025 ml. respectivamente. En placa para microtitulacién: Dispense 0.025 ml. de Buffer HSAG on cada orificio usando Ia placa horizontalmente (12 orificios) (ver esquema titulacién de Antigeno HA). Adicione 0.025 ml. de antigeno al primer orificio, mezcle con asa de dilucién y transfiera 0.025 ml. al siguiente orificio; mezcle asi sucesivamente hasta el ultimo, de éste descarte 0.025 ml. Goloque 0.025 ml. de Buffer HSAG en cada orificio, después 0.025 ml. de suspensién de glébulos rojos al 0.25%. Control de glébulos rojos En dos orificios coloque: Buffer HSAG 0.05 ml. Suspensién de glébulos rojos 0.025 ml. Mezcle y deje a temperatura ambiente 2 a 3 hor protegido de la vibracién. Lectura de los resultados: Una (Unidad HA) unidad hemaglutinante 03 la mAs alta dilucién de antigeno donde se observa aglutinacién, en el ejemplo 1 UHA esté en la dilucién 1:256. 98RUBELLA QOOHHGOAORESULTADOS DE H.A. ©0800 80800606 ke 118 32 68 128 286 BI 1028 Dilucién de Antigeno. Para la prueba HI se requiere una concentracién de 4 UHA (4 unidades Hemaglutinantes) Ejemplo: ‘Titulo dol antigeno 1:256—1 UHA Titulo del Antigeno “256 = a4 = 4 UHA Unidades HA deseadas 4 El antigeno puro se diluye 1:64 para obtener (4 UHA) Control de Glébulos rojos: No debe haber aglutinacién Descripcién de la Prueba H.I. En placas para microtitulacién: Coloque 0.025 ml. de Buffer, en cada Orificio de la Lémina. Adicione 0.025 ml. de suero absorbido al primer orificio (ver esquema titulacién anticuerpos H.l.). Con asa de dilucién mezcle y transfiera 0.025 ml. al segundo orificio, mezcle y transfiera 0.025 al tercero y asi sucesivamente hasta el iltimo, de éste descarte 0.025 al. Con gotero calibrado agregue 0.025 ml. de antigeno (conteniendo 4UHA) a todos. los orificios, mezcle. Incube a temperatura ambiente y protegido de la vibracién, durante cuatro horas 0 toda la noche. Lea provisto de una lupa sobre fondo blanco y con buena luz. 100QOQOQQOOOOOOOOResultados: RESULTADOS DE HI. TEST QQQQOOOO 5.4.7. Control de Calidad Ver en descripcién de la técnica los controles inclufdos. 5.4.8. Preparacién de Reactivos Buffer HSAG El balén aforado de 1.000 ml. Solucién salina HEPES* 200 ml. Albimina bovina (200 mg/ml.) 50 ml. Gelatina solucién 100 ml. Agua destilada complete 1.000 ml. El pH de esta solucién debe ser 6.2 + 0.05 de lo contrario ajiistelo con NaOH 0 HCLIN; guarde de 4 a 6°C; si permanece estéril tiene una estabilidad de 2 meses. Control positivo y control negativo. Se reconstituyen de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Solucién de glébulos rojos 0.25% Obtenga glébulos rojos humanos 0 + con anticoagulante ACD. Lavelos con Buffer HSAG hasta obtener un sobrenadanete transparente incoloro, si requiere mas de 3 lavadas, descarte los glébulos y obtenga nuevos; deben estar completamente libres de hemélisis, cualquier indicio de ésta altera la prueba. * N+2 Hidroxy ethyl Piperazine N - 1/4 ethane Sulfonic acid. 102Una vez lavados prepare una solucién al 4% en Buffer HSAG, de esta dilucién haga otra 1:16 y dsela para la prueba, obteniendo una concentracién final de 0.25%, efectie este proceso diariamonto. 54.9. Bibliografia ~ Behring Institute. Rubella Hemaglutination Inhibition test. (98) - Williams W y otros. Hematologfa tomo I Editorial Salvat. Barcelona 1975, ~ Clarke, D.H. and Casals, J. Tecniques for hemagglutination and hema~ gglutination inhibition with arthropod borne viruses. Amer J. trop med. Hyg. 7: (561-573) 1958. - Casals, J. Inmunological methods for animal viruses, in Methods in Virology Vol TIT. Chapter 4 (113-198). K. Maramorosch and Hilary Koprowski, Eds. Academic Press, New York and London 1967. ~ Hammon W. McD and Sather, G.E. Arboviruses in Diagnostic. Procedu- res for Viral and Rickettsial infections, Chapter 6 p&g. 227-280. - Inmunology Series #2 Standardized Rubella Hemaglutination-Inhibition gest. Center for Disease Control Publications, Atlanta, Georgia. October 1970. - Kenneth Hermann M.D. Serology of: Toxoplasmosis, Rubella, Cytomegalic inclusion disease, herpes simplex. (Center for disease control), ‘Atlanta. Georgia March 1977. 1035.5. ANTICUERPOS FLUORESCENTES CONTRA SIFILIS FTA — ABS* 5.5.1. Técnica Utilizada Anticuerpos Fluorescentes Anti-Treponema Pallidum suero. 5.5.2, Fundamento Se basa en la investigacién de anticuerpos especificos anti-Treponema Pallidum en suero absorbido, utilizando la técnica indirecta de Inmunofluorescencia. 5.5.3. Equipo y Elementos Microscopio de fluoresconcia con campo oscuro Incubadora ajustable 35°-38°C. Lépiz punta de diamante Guia para marcar los circulos de 1 cm. de didmetro sobre las laminas portaobjetos Tabla para colocar las lamina: Camara himeda Asa bacteriolégica No. 26 de platino de 2 mm. Papel filtro Léminas portaobjetos 1 x 2 pulgadas, extremos esmerilados y 1 mm. de espesor. Laminillas cubreobjetos 22 x 22 Cajas de coloracién con canastilla removibles para los portaobjetos Aplicadores de vidrio con los extremos pulidos 5.5.4. Reactivos Aceite de inmersién para fluorescencia ‘Antigono de Treponema Pallidum** Sorbente FTA-ABS** Antiglobulina humana marcada con Isotiocianato de Fluoresceina (conjugado)** Solucién tampon de Fosfato (SSB) pH 7.2 + 0.1 * Rxtractado del Manual de Procedimientos Serolégicos para sffilis Microbiologia e Inmunologfa INS. +* Reactivos preparados por el Laboratorio de Microbiologia INS. 104Tween 80 Liquide de montaje Acotona 5.5.5. Calibracién La calibracién de la persona se hace mediante un adiestramiento intenso antes de efectuar las determinaciones, 