T NG Quan Hydrogel PDF

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BÙI THANH THÁI
ĐIỀU CHẾ IN SITU HYDROGEL COMPOSITE

GELATIN-CHITOSAN/BCP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
KHOÁNG HÓA TRONG DUNG DỊCH SBF
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

NGÀNH HÓA HỮU CƠ
Mã số: 60440114
2016
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
BÙI THANH THÁI
ĐIỀU CHẾ IN SITU HYDROGEL COMPOSITE

GELATIN-CHITOSAN/BCP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG
KHOÁNG HÓA TRONG DUNG DỊCH SBF
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

NGÀNH HÓA HỮU CƠ
Mã số: 60440114
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. TRẦN NGỌC QUYỂN
2016
Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ môn Hóa học ------  ------
LUẬN VĂN ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU
VÀ ỨNG DỤNG – VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆT NAM – TP. HỒ CHÍ MINH
Nội dung nhận xét:

Cán bộ hướng dẫn khoa học: TS. Trần Ngọc Quyển
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Chủ tịch: ...............................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Phản biện 1: .........................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Phản biện 2: .........................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Ủy viên: .................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
Thư ký: ..................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
................................................................................................................................
HỘI ĐỒNG CHẤM BẢO VỆ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Ngày…..tháng…..năm 2016
LỜI CẢM ƠN
----------
Sau một thời gian học tập và nghiên cứu tại ĐH Cần Thơ cũng như Viện
Khoa học Vật liệu và Ứng dụng tôi đã học tập được nhiều kiến thức và có
nhiều trải nghiệm sâu sắc. Để hoàn thành nghiên cứu này, tôi xin gửi lời cảm
ơn chân thành đến:
Ts. Trần Ngọc Quyển Thầy đã dành bao tâm huyết và kiến thức của
mình để dẫn tôi đi từng bước trên con đường nghiên cứu khoa học và giúp tôi
học được nhiều điều trong cuộc sống.
Quí Thầy Cô Khoa Khoa học tự nhiên đã tận tình giảng dạy tôi trong
suốt thời gian học tập.
Tập thể các bạn phòng 39, 40 Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng,
các anh chị học viên cao học K21 đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong học tập và
nghiên cứu.
Cuối cùng, tôi xin gửi thành quả này đến gia đình, Cha Mẹ tôi, những
người luôn thầm lặng bên tôi, ủng hộ và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi
hoàn thành đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn!

Cần Thơ, ngày 25 tháng 5 năm 2016
Bùi Thanh Thái

TÓM TẮT
Trong lĩnh vực chữa lành các khuyết tật về xương, các vật liệu
composite được xem là có tiềm năng về chữa lành và tái tạo mô xương bị tổn
thương bởi sự cung cấp ion Ca2+, PO43- từ các hạt nano BCP để tăng cường
quá trình lành xương. Trong nghiên cứu này, hydrogel composite gelatin-
chitosan chứa các hạt nano BCP được điều chế để tái tạo xương. GTA, CHPA
được tổng hợp thông qua tác nhân ghép cặp EDC tại pH = 5 - 6 và được xác
định bởi 1H-NMR. Các hạt nano BCP được tổng hợp bằng phương pháp sóng
siêu âm với tỉ lệ Ca/P = 1,57 trong môi trường pH = 7 và được xác định bởi
SEM, XRD. Hàm lượng TA trong GTA và HPA trong CHPA được xác định
bằng quang phổ kế UV-Vis. Hai dẫn xuất của gelatin, chitosan (CHPA, GTA)
và các hạt nano BCP được sử dụng để điều chế hydrogel composite dưới sự
hiện diện của enzyme HRP và H2O2. Hydrogel GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP được đặc trưng bởi thời gian gel hóa, khối lượng
suy giảm trong dung dịch PBS trong 762h. Đánh giá khả năng khoáng hóa của
vật liệu sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày. Và sau đó, vật liệu được
mô tả bằng XRD, SEM và EDS. Đánh giá tương hợp tế bào của vật liệu thông
qua sự phát triển tế bào gốc của thỏ trên vật liệu. Cuối cùng, vật liệu được cấy
vào đùi thỏ trong 4 tháng và đánh giá lành xương bằng micro-CT.
Từ khóa: hydrogel, hydrogel composite, TA, HPA, GTA, CHPA, hạt nano
BCP, HRP, H2O2, EDC, SBF, PBS.
i
ABSTRACT
In the field of healing bone defects, several kinds of composite materials

