CONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL Se poate realiza: 1. la temperatura camerei 2. prin liofizare 3. prin refrigerare 4, prin congelare fi, ‘materialului seminal la temperatura camerei Se poate realiza: a, pentru o perioada scurta de timp; , pentru o perioada lunga de timp, a. Conservarea materialului seminal la temperatura camerei pentru o perioada scurtd de timp Pe spermé bruté: ~ imediat dupa recoltare materialul seminal este supus unui examen general si apoi se repartizeaza in doze; = se menfine 3-4 ore. Pe sper lilucatcs: = imediat dupa recoltare materialul seminal este supus unui examen general; = serealizeaza dilusia materialului seminal conform speciei; = sperma se las la echilibrat 2-3 ore; se utilizeaza dupa 2-3 ore; Aceasta metoda prezints urmitoarcle avantaje . ~ se realizeazd insiménjarea unui numar mare de femele; = impune utilizare mai rafionala a masculilor de reproductie; Amnbele metode se folosesc in efectivele de ovine. b. Conservarea materialului seminal la temperatura camerei pentru 0 perioada lunga de timp Se realizeaza prin anabioza acid’, Ph-ul ugor scazut conduce la acest tip de conservare. Prin anabiozd se infelege lipsa oricdror fenomene chimice gi biochimice observabile Diluantul se barboteaza 10 minute cu CO, purificat pind cand pH-ul ajunge Ia 6,2-6,3. Aceasti scddere se datoreaz& acidului carbonic rezultat in ‘urma reactiei dintre CO; si apa (HO) din diluant.CO;+H,0=H,CO, La taur in urma barbotarii mediul de dilufie ajunge la pH 6,3, apoi dup dilutie ajunge la 6,4. Materialul seminal astfel diluat este introdus in fiole brune, se inchid la flacdra, se individualizeaza, se pot pastra la temperatura camerei and la 6 zile/ capacitatea fecundants menfindndu-se ridicatd 4 zile. in momentul insiménfari, se deschide o fiold care se lasd la temperatura camerei 10 minute, apoi se utilizeaza. . Este 0 metoda ce nu se mai utilizeaz’. Conservarea materialului seminal la temperatura de 15-17°C, se utilizeaza pentru sperma de vier. Se realizeaza cu ajutorul unor diluanfi specifici, in functie de compozitia lor materialul seminal putndu-se conserva pana la 7 zile. 2. Conservarea prin liofizare Presupune uscarea materialului seminal la rece si in vid. Se poate pastra o perioada lunga de timp Nu se mai_utilizeazi pentru cd reanimarea spermatozoizilor are loc in Proportie de 10-15%. 5 3. refi Prin aceast4 metoda materialul seminal se conserva: -- > Gzzile (4 zile capacitate fecundanta) pentru sperma de taur; “ ~ 4 zile pentru sperma de berbec; - ~ 24-48 de ore pentru sperma de armasar sivvier. La_taur — dupa dilutie se repartizeazi in fiole sau eprubete de 1 ml individualizate, se inchid la flacdra sau cu dop de plutd, se introduc in cutii de material plastic si apoi la frigider unde se pastrazi 3-4 ore. in continuare ‘materialul seminal poate fi pastrat la frigider sau in termosul cu gheati, lizi izoterme $i se expediaza in teren, pastrindu-se pana la folosire. La_berbec — dupa dilujia finali, materialul seminal se introduce in eprubete ce se inchid cu dop, se conserva la fel ca la taur. Este o metoda utilazata mai des la ovine gi rar la taurine fn zonele greu accesibile. r 4. Con jalului seminal pri el ~ este cea mai rispandita metoda, se uilizeazd pentru toate speciile; - ofera cele mai bune rezultate; - pentru conservarea prin congelare se pot folosi toate cele trei tipuri de diluangi: salinisintetici, pe baza de lapte. {n diluanti folosifi se introduce ca substanté crioprotectoare glicerolul (elicerina), Aceasta polarizeazi molecula bipolar’ de apa schimbind Proprietatile biochimice ale apei, facdnd ca aceasta sa cristalizeze foarte fin, ingheajé fira sA-si mareasca volumul: congelare (cristalizare) vitroasa,Glicerolul extrage apa liber din celula seminala si prin