5.5.6. Descripcién do la Técnica Preparaciones Preliminares. a) Preparacién de las léminas con el antigeno de T. Palli jum: Mezcle bien la suspensién del antigeno mediante una pipeta provista de un bulbo de caucho, succione y expela la suspensién a través de la pipeta 10 veces, con el objeto de romper los grumos y obtener una suspensién uniforme de Treponema Observa en campo oscuro la suspensién, antes de preparar las léminas; si todavia hay grumos, mezcle nuevamente. Sobre portaobjetos muy limpios y con Iépiz de punta de diamante sefiale dos cireulos de 1 cm. de didmetro interior; con una gasa limpie el portaobjetos para remover las particulas de vidrio; comercialmente se consiguen los portaobjetos ya listos, con los circulos. Con asa bacteriolégica de platino No. 26 y 2 mm. de didmetro coloque la muestra on cada circulo extendiéndola uniformemente. La experiencia indica la mayor ‘© menor cantidad de suspensién necesaria para obtener buenas preparaciones, déjelas secar durante 15 minutos. Fijelas en. acetone por 10 minutos y séquelas completamente al aire (fije no ms de 60 preparaciones con 200 ml. de acetona). Guarde las preparaciones fijadas a ~ 20°C 0 menos. Las preparaciones fijadas y congeladas pueden guardarse indefinidamente, siempre y cuando se obtengan resultados satisfactorios con los controles. No es conveniente congelar y descongelar las preparaciones de antigono. b) Preparacién de los Sueros: Sueros bacteriolégicamente contaminados o hemolizados no son satisfactorios Para esta pruoba Caliente los sueros problema y los sueros control a 56°C por 30 minutos en bafio maria, antes de efectuar la prueba. c} Controles: Conserve y use los sueros control segin las recomendaciones de la casa productora.Propare los controles de suero total como se sefiala bajo Sueros Control para la prueba FTA-ABS. Toda prueba debe incluir los siguientes controles: Control Reactivo 4+: Es un suero reactivo o una dilucién de suero reactive que demuestra un grado fuerte (44) de Fluorescencia cuando se diluye 1:5 en SSB y una ligera reduccién del grado de fluorescencia cuando se diluye 1:5 en sorbente. a) Con pipeta de 0.2 ml. mida con la mitad inferior 0.05 ml. de suero control reactivo dentro de un tubo que contenga 0.2 ml. de SSB. Mezcle bien por lo menos 8 veces. ) Con la pipeta de 0.2 ml. mida con la mitad inferior 0.05 ml. de suero control reactive dentro de un tubo que contenga 0.2 ml. de sorbente; mezcle bien por lo menos 8 veces. Suero Control de Reactividad Minima (1 +): Es una dilucién de suero control reactive que muestra un grado minimo de Fluorescencia para dar un resultado “reactivo” y que debe usarse como el estandar de lectura. El suero control reactivo (4+) puede usarse para este control cuando se diluye en SSB segiin instrucciones. Suero Control no Especifico: Es un suero sifilitico que tiene un grado de fluorescencia no especifica de por lo menos 2- en FTA cuando se diluye en SSB al 1:5 0 4 una dilucién més alta. Con una pipeta de 0.2 ml. mida con la mitad inferior 0.05 ml. de suero control reactivo dentro de un tubo que contenge 0.2 ml. de SSB; mezcle bien por lo menos 8 voces Controles de Coloracién no Especifica. a) Preparaciones de antigeno tratadas con 0.03 ml. de SSB. b) Preparaciones de antigeno tratadas con 0.03 ml. de sorbente. Los controles de (4+), no especifico y de coloracién no especifica se incluyen con el propésito de controlar los reactivos y las condiciones de la prueba. El control de reactividad minima (1+), se incluye como estandar de lecture. Si observa una disminucién gradual de la fluorescencia en los controles reactivos a lo largo de un periodo de tiempo, es indicio de un deterioro en los sueros control, en los reactivos 0 en la fuente de luz. 106Patrén de Controles: a. Diluci6n 1:5 SSB Rat b. Diluci6n 1:5 sorbente R (44-34) Reactivo Minimo: (1+) Rt Suero no Especffico: a. Dilucién 1:5 SSB R (244) b. Dilucién 1:5 Sorbente N a Coloracién no Especffica: a. Antfigeno SSB + conjugado N b. Antigeno-Sorbente + Conjugado N Las pruebas en que estos controles no dan los resultados anteriores, deben ser consideradas no satisfactorias y los resultados de los sueros problema no pueden ser * informados. Prueba de FTA-ABS en Suero Identifique correctamente las preparaciones, numeréndolas en la porcién esmerilada dela lémina, lépices comunes sirven para este efecto, numere los tubos que correspondan a los sueros control en los cuales va a efectuar la prueba, coléquelos on una gradilla. Prepare controles reactivos (4+), reactivos minimos (1+), y suero no especifico de SSB o sorbente, de acuerdo a lo descrito bajo “Controles”. Coloque 0.2 ml. de sorbente en cada uno de los tubos necesarios para los sueros problema, con una pipeta de 0.2 ml. y midiendo con la mitad inferior agreguo 0.05 ml. do suero calentado dentro del tubo correspondiente, mezcle por lo menos 8 veces. Cubra las preparaciones de antigeno de los controles con diluciones de suero reactivo (44), 0 reactive minimo (1+) y suero no especifico, cubra las preparaciones de antfgeno correspondientes a los controles de coloracién con 0.03 mi. de SSB y 0.03 ml. de sorbente respectivamonto y las correspondientes a los sueros problemas con 0.93 ml. de la dilucién respectiva. Evite la evaporacién colocando las preparaciones en cémara himeda, incube a 35°-37°C por 30 minutos. Procedimiento de lavado: a) Coloque las preparaciones en las canestillas de lavado y lévolas bajo chorro de SSB por 5 segundos. 