le ROsANe MARINA PERALTA Departamento de Bioquimica da Universidade Estadual de Marings As protefnas constituem uma classe extremamente heterogénea de nacromoléculas. Geralmente sio instéveis quando nao estéo em seu ambiente nativo, o qual varia consideravelmente nos diferentes comparti- nentos celulares e fluidos extracelulares. Uma vez extraidas de seu meio bioldgico original, as protetnas ficam expostas a muitos agentes que podem omprometer irreversivelmente suas estruturas. Essas influéncias precisam ‘ercuidadosamente controladas, visto que, quando em solugdes ndo-estabi- liadas, as proteinas podem perder rapidamente a habilidade de desempe- nhar suas funcoes especificas. A integridade estrutural das proteinas esté itimamente relacionada ao pH e a temperatura do meio onde se encon- am. £ conveniente utilizar temperaturas proximas a 0 °C e manter 0 pH en uma faixa estreita, controlada pelo uso de solucdes tampoes. Outro fator ésestabilizante ce proteinas em solugao ¢ a presenga de proteases (enzimas ue clivam as ligacoes peptidicas das proteinas). As células contém protea- se outras enzimas degradativas que, apés a lise, so liberadas para as solugdes jntamente com as proteinas de interesse. As proteases podem ser especifica- mente inibidas por agentes quimicos sem prejuizo a atividade da proteina deejada. De forma geral, a estabilidade das protefnas é menor quando a concen- tucio protéica total da solucao é baixa. Outros fatores comprometedores da sabilidade protéica sao: contaminacao com metais pesados (que se ligam ineversivelmente as estruturas protéicas), concentracao salina e polaridade tas solugdes. A determinacao das condicées de uma solugao para as quais uma proteina apresente a maior estabilidade possivel, permitindo que dife- tmates procedimentos de fracionamento sejam utilizados com altos graus de rreuperacdo, é altamente individual. Entretanto, alguns parametros funda- nentais podem ser estabelecidos para o estudo de todas as proteinas. Neste tapitulo, discutiremos uma série de condigdes gerais, aplicaveis ao trabalho ‘om proteinas em solucao.194 de Laboratiro em Bioguimica 'A maioria das proteinas inicialmente estudadas foi isolada de fluidos extracelulares. As razdes para isso Vio desde a facilidade de obtencdo do material bruto até ao fato de que as proteinas extracelulares so mais esté- eis, estabilidade essa freqiientemente associada 4 presenga de pontes de Uissulfeto. Além disto, em sua maioria, as proteinas extracelulares s4o molé culas relativamente pequenas. Dessa forma, a lisozima, a ribonuclease ¢ 4 Guimotripsina, primeiras proteinas estudadas em detalhes, eram todas pro Senientes de fontes extracelulares. A maioria das proteinas sao, entretanto, intracelulares e muito menos estaveis. Para conseguir um meio de extragao adequado, duas condicdes devem ser definidas: aquela na qual a proteina de interesse ¢ esté Vel e a condicdo na qual a proteina é mais eficientemente liberada das célu jas ou tecidos. A escolha final é, geralmente, um meio termo entre as duas Os principais fatores a serem considerados serao discutidos brevemente, 2 seguir. Normalmente, o pH escolhido € aquele onde a atividade da protet na é maxima. Entretanto, nem sempre esse é 0 pH onde a extragao € mais tficiente ou aquele onde a estabilidade da proteina é maxima. Por exemplo, a tripsina tem uma atividade 6tima na faixa de pH 8 a 9, mas € muito mais estivel a pH 3, onde a autdlise é evitada. O uso de valores extremos de pit & algumas vezes, muito eficiente, como na extragdo de enzimas de leve ras com aménia 0,5 M. A maioria das proteinas € maximamente soltivel em solucoes de forga iénica moderada, de 0,05 a 0,1 M. Os tampdes mais utilizados estdo listados na Tabela 8.1, Uma capacidade tamponante aceitével é obtida den tro da faixa de pH igual a pKatl (ver Capitulo 1). Como as proteinas tam bem atuam como tampoes, € conveniente conferir 0 pH de uma solucie tampa fraca apés a adic&o de grandes quantidades de proteina Em muitas extragdes, 4 proteina desejada esté ligada a membranas ou particulas, ou esté agregada em Virtude de suas caracteristicas hidrofobicas. Nestes casos, as interagoes hidro- fobicas devem ser reduzidas pelo uso de detergentes ou agentes desnaturantes (nao ambos), Alguns dos detergentes mais comuns estdo listados na Tabela 8.2. A maioria deles nao desnatura as proteinas globulares nem interfere nas suas atividades biolégicas. Alguns, entretanto, como o dodecilsulfato de sodio ‘Tampées mais comuns utlizados para a extragdo protéica. Tampao PKs Acetato de sédio 475 Acetato de amonia 4,75; 9,25 Bicarbonato de sédio 6,50; 10,25, Bicarbonato de aménia 6,50; 9,25; 10,25 itrato de s6dio 3,09; 4,75; 6,00 Fosfato de sédio 1,96; 7,12; 12,32 Tris-HCl 321Procedimentos de isolamento¢ fracionamento de proteinas 195 (SDS), so desnaturantes. Como os detergentes so moléculas anfipaticas, eles eventualmente podem formar micelas caso suas concentracdes miceliais criticas By (CMC) sejam atingidas. Como a formacao de micelas complica os processos de purificacao, especialmente as cromatografias em coluna, € conveniente ss que concentragdes abaixo da CMC sejam utilizadas. Agentes desnaturantes, tais como uréia ou guanidina, ou compostos ~ organicos moderadamente hidrofébicos, tal como o etilenoglicol, também. : posiem ser utilizados para desfazer os agregados proteicos. : Concentragso a Detergente PFA aga protena mica ren ‘onica ase ‘- Titon X-100 nlo-iénico suave, nfo desnaturante 0,020 us Tween-80. nao-iénico suave, no desnaturante 0,002 o Deoxicolato de sédio anion suave, ndo desnaturante 0,210 = Dodecilsulfato de sédio aniénico desnaturante 0,230 H © potencial redox do citosol é menor (mais negati- es vo) que o do meio ambiente onde o oxigénio atmosférico esta presente. io Proteinas intracelulares freqiientemente tém grupos tidis expostos e esses n podem oxidar-se durante os processos de purificacao. Grupos tidis podem n- ser protegidos por agentes redutores, tais como 1,4-ditioeritritol (DTE), jo 14-ditiotreitol (DTT) ou mercaptoetanol. Normalmente, concentracbes entre 10 @ 25 mM sao adequadas para proteger os grupos tidis, sem reduzit a as pontes de dissulfeto internas, m A presenga de metais pesados pode ser pre- o- judicial as proteinas por duas razOes: eles aumentam a oxidaco dos grupos es ti6is pelo oxigénio molecular e podem formar complexos com grupos espe- la aificos. Esses problemas podem ser evitados pela adigdo de agentes quelantes a0s : sistemas protéicos. Os mais comuns sao 0 Acido etilenodiamino-tetracético EDTA) e 0 Acido etilenoglicol-bis-[B-aminoetil-éter] tetracético (EGTA), este tltimo mais especifico para 0 calcio. As capacidades quelantes do EDTA e do EGTA aumentam com o aumento do pH da solucao. Por outro lado, algu: mas solugdes protéigas podem ser estabilizadas pela adicao de fons metali- 0s. fons célcio, especialmente, tém a capacidade de estabilizar muitas pro- teinas. Como 0s fons divalentes calcio e magnésio formam complexos com quelantes, nao podem ser utilizados em combinacio com eles, Uma das mais sérias ameacas a estabilidade protéica €a presenca de proteases. A mais simples medida para evitar a protedlise € trabalhar em banho de gelo. A adi¢ao de um ou mais tipos de inibidores pro- teoliticos (Tabela 8.3) é eficiente, mas pode onerar os processos de purifica 20, especialmente para grandes volumes, pois sao agentes quimicos caros. Em alguns casos, é possivel controlar a protedlise ajustando o pH da solugo para um valor no qual as proteases sejam inativas, tomando-se o cuidado de tra. balhar em um pH onde a proteina de interesse continue estavel. Quando nio se tem idéia da natureza das proteases presentes no material de traba-196 Iho, € conveniente trabalhar com uma mistura de diferentes inibidores pro- teoliticos. Existem varias disponiveis no mercado. Medidas simples, tais como 0 uso de solugdes tampoes estéreis e manutengao das colunas cromatograficas a 4 °C e sob fluxo lento de tampao quando nao estao em operacao, sao geralmente sufi cientes para evitar crescimento bacteriano. Sistemas que utilizem tampoes proximos a neutralidade (fosfatos, acetatos e carbonatos) s4o mais suscet veis & contaminagio bacteriana. O uso de tampoes abaixo de pH 3 e acima de pH 9 usualmente previne o crescimento bacteriano, mas permite ocasio nalmente o crescimento de fungos. Azida s6dica (0,02%) pode ser adiciona da ao sistema tampao para prevenir crescimento de microrganismos Principals inibidores protealtcos. Concentrago 4 Inibidor Enzimas Ta EDTA metalo-proteases Simm Pepstatina A proteases icidas 14M Leupeptina serina-proteasese tiol-proteases uM Aprotinina serina-proteases 03M PMSF serina-proteasese tiol-proteases 05 mM Métodos gerais para ruptura celular. Tecnica Exemplos Métodos suaves ise osmética Lise dos ertréctos com égua o enzimatica Tratamento das bactérias com lsozima blizago quimica/autélise Extrago de leveduras com tolueno TTituracgo manu: idos animals moles em gral étodos moderados Homogeneizago com 0 uso de liquidifcador Maioria dos tecidos vegetals e animais TTituracdo com abrasive (alumina, areia, pérolas e vidro) Bactérias, fungos e tecidos vegetais Prensa frances Bactérias, fungos e tecidos vegetais Sonicagio Suspensdo de células py t | |v10- sob afi- eti- Procedimentos de isolamento fra As primeiras etapas de um procedimento tipico de fracionamento protéico consistem na lavagem do tecido e na aplicagao de um entre varios métodos de lise celular existentes (Tabela 8.4). Uma posterior centrifugacdo separa as proteinas soluveis dos restos de membranas e frag- mentos insoltiveis. Finalmente, a amostra protéica pode ser analisada, fracio- nada ou estocada Muitas células tém caracteristicas particulares que merecem atencao especial durante a desintegracao. Células vegetais sto, geralmente, mais difi- ceis de romper em virtude da parede celular. Bactérias variam desde aquelas fceis de romper através de enzimas digestivas ou por choque osmético, até espécies mais resistentes, com espessa parede celular, necessitando, portan- to, de tratamento mecanico para desintegracao. Durante os procedimentos de fracionamento protéico, o mais importan- te fator a ser seguido é a recuperacao da proteina em estudo, seja pela ativi- dade enzimatica, se ela for uma enzima, pela bioatividade de uma proteina no-enzimética ou por algum método capaz de quantificar 0 componente desejado, como, por exemplo, a anidlise eletroforética. O segundo ponto mais importante é 0 conhecimento da quantidade total de proteinas presen- ‘es na fracdo da qual se coletou a proteina em estudo. A partir desses dois dados, o percentual de recuperacao pode ser calculado. As vantagens e des- vantagens de cada um dos principais métodos utilizados para a determina- so da quantidade total de proteinas em materiais bioldgicos estao relacio- nadas abaixo. £ muito utilizada para tragar um perfil protéi- 60 apos uma amostra ter sido submetida a uma cromatografia de coluna. As principais vantagens sao a rapidez e o fato de nao destruir as proteinas das amostras. As principais desvantagens sao: 1. nao € quantitativo, visto que o método € baseado na absorbancia dos residuos de fenilalanina, tirosina e triptofano; se a proteina nao contiver estes aminodcidos, nao ser4 detecta. 