are potentially considered in healing and regenerating damaged bone tissue by
providing Ca2+, PO43- ion from BCP nanoparticles to increase bone healing
process. In this research, the BCP nanoparticles loaded gelatin/chitosan
hydrogel composite was prepared for bone regeneration. The gelatin-tyramine
(GTA) and chitosan-(4-hydroxyphenyl acetic acid) (CHPA) were synthesised
by using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) coupling
reagent in solution pH = 5 - 6 and these products were identified by 1H-NMR.
The biphasic calcium phosphate (BCP) nanoparticles were synthesized using
an ultrasonic assisted process with rate Ca/P 1,57 in pH = 7. The product was
ascertained by SEM, XRD. The content of tyramine (TA) in gelatin-tyramine
(GTA) and 4-hydroxyphenylacetic acid (HPA) in chitosan-4-hydroxyphenyl
acetic acid (CHPA) were confirmed by UV-Vis. Two derivatives of chitosan
and gelatin (chitosan-4-hydroxyphenylacectic acid (CHPA), gelatin-tyramine
(GTA)) and BCP nanoparticles were utilized to prepare the hydrogel
composites via enzyme horseradish peroxidase (HRP)-mediated reaction in the
presence of a small amount of hydrogen peroxide (H2O2). Hydrogel GTA-
CHPA and hydrogel composite GTA-CHPA/BCP were characterized with
gelation times, degradation weight in phosphate buffer saline (PBS) after 762
hours. The material mineralization ability was evaluated when it was soaked in
stimulates body fluid (SBF) after 28 days. And then the materials were
characterized by XRD, SEM and EDS. The materials were also assessed with
the cytocompatibility via cell proliferation of rabbit stem cells on the
materials. Finally, the material was implanted into rabbit femur for 4 months
and evaluation of bone quality by micro-CT.
Key words: hydrogel, hydrogel composite, tyramine, 4-hydroxyphenyl
acetic acid, gelatin-tyramine, chitosan-(4-hydroxyphenyl acetic acid), biphasic
calcium phosphate nanoparticles, horseradish peroxidase, hydrogen peroxide,
1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide, stimulates body fluid,
phosphate buffer saline.
ii
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, các công
việc được trình bày trong luận văn là do tôi thực hiện, kết quả thu được trong
quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa được ai công bố.
Cần Thơ, ngày 25 tháng 5 năm 2016

Học viên cam kết
Bùi Thanh Thái
iii
MỤC LỤC
TÓM TẮT ........................................................................................................... i

ABSTRACT ...................................................................................................... ii
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ ....................................................................... iii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iv
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... vii
DANH MỤC HÌNH ........................................................................................ viii
DANH MỤC PHỤ LỤC.....................................................................................x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ........................................................................... xi
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ......................................................................................1
1.1 Lý do chọn đề tài ..........................................................................................1
1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu ................................................................1
1.2.1 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................1
1.2.2 Phạm vi nghiên cứu ...................................................................................1
1.3 Ý nghĩa khoa học .........................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN ..............................................................................3
2.1 Chitosan ........................................................................................................3
2.2.1 Nguồn gốc của chitosan trong tự nhiên .....................................................3
2.2.2 Đặc điểm cấu tạo .......................................................................................3
2.2.3 Tính chất ....................................................................................................4
2.2.4 Ứng dụng của chitosan trong y sinh ..........................................................5
2.2 Gelatin...........................................................................................................7
2.2.1 Nguồn gốc của gelatin trong tự nhiên .......................................................7
2.2.2 Khái niệm...................................................................................................7
2.2.3 Phân loại gelatin ........................................................................................8
2.2.4 Tính chất vật lý ..........................................................................................8
2.2.5 Tính chất hóa học.......................................................................................8
2.2.6 Ứng dụng của gelatin trong y sinh...........................................................10
2.3 Hydrogel .....................................................................................................10
2.3.1 Khái niệm.................................................................................................10
2.3.2 Phân loại ..................................................................................................11
2.3.3 Cơ chế xúc tác vòng của enzyme HRP với sự hiện diện H2O2 ...............16
iv
2.3.4 Tính chất hydrogel ...................................................................................17
2.3.5 Ứng dụng hydrogel trong y sinh ..............................................................19
2.4 Hydrogel composite ....................................................................................22
2.4.1 Khái niệm.................................................................................................22
2.4.2 Vật liệu composite trong tái tạo xương ...................................................22
2.5 Giới thiệu về thành phần, cấu tạo của xương và Biphasic calcium
phosphate (BCP) ...............................................................................................23
2.5.1 Thành phần, cấu tạo của xương ...............................................................23
2.5.2 Biphasic calcium phosphate ....................................................................24
2.6 Tình hình nghiên cứu hydrogel và hydrogel composite trên thế giới ........25
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ........................................................................27
3.1 Phương tiện nghiên cứu ..............................................................................27
3.1.1 Hóa chất ...................................................................................................27
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................27
3.2 Các phương pháp khảo sát vật liệu .............................................................28
3.3 Quy trình tổng hợp ......................................................................................28
3.3.1 Tổng hợp BCP .........................................................................................28
3.3.2 Tổng hợp GTA.........................................................................................30
3.3.3 Tổng hợp CHPA ......................................................................................31
3.4 Tổng hợp hydrogel và hydrogel composite ................................................33
3.5 Khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite......................35
3.5.1 Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composite .........................35
3.5.2 Khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel và hydrogel composite ............35
3.5.3 Khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và hydrogel composite ......35
3.5.4 Đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel composite .....36
3.5.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel và hydrogel composite
đối với tế bào từ tuỷ xương thỏ ........................................................................36
3.5.6 Phẫu thuật tiêm (ghép) hydrogel và hydrogel composite .......................37
3.5.7 Xem kết quả xương mới hình thành bằng phương pháp micro-CT ........38
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .....................................................39
4.1 Kết quả tổng hợp BCP ................................................................................39
4.1.1 XRD của BCP ..........................................................................................39
4.1.2 Hình SEM của BCP .................................................................................39
4.2 Kết quả tổng hợp GTA ...............................................................................40
v
4.2.1 Phổ 1H-NMR của GTA ............................................................................40
4.2.2 Hàm lượng của TA trong GTA ...............................................................41
4.3 Kết quả tổng hợp CHPA .............................................................................42
4.3.1 Phổ 1H-NMR của CHPA .........................................................................42
4.3.2 Hàm lượng của HPA trong CHPA ..........................................................43
4.4 Kết quả khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite .........44
4.4.1 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA, CHPA, GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP ............................................................................44
4.4.2 Hình thái của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP .......................................................................................................47
4.4.3 Khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP .............................................................................................48
4.4.4 Kết quả đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP .............................................................50
4.4.5 Kết quả đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP đối với tế bào tủy xương thỏ ..............55
4.4.6 Kết quả micro-CT sau khi cấy ghép vật liệu trên thỏ ..............................56
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................57
5.1 Kết luận .......................................................................................................57
5.2 Kiến nghị ....................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................59
PHỤ LỤC .........................................................................................................62
vi
DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Đặc điểm gelatin loại A và B ............................................................. 8