107b) Sumorja la canastilla dentro de la caja de coloracién con SSB y déjela por 5 ‘minutos. ©] Agite las preparacionos répidamente en la SSB por lo menos 10 veces sacéndolas e introduciéndolas on le solucién. 4d) Repita los pasos “b" y “c” on nuova solucién. ¢} Lave las preparaciones bajo un chorro de agua destilada por 5 segundos. Seque las preparaciones suavemente con papel filtro apropiado, para remover todas las gotas de agua. Prepare la dilucién de trabajo del conjugado de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Coloque aproximadamente 0.03 ml. de conjugado diluido sobre cada una de las muestras: extiéndalo cuidadosamente con una varilla de vidrio de tal manera que cubra completamente la muestra. Proceda & colocar nuevamente en. cémara htimeda, incube a 35-37°C por 30, minutos y efectie el procedimiento de lavado y secado, Monte inmediatamente los portaobjetos colocando sobre cada muestra una gota de medio de montaje y coloque el cubreobjeto Examine las preparaciones tan pronto como sea posible. Si se presenta una demore coloque las preparaciones on cuarto oscuro y les dentro de las 4 préxima: horas. Observe las preparaciones microscépicamente, usando iluminacién con lémpara de mercurio y objetivo seco de gran aumento; para trabajo de rutina la ‘comb inacién de un filtro exitador BG12 de 3 mm de espesor y un filtro barrera OG1 0 su equivalente es satisfactorio. Observe las muestres no reactivas al campo oscuro con luz de tungsteno, con el objeto de verificar la presencia de Treponema. Use el control de reactividad minima (1+) como control estandar de lectura, informe la intensidad de la fluorescencia de los Troponemas de acuerdo a le tabla siguiente: Tntensidad de Pluorescencia Informe Moderada a fuerte Reactivo (R) rr Equivalente al control de reactividad minima (1+) Reactivo (R) + Débil, pero afin fluorescente, menos que el control (1+) Borderline B+ Negativo o vagamente visible No reactivo (N), 108NOTA: Todos los sueros que muestran un grado de fluorescencia 1+ 0 menos. deben ser probados nuevamente. Cuando un suero problema que inicialmente dié una lecture 1+ 63 nuevamente probado dando una lectura 1+ 0 més debe sor informado como “Reactive”. Informe los demés resultados como “Borderline”. Los problemas no fluorescentes {no reactivos) no deben ser probados de nuevo. Lectura Prueba 14 0 mas 1+ 0 menos 1+ <1+, 0 menos Sugerencia que debe adicionarse @ los informes de pruebas con resultados “Borderline”. El informe “‘Borderline" de la prueba FTA-ABS realizada en el Laboratorio de Microbiologia INS. significa que el resultado no debe ser interpretado ni como reactivo, ni como no reactivo y se solicita una nueva muestra para FTA-ABS. Sise trata dela segunda muestra de la misma persona y el resultado es de nue- vo “Borderline”, es absolutamento imposible determinar si la persona tiene o no evidencia serolégica de infeccién sifilitica. Se sugiere una revisién cuidadosa de la historia de la persona y de los hallazgos del examen fisico, el diagnéstico reposa necesariamente sobre historia clinica en virtud de los hallazgos serolégicos de tipo “Borderline”. 5.5.7. Control de Calidad Ver en descripcién de la técnica los controles incluidos. 5.5.8. Preparacién de Reactivos Antigeno: Treponema Pallidum a. El entigeno para la prueba FTA-ABS es una suspensién de Treponema Pallidum (Cepa Nichols) extraida de tejido testicular de conejo. Dicho extracto debe contener un mfnimo de 30 Treponemas por campo, bajo objetivo seco de gran aumento; este antfgeno puede guardarse de 6* a 10°C, o procesarse por liofilizacién. 109b. Guarde el antigeno liofilizadode6* a 10°C y pa instrucciones de la casa productora. usarse rehidrételo segdn c. Descarte toda suspensién de ant{geno, si esté contaminada con bacterias 0 no tiene la adecuada reactividad con los sueros control. Sorbente FTA-ABS a. El sorbente es un producto estandarizado preparado a partir del cultivo Treponema de Reiter. Puede adquirirse comercialmente, en forma liofilizada o liquida. b. Rehidrate el sorbente liofilizado, consérvelo segin las instrucciones de la casa productora. Antiglobulina Humana marcada con Isotiocianato de Fluor ina (conjugado). a. El conjugado para esta prueba debe ser de calidad comprobada. Pruebe cada nuevo lote de conjugado para determinar su titulo de trabajo y para verificar su reactividad estandar y las caracteristicas de coloracién no especifica. b. Guarde el conjugado liofilizado de 6° a 10°C. Una vez rehidratado distribayalo en cantidades no menores de 0.3 ml. y consérvelo en congelador a - 20°C 0 menos. Para efectos précticos un conjugado con titulo de trabajo de 1:400 0 mayor, puede diluirse 1:10 con solucién salina Buffer (adicionada de Merthiolate al 1:500) antes de guardarse. c. Cuando descongele el conjugado para su uso, no debe volverlo a cong’ consérvelo de 6" a 10°C. Este puede usarse hasta tanto la reactividad con los sueros controles sea satisfactoria, d. Cuando note un cambio en la reactividad, el conjugado en uso debe ser retirado para determinar si este es el factor que esté produciendo dicho cambio. Solucién Salina Tampén do Fosfato (SSB) pH 7, 2+0.1. Férmula para un litro: NaCl 7.65 gr. Na,HPO 0.124 gr. KH,PO, 0.21 gr. Agua destilada complete, 1.000 ml. Determine el pH de cada lote de solucién salina tamp6n para FTA-ABS. Deseche las soluciones con pH fuera del rango estipulado (7,2 + 0.1). Tween 80. Para preparar SSB con 2% de Tween 80 caliente los dos reactivos a 56°C en bafio maria 10A 98 ml. do SSB agrogue 2 ml. de Tween 80 con pipeta, teniendo cuidado de medir exactamente sin mezclar con la pipeta. Esta solucién debe tener un pH 7.0 - 7.2, Determine el pH periddicamente ya que la solucién puede variar hacia pH dcido. Conserve la solucién a 4°C, descarte la solucién. bserva precipitados u ocurren cambios de pH Liquido de montaje. Consiste en una parte de SS B pH 7.2 y 9 partes de glicerina pura. 5.5.9. Bibliografia. ~ Instituto Nacional de Salud. Microbiologia e Inmunclogia._Manual de Procedimientos Serolégicos para diagnéstico de Sifilis.pogota 1976: - U.S. Department of Healt, Education and Welfare. Manual of test for Syphilis, 1969, C.D.C. Atlanta. Georgia. m5.6. ANTICUERPOS CONTRA TOXOPLASMA 5.6.1. Técnica Utilizada Inmunofluorescencia indirecta para Toxoplasma. 