4a; 2. 0 método sofre forte interferéncia de acidos nucléicos. £0 método mais citado na literatura. Baseia-se na formagao de um complexo cobre-proteina e na reducao do reagente fosfomo- libdato-fosfotungstato (reagente de Folin-Ciocalteu) pelos residuos de tirosina etriptofano das protefnas. As principais vantagens sdo a sensibilidade e a pre- cisio do método. As principais desvantagens sao 0 tempo de reacdo, a insta- lidade dos reagentes, a desnaturacao irreversivel das proteinas e a interferéncia de muitas substancias. Muitos interferentes, entretanto, podem ser removidos, Precipitando-se as proteinas da solucao antes do ensaio, E um método rapido e sensivel para a quan- tificasao de protefnas utilizando o principio de ligacao proteina-corante. A cor 0 coomassie brilliant blue G20 em solugao dcida diluida muda proporcional- mente & ligagdo do corante as proteinas. As principais vantagens deste méto- do sto a sua rapidez, simplicidade e o fato de sofrer poucas interferéncias As proteinas sao purificadas pelo uso de sucessivos métodos de fraciona- mento, Em uma série de etapas independentes, as diferentes propriedades fisico-quimicas da proteina de interesse sio utilizadas para separé-la pro- gessivamente de outras substancias. A idéia central é eliminar seletivamen- 'e outros componentes da mistura, de tal forma que s6 reste a proteina 197198 Métodos de Laboratrio em Biog (Tubo de coleta Eluigo e separacao) Eluigao e separagao do componente 1 ‘do componente 2 Esquema geral de uma separagSo cromatogréfica. Uma mistura de proteinas¢ aplicada no topo de uma coluna cilindrica contendo uma resina sélida e permedvel imers sm um solvente. Um grande volume de solvente é entdo bombeado através da coluna, & passagem das diferentes proteinas através da coluna seré mais ou menos retardada confor: ‘me seus diferentes graus de interag20 com a resina desejada. Pela cromatografia, por exemplo, uma técnica originalmente desenvolvida para separar pequenas moléculas, tais como agicares ¢ ami- noacidos, € possivel fracionar as proteinas de uma solugao, passando a mis- tura através de uma coluna contendo uma matriz s6lida porosa. As diversas proteinas sdo diferentemente retardadas por suas interagdes com a matrize podem ser coletadas separadamente (Figura 8.1). Nas secdes que seguem, Analisaremos como as diferengas de solubilidade, peso molecular, carga elé- trica e afinidade biol6gica por outras moléculas podem ser exploradas para separar as proteinas. A preci- pitagao de uma proteina em um extrato pode ser conseguida adicionando sais, solventes organicos ou polimeros organicos, ou alterando a temperatu- ra e 0 pH da solucdo. Os agentes precipitantes mais comuns estdo listados na Tabela 8.5. Uma vez que cada proteina tem uma composicdo caracteristica de aminofcidos que determina 0 seu comportamento como um eletrdlito, ¢ possivel realizar um fracionamento protéico por precipitagao diferencia visto que nas condigdes onde algumas protefnas precipitam, outras perme necem em solugdo. A precipitagao diferencial foi o primeiro método utiliza do no fracionamento protéico. Ela continua sendo utilizada na pesquis,‘Procedimentos de isolamento¢fracionamento de proteinas 199) moderna como método para concentrar proteinas ou quando o objetivo é um fracionamento relativamente grosseiro e preliminar das proteinas de uma amostra. Alguns métodos de precipitagdo sao desnaturantes, como, por exemplo, a precipitacao com Acido tricloroacético (TCA). Em outros méto- dos, se observados alguns cuidados no manuseio da amostra, as proteinas sio precipitadas com manutengio de alta percentagem da atividade origi- nal, Entre esses, 0s mais utilizados sao a precipitagao com sulfato de ami nia, solventes orgdnicos e polietilenoglicol. Entretanto, varios outros tipos de precipitagdes sao também titeis, tais como precipitacio isoelétrica, des- naturagdo seletiva pelo pH ou temperatura e imunoprecipitacao. Principals agentes precipitantes. Agente Tipo Propriedades Sulfato de aménia sal Muito sokivele estabilzante Etanol Solvente Inflamavel, risco de desnaturaca0 Acetona Solvente Inflaméve,risco de desnaturagso p Polietilenoglicol Polimero Nao-carregado, no-inflamével Quando sais estdo presentes em ea alas concentragdes, as proteinas tendem a agregar-se, um efeito denomina- A o precipitagao por salificacao (salting-out). Sdo bastante complexas as bases or fsicas dessa precipitagao. Um dos fatores é que a concentragao elevada de sais pode remover a agua de hidratag4o das moléculas protéicas, reduzindo, dessa maneira, sua solubilidade. Outros fatores, porém, podem estar envol- vidos. Qualquer que seja sua base fisica, a precipitagao por salificagao é um ro grocesso importante para a separacao de misturas protéicas, uma vez que int proteinas diferentes variam quanto a sua resposta a concentracao de sais nisl neuttos. Os precipitados protéicos mantém sua conformasao nativa aaa podem ser dissolvidos novamente, em geral, sem ocorrer desnaturagao. £ Ze importante lembrar que fatores tais como pH, temperatura e pureza da fra- eat so protéica contribuem sobremaneira para determinar 0 ponto de salting ae tut de uma proteina em particular. aa O sulfato de amOnia é preferido para essa precipitagao em conseqiién- cia de sua elevada solubilidade em gua, que permite atingir forcas idni- as muito elevadas. Outras vantagens sao: as solugdes protéicas em sulfato deaménia sao estaveis por longos periodos e o sal pode ser removido facil- mente por didlise, ultrafiltraco ou coluna de dessalificagao. As concentra- (es de sulfato de aménia sdo geralmente expressas em percentagem de sturagio. Uma equacao simples para determinar a quantidade Q, em gra- mas, de sulfato de amOnia necesséria para fazer | litro de soluca0 a x por tento, a uma temperatura de 20°C, a partir de uma solugdo x, por cento, é 533(x = xs) Qs 2 100 —0,32x [8.1]200 Métados de Laboratrio em Bioguims Algumas proteinas, principalmente as de alto peso molecular, precipi tam abaixo de 24% de sulfato de aménia, enquanto a maioria delas o fazem acima de 60%. Uma distribuigao tipica de precipitagao de proteinas, a par tir de um extrato bruto, é mostrada na Figura 8.2. © tempo necessério para a precipitagdo das proteinas apés a adicao do sal também varia consideravelmente. Enquanto algumas proteinas precipitam nos primeiros 20 minutos, outras requerem varias horas para completa preci pitacdo. As diferencas na quantidade de sulfato de aménia e no tempo neces sirios para completa precipitacao sto exploradas para o fracionamento das proteinas nos primeiros estégios dos protocols de purificagio. Freqien- temente, a precipitagao com sulfato de aménia também remove RNA € DNA Um importante ponto a ser considerado é que a adigao de sulfato de amé- nia (ou qualquer outro sal) nunca precipita todas as moléculas de uma deter minada proteina, mas reduz sua solubilidade. Se a mistura contém, por exemple, uma proteina na concentragao de 1 mg/ml, a adi¢ao do sal causara uma red 40 na sua solubilidade para 0,1 mg/ml, ou seja, a precipitacao sera de 90%. Por outro lado, se a proteina tiver uma concentracao inicial de 0,1 mg/ml, ¢ mesma concentragao de sal nao causara nenhuma precipitacao. Em outras pala vvras, a concentragio de sal necesséria para precipitar uma determinada proteina depende nao somente das propriedades das proteinas presentes, mas também das concentragées presentes na solucao inicial © método de precipitacao por sol ventes organicos misciveis com a agua tem sido empregado desde 0 inicio dos processos de purificagao de proteinas, sendo particularmente importante nos processos em escala industrial. A adicao de solventes organicos neutros mis civeis com a gua, em especial etanol ou acetona, reduz a solubilidade da maio ria das proteinas globulares a ponto de precipité-las. Estudos quantitativos desse feito mostram que a solubilidade protéica em pH e forga idnica fixados é uma fungao da constante dielétrica do meio. Uma vez que o etanol e a acetona pes suem constantes dielétricas inferiores a da agua, sua adigdo a uma solugao pro 200 100 img de proteinas precipitadas 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 FS % de saturagao de sulfato de aménia Exemplo de uma curva de precipitagao com sulfato de amOnja. FS é a quant dade de proteina solivel a 100% de saturagio.Procedlmentos de solamentoefacionamento de proteinas 201 sal Devido a desnaturagao protéica pelo calor e por reacdes quimicas am que ocorrem com o aumento da temperatura (reagées proteoliticas, por eci- exemplo), é interessante manter uma solucao protéica numa temperatu- ; raem torno de 0 °C. O trabalho é feito geralmente em banho de gelo. Deve-se evitar, entretanto, contato direto com o gelo, pois se este tiver sido feito em formas de metal, poder conter metais pesados que irdo causar desnaturagdo protéica. Se uma enzima ¢ estavel numa temperatu- ramais elevada, a preparacao pode ser levemente aquecida para desnatu- ES rar outras proteinas que podem ser entdo removidas por centrifugagao. du. Se a preparagdo enzimatica for estocada por uma noite ou periodos 2%. mais ongos, € conveniente congelar. No descongelamento, a solugéo wa estaré heterogenea, Solugdes protéicas que foram congeladas devem ser ala- completamente homogeneizadas antes de sua utilizacao. ina sem Em geral, polissacarideos tornam-se menos soltiveis apés 0 congela- mento. £ interessante congelar o material por uma noite, descongelé-lo, a centrifugar e remover as substancias insoltiveis. icio Visto que algumas proteinas so desnaturadas pela exposi¢ao