Bảng 3.1 Công thức tổng hợp hydrogel composite GTA-CHPA/BCP ........... 34
Bảng 4.1 Độ hấp thu A (λ = 275 nm) của dung dịch TA và GTA .................. 41
Bảng 4.2 Kết quả tính toán lượng TA trong GTA ........................................... 42
Bảng 4.3 Độ hấp thu A (λ = 275 nm) của dung dịch HPA và CHPA ............. 43
Bảng 4.4 Kết quả tính toán lượng HPA trong CHPA...................................... 44
Bảng 4.5 Thành phần trăm các nguyên tố trong phân tích EDS của hydrogel
sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày.................................................... 53
composite sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày .................................. 54
vii
DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Phản ứng deacetyl hóa chitin tạo chitosan.......................................... 3

Hình 2.2 Cấu trúc chitosan ................................................................................ 3
Hình 2.3 Cấu trúc gelatin ................................................................................... 7
Hình 2.4 Tương tác tạo liên kết hydro của hyaluronic acid và methylcellulose
......................................................................................................................... 11
Hình 2.5 Tương tác kỵ nước ............................................................................ 12
Hình 2.6 Tương tác ion .................................................................................... 12
Hình 2.7 Tương tác lập thể D - lactide và L - lactide ...................................... 13
Hình 2.8 Tạo liên kết ngang bằng glutaraldehyde ........................................... 13
Hình 2.9 Tạo liên kết ngang thông qua polymer hóa gốc tự do ...................... 14
Hình 2.10 Tạo liên kết bằ ng phản ứng cô ̣ng Michael ..................................... 15
Hình 2.11 Tạo liên kết ngang bằ ng phản ứng Schiff-base .............................. 15
Hình 2.12 Liên kết ngang hình thành với sự hiện diện HRP và H2O2 ............ 16
Hình 2.13 Cơ chế xúc tác vòng của HRP dưới sự hiện diện của H2O2 ........... 17
Hình 2.14 Sự trương nở của hydrogel ............................................................. 17
Hình 2.15 Truyền tải thuốc bằng hệ thống chứa. ............................................ 20
Hình 2.16 Truyền tải thuốc bằng hệ thống nền ............................................... 20
Hình 2.17 Cấu tạo của xương .......................................................................... 24
Hình 2.18 BCP (a) dạng bột, viên và các khối đặc, xốp (b) dạng gel ............ 25
Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp BCP ......................................................................... 29
Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp GTA ........................................................................ 31
Hình 3.3 Phản ứng tổng hợp GTA.................................................................. 31
Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp CHPA ..................................................................... 32
Hình 3.5 Phản ứng tổng hợp CHPA ............................................................... 32
Hình 3.6 Tổng hợp hydrogel composite GTA-CHPA/BCP với sự hiện diện
của HRP và H2O2 ............................................................................................. 34
Hình 3.7 Quy trình phẫu thuật thỏ tiêm (ghép) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C ........................................... 38
Hình 3.8 Thí nghiệm in vivo trên thỏ (A) lỗ khoan, (B) mẫu hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C ............................................................... 38
Hình 4.1 Giản đồ XRD của BCP với tỉ lệ mol Ca/P = 1,57 tại pH = 7 ........... 39
Hình 4.2 Hình SEM của BCP tổng hợp bằng phương pháp sóng siêu âm với tỉ
lệ Ca/P = 1,57 tại pH = 7 ................................................................................. 40
viii
Hình 4.3 Phổ 1H-NMR của GTA trong D2O ................................................... 40
Hình 4.4 Phương trình đường chuẩn của TA .................................................. 41
Hình 4.5 Phổ 1H-NMR của CHPA trong D2O................................................. 42
Hình 4.6 Phương trình đường chuẩn của HPA ................................................ 43
Hình 4.7 Thời gian gel hóa của GTA với nồng độ HRP 0,05 mg/mL ........... 45
Hình 4.8 Thời gian gel hóa của CHPA với nồng độ HRP 0,07 mg/mL .......... 45
Hình 4.9 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C với nồng độ HRP 0,07 mg/mL ............. 46
Hình 4.10 Hình SEM (a) hydrogel GTA-CHPA-2G:1C-0 ngày và (b) GTA-
CHPA-5G:1C-0 ngày....................................................................................... 47
Hình 4.11 Hình SEM (a) của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C-0
ngày và (b) GTA-CHPA/BCP-5G:1C-0 ngày ................................................. 47
Hình 4.12 Biểu đồ % khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA trong
dung dịch PBS ................................................................................................. 48
Hình 4.13 Biểu đồ % khối lượng suy giảm của hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP trong dung dịch PBS ................................................................... 48
Hình 4.14 Giản đồ XRD của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C trước và sau khi ngâm trong dung dịch
SBF 28 ngày .................................................................................................... 51
SBF 28 ngày .................................................................................................... 52
Hình 4.16 SEM và EDS của hydrogel GTA-CHPA-1C:2G sau khi ngâm trong
dung dịch SBF 28 ngày.................................................................................... 53
Hình 4.17 SEM và EDS của hydrogel GTA-CHPA- 1C:5G sau khi ngâm trong
dung dịch SBF 28 ngày.................................................................................... 53
Hình 4.18 SEM và EDS của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C sau
khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày .......................................................... 54
Hình 4.19 SEM và EDS của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C sau
khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày .......................................................... 54
Hình 4.20 Sự bám dính và phát triển của tế bào từ tủy xương thỏ trên vật liệu
(a) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và (b) hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-5G:1C .......................................................................................... 55
Hình 4.21 Ảnh Micro-CT (khối xương - mặt cắt lát) của mẫu xương (a) bình
thường, (b) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C, (c) hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-5G:1C và (d) đối chứng .............................................................. 56
ix
DANH MỤC PHỤ LỤC
PL1.1 Phổ 1H NMR của GTA trong D2O ....................................................... 62