5.6.2. Fundamento Investigacién de anticuerpos espectficos contra utilizando la técnica indirecta de Inmunofluorescencia. 5.6.3. Equipo y Elementos Microscopio de fluorescencia Filtro excitador BG-12 Filtros oculares K 510-K530 Lémpara de mercurio HBO 200 Placas de microdilucién Pipetas 0.05 para microdilucién ‘Asas para microdilucién de 0.05 ml Léminas porta-objetos Corning Process Clean Laminillas cubreobjetos 22 x 40 Pipetas de Pasteur Peras de caucho Incubadora 37°C Pipetas 0.02 mi, 0.5 ml. y 1 ml. Lépiz de cera Marcadores Vasos de precipitado Papel de filtro Cémara hiimeda Cajas para coloracién 5.6.4. Reactivos Toxoplasma en suero Conjugado: Gama globulina antihumana conjugada con Isotiocianato de Fluoresceina*. Solucién salina buffer fosfato (PBS) pH 7.6 Buffer glicerol pH 9.0 Antigeno de toxoplasma Azul de Evans solucién stock 1% * Producido por el laboratorio de Microbiologia del INS. 125.6.8. Calibracién Rovise la calibracién de las asas con papel secante (Microtiter diluter delivery tester). 5.6. Descripeién de la Técnica Dilucién del suero: Marque las places para microdilucién, asi: Asigne para el control y cada uno de los sueros desconocidos una hilera vertical de 12 orificios (ver diagrama), en el sentido opuesto de la lémina marque las diluciones dobles progresivas de cada muestr Con un gotero de 0.05 adicione 0.05 ml. de PBS-pH 7.6 a cada orificio vertical. Coloque en el primer orificio correspondiente 0.05 de suero sin diluir, con una. asa de dilucién de 0.05 ml., prepare diluciones con factor 2 hasta el iltimo orificio. Las diluciones 1:16, 1:64, 1:256, en la prueba. 024, 1:4.096 y 1:16.984 son las usadas Preparacién de las l4minas con el antigeno: Rotire del congelador las preparaciones con el antigeno y descongélelas. Lave las léminas con un chorro suave de agua destilada a fin de no desprender ol antigeno. Seque las laminas con cuidado usando papel absorbente o aire seco. Marque las léminas con Idpiz marcador. Identifique el control en esta forma: Control ( - } Ngativo: Suero negative usado en las diluciones 1:4 y 1:16. Control de conjugado: Agregue PBS a dos preparaciones. Bjemplo: 13OOOOOOOOOOOO- DOODBOOOOOOS:Marque las preparaciones de la segunda lamina control como sigue: Control positive (+ }: Haga cuatro preparaciones con sueros de titulos conocidos: 1:16, 1:64, 1:256, 1:1.024, NOTA: Para mayor seguridad el control de suero se usa en diluciones con factor 2 y el suero rutina en diluciones con factor 4. Marque las preparaciones on la lémina y coléquelas sobre toallas himedas con el nimoro de identificacién hacia arriba. Adicione el suero apropiado en las léminas control; use una pipeta Pasteur para cada suero y agregue Ja dilucién a cada una de las preparaciones en sentido descendente. Ejemplo: Con una pipeta Pasteur agregue una gota de suero negativo de diluciones 1:4 y 1:16, a las correspondientes preparaciones. Adisione tia 1:16 Adicione PBS Pre} e cuatro diluciones de cada suero desconocido, asi: Gon una pipeta Pasteur transfiora en este orden una gota de les diluciones: 1:1024, 1:256, 1:64 y 1:16 del primer suero desconocido, (de las diluciones hechas en el microplato) cubriendo el circulo de la preparacién donde esté el antigeno. Una vez el suero y los controles estén en las laminas tapelas y coléquelas en incubadora a 37°C, durante 30 minutos. Aliste cuatro vasos de precipitado (con capacidad superior a 100 mi.) parcialmente Ilene 3 de éllos con solucién PBS pH 7.6 y uno con agua destilada mSCuando las laminas estén listas juéguelas en agua destilada con chorro si que no caiga directamente sobre la preparacién, luego sumérjalas sucesivamente en los tres vasos de precipitado con PBS pH 7.6, séquelas con papel absorbente 0 con aire y coléquelas en los recipientes que contienen toallas himedas (camara himeda*).. Coloque una gota de conjugado antihumano titulado y diluido en azul de Evans 1/10.000 con pipeta Pasteur en cada uno de los circulos de la preparaci6n, tape nuevamente e incube a 37°C por 30 minutos en incubadora. Retirelos y juague nuevamente en un chorro de agua destilada que no caiga directamente sobre la preparacién, luego sumérjala sucesivamente en los tres vasos de precipitado con PBS pH 7.6 y por tltimo en el que contiene agua destilada. Seque las laminas. Goloque una pequefia gota de Buffer-glicerol pH 9, en cada preparacién y cubra con una laminilla cubreobjeto: Observe al microscopio de fluorescencia con objetivo 100 X. Examine primero las laminas de control y lea cuidadosamente la descripcién de la reaccién positiva y negativa a continuacién. Positivo (+): Es positivo cuando el tono amarillo-verdoso se oxtionde en toda la periferia e interior del pardsito. Esta reaccién puede ser suficientemente intensa en diluciones bajas de un suero fuertemente positivo. En diluciones altas la coloracién de la periferia tiende a formar un halo hacia el interior del pardsito. PosiTivo ‘Amar ilo vera an positive * Para colocar las 14minas se usan cajas de petri provistas de toallas de papel héimedas. m6Negativo ( - }: Es negativa le reaccién cuando no da fluorescencia amarillo-verdoso alrededor de la periferia del organismo, también se considera negativa, cuando solo un extremo del organismo da fluorescencia, se llama coloracién polar y ocurre en diluciones bajas y desaparece en diluciones 1:64. NEGATIVO \ cn soe 5.6.7. Control de Calidad Ver en descripcién de la técnica los controles incluidos. 