congelare nu se ezioneazé membrana celulara. Glicerolul se va adduga in anumite etape gi la concentratii diferite pentru c& peste anumite limite si la temperaturi usor crescute devine toxic pentru ‘spermatozoizi. Indiferent de tipul diluantului se vor prepara 2 fractiuni: {n cazul diluantilor salini: Fractiunea A contine: - 2,9 citrat de Na = 20 mi galbenus de ou - 80 ml apa bidistilata - antibiotice Eractiunea B contine:_-2,9 citrat de Na ~ 20 ml galbenus de ou = 14-16 ml glicerol ~ 64-66 mi api bidistilata ~ antibiotice {in cazul diluantilor pe baza de lapte: glicerolul intra in proprtie de 10%. La congelarea materialului seminal in granule glicerolul intra in proprtie de 45%. Dupa prepararea celor dowd fractiuni acestea se vor pasta astfel: = 0 cantitate mic& 5-10% din fractiunea A se va pistra la 37° C, pentru prima dilutie; = cea mai mare parte din fractiunea “A se va pastra la temperatura camerei pentru a doua dilute; - diluantul B (ce confine glicerol) in totalitate se va pastra la frigider pentru a treia dilufie. Prima dilute (dilutia iniila) ~ se realizeaza in proporje de 1/ in stcla speciala de dilutie cu pereti dubli intre care se afld apa la 37°C. Dupa recoltare se efectueazi examenul general al materialului seminal, se refine o cantitate mica de sperma pentru numardtoare gi alte examene, Sperma se introduce in sticla de dilutie unde se realizeaza dilutia initial in raport de 1/1 cu fractiunea A a diluantului pastrata la 37°C. Se goleste apa dintre perefii sticlei, se lasi la temperatura camerei 10-20 minute. in acest interval se face numératoarea si alte examene speciale gi se calculeaza raportul de dilute final: RDF+C1/C2x MxV fn care: ~ Cl = concentrafia spermei brute in spermatozoizi (pe ml); - C2=numirul de spermatozoizi pe care dorim si-i avem in doz;- M = mobilitatea minima a spermatozoizilor dup’ decongelare (0,35%); - V_ =volumul dozei de spema (ml) Dilutia a doua (intermediara) - se realizeaz dup 20 minute cu fractiunea A a diluantului pastrata la temperatura camerei pnd se ajunge 1a raportul ¥4 din RDF calculat. Imediat materialul seminal astfel diluat se introduce la frigider unde se pastreaza alaturi de fractiunea B timp de o ord. Dilutia finald — se realizeaz dupa | ord cu fractiunea B ce se adauga in mod fractionat addugdndu-se 10%, 20%, 30% pana se atinge RDF calculat. Dupé dilufia final materialul seminal repartizat in doze, se introduce la frigider pentru echilibrare 4-20 de ore in functie de tehnologie. in timpul echilibrarii glicerolul are posibilitatea si organizeze mediul de diluie in vederea congelarii Congelarea propriu zis — care in functie de modul prin care se trece peste punetul crioscopic poate fi 1. rapida: a.in fiole b. in paiete ¢. im granule , 2. lenté Congelarea poate folosi unul din urmatorii agengi criogeni ~ zipada carbonica; realizeazi o temperatura de: -79°C -aer lichid: realizeaza o temperatura de -183°C - azot lichid : realizeaza o temperatura de - 196°C ~ heliu lichid: realizeaz& o temperatura de - 270° C. a. Congelarea in fiole Dupa dilufia finala, se calculeaz4 necesarul de fiole pentru fiecare ejaculat, Fiolele se individualizeaz4 cu ajutorul unei magini de imprimat inscriptionandu- se: = numarul si codul laboratorului; ~ numele, codul taurului, nr matricol, rasd; = data congelarii, Fiolele se umplu cu seringi semiautomate se inchid la flaca, se fixeaz pe tije port fiola si se introduc la frigider pentru echilibrare 6-20 de ore. Dupa echilibrare tijele se ageazd pe un gratar metalic situat la 1 om deasupra azotului timp de 8-10 minute realizéndu-se precongelarea in vapori de azot lichid. Congelarea se face prin scufundarea tijelor port-fiole in azot lichid, Verificarea calitatii materialului seminal. La 24 de ore, se preleveazd 2-3 