PL1.2 Phổ dãn rộng 1H NMR của GTA trong D2O......................................... 63
PL1.3 Phổ 1H NMR của CHPA trong D2O .................................................... 64
PL1.4 Phổ dãn rộng 1H NMR của CHPA trong D2O ...................................... 65
PL1.5 SEM và EDS của GTA-CHPA-2G:1C-28ngày .................................... 66
PL1.6 SEM và EDS của GTA-CHPA-5G:C-28 ngày ..................................... 67
PL1.7 SEM và EDS của GTA-CHPA/BCP-2G:1C-28 ngày .......................... 68
PL1.8 SEM và EDS của GTA-CHPA/BCP-5G:1C-28 ngày .......................... 69
x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
SBF Stimulates body fluid

BCP Biphasic calcium phosphate
CHPA Chitosan-4-hydroxyphenylacetic acid
EDC 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide
GTA Gelatin-tyramine
HRP Horseradish peroxidase
HPA 4-hydroxyphenylacetic acid
1
H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance
Da Dalton
UV-Vis Ultraviolet-Visible Spectrum
SEM Scanning electron microscopy
EDS Energy-dispersive X-ray spectroscopy
XRD X-ray diffraction
PBS Phosphate buffer saline
H2 O 2 Hydrogen peroxide
xi
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1.1 Lý do chọn đề tài

Trong những năm gần đây lĩnh vực nghiên cứu chế tạo các loại vật liệu
y sinh được đặc biệt quan tâm. Bởi vì, những loại vật liệu dùng trong cấy ghép
và thay thế xương trước đây tuy tương hợp sinh học nhưng tính chất cơ lý của
chúng khác biệt nhiều so với xương, dẫn đến nguy cơ gãy xương do kém
tương thích giữa phần xương tiếp xúc với vật liệu ghép là khá cao. Do đó, các
nhà khoa học đã hướng tới nghiên cứu vật liệu cấy ghép tái tạo trên cơ sở các
vật liệu composite chứa BCP. Vì BCP có tính tương hợp sinh học, hoạt tính
sinh học cao và khả năng chữa lành xương do thành phần tương tự thành phần
khoáng trong xương. Ngoài ra, BCP có khả năng hòa tan từ từ trong cơ thể để
giải phóng ion Ca2+ và PO43- có lợi trong việc hình thành và phát triển tế bào
xương [1,2].
Những polymer tự nhiên như gelatin, chitosan có ưu điểm tương hợp
sinh học, giảm cấp sinh học, kháng khuẩn, kích thích tế bào phát triển [3-7].
Do đó, trong nghiên cứu này các polymer trên được sử dụng để điều chế
hydrogel composite khi kết hợp với BCP. Nhằm tạo ra loại vật liệu có tiềm
năng trong tái tạo xương nhờ khả năng tương hợp sinh học, suy giảm sinh học,
thúc đẩy khả năng tạo khoáng, cải thiện được tính năng của các vật liệu cấy
ghép trước đây. Vì vậy, đề tài ”Điều chế in situ hydrogel composite gelatin-
chitosan/BCP và đánh giá khả năng khoáng hóa trong dung dịch SBF” đã
được lựa chọn để nghiên cứu.
1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu
1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

Điều chế in situ hydrogel composite gelatin-chitosan/BCP và đánh giá
khả năng khoáng hóa trong dung dịch SBF.
1.2.2 Phạm vi nghiên cứu

- Nghiên cứu tổng hợp GTA, CHPA và BCP.
- Đánh giá thành phần, cấu trúc của GTA, CHPA và BCP.
- Khảo sát: thời gian gel hóa, hình thái, khối lượng suy giảm trong dung
dịch PBS, khả năng tạo khoáng trong dung dịch SBF của hydrogel GTA-
CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP.
1
- Đánh giá sự tương hợp sinh học thông qua sự bám dính và phát triển
của tế bào tủy xương thỏ trên vật liệu.
- Đánh giá quá trình chữa lành khuyết tật xương của vật liệu trên thỏ.
1.3 Ý nghĩa khoa học