a0 ante oxigénio, uma agitagdo muito forte deve ser evitada. Nao usar agitador de nis- tubos tipo vértex. A melhor forma de agitagao é vedar a boca do frasco aio- com um plistico e inverté-lo delicadamente ima Proteinas acfdicas so mais facilmente precipitadas como comple- pos- x05 com cations divalentes (por exemplo: magnésio) pro- Proteinas de alto peso molecular e proteinas com caracteristicas hidrofilicas mais acentuadas tendem a precipitar com quantidades meno- res de solvente organico e em menores concentragdes de sais. Num pH pr6ximo ao seu pl, a solubilidade de uma proteina é minima. Em qualquer processo de precipitagao utilizado, € recuperacao superior a 70%, desejavel uma téca aquosa aumertta as forgas de atracdo entre cargas opostas, reduzindo assim ograu de ionizacao dos grupamentos R da molécula protéica. Como resultado, moléculas de protefna tendem a se agregar e precipitar. Misturas de proteinas podem ser separadas tendo como base as diferen- «2s quantitativas em sua solubilidade em misturas geladas de etanol-égua ou acetona~igua. Como regra geral, a quantidade de solvente orginico neces- siria para precipitar uma proteina é tanto menor quanto maior for © peso molecular da proteina e quanto mais proximo ao seu ponto isoelétrico esti- vero pH da solugao. O solvente utilizado deve ser completamente miscivel com gua, nao interagir com as proteinas e ter um bom efeito precipitante, 0s mais utilizados sao o etanol e a acetona, mas uma variedade de outros anti solventes, tais como, metanol, n-propanol, dioxano, éteres e cetonas, tam- bém servem para o mesmo propésito.202 de Labortiro em Bloquimica As proteinas so facilmente desnaturadas em solventes organicos a tem: peraturas acima de 10 °C. Assim, as misturas devem ser mantidas a baixas temperaturas, de preferéncia entre 0 e 4 °C. A razao para a desnaturacao esté relacionada com a desestabilizacdo das interacdes hidrofébicas intramolecu: lares que ajudam na manutengao das estruturas protéicas, que € provocada pela forte interagao das moléculas organicas pequenas com 0s residuos pro t€icos hidrofdbicos, a temperaturas mais elevadas. Sais e solventes organicos nao sao os \inicos materiais que podem causar agregacao de proteinas sem desnaturacio, Alguns polimeros de alto peso molecular, soltiveis em agua, podem causar precipitacao protéica. O mais adequado ¢ o polietilenoglicol (PEG), dispont- vel em uma variedade de graus de polimerizacao. PEGs de peso molecular igual ou superior a 4 kDa s4o mais eficientes, sendo os de peso molecular en- tre 6 e 20 kDa os mais comumente utilizados. © comportamento das proteinas na precipitacao com PEG é semelhante ao seu comportamento na precip tacdo por solventes organicos. Maxima precipitacdo protéica € obtida com uma concentragao final de PEG ao redor de 30%. O PEG tem sido mais ‘empregado na precipitasao de proteinas pouco soliiveis, tais como as globu- linas. Para protefnas com alta solubilidade, torna-se necessério 0 uso de altas concentracées de PEG, 0 que provoca alguns problemas operacionais (por exemplo, dificuldade na centrifugacao do material). Além disso, o PEG nio é facilmente removido da fragio protéica como 0 sao os sais e solventes organicos. Entretanto, a presenca de niveis residuais de PEG nao interfere nos métodos de fracionamento convencionais posteriores (cromatografia de troca iOnica e filtragao em gel, por exemplo), Diferentes pesos moleculares implicam, também, diferengas de tamanho, que sao exploradas por diversos métodos de fracionamento, E um processo que separa moléculas de acordo com o seu tama nho através do uso de membranas contendo poros de dimensdes inferiores 0s tamanhos das macromoléculas (membranas semipermeaveis). Esses poros permitem que moléculas pequenas, tais como solventes, sais e metabdlites pequenos, difundam através da membrana, mas impedem a passagem de moléculas maiores. Celofane (acetato de celulose) é 0 material mais comu mente utilizado em didlise. A dilise (que nao é considerada um tipo de cro- matografia) € rotineiramente utilizada para a troca do solvente ou da solugio tampao no qual as macromoléculas estdo dissolvidas. A solugio das macro moléculas é colocada dentro de um saco de dialise, que é entao submerso em um grande volume do novo solvente. Apés algumas horas de agitacio, 3 solug6es estardo equilibradas, mas as macromoléculas permanecerao dentro do saco de didlise. Estio disponiveis no mercado tubos de dialise em uma variedade de tamanhos que permitem a passagem de moléculas relativamen. te grandes (peso molecular entre 15 e 20 kDa). Dessa forma, é possivel realizar um fracionamento protéico: caso a proteina de interesse tenha peso molec lar muito superior a 20 kDa, 0 uso de uma membrana de didlise que permite a passagem de moléculas com peso molecular de até 20 kDa permitiré a el 10 de todas as proteinas contaminantes que tenham peso molecular até este valor. Nos procedimentos de laboratério, a didlise € uma etapa conve niente para ser feita durante a noite, visto que 0 procedimento nao requet monitoramento. Entretanto, a existéncia de enzimas proteoliticas no material (que degradam as proteinas) e de celulases (que degradam a membrana de dié- lise e provocam perda total do material) pode inviabilizar essa’ pratica.Procedimentos de solamento¢fracionamento de proteinas 203 m- A dilise pode ser utilizada também para concentrar uma solugo de cas macromoléculas se 0 saco de didlise for colocado em um dissecante polimé- sta co, tal como o polietilenoglicol, que ndo pode penetrar na membrana. A u- concentragao da solucdo é afetada pela perda de 4gua que difunde através da da membrana para ser absorvida pelo polimero. ro E um método que utiliza a pressdio de um gés para forcar 0 liquido através de uma membrana. Se os poros da membrana so tais que permi os tem a passagem de pequenas moléculas de proteina, um fracionamento protéi- io. 0 realizado. Moléculas maiores sio retidas na membrana e a solucao torna-se sar mais concentrada do que a solugao original, visto que a 4gua passa pela mem- ai. brana. Pelo fato de as membranas nao possuirem um tinico tamanho de poro e lar sim poros de tamanhos préximos (por exemplo, poros na faixa de 1 kDa ou na n- faixa de 10 kDa), nao existe um peso molecular absoluto que determine quais ras proteinas passam e quais ndo passam pela membrana. Moléculas de tamanhos pi- Pouco superiores ao limite poderdo passar pela membrana, Mas, se a proteina de om Interesse for muito maior do que o tamanho dos poros (30-50% maior), ela serd ais "etida em 100% na solugao concentrada. O método é, obviamente, muito menos nu discriminativo que a cromatografia de exclusto molecular (ver a seguit), visto tas que fornece somente duas fragdes: “proteinas maiores” e “proteinas menores”. A vor gande vantagem da ultrafiltragio é 0 fato de ela poder concentrar de forma ao suave solucdes protéicas muito diluidas com um minimo de desnaturagio (a tes recuperagdo € maior que 90%), de forma a permitir o processamento posterior 2re «esse material concentrado com métodos mais eficientes de fracionamento (cro- de matografia de filtragao ou de afinidade, por exemplo). A cromatografia de exclusio mole- «ular, filtragao em gel ou peneira molecular, permite a separagaio de molécu- 10, las com base nas diferencas de seus tamanhos e formas. £ um meétodo titil ‘anto para o fracionamento de moléculas quanto para a determinagao de peso 1a- molecular. Na cromatografia de exclusao molecular, a mistura de proteinas, res dissolvidas em tampao adequado, flui através de uma coluna cheia de esferas os. microscépicas de um material polimérico altamente hidratado e inerte, pre- os. viamente lavado e equilibrado com um tampao. As esferas esto disponiveis de Comercialmente e as mais conhecidas s4o o Sephadex e a Sepharose, deriva- ue dos de polissacarideos, e 0 Bio-Gel, derivado da poliacrilamida (Tabela 8.6) 0- Todos eles podem ser preparados com diferentes graus de porosidade inter- 40 na, Nas colunas, as proteinas de diferentes tamanhos moleculares penetram co os poros internos das esferas em graus variados, percorrendo desta forma a m coluna com velocidades especificas (Figura 8.3A). Moléculas protéicas muito as gandes nao podem penetrar nos poros das esferas e, assim, permanecem no 10. wlume excluido da Goluna, definido como o volume da fase aquosa que est na 4a parte externa das microesferas. As moléculas pequenas, por penetrarem ne livemente nos poros das microesferas, tém seu percurso retardado. ar principal uso da cromatografia de exclusio molecular € 0 fracionamento u- prtéico. Se a proteina de interesse é relativamente grande (peso molecular acima ite de 100 kDa, por exemplo), a filtragao em gel pode ser utilizada como uma das ai ‘tapas iniciais do processo de purificacao. A proteina elui nas primeiras fracoes € te todas as proteinas menores permanecem na coluna, permitindo uma purificacao re- onsideravel. Se peso molecular aproximado da proteina nao € conhecido, a ter matriz escolhida deve ter uma ampla faixa de fracionamento. Nos processos de ial Dutificacdo protéica, a filtraco em gel é muito utilizada em associagao com a cro- ia atografia de troca idnica (filtragdo em gel seguida de cromatografia de troca iinica ou vice-versa), visto que os dois métodos so complementares.204 Laborato em Bloquimica Aguns materais comuns utiizados em gel de fitracao. (Os géis Sephadex e Sepharose sio produtos da Pharmacia Fine Chemicals AB; 105 géis Bio-Gel sio produzidos por BioRad Laboratories. Faixa de fracionamento ea! ee (em kDa) Sephadex G-10 Dextrano 0,05-0,7 Sephadex G-25 Dextrano 1s Sephadex 6-50 Dextrano 1-30 Sephadex G-100 Dextrano 4-150 Sephadex G-200 Dextrano 5-600 Bio-Gel P-2 Poliacrlamida 01-18 Bio-Gel P6 Poliaeriamida 16 Bio-Gel P-10 Poliacriamida 1,5-20 Bio-Gel P30 Polacriamida 24-40 Bio-Gel P-100 Polacrlamida 5-100 Bio-Gel P-300 Polacriamida 60-400 Sepharose 68 Agarose 10-4000 Sepharose 48 Agarose 60-2000 Sepharose 28 Agarose 70-4000 Fluxo do solvente Trdca iénica Filtragao Afinidade A B c Trés principais tipos de cromatografia. Na cromatografia de troca ionic, resina € cartegada com cargas positivas (trocadora de anions) ou negativas (ttocador de tions) que retardam a passagem de proteinas com carga oposta. A associacao de uma proteina depende do pH e da forca iOnica da solucao que passa pela resina. Na cromatografia de filtragdo, a resina consiste de mintisculos