5.6.8. Preparacién de Reactivos Buffer-Fosfato-Salina PBS pH 7.6 (0.01M) A. Solucién concentrada (10X) Na,HPOs (anhidro) 12.96 gr. NaHPO, (H;0) 1.80 gr. Cloruro de sodio 85 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. B, Solucién de trabajo Solucién concentrada (10X) 100 ml. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Ajuste el pH con NaOH o HCl. 0.1N si Buffer Glicerol pH 9.0 1. Buffer fosfato pH 9.0 Na;HPO; anhidro 28.4 gr. ‘Agua destilada complete 1.000 ml. Ajuste @ pH 9.0 72. Buffer-Clicerol pH 9.0 Buffer Fosfato pH 9.0, 1 volumen Glicorol, 9 volimenes Ajuste a pH 9.0 ‘Azul de Evans 1% ‘Azul de Evans polvo, 0.5 gr. PBS pH 7.6, 50 ml. 5.6.9. Bibliograffa = Departament of healt, education and Welfare. Serology of Toxoplasno is . Inmunology series No.1 Center for Disease Control (C.D.C,) Atlanta Georgia marzo 1977,5.7, ANTIGENO DE SUPERFICIE HEPATITIS B 87.1. Técnica Utilizada Inmuno ensayo enzimAtico HBsAg* (ELISA). 5.7.2. Fundamento El inmuno ensayo enzimético HB,Ag es un inmunotest para la deteccién de antigeno de superficie de hepatitis B en plasma o suero usando el principio del sandwich. EL HB,Ag en la muestra reacciona con los anticuerpos inmovilizados en la superficie de los tubos plasticos que vienene en el Kit. Después de lavado los anticuerpos del conjugado de peroxidasa especifico para HBsAg reaccionan con el remanente de Antigeno determinante en una segunda reaccién. Bl exceso de anticuerpos del conjugado enzimatico se remueve por lavado y la actividad enzimatica se determina en la fase sélida La reaccién enzimatica es catalizada por el peréxido de hidrégeno y el desarrollo de color (cromégeno) de la reaccién se frena por la adicién de acido sulférico diluido. La intensidad de color es proporcional a la concentracién de HBsAg en la muestra. La lectura de los resultados se puede hacer visual o fotocolorimétricamente comparando la intensidad de color con el color de los controles positivo y negativo. 5.7.3. Equipo Empleado Fotocolorimetro longitud de onda 492 nm. Cubeta: 1 cm. de paso de luz Bafio maria 401°C Micropipetas autométicas 200 y 1.000 microlitros Dispensador 2 ml. con sistema do aspiracién. * HB,ag antigeno de superficie hepatitis B. 95.7.4. Reactivos Tubos con anti HB,Ag de cordero en gradilla especial Conjugado peroxidasa anti HB,Ag (de conejo) preservado con gentamicina. Estable 4 soman ‘C una vez reconstitufdo. Diluyente para el conjugado de peroxidasa Suero control positive para HBgAg ‘Suero control negative Solucién de lavado concentrada “Tween” en solucién Buffer de fosfato. Buffer substrato: Peréxido de hidrégeno en Buffer fosfato citrato, sodio-P Ethyl- Mercurio-Mercapto-Benzeno-Sulfonato como proservativo. ‘Cromégeno (0- phenylendiamine dihydrocloride OPD). Estable 1 hora protegido de la luz Solucién de frenado (écido sulférico 0.5 N). Estable 1 semana 4-6°C. Cubiertas adhesivas Todos los reactivos son establos hasta su fecha de expiracién de 4-6°C. Precaucionos: EL kit incluye un control positive que no garantiza total inactivacién del virus, tanto el equipo como las muestras se manejan como si fuera material infeccioso, El material desechable es preferible autoclavarlo por una hora a 121°C; todos los liquidos aspirados producto de juagados se deben desechar on una solucién de hipoclorito de sodio 2.5% y dejarse en contacto con éste, minimo 30 minutos. Evite el contacto de el cromégeno y la solucién de frenado con la piel, no mezcle reactivos de diferentes lotes ni descarte el desecante de los tubos plésticos. 5.7.5. Calibracién La persona se calibra en el procedimiento y lectura antes de iniciar el Procesamiento de muestras. 5.7.6. Descripcién de le Técnica Determine la cantidad de tubos a usar (1 por muestra més 5 controles) y guarde ol resto en la bolse plastica bien cerrada con las tabletas desecantes dentro. Pipetee 200 microlitros de suero control negativo en los tubos 1, 2, 3 y 4, 200 microlitros de control positivo en el tubo 5. A partir del sexto, pipetee 200 microlitros de muestra en cada uno de los tubos, subsiguientes, (el suero no necasita inactivacién) al pipetear evito las burbujas de aire. Cubra con durante 90 minuto placa adhesiva los tubos de incube a 40°C en baiio de maria 170Remueva la placa adhesiva y aspire los tubos, afiada aproximadamente 2 ml. de solucién lavadora dilufda, aspire otra vez, repita el lavado 2 veces, descerte esta solucién. Pipetee 200 microlitros de conjugado de peroxidasa diluida en cada tubo (empezando por el primero) evite burbujas de aire. No humedezca las paredes del tubo {puede ceusar falsos positives). Cubra los tubos con otra placa adhesiva sin usar e incube en baiio maria 40" durante 1 hora. Algunos minutos antes de terminar la incubacién, afiada 10 ml, do solucién Buffor-Substrato a una botella de cromégeno, disuelva mezclando suavemente, guarde protegido de la luz (para aproximadamente 40 