fiole/ejaculat, decongelare rapids, analiza microscopic, aprecierea mobilitatii Daca mobilitatea este:> 30% - fiolele se trec fn containerul de stocare, unde se pastreazA pans la livrare; <30% - fiolele se aruncé. b. Congelarea in paicte Paietele sint-confectionate din material plastic rezistent Ia variafi mari de temperatura. ‘Dupa capacitate paietele pot fi: = mari: Im! = mijlocii: 0,5 ml = mici: 0,25 ml Toate paietele au lungimea de 133 mm. Dupa dilufia final se caleuleazé numérul de paicte pe ejaculat iar apoi s¢ individvalizeaza: numele, — inijiala —laboratorului, numele si codul animalului,rasa data congelati ‘Umplerea paietelor se poate realiza: - manual = sub clopot de vid = automat 5 Unul din capetele paietei poate fi inchis la ultrasunete caz in care dupa umplere celilalt capat se va inchide cu o pudra de alcool polivinilie ce va forma im dop iva servi ca piston in momental instmanfarii atificiale. Sau unul din Capete poate fi inchis cu un dop winal: 2 straturi de bumbac intre care se afla pura de alcool polivnilic — folost ca piston- iar dupa umplere cellalt capat ¢ Inchis la ultrasunete. Dupa umplere paietele sunt aezate pe rame metalice/lemn gi introduse in vitrine frigorifice pentra echilibrare (4-20h). ‘Dupa echilibrare, ramele cu paiete se ageazi pe un erdtar metalic situat 1a 1-2mm sub nivelul azotului lichid- se realizeaza precongelarea in vapori de azot lichid 7-9 minute. Paietele sunt introduse in recipienti din material plastic (gobleti) care se scufund’ in azotul lichid din containerul de congelare — congelarea propriu-zis ‘Dupd 24 ore se decongeleazi 2-3 paicte pe ejaculat pentru a se verifica nfobilitatea ‘Dac mobilitatea este: > 30% - paietele se trec in containerul de stocare, unde se pastreazi pind Ia livrare; ‘< 30% - paietele se aruncd c. Congelarea in granule ‘Dupa diluare materialului seminal se raceste 90 minute la 13°C gi apoi se echilibreaza la frigider 4-5 ore. Congelarea se realizeaza in alveolele unei plici de z4pada carbonicd la - 79°C.Sperma se repartizeazi in doze de 0,1 ml (10 mil. de spermatozoizi mobili) cu ajutorul unei seringi semiautomate, Placa se acoperd imediat cu vata sterila, se asd 7 minute, apoi granulele se recolteaz4, se ambaleazi asernanétor comprimatelor in foli, se individualizeaza, se introduc in recipienfi din material plastic si se scufunda in azotul lichid din containerul de congelare. ‘Dupa 24 de ore se decongeleazd 2-3 granule si se verified mobilitatea. ‘Daca mobilitatea este: > 30% - granulele se trec in containerul de stocare, unde se pastreazdi pind la livrare; < 30% - paietele se aruncé. Pentru ins&ménfare sunt necesare fiole cu diluant. Fiola cu diluant se fncdlzeste la 37°C, se deschide gi se introduce granula care se decongeleaza $i apoi este aspirat8 in pipeta de insémanfare. Congelarea lent ntr-un vas mare se pune alcool 96° cu temperatura de $°C, un termometru si paieiele/fiolele pe care dorim si le congelam. Ulterior se va adauga zapadi carbonied, cea ce face ca temperatura si scada treptat ‘Temperatura scade cu: a. 1 grad/minut de la 5°C Ia -15°C b. 2 grade/minut de la -15° C la - 30°C cc. brusc de la- 30°C la -79° C, prin adaugare de zapada carbonicd in cantitate mai mare Sperma se va pastra in recipiente cu circuit inchis in care se va introduce zépada carbonicd la 34 ile pentru a mentine o temperatur& constant de -79°C. ‘Acest interval de temperatura trebuie parcurs repede si in sens invers, decongelarea realizéndu-se in 3 minute iar insimanjarea artificial in ‘urmatoarele 5 minute. Se prefer congelarea rapida pentru a se depasi intr-un timp cét mai scurt zona criticd dintre -3° si - 60°C. Pentru fiecare fiold/paiet care se decongeleaza, trebuie si se asigure un volum de 250-300 ml de apa la 37°C. Paietele au aceeasi lungime de 133 mm,