grdos porosos. Proteinas equ tram nos poros e passam mais lentamente pelo leito da coluna. Proteins res, que a pidamente. Na ¢ guem entrar nos gros, sio levadas para fora da coluna mals imatografia de afinidade, as resinas tém ligadas covalentemente grup especificos que interagem com determinada proteina, ficando retida no leito da colin, ‘enquanto todas as outras saem rapidamente. A proteina ligada pode ser eluida por mudanga de pH ou por solugdes salinas concentradas.Prcedimentos de solamentoefacionamento de proteinas 205 5,0 48} ve 46 Log PM 44 42 40 (0c (5 tO 2.5.05) VelVo Determinago do peso molecular de uma proteina (») através de uma coluna {e filtracio Sephadex G-100, a pH 7. Utilizou-se uma coluna com volume de 70 mi equilibrada com tampao fosfato 100 mM, pH 7. Para calibrar a coluna foram utilizadas ‘quatro proteinas padrao (-): soroalbumina bovina (66 kDa), ovoalbumina (43 kDa), anidrase carbénica (29 kDa) e lisozima (14,3 kDa). Vo = 21 mil, calculado a partir da elulgao de azul de dextrano 2000. A filtragao em gel ¢ utilizada também para a determinagao do peso mole- cular de uma proteina. Nesse caso, uma curva de calibragao € necesséria (Figura 8.4). A coluna é montada em um tampio adequado, ¢ o volume morto (V,) é determinado pela passagem de uma solucdo de azul de dextra- 10 (blue dextran; peso molecular de 2000 kDa). Os volumes de eluicao (V.) ée varias proteinas de pesos moleculares conhecidos s4o determinados as azoes V/V, calculadas. A representacao grafica do logaritmo do peso mole- aular das proteinas versus V./V, resulta numa reta que, por interpolacao, pode ser utilizada para a determinagdo do peso molecular de uma proteina, desde que a razdo V,IV, seja calculada nas mesmas condigdes da curva Outros usos da filtracdo em gel so a remogao de impurezas de baixo e peo molecular (sais, pequenos fragmentos protéicos gerados por atividade S proteolitica etc.), a separacdo das subunidades protéicas no caso de protei- ° tas oligoméricas, a troca do tampao etc. y A separacao das pro- itinas tendo como base sua carga elétrica depende, em tiltima anilise, de suas ropriedades acidoBasicas, que sio grandemente determinadas pelo nimero étipo de grupamentos R ionizaveis de suas cadeias polipeptidicas (arginina, histdina, lisina, acido aspartico e acido glutamico). A um dado pH, uma pro- wa tcina ira possuir uma carga iquida. Num valor baixo de pH, a carga liquida tz seré mais positiva, e num valor alto de pH, a carga liquida ser mais negativa ima (Figura 8.5). O pH no qual as cargas positivas igualam as cargas negativas (em sutras palavras, 0 pH no qual a carga efetiva da proteina € zero) define 0 vas onto isoclétrico da protefna (pl). Para a cromatografia de troca iénica, uma = boa regra a ser seguida quando o pl da proteina € conhecido, ¢ selecionar 0 au Hide trabalho distante &m uma unidade do seu pl. Neste pH, a proteina teré Ga targa liguida suficiente para se ligar a coluna trocadora e continuara estavel, ot isto que condigdes mais drasticas, tais como forga idnica alta ou significati- vas variagdes no pH, podem causar desnaturacao.206 1 t g j tio I 5 2 4 6 8 10 é pH Efeito do pH na carga liquida de uma proteina. No proceso de troca iénica, os fons eletrostaticamente ligados a uma matriz insolivel e quimicamente inerte s4o reversivelmente trocados pelos ions em solucao (Figura 8.3A). Uma matriz insoltivel que tenha ligado grupos carregados positivamente sera uma matriz trocadora de anions, enquanto uma que tiver grupos carregados negativamente seré uma matriz trocadora de Citions. AS resinas trocadoras mais comumente utilizadas estao listadas na Tabela 8.7. Suponhamos que uma proteina tenha carga Ifquida positiva a pl 7. Ela se ligara a uma coluna contendo grupos negativos. Essa proteina pode 14 ser eluida (liberada) pelo aumento de concentracao de cloreto de sédio ou outro sal no tampao de eluigdo, visto que os fons sédio competiraio com os grupamentos com carga positiva da proteina, pela ligacao a coluna, Proteins com baixa densidade de grupamentos carregados tenderdo a emergir prime: ro, seguidas das que tenham maior densidade de cargas. Dois tipos de eluigao s4o possiveis com uma coluna de troca iénica: elu sao por etapas e elui¢ao por gradiente (Figura 8.6). Na eluicao por etapa "| 10 | | 0.01 ° 10 20 30 40 50 60 70 © 10 20 30 40 60 60 70 Avo (Nac) Numero da fragéo Numero da fragao Principals tipos de eluicio utilizados em cromatografia de troca lOnica. (A) ge cdiente linear de eluigdo; (B) eluicao por etapasProcedmentos de islamentoefacionamento de proteinas 207 AAlguns materiais comuns ut 1dos em cromatografia de troca lénica de protenas Nome Tipo Grupo ionizavel Caracteristica Dowex 1 Resina de poiestieno, @-CH,N"(CH3),_trocadora anionica fortemente basica Dowex 50 Resina de potestreno, 2-504 trocadora catiénica fortemente écida DEAE celuose Btsica “CH;CH.N(CHs)z___fraciona proteinas OMecelulose Acidica ci,cooH fraciona proteinas ma neutras e bésicas Jos pos ma de a volumes determinados de solugdes salinas de forgas idnicas crescentes so pit adicionados (por exemplo, adiciona-se 50 ml de uma solugao de NaC! 0,05 M, a seguida da adicao de 50 ml de NaCI 0,10 M etc). Um gradiente de eluig’o po femove proteinas por um gradual aumento da forca idnica. Apesar da elui- 10s sto por etapas ser um procedimento mais simples e répido, o gradiente de nas dluicao € mais eficiente, visto que a eluicdo por etapas pode resultar na elui- nei- #o simultnea de varias proteinas devido ao grande aumento que ocorre na forga idnica quando se passa de uma etapa para outra. sui Outros fatores, além da carga global, podem influenciar 0 comportamen- fa to das proteinas em colunas de troca idnica. Os dois mais importantes sio as interagdes entre os residuos hidrofébicos das protefnas com as resinas e a for- macao de pontes de hidrogénio entre as proteinas e o trocador iénico. A cromatografia de troca iOnica € 0 método cromatografico mais utiliza- do nos processos de purificacao de proteinas. Sua popularidade deve-se a sua alta resolucio, facilidade de uso, reprodutibilidade e baixo custo. O i principio da troca iénica permite que a proteina se ligue mesmo quando um frande volume de tampao € aplicado, tornando o processo especialmente itil nas etapas iniciais de purificacdo. Para separacdes nas quais a velocida- de € importante (remogao de proteases ou purificagao de proteinas com imitado tempo de atividade), a cromatografia de troca iénica pode ser rea- liada em suportes que permitam fluxo rapido Um tipo particular de cromatografia de troca idnica ¢ a focalizacao isoelétrica (ou cromatofocalizacao; Figura 8.7). Na focalizacao isoelétri- @, as proteinas sao separadas como resultado da formagao isocratica de um gradiente interno de pH nas colunas trocadoras de fons. Se um tam- pio de determinado pH flui através de uma coluna trocadora de fons equi- lbrada com um segundo tampao com outro pH, um gradiente é formado imedida que os dois tampoes se misturam, e as proteinas ligadas a resina serio elufdas dependendo de seus pI’s. Mesmo que a maioria das proteinas fenha pI na faixa de pH entre 5 e 8, existe uma considerével heterogenei- fade dentro dessa regido a qual permite uma eficiente separacao. 0 gra208 FASE ESTACIONARIA AMOSTRA PROTEICA TAMPAO | Proteina move-se p | rapidamente pH7.3 | Fy Proteina Proteina move-se = ligada lentamente i [eas] | + | ay Ee Esquema de uma cromatofocalizacio, As proteinas so separadas pela form ‘glo de tum gradiente isocratico de pH. A cromatografia de afinida desenvolvida durante os anos 60-70, refere-se originalmente ao uso de ligar- tes naturais imobilizados, que interagem especificamente com uma protein ligante ¢ imobilizado em uma particula que pode ser empacotada em uma coluna, A amostra contendo a proteina é passada pela coluna e a proteins especifica interage com o ligante ficando retida, enquanto as outras proteinas permanecem na fase mével, conforme ilustrado pela Figura 8.3C Técnicas de afinidade fazem uso, em geral, de uma interagao bioespecitica que resulta em uma mudanga nas propriedades da proteina, de tal forma que ela possa ser separada das outras. Nao somente pode ser aplicada em colunas cromatograficas, mas também em precipitacao, eletroforese e outros métodes de separacao. A maioria dos procedimentos é, entretanto, cromatografico. 4 cromatografia de afinidade apresenta alta resolugao, mas devido ao seu alto custo, é geralmente usada nas fases finais dos processos de purificacdo pro- téica, apos o material ter sido parcialmente fracionado pelos métodos cro matograficos anteriormente descritos. © termo eletroforese ¢ usado para descrever a migragao de particulas car regadas em um determinado meio sob a influéncia de um campo elétrico. Procedimentos eletroforéticos nao sio utilizados para fracionamento de molé culas em larga escala, visto que métodos altemnativos mais adequados como por exemplo os métodos cromatogrificos, estdo disponiveis. As eletroforess sao, entretanto, especialmente titeis como métodos analiticos, visto que els permitem a separacao e a visualizagao das proteinas, possibilitando uma ané lise da heterogeneidade protéica existente em um material, ou a anélise do grau de pureza de uma preparacio. As eletroforeses permitem também a dete minacao de uma série de propriedades das proteinas, tais como, seus ponte isoeletricos e pesos moleculares. Para isso, as amostras devem ser colocatasProcedlmentos de isolamentoefacionamento de proteinas 209 + } um suporte de tal modo que se defina um campo para a aplicacao de corren- teelétrica e que permita que as moléculas se movam, (O.uso da eletroforese para a separacdo de proteinas iniciou-se no final da década de 30. As primeiras eletroforeses foram as eletroforeses livres, onde a solugao tamponada da mistura proteica era colocada em uma célula em forma de U e um campo elétrico estabelecido entre os eletrodos. Essa eletro- forese foi rapidamente suplantada pela eletroforese de zona, onde a solucdo proteica é imobilizada em uma mattiz s6lida ou suporte, um material poro- soe hidratado que apresenta rigidez mecénica, eliminando assim a convec- s0 € os distarbios por vibracdo. Os primeizos suportes utilizados foram papel de filtro ¢ acetato de celulose. A introdugao da técnica da eletrofore- se de zona possibilitou a obtengdo de resolugoes significativamente maiores do que as obtidas na eletroforese livre. Contudo, foi