determinaciones). Remueva la placa adhesiva, aspire los tubos y lave 4 veces como en el paso de levado anterior. Pipetee en cada tubo 200 microlitros de 1a solucién Buffer-Substrato cromégeno. Cubra con placa adhesiva limpia e incube 30 + 2 minutos @ temper ambiente protegido de la luz. ture, Remueva nuevamente la placa adhesiva y afiada 1.000 microlitros de solucién do frenado de la reaccién*. Lea los resultados dentro de una hora. Lectura visual: Coloque la gradilla sobre fondo blanco. Control positivo: color amarillo-naranja comparado con los incoloros. Si el control positivo y los negativos son del mismo color, repita la prueba. Lectura Fotométrica (a 492 nm): Ajuste a Ola absorbancia del fotocolorimetro colocando 1 ml. de agua destilada. ‘on.una cubeta y lea la absorbancia primero de los controles negativos, luego el control positivo** , y por iltimo las muestras. * En la misma secuencia que afladié cl Buffer substrato cromégeno. ** Después de hacer esta medida juague varias veces la gubeta hasta que la lectura sea 0. mCéleul el promedio. ‘ome las lecturas en absorbancia de los controles negativos y calcule Si uno de los controles negativos da un resultado superior a 0.10 no incluya el liltimo en el célculo. Si més de un control negativo esté cercano a 0.10 0 la diferencia entre la absorbancia del control positive y el promedio de las absorbancias de los controles negativos es menor de 0.5, repita la prueba. Adicione 0.050 al valor promedio de las absorbancias de los controles negativos. Las muestras con As menores a este valor son negativos. Las muestras con As iguales 0 superiores a este valor son positivos. Ejemplo: Sogetives Absorbancia 1 0.065 2 0.068 3 0.064 4 0.071 Suma 0.268 0.067 + 0.050 = 0.117 Valores iguales o superiores a 0.117 = Positive (+) Valores inferiores a 0.117 = Negativo (-) 5.7.7. Control de Calidad Se hace incluyendo sueros control positive y negativo. 5.7.8. Preparaci6n de Reactivos Vienen listos para el uso y se reconstituyen de acuerdo a las instrucciones del fabricante, 5.7.9. Bibliografia ~ Paul Ehrlich Institute, federal office for sera and vaccines. Enzime Inmunoassay for detection of hepatitis B Surface Antigen. Germany. Anmunoassay for detection of hepatitis B Surface Antigen. m25.8. SEROLOGIA PARA SIFILIS V.D.R.L. 5B. 5.8.2. ‘Técnica Utilizada VDRL* Fundamento Se basa en la reaccién de los anticuerpos presentes en el suero de una persona infectada con T. Pallidum, evidenciada mediante reaccién de floculacién. 58.3. 5.8.4. 5.8.5, 58.6. agujas, Equipo y Elementos Agitador de velocidad variable, graduado a 180 RPM que circunscriba un cfrculo de 3/4 de pulgada de diémetro sobre un plano horizontal. Léminas con anillos de cer4mica de 14 mm de diametro y fondo plano Portaléminas de ma Agujas hipodérmicas sin punta nimeros 18, 19 y 23 Jeringas tipo luer de 1 0 2 ml. Frascos de 30 ml. con tapa de vidrio, boca angosta de aproximadamente 30 mm de diémetro, fondo interior plano. Reactivos Antigono VDRL** Solucién salina Buffer pH 6.0 + 0.1** Solucién salina 0.9% Solucién salina 10% Calibracién La persona que efectie la determinacién se capacita y adiestra para la lectura. Descripcién de la Técnica Determinacién de la exactitud de la cantidad de Antigeno agregado con las * Venereal Diseases Research Laboratories. +** Producido por el Laboratorio de Microbiologfa INS. 123Es de primordial importancia que use las adecuadas cantidades de reactivos, por tal motivo las que utilice diariamente deben ser probadas. La practica puede permitir una gran rapidez para agregar la suspensién de antigeno y de solucién salina, pero se debe ejercitar también para tener gotas de tamaiio uniforme. Para la prueba cualitativa de suero en l4mina agregue el antigeno con una jeringa provista de una aguja No. 18 sin punta, la cual debe dar 60 +2 gotas de suspensién de antigeno por mililitro, cuando la jeringa y la aguja son sostenidas verticalmente. Para la prueba cuantitativa de suero en lamina agregue el antigeno con una jeringa provista de una aguja No. 19 sin punta, la cual debe dar 75 + 2 gotas de suspensién del antigeno por mililitro, cuando sostenga la jeringa y la aguja verticalmente. Para la prueba cuentitativa de suero en lémina agregue la solucién salina 0.9% con una jeringa pravista de una aguja No. 23 (con o sin punta), la cual debe dar 1002 gotas de solucién salina por mililitro, cuando sostenga la jeringa y la aguja verticalmenti saciones de volumen Ajuste las agujas que no dan exactament correcto antes de usarlas. tas especi Pruebas Preliminares de la Suspensién del Antigeno: Bfectie la prueba de los sueros control de reactividad conocida, como se describe en prueba VDRL cualitativa en suero sobre lémina. Prepare controles apropiados de suero completo como se describe en Sueros para Pruebas con Antigeno no Teponémico. Las reacciones con los sueros control deben reproducir exactamente el patron de reactividad establecido para tales sueros. Bl suero no reactivo debe mostrar una comple del antigeno. suspensién de las particulas No w antigeno. antigenos que no sean satisfactorios ni mezclas de suspensién de NOTA: Incluya los sueros control de reactividad conocida (reactivo, reactivo débil y no Teactivo), cada vez que prepare la suspensién de antigeno, con el fin de conocer la cantidad del mismo. Preparacién de Suero: Utilice suero Iimpido obtenido por la centrifugacién de sangre coagulada, caliente* a 56°C en bafio maria por 30 minutos antes de efectuar las pruebas. * No es inactivacién sino calentamiento para estabilizar la lectura de la reaccién. 