Kết hợp các tính chất có lợi của gelatin, chitosan trong tăng sinh tế bào
và khả năng cung cấp ion Ca2+ và PO43- để hình thành khoáng xương từ các
hạt nano BCP. Nhằm chế tạo ra loại vật liệu mới có thể tiêm trực tiếp vào
khuyết tật của xương có tác dụng kích thích tế bào xương phát triển, tương
hợp sinh học và có thời gian giảm cấp sinh học phù hợp với thời gian tái tạo
của xương.
2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN
2.1 Chitosan
2.2.1 Nguồn gốc của chitosan trong tự nhiên

Chitosan là một polymer carbohydrate tự nhiên biến đổi từ chitin. Chitin
có trong tự nhiên ở cả thực vật và động vật như loài giáp xác, côn trùng, nấm
và một vài loài tảo. Chitosan được sản xuất bằng phương pháp deacetyl hóa
bằng nhiệt hóa trong môi trường kiềm (Tolamite et., 2000).
Hình 2.1 Phản ứng deacetyl hóa chitin tạo chitosan
2.2.2 Đặc điểm cấu tạo

Chitosan có thành phần chủ yếu là glucosamine, chitosan có các nhóm
chức hoạt động gồm một nhóm amino ở vị trí C2, hai nhóm hydroxyl ở vị trí
C3, C6. Sự thay đổi hóa học của những nhóm chức này cung cấp các vật liệu
có ích trong các ứng dụng khác nhau [6].
Tên gọi IUPAC của Chitosan: Poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose
hay Poly β-(1-4)-glucozamin.
Công thức phân tử : (C6H11O4N)n
Công thức cấu tạo:
Hình 2.2 Cấu trúc chitosan
3
2.2.3 Tính chất
2.2.3.1 Tính chất vật lý

Chitosan là chất rắn, xốp nhẹ, hình vảy có thể xay nhỏ nhiều kích cỡ
khác nhau có màu trắng hoặc màu vàng nhạt, không mùi, không vị (Riccardo,
1996). Tính chất của chitosan phụ thuộc vào những yếu tố như mức độ
deacetyl hóa, trọng lượng phân tử, tỉ trọng, độ nhớt, tính tan [6,7].
Mức độ deacetyl hóa (DDA): là một đặc tính quan trọng của quá trình
sản xuất chitosan bởi vì nó ảnh hưởng đến tính chất hóa lý và khả năng ứng
dụng của chitosan sau này. Độ deacetyl hóa (DD) của chitosan khác nhau dẫn
đến sự khác biệt về khối lượng phân tử, độ nhớt, khả năng hòa tan trong
acid… DDA của chitosan khoảng 56 - 99%.
Trọng lượng phân tử: Chitosan là polymer sinh học có khối lượng phân
tử cao. Khối lượng chitin thường lớn hơn một triệu Dalton trong khi các sản
phẩm chitosan thương phẩm có khối lượng khoảng 100.000 - 1.200.000
Dalton.
Tỉ trọng: Trong một số nghiên cứu về dẫn nhiệt cho thấy tỷ trọng của
chitin và chitosan từ giáp xác rất cao (0,39 g/cm3). Mức độ deacetyl hóa cũng
làm tăng tỷ trọng của chitosan.
Độ nhớt: là yếu tố quan trọng để xác định khối lượng phân tử của
chitosan. Chitosan phân tử lượng cao thường làm cho dung dịch có độ nhớt
cao. Ngoài ra, độ nhớt còn bị ảnh hưởng bởi pH, sức mạnh ion và nhiệt độ
dung dịch. Độ nhớt của chitosan tăng với sự gia tăng nồng độ chitosan, mức
độ deacetyl hóa nhưng độ nhớt giảm khi tăng nhiệt độ và pH. Ứng dụng của
chitosan thường bị hạn chế do độ nhớt cao và độ hòa tan thấp của chitosan ở
pH trung tính. Điều chỉnh pH khoảng 7,5 sự keo tụ gây ra do deproton hóa và
không hòa tan polymer. Chitosan với mức độ deacetyl hóa 50% tan được trong
dung dịch trung tính. Trong khi chitosan với mức độ deacetyl hóa 40% hòa tan
được trong môi trường dung dịch nước với pH lên đến 9.
Tính tan: Chitin tan hầu hết trong các dung môi hữu cơ, trong khi đó
chitosan tan trong dung dịch acid pH dưới 6,0. Các acid hữu cơ như acetic
acid, formic acid, lactic acid thường được sử dụng để hòa tan chitosan.
Thường sử dụng nhất là dung dịch chitosan 1% tại pH 4,0. Chitosan cũng tan
trong dung dịch HCl 1% nhưng không tan trong H2SO4 và H3PO4.
4
2.2.3.2 Tính chất sinh học