a introducao de supor- is que retardam ou excluem moléculas em fun¢do de seus pesos molecula- "5, fais como os materiais usados na cromatografia de exclusdo molecular, que possibilitou a obtencao de uma resolucao eletroforética compativel com as necessidades analiticas da bioquimica moderna. O suporte mais empre- ado com essa finalidade € a poliacrilamida . gel de poliacrilamida fo introduzido como suporte nas eletroforeses no final da década de 50 e, esde ento, vem sendo amplamente utilizado para a separacao de macromo- clas. Quimicamente, o gel € produto da polimerizago da acrilamida e da Ae NNN metileno-bis acrilamida. A formagao do gel ocorre por um mecanismo de es polimerizagao vinilica, catalisada pela riboflavina (catalisador fotoquimico) a ou pelo persulfato de aménio (catalisador quimico). Os dois catalisadores par- Ea ‘icipam da gerac3o de radicais livres, que s4o estabilizados por uma amina te cat iia, 0 TEMED. Os radicais livres formados reagem com a acrilamida, ativan- Ree oa. A acrilamida ativada reage com outras moléculas de acrilamida forman- Go ligag6es cruzadas intercadeias, produzindo uma longa cadeia linear do ica polimero. Para a formago do gel de poliacrilamida, € necessario a participa- aa tio da bis-acrilamida, que atua formando ligagoes cruzadas entre as cadeias aa neares, Originando uma rede que resulta na formacao do gel. O comprimen- oa iomédio das cadeias lineares € determinado pela concentragao de acrilam uA eaconcentracao da bis-acrilamida determina a quantidade de ligagoes cruz tlio is. A relagdo acrilamida/bis-acrilamida determina as propriedades fisico-qui nod micas do gel tais como, densidade, elasticidade e tamanho dos poros. 0- Asdiferentes técnicas de eletroroforese em gel de poliacrilamida baseiam-se ta heterogeneidade das seguintes propriedades fisico-quimicas das protef- 1s: peso molecular, carga elétrica liquida e ponto isoelétrico. Com essa técni 2 de eletroforese, € possivel a separacao das proteinas com cargas liquidas ttetivas diferentes em um determinado pH. A Figura 8.8 mostra um equipa mento para a eletroforese em gel. O campo elétrico € aplicado através da ligagao de polos (positivo e negativo) localizados nas extremidades do gel. Dependendo do pH do tampao, as moléculas protéicas terdo carga liquida pasitiva ou negativa, © que determinaré a colocagdo do polo positivo ou ‘egativo acima ou abaixo do gel. Em pHs alcalinos, pH 9,0 por exemplo, a naloria das proteinas esté carregada negativamente. Dessa forma, 0 anodo tcolocado na extremidade oposta a da colocacdo das amostras no gel. Esse procedimento ¢ denominado eletroforese para proteinas acidas. Quando a cor- rte € aplicada, as moléculas migrarao na direcao do Anodo. A adigao deom Biogun um corante como 0 azul de bromofenol as amostras proteicas possibilita o acompanhamento da eletroforese, visto que o corante migra mais ra que as macromoléculas, criando uma linha denominada front. Em pHs ci dos, pH 4,5 por exemplo, as protefnas estdo carregadas positivamente. Desst forma a direcdo da corrida € inversa aquela descrita acima, e o procedimen to € denominado eletroforese para proteinas bdsicas. A eletroforese em gel de poliacrilamida-dode cilsulfato de sédio (SDS-PAGE) € um procedimento eletroforético que separe as proteinas com base nos seus pesos moleculares. © SDS ([CHs-(CH,) :o-CH; (O-SO,|Na*) liga-se as porgdes hidrofobicas das proteinas (1,4 g de SDS para cada g de proteina), rompendo suas dobras e permitindo que elas existam em conformacao estendida estavel. Como resultado, o tamanho do complexo proteina-SDS é proporcional ao seu peso molecular. O SDS ligado adiciona um grande niimero de cargas negativas as moléculas das proteinas, tornando Insignificantes suas cargas intrinsecas. Dessa forma, as velocidades de migr a0 dependem exclusivamente dos pesos dos complexos proteina-SDS, com as proteinas menores migrando mais rapidamente. A eletroforese com SDS pode ser desnaturante ou nao-desnaturante. Se as amostras protéicas forem fervidas e reduzidas (pela adigao de B-mercap toetanol ou ditiotreitol), as proteinas serdo desnaturadas e suas possives sub-unidades serdo separadas. A eletroforese desnaturante permite a deter minacao do peso molecular das proteinas. Para essa finalidade, padroes pro téicos de pesos moleculares conhecidos sao aplicados no mesmo gel da pro teina de interesse. Determinando a mobilidade relativa de cada uma das proteinas de pesos moleculares conhecidos, podemos montar uma curva de calibragao, representando os valores das mobilidades relativas dos padroes protéicos contra os logaritmos dos seus pesos moleculares (Figura 9.8). Na eletroforese com SDS ndo-desnaturante, as amostras nao sao fervidase no sao utilizados agentes redutores. Como uma grande variedade de prote! nas resiste ao tratamento com SDS, apés a corrida eletroforética é possivel ret rar o SDS do gel (banho em isopropanol por 30-60 minutos) e recuperar 3 proteinas nativas. Caso a proteina seja uma enzima, € possivel localizar sua posi¢ao no gel (ver adiante). Amostra Sistema para eletroforese em gel de poliacrilamida,ccediment ‘solamento facionamento de protsinas 211 10 Nessa técnica, as proteinas do migram até encontrar um pH no meio eletroforético que seja corresponden- te ao seu ponto isoelétrico. Para que isso ocorra, é necessario que seja estabe- ssa lecido um gradiente de pH entre 0 Anodo e o cétodo. Tal gradiente € formado pela migragao rapida de certas substancias poliméricas denominadas anfélitos (moléculas que contém em suas estruturas varios grupos ionizéveis tais como de- carboxilas e aminas substituidas, cujos valores de pK, cobrem uma ampla ara faixa de pH). Quando uma mistura protéica é colocada nesse gel, cada protel- He na migra até atingir 0 pH que ¢ igual ao seu pl. Assim, proteinas com diferen- ara tes pl distribuem-se de forma diferente ao longo do gel (Figura 10.8). em 2x0 Apés a cortida eletroforética, as macromoléculas separadas nos géis podem am set visualizadas por diversos métodos. Os mais utilizados sto: do 1. Coloracao pelo azul de coomassie (R250/350, G250). Método econd- sra- mico e conveniente, visto que permite a fixagdo e coloracao ao mesmo om tempo. O corante é adicionado a uma solugao fixadora (mistura de metanol, Acido acético e agua) € 0 gel imerso nessa solucao. O excesso Se de corante € removido por lavagens sucessivas do gel com a mistura ap- cido acético-metanol-égua sem o corante. Bandas azuis indicam as pro- eis teinas, Esse método de colorago é pouco sensivel para a visualizagao de ter- slicoproteinas, visto que estas coram muito pouco com esse corante. v0: 2. Coloragao pela prata. £ um método de uso geral para todos os tipos x10 de proteina, sendo muito mais sensivel que a coloragdo com o azul de das coomassie. Apés a etapa de fixagao (em geral com isopropanol), o gel de € colocado em uma solusdo de nitrato prata. As bandas proteicas oes adquirem uma cor marrom-amarelada. 3. Coloragao para glicoproteinas. 0 componente carboidrato das glico: ase proteinas é corado pelo reagente de Schiff (a base de fucsina), apés pré- tel- via fixagao com Acido acético. Apés o descoramento feito com Acido eti- acético, as proteinas aparecem rosadas. Esse método é indicado para cas glicoproteinas com alto teor em carboidratos. sua 4. Visualizagao de enzimas (geracao de zimogramas). A visualizacao de enzimas em géis de poliacrilamida pode ser feita de duas formas gerais. Na primeira, 0 gel é imerso em um banho contendo um subs- trato, que ao ser modificado pela enzima fixada no gel, gerar4 um pro- duto colorido insoltivel, que impregna o gel. Na segunda, o substrato 50 tn gel de polscrlamida SDs) ara a constrglo, tic de cloves proteinas padra ): Ne Da, ovontbumina (45 1Da,tuprinogeno (a 45. Log PM 400. a), Bactoglobulina 00 01 02 038 04 05 06 O7 08 18,4 kDa) elisozima 143 kDa) Mobilidade eletroforética,212 € incorporado a um gel de agarose (gel do substrato) e esse gel é colo- cado em cima do gel da enzima, formando um sanduiche. A ago di enzima sobre o gel do substrato deve causar uma modificacao visu de modo a orientar a localizago da enzima. Gradiente estavel de pH t M0 0 Oo Go 8 > Osa @) < w) 0 9 8 7 6 5 4 alizagao isoelétrica de proteinas. Para cada proteina existe um pl lttico (pl), onde sua carga efetiva € zero, Na focalizacao isoele as proteinas so submetidas a uma eletroforese em gel de poliacrlamida no qual um gradiente de pH foi previamente estabelecido pelo uso de uma mistura de tampoes anfolitos). Cada proteina ird deslocar-se no gel até 0 ponto onde o pH € igual ao seu p ermanecendo. No exemplo acima, a proteina tem pl igual a 7,8 Para purificar uma proteina até a obtengao de uma fraco homogénea, muitas etapas de fracionamento podem ser necessarias, 0 que torna o pro cedimento demorado e caro. Além disso, quanto mais etapas forem neces sarias para a putificagao, menor sera a recuperagao protéica. Na literatura, ha descrigdes de procedimentos de purificagdo nos quais, ao final, apenas 5% da protefna desejada fol recuperada. Em algumas situagoes, pode nio ser necessdrio trabalhar com uma fraco homogénea da proteina, NessesProediments de isolamenta¢fracionamento de proteinas 213 casos, apenas uma purificagao parcial do extrato protéico bruto ¢ realiza- a da, de forma a tornar © processo mais econémico e rapido. Neste roteiro , pratico, é descrito o processo utilizado para a purificagao parcial das ami- lases de Aspergillus tamarii, As amilases, enzimas capazes de hidrolisar 0 amido (polissacarideo for: mado por moléculas de glicose unidas através de ligagdes glicosidicas do tipo a(1—4) € a(1—6), sd encontradas em muitos microrganismos, incluindo bactérias, leveduras e fungos filamentosos. Dentre os fungos fila- mentosos, varias espécies do género Aspergillus sAo consideradas excelentes produtoras, sendo algumas, como A. niger, A. awamori e A. oryzae, explora- das comercialmente. Uma vez que 0 amido, o substrato natural das amila- ses, € um polissacarideo de alto peso molecular que nao pode passar pelas membranas celulares microbianas, as amilases sao essencialmente proteinas extracelulares. De acordo com 0 modo de acao e os produtos formados, as amilases sio classificadas em (a) a-amilases, que hidrolisam as ligacoes a(1—4) ao acaso, produzindo uma mistura de diferentes oligossacarideos (0) B-amilases, que hidrolisam as ligagdes «(1—4) produzindo maltose; (c) slicoamilases (ou amiloglicosidases), que hidrolisam as ligagdes o(1—4), produzindo glicose; (d) a(1—6) glicosidases, que hidrolisam as ligagoes a(1—6) da amilopectina (os dois tipos principais so as pululanases e as isoamilases). Em geral, os microrganismos possuem mais de um tipo de amilase. A degrada¢ao enzimatica do amido pode produzir, portanto, uma mistura de diferentes agticares redutores: glicose, maltose e malto-oligossa- carideos de baixo peso molecular. Se a determinacao da atividade amilolitica for realizada por um método que detecte os acticares redutores produzidos na hidrolise do amido, esta sera uma medida da atividade amilasica total de um microrganismo, nao sendo possivel identificar quais tipos de amilases foram produzidos por ele. Apés o fracionamento protéico, entretanto, é possivel identificar o tipo da amilase analisando por cromatografia os a¢ti- cares produzidos na hidrdlise do amido pelas enzimas em questao. s resultados apresentados neste roteiro pritico foram obtidos utilizando © fungo Aspergillus tamarii (Moreira et al., 1999). Essa cepa est armazenada e isponivel no Laboratério de Bioquimica e Fisiologia de Microrganismos DBQ/UEM. A cepa é mantida em laboratério através de repiques periddicos, utilizando o meio égar-batata-dextrose. Apés 5S dias, a 28 °C, as culturas s40 armazenadas em geladgjra. Usar as culturas com até 30 dias de idade Picar e cozinhar até amolecer com cerca de 400 ml de agua destilada 200 g de batatas descascadas. Filtrar em gaze. Utilizar o filtrado. Adicionar 15 g de glicose e 18-20 g de agar. Ferver. Completar o volume para 1 litro com agua. Colocar cerca de 15 ml do meio em tubo de ensaio e autoclavar durante 20 minutos. Esfriar os tubos na posi¢do inclinada Desenvolver as culturas em 5 frascos erlenmeyer de 250 ml contendo cada um 50 ml de solugéo mineral de Vogel (Montenecourt e Eveileigh,24 1977) e amido comercial 1% como fonte de carbono. Autoclavar os meios durante 20 minutos. Inocular 10* esporos do fungo em cada um dos fras cos € incubar as culturas, a 28 °C, sob condicoes estaticas. Apds 5 dias separar as massas miceliais obtidas por filtragao a vacuo. Reunir os filtra dos das culturas, centrifugar 10 minutos a 2.500 rpm. Utilizar o sobrena dante como fonte das amilases. Misturar 100 mg de corante coomassie brilliant blue G (Serva Blue G) + 50 ml de etanol 95% + 100 ml de H,PO, 85%. Completar 0 volume para 1000 ml com Agua destilada. Filtrar. Este reagente pronto apresenta cor acastanhada clara. Conservar em geladeira, em frasco escuro. Caso apés alguns dias apresente precipitado, pode ser novamente filtrado. Preparar solugdes padrao de albumina bovina nas concentragées de 20, 40, 60, 80 e 100 ug/ml. Adicionar em tubos de ensaio 0,5 ml de cada solu a0 padrao. Fazer em duplicata. Adicionar § ml do reagente de Bradford. Agitar. Para o tubo branco, adicionar 0,5 ml de agua destilada e 5 ml do reagente de Bradford. Aguardar 5 minutos e ler em espectrofotémetro, a 595 nm, zerando o aparelho com o tubo branco. Tragar a curva de calibra do e calcular o fator de calibragao (para detalhes consulte o Capitulo 2), Diluir o filtrado da cultura-amostra convenientemente com Agua dest lada. Proceder como na curva padrao. Calcular a concentracao protéica em mg/ml, Utilizar 0 método do Acido 3,5-dinitrossalicilico (Miller, 1959) para a determinacao dos agicares redutores, tendo glicose como referéncia. Dissolver 1,0 g de DNS em 30 ml de agua em banho-maria a 56 °C Dissbiver 30 g de tartarato de s6dio e potdssio em 20 ml de NaOH 2. Misturar as duas solugdes e completar 0 volume para 100 ml com agua des tilada: Adicionar aos tubos numerados de 1 a 6: 0,25 ml de solugéo padrio de glicose de concentragdes iguais a 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 3,0, 4,0 e 5,0 umoles/m! respectivamente. Fazer em duplicata. Em um tubo identificado como 5 (branco), adicionar 0,25 ml de tampao fosfato pH 6. Em todos os tubes, adicionar 0,25 ml de tampio fosfato 50 mM, pH 6, e 0,5 ml de reativo de DNS. Ferver por § minutos em banho-maria. Resfriar e adicionar 5 ml de 4gua. Ler as amostras a 540 nm, zerando o aparelho com 0 branco (8) Tracar a curva de calibragao e calcular o fator de calibracao.de solamente ¢ faclonamento de proteinas 215 los Procedimento — Em um tubo de ensaio, adicionar 1,0 ml de solugéo as- de amido a 1% em tampao fosfato 50 mM, pH 6. Colocar o tubo em as, banho-maria a SO °C. Adicionar 1 ml de solugdo de enzima conveniente- ra- mente diluida. Homogeneizar e rapidamente retirar 0,5 ml da mistura € aa- coloc: em tubo de ensaio contendo 0,5 ml de reativo de DNS (tempo zer0). Ap6s 10 minutos, retirar nova aliquota da mistura e adicionar em tubo contendo 0,5 ml de DNS (tempo de 10 minutos). Ferver os tubos por S minutos. Resfriar e adicionar 5 ml de agua. Ler a absorbancia, zerando 0 aparetho com o tubo do tempo zero. Calculo da atividade enzimatica — Dividir a absorbancia encontrada pelo. fator de calibragao. Dividir por 10 (10 minutos de incubagao). Multiplicar pelo fator de diluigao utilizado. Uma unidade de atividade enzimatica (U) é definida )+ como a quantidade de enzimas que produz 1 mol de acticar redutor por minu- ara to nas condicdes do ensaio, utilizando glicose como padrao. A atividade espe- cor cifica € calculada dividindo-se as unidades de atividade encontradas por ml de 36s meio pela quantidade em mg de proteinas por ml de meio (U/mg de proteina) Para detalhes consulte 0 Capitulo 5, 20, vu: rd. do da Colocar 200 mi de filtrado das culturas em banho de gelo. Adicionar ora lentamente, e sob agitagdo suave, 400 ml de acetona gelada (-20 °C, man. », tida em freezer por pelo menos 1 noite). Manter em banho de gelo por cerca de 20-30 minutos. Centrifugar 40-60 minutos em centrifuga refrigerada a 3.500 rpm. Desprezar o sobrenadante. Redissolver 0 precipitado em 5,0 ml sti- de agua destilada. Particulas de dificil dissolugao podem ser proteinas des- em naturadas e podem ser removidas por centrifugacdo. Medir o volume obti- do. Calcular a atividade amildsica. Calcular a recuperacao da atividade amilasica. Calculo da recuperacao': aa “ede ecuperacao = vida amilésica total p6s preciptagdo (Uiml_x volume) atividade amilisica total inicial (U/ml volume) * Para este microrganismo, é tipica uma recuperacao entre 70% e 80%. °C N . les- Utilizar uma resina trocadora ani6nica, DEAE-celulose. A DEAE-celulose é adquirida seca. © primeiro passo é a hidratagto da de resina. Um grama de matriz seca pode expandir para 5-50 ml de material ml inchado. Assim, incubar 10 g da matriz seca com cerca de 100 ml de 4gua >B destilada. Deixar por 3-4 dias a temperatura ambiente, agitando periodica- 20s, mente. Opcionalmente, pode-se hidratar a resina fervendo 0 material por de algumas horas. Nesse caso, tomar 0 cuidado de adicionar mais agua para de compensar a evaporagdo. Apés completa hidratacdo, aplicar o seguinte tra- B) tamento para carregar a resina: adicionar HCI para concentragao final de 0.1N e agitar a mistura suavemente por 30 minutos. Ap6s esse periodo,216 decantar, adicionar agua e decantar novamente. Repetir a operacio até obter pH neutro. Adicionar NaOH para concentracao final de 0,1 N e agi tar a mistura suavemente por 30 minutos. Repetir as lavagens e decant Goes até pH neutro. Equilibrar a resina com 0 tampio adequado. Nesse cas especifico o tampao serd fosfato 10 mM, pH 6,8. A resina esta pronta para ser empacotada. Esse mesmo tratamento serve para reciclar a resina apos o uso. Para empacotar a coluna, retirar 0 excesso de liquido (deixar aprox: madamente um volume da matriz e um volume de tampao). As dimensbes da coluna podem ser escolhidas de acordo com a resolucao desejada. Para uma boa resolucio, uma razao largura para altura de aproximadamente 1:10 é recomendada. Uma coluna 1,5 x 20 cm é adequada. Alguns mate riais econémicos podem ser utilizados para a confeccdo de uma coluna: seringa de vidro ou bureta, na qual se adapta uma ponta. Se usar esse tip de coluna adaptada, € necesséria a colocacao de um pequeno pedaco de li de vidro (manusear a 1a de vidro com luvas) para “segurar” a resina. Par fechar a coluna, fazer um nd em uma mangueira de silicone e tampar a ponta da coluna, O empacotamento da resina na coluna deve ser feito cu dadosamente e na temperatura na qual sera utilizada. Se a cromatografia for realizada a 4 °C numa cAmara fria, empacotar a resina ja dentro dt mara fria, Evitar choques térmicos ap6s 0 empacotamento. Ap6s o emp cotamento, eluir grande volume de tampao e testar 0 pH do liquido elu do. Nao deixar bolhas na coluna: elas prejudicam o fracionamento prot! co. Nao encher toda a coluna com a resina: deixar cerca de 5 cm livres para aplicagao da amostra e do tampao e para a colocagao de uma rolha na qual seré adaptada uma mangueira de silicone, por onde sera aplicado o tam pao de solucao salina de eluigao. A amostra deve estar limpida. Centrifugar ou filtrar caso a amostr apresente alguma turbidez. A amostra protéica deve, de preferéncia, estar em uma concentrago abaixo de 10 mg/ml. Diluir o material com tampio fosfato 10 mM, pH 6,8, utilizado para equilibrar a coluna, para conseguit a concentragao protéica adequada. Drenar a coluna até o tampéo atingira superficie da resina e fechar a coluna. Com o auxilio de uma pipeta Pasteu; aplicar delicadamente 3,0 ml da amostra na superficie da resina. Abrira coluna até a amostra ter entrado na matriz. Aplicar cerca de 3,0 ml de tan: po. Abrir a coluna até todo o tampao ter entrado na matriz. Adicionar mais 3,0 ml de tampio. A coluna esta pronta para a lavagem e eluigio das proteinas. Acoplar a mangueira de safda da coluna a um coletor de fragtes prdgramado para coletar fracoes de 2,5 ml. Enumerar as fragdes eluids. Deixar fluir aproximadamente 100 ml de tampao, coletando 0 liquido elu: do em fragdes de 2,5 ml em tubos de ensaio, para retirar todas as proteinas nao ligadas a resina. Para verificar se todas as proteinas nao ligadas foram eluidas, determinar a absorbancia a 280 nm. Eluir as protef-nas com un gradiente linear de NaCl (0-0,50 M), no mesmo tampao, com um fluxo de 15 ml/hora. Coletar fracoes de 2,5 ml. Determinar a absorbancia a 280 nm de todas as fragdes elufdas (cera de 80 tubos). Localizar as amilases submetendo as fragoes a anélise pelo método do DNS (ver acima). Construir o grafico relacionando 0 niimero dzaté gi ta- 1s0 ara ara ate te. po de ara ra fia da ui ara ual tra tar 