124Examine cuidadosamente los sueros una vez sacados del beiio maria y centrifugue aquellos que presentan particulas 0 turbidez. Caliente nuevamente a 56°C por 10 minutos todos los sueros que tengan més de 4horas de haberse inactivado originalmente y a los cuales deba practicar la prueba. En el momento de efectuar le prueba los sueros deben ter rura del ambiente. Ja temps Prueba VDRL cualitativa en lémina para suero: NOTA: Las pruebas de floculacién en lémina para Sifilis son afectadas por la temperatura ambiente, Para obtener resultados confiables y reproducibles. las pruebas deben reelizarse en un ambiente cuya temperatura esté entre los 23° y 29°C. A temperaturas més bajas, la reactividad de la prueba disminuye, a temperaturas més altas la reactividad de la prueba aumenta. Coloque con una pipeta de 0.2 ml. 0.05 ml. de suero previamente calentado, dentro de un circulo de la lamina* ‘Agregue una gota (1/60 ml.) de la suspensién del antfgeno, con una jeringa provista de una aguja No. 16 sin punta, sobre cada uno de los sueros. Rote las laminas durante 4 minutos en agitador mec4nico a 180 RPM. NOTA: Cuando estas pruebas se realizan en zonas de clima seco, cubra las laminas con une caja (caja do Petri o similar) que tenga papel filtro himedo, de manera que durante el proceso de rotacién se pueda prevenir la excesiva evaporacién. Lea las pruebas microscépicamente con um ocular 10 y un objetivo 10, inmediatamente después de la rotacién. Informe los resultados, asf: Grumos grandes y nedianos Reactivo (R) Grumos pequefios Reactivo débil (RD) No grumos o formacién ligera mente grumsa No reactivo (NR) Ocasionalmente puede presentarse el fénomeno de pro-zona. Este fenémeno se presenta cuando hay una completa o parcial inhibicién de la reactividad en suero 0 dilufdo, * Liminas de concavidad 0 anillo de vidrio no se recomiendan para esta prueba. 5En ocasiones dicho fenémeno es muy grande dando Ynicamente reacciones débilmente reactivas o ligeramente grumosas (no reactivas) con suero no diluido. Es por lo tanto recomendable que todo suero que presente reaccién débil reactiva 0 ligeramente grumosa en la prueba cualitativa se someta a prueba cuantitativa antes de dar ol informe VDRL. Sila prueba da resultados reactivos en algunas diluciones debe informarse como reactivo y darse ademés el titulo de tal reactividad segiin normas que se describen en prueba de VDRL cuantitativa en lamina para suero. Prueba de VDRL cuantitativa en Iémina para suero: Efectie la prueba cuantitativa a todos aquellos sueros que en la prueba cualitativa hayan sido reactivos, reactivos débiles o no reactivos grumosos, hasta una dilucién en que no sean reactivos. Use las diluciones: No diluido 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32. Coloque dos sueros problema por lamina. Ponga en una gradilla los sueros problema y exactamente detrds de cada suero coloque un tubo de ensayo con 0.7 ml. de solucién salina 0.9%. Prepare una dilucién 1:8 do cada suero problema, mezclando 0.1 ml. de suero correspondiente con 0.7 ml. de solucién salina 0.9%, use una pipeta de 0.2 ml., graduada en subdivisiones de 0.01 ml. Mezcle bien, deje la pipeta en el tubo con la dilucién hasta que todas las diluciones estén listas. 126Con la anterior pipeta coloque 0.04 ml., 0.02 ml., y 0.01 ml. de dilucién 1:8 dentro de los enillos 4, 5 y 6 reepectivamente (observe la figura anterior). Deposite el remanente que queda en la pipeta, dentro del tubo que contiene la dilucién 1:8. Con la misma pipeta coloque 0.04 ml., 0.02 y 0.01 ml. del suero no diluido dentro de los anillos 1, 2 y 3 de la lamina respectivamente. Agregue 2 gotas (0.01 ml./gota) de Ja solucién salina 0,9% @ los anillos 2 y 5 de cada uno de los sueros problema, mediante una jeringa provista de una aguja No. 23. Adiciono 3 gotas (0.01 ml/gota) de solucién salina 0.9% a los anill cada uno de los sueros problema mediante una jeringa provista de una aguja No. 23. Rote suave y manuelmente le 1émina durante 15 segundos, con el objeto de mezclar bien el suero y la solucién salina. Agregue una gota (1/75 ml.) de la suspensién del antigeno @ cada uno de los anillos, con una jeringa provista de una aguja No. 19. Contintie la prueba en le misma forma ya descrita para la prueba cualitativa y lea los resultados microscdpicamente on. términos, de la mayor dilucién que produce un resultado reactivo (no débil reactive) segiin los siguientes ejemplos: Suero sin DILUCIONES Diluir (isi) [T 1 eile Taz | INFORME Si en todas las diluciones de los sueros se produce un resultado reactivo propare una dilucién 1:64 del suero en solucién salina 0.9%, simplemente mezclando 0.1 ml. de la dilucién 1:8 an 0.7 ml. de solucién salina. Mezcle bien y efectiie la prueba con esta dilucién 1:64 haciendo tres diluciones en la misma forma efectuada originalmente con la dilucién 1:8. Esto equivale a diluciones 1:64, 1:128 y 1:256. * La cantidad de suspensién de antigeno usada en este método se ha redu- cido a 1/75 ml., debido a que el volumen del suero problema se ha re- ducido a 0.04 ml. Ww5.8.7. Control de Calidad Se efectéa mediante el control de agujas; reactivos, suero e incluyendo suero control de reactividad conocida. 5.8.8. Preparacién de Reactivos Solucién Salina Buffer para VDRL con 1% de Cloruro de Sodio pH 6,0 + 0.1. Formaldehido noutro 0.5 ml. Fosfato de sodio secundario, anhidro NazHPO. 