Chitosan có những tính chất quan trọng như khả năng tương hợp sinh
học, phân hủy sinh học, chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn và kháng nấm,
kháng khối u, kích thích sự phát triển tăng sinh của tế bào, khả năng hấp thụ
kim loại nặng… Ngoài ra, chitosan còn có khả năng giảm cholesterol trong
máu, hoạt tính kháng virus, điều trị bệnh thận mãn tính và chống rối loạn nội
tiết [7,8].
Vào năm 1968, K. Arai và cộng sự đã xác định chitosan hầu như không
độc, liều tử vong (LD50) cho uống của chitosan đã được ghi nhận là 16g/kg
trọng lượng cơ thể, không gây độc trên súc vật thực nghiệm và người, không
gây độc tính trường diễn [9].
Nghiên cứu tiêm chitosan theo đường tĩnh mạch trên thỏ, các tác giả đã
kết luận: chitosan là vật liệu hoà hợp sinh học cao, nó là chất mang lý tưởng
trong hệ thống vận tải thuốc, không những sử dụng cho đường uống, tiêm tĩnh
mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da, mà còn sử dụng an toàn trong ghép mô [9].
Dùng chitosan loại trọng lượng phân tử trung bình thấp để tiêm tĩnh
mạch, không thấy có tích luỹ ở gan. Loại chitosan có DD ≈ 50%, có khả năng
phân huỷ sinh học cao, sau khi tiêm vào ổ bụng chuột, nó được thải trừ dễ
dàng, nhanh chóng qua thận và nước tiểu, chitosan không phân bố tới gan và
lá lách [9].
2.2.4 Ứng dụng của chitosan trong y sinh

Chitosan nhờ vào các đặc tính tối ưu về mặt sinh học cho nên chitosan và
dẫn xuất của nó được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong nhiều lĩnh vực
khác nhau, đặc biệt là lĩnh vực y sinh.
2.2.4.1 Điều trị bỏng

Chitosan có tác dụng điều trị vết bỏng rất tốt vì chitosan có thể hình
thành màng có tính dai, thấm nước và tương thích sinh học. Những màng này
có thể được hình thành trực tiếp trên vết bỏng bằng cách dùng dung dịch nước
của chitosan acetate. Ưu điểm của loại này là nó cho phép thấm oxy tốt và có
thể phân hủy tự nhiên bởi enzyme của cơ thể. Do đó, chitosan không cần phải
loại bỏ khỏi vết bỏng trong khi băng gạc khi loại bỏ khỏi vết bỏng thường làm
tổn thương mô [3].
5
2.2.4.2 Điều trị mắt

Chitosan dùng thay thế các loại polymer tổng hợp trong ứng dụng chữa
mắt. Chitosan có các đặc tính cần thiết cho việc chế tạo một ống kính áp tròng
lý tưởng như quang học trong suốt, ổn định cơ học, điều chỉnh quang học, độ
thấm khí, tính ẩm và khả năng tương thích miễn dịch [3].
2.2.4.3 Cầm máu

Trong y học, chitosan còn được sử dụng như một chất cầm máu, đã được
cho phép sử dụng trong băng gạc giúp giảm mất máu của vết thương và kháng
khuẩn, không gây dị ứng. Tác nhân cầm máu chitosan thường là muối chitosan
hình thành khi trộn chitosan với một acid hữu cơ như succinic acid hoặc lactic
acid. Tác nhân cầm máu hoạt động bằng sự tương tác giữa các màng tế bào
hồng cầu (điện tích âm) và chitosan proton (điện tích dương) và cả tiểu cầu
dẫn đến hình thành cụm máu đông. Các muối chitosan có thể được trộn với
các vật liệu khác để làm cho chúng hấp thụ nhiều hơn chẳng hạn như kết hợp
với alginate hoặc có thể thay đổi tốc độ hòa tan, hấp thụ sinh học của muối
chitosan. Các muối chitosan có tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học
nên chúng rất tương thích với cơ thể. Chitosan proton hóa có thể bị cắt thành
glucosamine bởi lysozyme trong cơ thể, liên hợp với các acid tự nhiên trong
cơ thể chẳng hạn như lactate hoặc succinate [4].
2.2.4.4 Truyền tải thuốc

Chitosan có điện tích dương trong môi trường acid và điện tích dương
này hình thành do proton của nhóm amine tự do của chitosan. Do đó, nó
không tan trong môi trường base và trung tính. Khi gặp môi trường acid,
proton của nhóm amine hình thành làm tăng khả năng hòa tan của chitosan.
Điều này rất có ý nghĩa trong ứng dụng y sinh để truyền tải thuốc. Dựa vào
tính chất này chitosan được dùng làm màng bao capsule để vận chuyển thuốc
đến môi trường có tính acid, nơi mà nó chỉ tan và phóng thích thuốc (ví dụ
thực tế là làm bao vận chuyển insulin). Chitosan được đánh giá có tính tương
hợp sinh học, có ái lực mạnh với nhiều loại tế bào. Cho nên các vật liệu y sinh
trên nền chitosan được nghiên cứu kết hợp với nhiều tác nhân kích thích các tế
bào tái tạo mô như peptide và protein [4].
6
2.2 Gelatin
2.2.1 Nguồn gốc của gelatin trong tự nhiên

Gelatin là một loại polymer tự nhiên thu được bằng cách thủy phân một
phần collagen như da cá, mô của khớp nối, xương động vật thường được ứng
dụng cho dược phẩm và y tế do tính phân hủy sinh học và tương thích sinh học
của nó trong môi trường sinh lý. Thành phần acid amine gần đúng của gelatin
như sau:
Tyrosine < 0,5%, methionine và histidine < 1%, 1% hydroxylysine, 1%
isoleucine, 2% threonine, 2% phenylalamine, 2% valine, 3% leucine, 4%
serine, 4% lysine, 6% aspartic, 8% arginine, 9% alanine, 10% acid glutamic,
12% hydroxyproline, 12% proline, 21% glycine [10].
Hình 2.3 Cấu trúc gelatin
2.2.2 Khái niệm