20 uir ra dar jas Ses as. mm m de ca alo da te benzeno:n-butanol:piridin: es (glicose, maltose, isomaltose e outrc a¢io I uma a-amilase. fragdo contra a absorbancia a 280 nm, atividade amilisica e concentracao de NaCl (Figura 8.11). Reunir as fraces dos tubos com alta atividade ami. lésica (designada como amilases Ie Il). Concentrar as duas fragoes pot lio. filizacao e guardar 0 liofilizado em freezer para estudos posteriores Distribuigao de protesnas e ati Vidade amilésica apés cromatografia de troca ‘nica utilizando resina DEAF-celulose do Precipitado acetOnico dos filtrados de cultura de A. tamari. Atividade amildsica(°); absor bancia a 280 nm (_); NaCl (==), Amilase (Wim), Ax nm, NaCl x 10“\(M) método simples e rapido para det produzidos por um microrganismo, é a dos produtos de hidrélise do amido, terminar quais tipos de amilase sio anilise por cromatografia em papel \ dois tubos de ensaio (numerados 1 e 2) adicionar 1,0 ml de solucao de amido a 1% em tampao fosfato 50 mM, pH 6. Colocar em banho-maria ‘temperatura de 50 °C. Dissolver as fragdes I e II liofilizadas em cerca de 30 ml de tampao fosfato pH 6. Adicionar 100 ul da fragao I ao tubo Le 50 ul a fracdo II ao tubo Il. Homogeneizar e imediatamente retirar aliquotas de 100 il, inativando-as por fervura do material durante 5 minutos. Retirar novas alfquotas de 100 4l nos tempos 30 e 60 minutos, inativando-as da mesma maneira. Com 0 auxilio de capilares aplicar 15 ull de cada amostra tempos 0, 30 © 60 minutos) em papel cromatografico Whatman n° 1 ‘plicar 15 yl de solucdes padrao de glicose, maltose e isomaltose. Fazer ima corrida cromatografica descendente utilizando como sistema solven. ia:gua (1:5:3:3) por cerca de 15 horas. Retirar ? Papel cromatografico e revelar utilizando reagente nitrato de prata Trevelyan, 1950). No hidrolisado da fragdo I, sera possivel identificar a resenca somente de glicose, o que indicard ser essa amilase uma glicoami- se. No hidrolisado da fragao Il, haveré uma mistura de diferentes actica. »8 oligossacarideos), sugerindo ser a rocedimentos de isolamento ¢ facionamento de pretinas218 Métodos de Lab protocolo descrito acima é um tipico exemplo do uso de técnicas de fracionamento protéico quando o objetivo nao é a purificacao de protefnas. Como 0 objetivo era o de determinar quais tipos de amilases eram produ Zidas pelo fungo Aspergillus tamarii, foram realizados dois fracionamentos protéicos, que permitiram separar as amilases produzidas por esse fungo. Separadas, podem ser classificadas, analisando-se os produtos por elas for mados na hidrélise do seu substrato. As enzimas que hidrolisam as diferentes ligagdes glicosidicas existentes sao genericamente denominadas glicosidases (EC.3.2.1.-), ¢ estao presentes em varios tipos de células. Essas enzimas exibem alto grau de variabilidade com respeito a especificidade pelo substrato, localizagao e propriedades fisico-quimicas. B-glicosidases com especificidade multipla tém sido descr: tas em varios organismos (animais, plantas e microrganismos). Neste roteiro, descrevemos 0 processo de purificagio de uma B-glucosidase (EC.3.2.1.21) intracelular do fungo celulolitico Humicola grisea var. thermoidea. Essa ens ma € multiespecifica, sendo eficiente na hidrélise de diversos substratos: Brglucosideos, B-galactosideos e B-fucosideos. Os resultados apresentados neste roteiro pritico foram obtidos utilizando © fungo Humicola grisea var. thermoidea (Peralta et al., 1990). Esta cepa esti armazenada e disponivel no Laborat6rio de Bioquimica e Fisiologia de Microrganismos do DBQ/UEM. Em laboratério, o fungo é mantido a 45 °C em meio solido constituido por farinha de aveia 4% e gar 2% por cerca de 10 dias e conservado posteriormente em geladeira Inocular 10* esporos em cada um dos 20 frascos erlenmeyer de 250 mi, contendo 50 ml do seguinte meio: CaCO, 0,1%, peptona 0,1%, gelatin 0,259, extrato de levedura 0,8%, NaCl 0,5% e celulose 0,19, Desenvolve as culturas durante 22 horas, a 40 °C, sob agitac4o de 130 rpm. Separar as massa miceliais por filtragao a vacuo, lavando com Agua destilada. Juntar as massas miceliais e retirar 0 excesso de gua, prensando-as manualmen. te contra papel de filtro. Congelar por 24 horas. Colocar a massa micelial congelada em gral sob banho de gelo. Adicionar areia ou pérolas de vidro (cerca de 2 vezes 0 peso da mass. Triturar com o auxilio de um pistilo. Ressuspender a mistura em Agua des tilada. Centrifugar a 8,000 g durante 20 minutos em centrifuga refrigerada. Esse serd o extrato protéico bruto.ee ee ‘Solament¢ facionamento de protinas 219 Solucdo A: Na,CO, 2% em NaOH 0,1 N. Solugdo B: CuSO,.5H,0 1% em agua. } — Selucdo C: tartarato de sédio e potassio 19 em agua Solucao cupro-alcalina: misturar 50 ml de A+ 0,¢ ml de B + 0,5 ml de na hora do uso, Reativo de Folin-Ciocalteu: usar na concentracdo de 1 N Misturar 1 ml da amostra protéica convenientemente dilufda com 5 mi da Gaucho cupro-alcalina. Agitar vigorosamente. Esperar 1 minutos. Adicionar 025 ml de reativo de Folin-Ciocalteu. Agitar vigomecmente Esperar 30 minu cone, a £m espectrofotometro a 660 nm, zerando o aparcing bere um bran- (© no qual a solucao protéica foi substituida por 1,0 ny de agua ] i Preparar solugdes padrao de albumina bovina nas concentracdes de 20, Sicko, 80 © 100 ug/ml. Fazer em duplicata, Tracar'a cong de calibragao e calcular 0 fator de calibragio, » ats P-slucosidase &ensaiada por meio de um método desconti (ONPGIy NA? © SUPStato sintético o-nitro-enil-p D-glucopnonen (ONPGIu). (Colocar em um tubo de ensaio 0,5 ml de solugao 3,0 mM do substrato pre- Prnaido em tampao fosfato 50 mM, pH 6. Adicionar 100 pl a, solugao de enzi- interncevenientemente diluida, Incubar a reagao, a 50°C; duran 10 minutos. seemomper a reacio pela adicdo de 2,0 mi de sclugio saturada de tetraborato te sodio. Estimar a concentracao do ion onnitrofensinee liberado espectrofoto- soma amente a 410 nm. Uma unidade de atividade Pegluccece € definida ol por duantidade de enzima necesséria para produzir L0 nmol ue onitrofe- nol por minuto, sob as condigoes do ensalo. rrecipitar 0 extrato bruto com sulfato de aménia 75% (utilizar para ada 100 ml de extrato bruto, 49,5 g de sulfato de made, O sulfato de anh, 4 Gove ser adicionado lentamente ao extrato bran, mantido em banho de gelo. Agitar lentamente. Evitar a formagao de espuma, pois esta pang que esta havendo desnaturagao protéica, Manteno mistura em Panho de gelo por uma noite. Centrifugar o material « ne 000g durante 30 volume de ge centtifuga refrigerada. Dissolver 0 precipitado eer Pequeno volume de agua destilada,220 Dialisar 0 material contra 4gua por 24 horas, a 4 °C, com sucessivas trocas de agua. Utilizar uma membrana com cut off de 40.000 Da. Liofilizar 0 materia Redissolver em no maximo 5,0 ml de tampao fosfato 50 mM, pH 6. Procedimento para preparo da coluna Sephadex G-200*. A resina é geralmente adquirida seca. Para hidraté-la, adicionar dez partes de tampio fosfato de potdssio 50 mM, pH 6, e detxar sob agitacao por pelo menos uma noite. A agitacdo € importante, pois permite uma hidratagao uniforme da resina. Nao utilizar, entretanto, agitador magnético, pois pode ocasionr quebra do material da resina em particulas menores, o que interfere na cr. matografia. Para o empacotamento, € melhor retirar 0 excesso de liquido (deixar aproximadamente um volume da matriz e um volume de tampi0) Colunas de filtragao em gel sao geralmente longas e estreitas (altura cerca de 40 vezes o diametro) para permitir separacdo mais eficiente. Deve-se evitar, entretanto, o uso de colunas com didmetros inferiores a 1,0 cm, pois as inte rages das proteinas com as paredes da coluna podem. comprometer a sep ragdo. Uma boa opcao é o tamanho 2,9 x 90 cm (volume aproximado de 600 mi) Antes do empacotamento, retirar as bolhas da resina com o auxilio de uma bomba de vacuo. Retirar o excesso de tampio, e proceder como descrito para © empacotamento da coluna de troca iénica no roteiro pritico 2.1. Apéso empacotamento, lavar a coluna com varios volumes de tampao. Observar cuidadosamente a possivel presenga de bolhas e se 0 empacotamento foi feito de maneira homogénea. Para verificar se o empacotamento foi adeque do, adicionar um pequeno volume de uma solugao de blue dextran 2 mg/ml (0 volume maximo a ser aplicado deve ser 1% do volume total da coluna esse caso 6,0 mi). © corante deve eluir em no maximo 2 vezes o volume aplicado, ou seja, 12 ml. Blue dextran serve também para determinar o volt: ‘me morto da coluna. O volume morto refere-se ao volume necessario paraa eluigdo de particulas que nao entram em qualquer poro da resina de fit a0. Dessa forma, o volume morto define o menor volume no qual uma pro teina pode emergir da coluna. Aplicacao da amostra, eluicdo e coleta das fracdes. Trabalhar a 4% Aplicar, cuidadosamente, com 0 auxilio de uma pipeta Pasteur, o material obtido anteriormente em uma coluna de filtragao Sephadex G-200, com um volume de 600 mi (2,9 x 90 cm), equilibrada com tampao fosfato de potissio 50 mM, pH 6, mais azida 1,0 mM e EDTA 1,0 mM. Eluir o mate rial com o mesmo tampao com um fluxo de 15 ml/hora. Coletar fracdes de 3,0 ml. Determinar a absorbancia a 280 nm e a atividade de hidrélise sobre © substrato ONPGlu em todas as fragdes (Figura 8.12). Juntar as fragées com alta atividade enzimética. Medir 0 volume. Calcular a atividade B-glu cosidase. Calcular a concentragao protéica pelo método de Lowry Fara uma eicente separacio por fitracdo em gel, €essencial que a resina utlizada, ness caso uns Sephadex G-200, sea montada de maneira homogénea e sem a presenca de microbolhas. Uma ci na pode ser utlizada visas Vezes.Apds 0 uso, lavarexaustivamente com o tampao de equilib 38 Conarsolucio de azda sédica 0.02%, Manter a coluna fechada, de preferncia em cAmara fl,al de a de ceca = zs ae nr 3 f z p*. Lo ee 0 2 8075001810 Numero da fragéo Distribuigao de proteinas Widade Brglucosidase dos extratos celulares, pds cromatografia de filtragao em Sephadex G-200. As proteinas foram eluidas com tam fosfato SO mM, pH 6, fluxo de 15 mi/hora; fragdes de 3,0 ml foram coletadas. bsorbancia a 280 nm ( );atividade B-glucosidase (®), Montar uma coluna de DEAE-celulose 2 x 30 cm (ver procedimento no roteiro anterior) e equilibré-la com tampao fosfato de potéssio 50 mM, pH 6. Aplicar o material obtido na cromatografia de filtracdo. Lavar a coluna com cerca de 100 mi de tampao. Coletar