0.037 gr. Fosfato de potasio primario KH:PO, 0.170 gr. Cloruro de sodio 10.0 gr. Agua destilada complote 1.00.0 ml. Determine ol pH de la solucién y guérdela en frasco con tapa de rosca o en frasco con tapa de vidri NOTA: Cuando ocurra algtin cambio inexplicable en la reactividad de la prueba controle el pH de le solucién salina Buffer para VDRL, con el objeto de saber si éste puede ser el factor alterado. Soluciones salinas fuera del margen de pH 6.00.1 deben desecharse. Solucién Salina 0.9 por ciento. Pose 900 mgr. de cloruro de sodio y complete 100 ml, de agua destilada. Solucién Salina 10 por ciento. Pose 10 gramos de cloruro de sodio y complete a 100 ml. con agua destilada. Preparacién de la Suspensién del Antigeno. La temperetura tanto del antigeno como de la solucién salina tampén en el momento de preparar la suspensin debe ser de 23°-20°C. Coloque con pipeta 0.4 ml. de solucién salina tampén en al fondo del frasco con tapa de vidrio y capacidad de 30 ml. Agrogue 0.5 ml. de antigeno (con la parte inferior de una pipeta de 1.0 ml. graduada hasta la punta) directamente sobre la solucién salina on forma continua, mientras lentamente va rotande el frasco sobre una superficie plana. NOTA: Agregue el antfgeno gota a gota, en forma répida de manera que aproximadamente 6 segundos sean necesarios para cada 0.5 ml. de antigeno. El extremo de la pipeta debe permanocor en el tercio superior dol frasco y le rotacién no debe ser tan vigorosa que salpique solucién salina sobre la pipeta. La adecuada velocidad de rotacién se obtiene cuando el centro del frasco circunscribe un cfrculo de didmetro aproximado a dos pulgadas tres veces por segundo. Expela la dltima gota de antigeno que pormanece on la pipeta, sin que ésta toque la solucién salina, continie rotando el frasco por 10 segundos; agregue 4.1 ml. de solucién salina tampén con una pipeta de 5 ml. 8Goloque la tapa del frasco y agite del fondo a la tapa sucesivamente, més 0 ‘menos 30 veces en 10 segundos. La suspensién de antigeno esté lista para ser usada y debe usarse ol mismo dia. Puede preparar un volumen doble de la suspensién del antigeno doblando las cantidades; use una pipeta de 10 ml. para agregar un volumen do 8.2 ml. de solucién salina. Pruebe las suspensiones con los sueros control y luego haga una mezcla con todas aquellas que tengan una reactividad satisfactoria. Mezcle suavemente la suspensién de antigeno cada vez que la utilice; no lo haga con la jeringa, ya que este procedimiento causa rompimiento do las particulas pérdida de reactividad. 5.8.9. Bibliografia - U.S. Department of Healt, Education and Welfare. Manual of test for Syphilis, 1969, C.D.C. Atlanta. Georgia. = Instituto Nacional de Salud. manual de Procedinientos Serolégicos para Diagnéstico de Sifilis 1976. Bogota Colombia. ne6. PRUEBAS TOXICOLOGICAS6.1. ACTIVIDAD DE COLINESTERASA 6.1.1, Técnica Utilizada ‘Método colorimétrico (Lovibond). Fundamento La enzima colinesterasa de la sangre libera Acido acético del substrate Perclorato de acetilcolina produciendo un cambio de pH revelado por el indicador azul de bromotimel. 6.1.3. Equipo y Elementos Equipo colorimétrico Lovibond que consta de: Un termémetro (°C y *F) Una gradilla de madera (20 tubos) Pipetas graduadas 0.01 ml. (6) Comparador de colinosterasa (1) Disco para el comparador 5/30 (1) Celdas para el comparador (3) Vaso do precipitado 250 ml. (1) Probeta graduada de 100 ml. (1) Frascos pldsticos de 500 ml. (2) Frasco plastico lavador (1) Frascos goteros de vidrio con graduaciones a 1.0 y 0.5 ml. con tapa (3) Poras de caucho (20) Tapones de caucho pequefios (20) Tapones de caucho medianos (10) 6.1.4. Reactivos Soluci6n indicadora sal sédica de azul de bromotimol Solucién substrate perclorato de acetilcolina Agua destilada libre de CO, Muestra: Sangre total anticoagulada con heparin. 6.1.5. Calibracién El comparador de cloro viene previamente calibrado por la casa productora. 1336.1.6. Descripcién de la Técnica Control de reactivos. Antes de iniciar las determinaciones es "indispensable un control de los reactivos, el cual se efectiia con una muestra de sangre humana heparinizada. En un tubo de ensayo coloque: Indicador 0.5 mil. Sangre 0.01 ml Substrato 0.5 ml, Mezclo bien ¢ inmodiatamente vierta en una celda del comparador, coléquela en el compartimiento derecho del mismo’; efectie la lectura dirigiendo el comparador hacia una fuente de luz natural o artificial blanca y girando ol disco hasta que coincida el color de éste con la solucién de prueba. Si los reactivos se encuentran en perfectas condiciones, debe obtener una lectura de 0% 0 12.5%, si el valor es mayor busque la causa asi; Repita la prueba varias veces cambiando primero el tubo para descartar contaminacién del mismo, luego caliente el indicador hasta ligera ebullicién para libererlo de la posible absorcién de CO, y por iltimo si el problema persiste descarte ol substrato y prepare nueva solucién. Después de que obtenga resultados satisfactorios en esta parte, los reactivos estén listos para usar. Determinacién: Prepare un blanco para restar el valor del color inherente a la sangre asf: Agua destilada, 1 ml. Sangre total anticoagulada, 0.01 ml, Viértalo on una celda y coléquelo en el compartimiento izquierdo del comparador; se emplea en la lectura de las muestras de las personas. Propare un tubo pera cada persona y uno para control, que se coloca en el primer orificio de la gradilla {puede procesar 15-20 determinaciones); coloque en cada ‘tubo: Indicador Sol, 0.5 ml. Muestra sangre, 0.01 ml. Juague la pipeta 2 0 3 veces en el indicador. * 81 lado izquierdo de! comparador debe estar vacfo. 134