Từ “gelatin” đã trở nên được dùng phổ biến từ năm 1700 bắt nguồn từ
tiếng latin là “gelatus” có nghĩa là màng hay chất làm đông. Hiện nay có nhiều
cách khác nhau để định nghĩa gellatin [11-13].
Năm 1967, Ramachandran định nghĩa gelatin là một polypeptide khối
lượng phân tử lớn có nguồn gốc collagen, một thành phần protein chính của
mô liên kết có nhiều trong xương, da và nội tạng.
Năm 1987, Rose định nghĩa gelatin là từ để chỉ những hợp chất protein
có nguồn gốc collagen.
Năm 1990, tổ chức Y khoa của Mỹ (USP – United States Pharmacopeia)
định nghĩa gelatin là một sản phẩm của quá trình phân giải collagen có nguồn
góc từ da và xương của động vật.
Năm 1998, Bailey và Paul định nghĩa về căn bản là protein tinh sạch
dùng trong thực phẩm được thu nhận từ collagen đã bị thoái hóa do nhiệt, có
cấu trúc như protein động vật.
7
2.2.3 Phân loại gelatin

Người ta thường dựa vào phương thức sản xuất để phân loại gelatin
thành gelatin loại A và B . Mỗi loại có đặc tính khác nhau và được tóm gọn
trong (Bảng 2.1) [11].
Bảng 2.1 Đặc điểm gelatin loại A và B
Loại gelatin A B
Nguồn gốc Da heo Xương heo Da bò Xương bò
Điểm đẳng điện (pI) 7,5 - 9 6,5 - 8 4,8 - 5,2 4,8 - 5,2
Độ nhớt (mPa.s) 1,8 - 5,5 1,8 - 4 2-7 2-7
2.2.4 Tính chất vật lý

Gelatin thương mại ở dạng tinh khiết, khô, không mùi, không vị, cứng,
giòn, màu vàng rất nhạt đến hổ phách, trong suốt, có độ ẩm từ 8 - 13% [11].
Gelatin là một thực phẩm, không phải là phụ gia thực phẩm nên không
có giới hạn sử dụng. Tính chất gelatin phụ thuộc vào pH, nguyên liệu thu
nhận, nhiệt độ, nồng độ, thời gian và phương pháp chế biến. Gelatin là một
chất keo sinh học được ứng dụnng nhiều trong sản xuất keo [12,13].
2.2.5 Tính chất hóa học
2.2.5.1 Cơ chế gel gelatin

Gelatin trương nở khi được cho vào nước, hấp thụ một thể tích nước
bằng 5 - 10 lần thể tích của bản thân nó. Khi được gia nhiệt đến nhiệt độ cao
hơn điểm tan chảy, gelatin sẽ trương nở hòa tan và tạo thành gel khi được làm
nguội. Quá trình chuyển đổi giữa dạng dung dịch và dạng gel có tính thuận
nghịch. Tính chất này được lợi dụng trong quá trình chế biến thực phẩm [11].
2.2.5.2 Độ bền gel

Tuy gelatin có thể tạo gel không cần phối hợp với chất nào khác. Nhưng
tính chất gel của gelatin phụ thuộc rất lớn vào nồng độ, nhiệt độ, pH và thời
gian.
Khi nồng độ càng tăng và nhiệt độ cao thì độ nở của gelatin càng lớn.
Nồng độ của gelatin càng tăng và độ nở càng cao thì độ nhớt của gel càng lớn.
Nhiệt độ và thời gian gia nhiệt càng cao thì độ cứng của gel càng giảm. pH
càng thấp thì độ cứng của gel càng giảm, cùng pH nếu thời gian gia nhiệt càng
dài thì độ cứng của gel càng giảm nhanh [12].
8
2.2.5.3 Độ nhớt
Độ nhớt cũng quan trọng như khả năng tạo gel và cũng phụ thuộc vào
nhiệt độ lẫn nồng độ. Độ nhớt tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch và tỉ lệ nghịch
với nhiệt độ. Dưới 20 oC dung dịch sẽ tồn tại ở dạng gel (ngoại trừ nồng độ
quá thấp). Trong khoảng 20 - 35 oC, dung dịch vừa tồn tại ở dạng gel vừa tồn
tại ở dạng dung dịch nhớt hoặc ở dạng chất lỏng có độ nhớt không ổ định.
Trên 35 oC, các phân tử gelatin trở nên rời rạc, cho dù có tăng nồng độ gelatin
trong dung dịch thì chúng vẫn không liên kết với nhau [11,12].
2.2.5.4 Điểm đẳng điện (pI)

Phân tử gelatin tích điện trong dung dịch base hay acid, chúng sẽ di
chuyển trong điện trường. Ở pH = 2 tất cả các nhóm carboxyl không tích điện,
phân tử gelatin mang điện tích dương cực đại (do điện tích nhóm amino và
guanidino). Khi pH tăng các nhóm carboxyl bắt đầu tích điện và ở pH = 6,5
các nhóm carboxyl tích điện âm. Điện tích của phân tử ảnh hưởng đến tính
chất của gelatin.
Ở pH mà không có sự di chuyển xảy ra gọi là điểm đẳng điện và tại pH
này, dung dịch gelatin kém bền nhất, dễ tủa, có hàm lượng tối đa các phân tử
protein không tích điện. Gelatin xử lý bằng kiềm có điểm đẳng điện (pI = 4,8 -
5,2), xử lý bằng acid (pI = 7 - 9) [11].
2.2.5.5 Tính lưỡng tính