fracdes de 5,0 ml. Eluir as proteinas ddsorvidas com gradiente linear de NaCI dissolvido no mesmo tampao com um fluxo de 50 mi/hora. Coletar fragdes de 5,0 ml. Determinar a absorbancia a 280 nm e a atividade de hidrdlise sobre o substrato ONPGIu em todas as fragdes (Figura 8.13). Juntar as fragdes com alta atividade enzi- matica. Medir 0 volume. Calcular a atividade B-glucosidase. Calcular a con- entragao protéica pelo método de Lowry. Dialisar contra agua por pelo menos 12 horas. Liofilizar o material. Guardar congelado. ca 0.45: 0.40 f 0.35 glucosidase (Umi W) 10eN © ose +.0,00 0 2 8640 «660810 Numero da fragao Cromatografia de troca JOnica em DEAE-celulose das frases com atividade glucosidase, apés fracionamento em Sephadex G-200, A eluigdo fot realizada com um sradiente linear de NaCl em tampa fosfato 50 mM, pH 6. Absorbincia a 280 nm ( vidade B-glucosidase (°); NaCl ( 21Ao realizar um procedimento de purificagdo de proteina, ¢ imprescin divel o acompanhamento da eficiéncia de cada método de fracionament € da recuperacao da proteina em estudo. Assim, para cada uma das etapas, fazer a determinacao de (a) quantidade total de proteina, (b) atividade enzimética total, (©) atividade enzimatica especifica, (d) fator de purifice (G80 e (e) recuperacao da atividade. Com esses dados, construir uma tabela Tesumo como a que esté mostrada na Tabela 8.8, Purificacdo da B-glucosidase intracelular de Humicola grisea. Beolucosidase Volume Proteina Etapas Unidades Unidades por Grau de _Rendimento (id (9) totais mg proteina purificacio —(%) Extrato bruto 320 641,50 21215 0,33, 100 Precipitagso com 75%6 de sulfato de aménia -35——416,60 205,550.49. 1s 7 Sephadex G-200 79-2140 111,95 5,23 158 33 DEAE-celulose fragio I 82 460 7525 16,36 49,6 5 A Tabela 8.8 mostra que a enzima foi purificada cerca de 50 vezes, com uma recuperacéo de aproximadamente 35%. Para verificar a homogeneidade da fre Gio protéica que foi obtida, utilizar dois métodos eletroforéticos: eletroforex no desnaturante para proteinas acidas e eletroforese desnaturante SDS-PAGE. Com SDS-PAGE ¢ possivel também estimar o PM da proteina. mi Solucdo A — TRIS 9,75 g; HCI 1 M, 12 ml; TEMED acertar 0 pH em 8,7 Solucao C — Acrilamida 9,6 g; bis-acrilamida 0,32 g; 4gua para 20 mi acertar o pH em 8,9%. Solugao F (tampao de corrida) — TRIS-HCI 50 mM (3,04 g/500 mi glicina 36 mM (1,35 g/S00 ml); acertar o pH em 8,9. Solugdo G — Persulfato de am6nia 35 mg/25 ml. Preparar na hora do uso. £ 0 catalisador da polimerizacao. O persulfato de aménia nao € muito estdvel. Com o tempo ele se degrada a sulfato, que ndo tem agdo cataliss dora. Se o persulfato for velho, pode ser necessdrio aumentar a quantidade no preparo da solucdo G. Guardar no freezer em frasco bem vedado. A degradacdo € maior a temperatura ambiente e na presenga de umidade. *Cuidado ao manusear acrilamida e bis-acrilamida; so compostos neuro- t6xicos. Usar mascara e luvas. Apés a polimerizagao nao sao neurotoxicos. 50 yl; gua para 25 | i4 } __ Misturar 5,6 ml da solugao A + 7,5 ml da solucdo C + 9,4 ml de égua + in- 22 ml da solucao G. Essa quantidade é para um sistema em placa 20 x 20 cm. nto As quantidades podem ser aumentadas ou diminufdas, proporcionalmen- vas, te, conforme a necessidade ade sel _Misturar 50 pl da amosta (contendo aproximadamente 50 1g de pro teina) + 50 ul de sacarose 40% preparada no tampio da corrida + 5 ul de J azul de bromofenol 0,025 i Aplicar a amostra no pogo do gel, conforme mostra a Figura 88. Aplicar a amostra pelo menos duas vezes: ap6s a corrda eletroforética, uma serd corada com coomasse biue e a outra sera utilizada na deteccio da atividade Prglucosidase. sto) Para um sistema de eletroforese em disco, utilizar 2 mA/tubo até o indica- dor entrar no gel e 4 mA/tubo posteriormente. Caso sea um sistema em placa, utilizar 20 mA até o indicador entrar no gel e 50 mA posteriormente. Com o auxilio de uma espitula, remover o gel do sistema. Se o sistema eletroforético for em placa, cortar 0 gel em fatias, de acordo com a aplica- ao feita Corante Coomassie blue: coomassie brilliant blue R 0,1% em uma mis- roa tura de metanol 50% e acido tricloroacético 20%. fre Solugao de descoloracao do gel: 80 ml de dcido acético, 250 ml de eta- rese nol e 650 ml de agua destilada. GE Solucdo conservante do gel: cido acético glacial 7% em agua. Colocar o gel em uma cuba e deixar em contato com a solucdo coran- te por cerca de 12 horas (uma noite). Retirar o corante, lavar a cuba e o gel com agua destilada e adicionar a solugdo descolorante. Trocar a solucdo ml descolorante algumas vezes caso queira acelerar 0 processo de descolora- g40. Apés a descoloragao, 0 fundo do gel ficara claro e a banda protéica, mi corada de azul (Figura 8.14). Apés a descoloracao, conservar 0 gel em solugdo de acido acético 7%, ni) Apés a eletroforese para proteinas acidas, lavar 0 gel com solucéo 25% de dlcool isopropilico em tampao fosfato SO mM, pH 6, por 30 minutos e duas vezes com tampao fosfato, 30 minutos cada vez, Mergulhar o gel por Thora, a $0 °C, em Solugao de substrato preparada no momento do uso da seguinte forma: dissolver 6-bromo-naftil-B-D-glucopiranosideo em difor- mamida (20 mg/ml). Adicionar 0,07 mg/ml de fast blue B. Adicionar 500 pl 10: dessa solucao a 25 ml de tampao fosfato 50 mM, pH 6. A banda protéica com atividade B-glucosidase apresenta cor purpura (Figura 8.14B).224 Métodos de Labora om Bioguimica Solugdo de acrilamida: acrilamida 28 g; bis-acrilamida 2,0 g; gua qsp 100 ml Solugdo de persulfato de aménia 10% em agua: preparar na hora do uso. Tampao de eletroforese (diluir duas vezes para usar): TR1s 0,05 M; gli cina 0,5 M; SDS 0,2%; acertar o pH em 8,3. Misturar 9,5 ml da solugdo C + 10 ml do tampao Tas 1,5 M, pH 8,3 + 0,40 ml de SDS 10% + 0,10 ml de TEMED + 0,40 mi de persulfato de amé. nia 10% + 20 ml de agua Misturar 100 yl da amostra + 100 ul do tampao de corrida sem diluit + 0,1% de B-mercaptoetanol. Ferver 5 minutos. Adicionar 3 ll de azul de bro- mofenol 0,02%. Utilizar como marcadores de peso molecular as seguintes proteinas: soroalbumina bovina (PM = 66.000), ovoalbumina (PM = 43.000), tripsinogé nio (PM = 24.000), B-lactoglobulina (PM = 18.400) e lisozima (PM = 14.300) () “a 8) © (0) Eletroforese em get de pollacrilamida. A e B: Eletroforese no-desnaturante para proteinas dcidas em gel de poliacrilamida 7,596. A: Coloracdo com coomassie brilliant blue; teste para atividade B-glucosidase usando 6-bromo-2-naftl-f-D-glucopiranosideo como substrato; C € D: eletroforese sob condicoes desnaturantes (SDS-PAGE). Em Cos seguintes marcadores de peso molecular foram utilizados: (1) soroalbumina bovina, 66 kDa; (2) ovoalbumina, 43 kDa; (3) tripsinogénio, 24 kDa; (4) B- lactoglobulina, 18,4 KDae (6) lisozima, 14,3 kDa. Em D, B-glucosidase corada com coomasse brilliant bluemi. 3+ nd- oge 00), illiant sideo kDa e imentosdeisolamentoe fracionamento deproteinas Preparar 100 yl da mistura de marcadores cada um na concentragdo de 10 g/t. Preparar os marcadores para aplicagao no gel de poliacrilamida como descrito para 0 preparo da amostra, Proceder como na eletroforese ndo-desnaturante. A banda protéica apresentara coloracao azulada (Figura 8.14D). Com 0 auxilio de uma régua medir a distancia percorrida pelo corante azul de bromofenol. Medir a distdncia percorrida pelos marcadores de peso molecular (Figura 8.14C). Calcular o Rf (mobilidade relativa), dividindo a distancia percorrida por marcador per se pela distancia percorrida pelo corante. Construir um grafico, plotando na abcissa os valores de Rf e na ordenada os logaritmos dos pesos moleculares dos padroes (Figura 8.9). Medir a distancia percorrida pela B-glucosidase recém-purificada. Calcular seu Rf, interpolar na curva de calibracao e determinar seu peso molecular. E conveniente usar mais de um método na determinagao do PM. Assim, além da determinacdo do PM utilizando eletroforese desnaturante, deter- minar 0 PM da proteina por cromatografia de filtracao. Utilizar uma coluna de Sephadex G-100 com volume de 70,7 ml (1 x 90 cm), Equilibrar a resina com tampio fosfato de potdssio 100 mM, pH 7, mais NaCl 100 mM (a adicao do sal impede qualquer tipo de interagdo hidrofs- bica entre a resina e as proteinas, o que poderia retardar a eluigio). Preparar uma solugdo 2 mg/ml de blue dextran 2000 no mesmo tampao da coluna. Aplicar 1,0 mi na coluna. Coletar amostras de 1,0 ml com um fluxo de 50ml/hora, Determinar Agro nm das fragdes coletadas. Calcular 0 volume morto, medindo 0 volume de todos 0s tubos até o tubo onde a Ao nm for maxima, Utilizar as seguintes proteinas para calibragao da coluna: soroalbumina bovina (PM = 66.000) ovoalbumina (PM = 43.000), anidrase carb6nica (PM = 29.000) e lisozima (PM = 14.300). Preparar uma solug3o na concen- tagio de 3 mg/ml de cada uma das proteinas padrao no mesmo tampao com o qual a coluna est equilibrada. Aplicar 1,0 ml de cada padrao. Coletar amostras de 1,0 ml com um fluxo de 5,0 ml/hora. Determinar absorbancia a 280 nm das fragdes coletadas. Determinar o volume de elui- gio (V,) de cada padrao. Lavar a coluna com tampao de eluigao, deixando passar cerca de 80-100 ml do tampao antes da aplicago do novo padrao. Construir grafico V,/V, versus logaritmo do peso molecular (Figura 8.4). Aplicar 1,0 ml da amostra. Eluir com tampao fosfato. Coletar amostras de 10 ml com um fluxo de §,0 ml/hora. Determinar a absorbancia a 280 nm das 25226 fragoes coletadas, Calcular V, da proteina. Interpolar V/V, da B-glucosidase na curva de calibracao da coluna e calcular o seu peso molecular. Comparar 0 valor do peso molecular obtido na eletroforese desnaturante. © protocolo experimental mostrado nesse roteiro pratico é um tipico exem plo de purificacio de proteinas. O objetivo principal era o de obter uma fragéo homogenea da B-glucosidase de Humicola grisea. Apés a seqiiéncia de fraciona- mentos protéicos, € essencial analisar a homogeneidade da fragao protéica que foi obtida por pelo menos dois métodos diferentes. 1. Alexander, R. R. e Griffiths, J. M. — Basic Biochemical Methods. 2° edigao John Wiley & Sons, Inc. New York, 1993. 2, Bollag, D. M.; Rozycki, M. D. e Edelstein, S. J. — Protein Methods. 3* edi ao, John Wiley & Sons, New York, 1996. 3. Bradford, M. — A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of dye-binding Analytical Biochemistry 72, 248-54, 1976. 4. Creighton, T. 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