Gelatin là một protein điển hình, có khả năng hoạt động như một acid
hay một base. Tính chất lưỡng tính là do các nhóm carboxyl (-COOH) thể hiện
tính acid và nhóm amine (-NH2) thể hiện tính base được tạo ra trong suốt quá
trình thủy phân. Một cách tổng quát gelatin tồn tại trong dung dịch dưới dạng
lưỡng cực +NH3–CH2–COO-, thường được gọi là ion “Zwitter”.
Vì vậy, gelatin là một protein điện ly lưỡng tính:
Trong môi trường acid, sự phân ly của nhóm acid bị kìm hãm, gelatin tác
dụng như một base.
Ngược lại trong môi trường base sự phân ly của nhóm base bị kìm hãm,
gelatin tác dụng như một acid.
Tính lưỡng tính được xác định dễ dàng khi cho gelatin phản ứng với acid
hay base [11,12].
9
2.2.5.6 Tính hòa tan

Gelatin tan một phần trong nước, gelatin khô sẽ phồng lên hay ngậm
nước khi khuấy ở trong nước (hỗn hợp không chứa quá 34% gelatin). Ở nhiệt
độ 40 oC và với thời gian là 30 phút, gelatin sẽ hòa tan hoàn toàn tạo thành
dung dịch đồng nhất. Mức độ hòa tan của gelatin phụ thuộc vào nhiệt độ, nồng
độ và kích thước phân tử.
Gelatin tan trong các dung môi như: glycerol, sorbitol…Gelatin không
tan trong alcohols, acetone, cacbon tetrachloride, benzen, petroleum và hầu hết
trong các dung môi hữu cơ không phân cực [12,13].
2.2.6 Ứng dụng của gelatin trong y sinh

Do có tính chất tương thích sinh học, phân hủy sinh học, không độc…
nên gelatin được sử dụng rộng rãi trong y tế, dược phẩm.
Trong công nghiệp dược phẩm được sử dụng chủ yếu tạo lớp vỏ bao
viên nang thuốc, đóng gói giúp ngăn ngừa quá trình oxy hóa, tránh ẩm, nhiệt
độ và làm ngon miệng [10].
Gelatin còn được ứng dụng trong chữa trị chấn thương sụn. Dẫn xuất
furfuryamine liên hợp gelatin (gelatin-FA) là một chất nhạy cảm với ánh sáng
có khả năng tạo liên kết ngang khi được chiếu sáng giúp hình thành khung cho
các tế bào mô xương phát triển [5].
Hiện nay gelatin có nhiều ứng dụng như là chất vận chuyển protein bởi
khả năng giảm thoái hóa protein và bảo vệ DNA plasmid khỏi suy giảm nhanh
chóng do nucleases. Một số dẫn xuất được tạo ra bằng cách thay đổi thành
phần hóa học của nhóm amin như etylendamin (Ed), spermidine (SD) và
spermine (Sm) được sử dụng vận chuyển DNA plasmid [14].
2.3 Hydrogel
2.3.1 Khái niệm

Các nhà nghiên cứu trong những năm qua đã đưa ra định nghĩa về
hydrogel như sau [15]:
Hydrogel là mạng lưới ưa nước với các liên kết được tạo ra bởi các phản
ứng đơn giản của một hoặc nhiều monomer.
Hydrogel là vật liệu cao phân tử có khả năng trương nở và giữ lại một
lượng nước đáng kể trong cấu trúc nhưng nó không tan trong nước.
10
2.3.2 Phân loại

Hiện nay, có nhiều cách để phân loại hydrogel tuy nhiên cách phân loại
hydrogel dựa vào loại liên kết ngang hình thành bằng phương pháp vật lý và
phương pháp hóa học được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu về
hydrogel [16].
Các phương pháp tạo liên kết ngang khác nhau nhằm tạo ra loại hydrogel
tối ưu về mặt thời gian gel hóa, tính chất cơ lý và tương hợp sinh học. Vì
những tính chất này có ý nghĩa rất quan trọng cho các ứng dụng trong cấy
ghép và tái tạo mô [17].
2.3.2.1 Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp vật lý
Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp vật lý (gel vật lý) là mối
tương tác vật lý giữa các phân tử polymer [18].
Tương tác tạo liên kết hydro: Hydrogel hình thành nhờ tương tác tạo
liên kết hydro có thể được thực hiện bằng cách tăng hoặc giảm nhiệt độ đến
nhiệt độ đông đặc. Poly (vinyl ancohol), hyaluronic acid và methylcellulose…
là những hydrogel điển hình được tạo thành theo phương pháp này. Liên kết
hydro cũng có thể được dùng để tổng hợp hydrogel tiêm được. Hỗn hợp của
hai hay nhiều các polymer tự nhiên có thể có sự đồng bộ về tính lưu biến, có
nghĩa là các thuộc tính đàn hồi, độ nhớt của hỗn hợp polymer giống gel nhiều
hơn so với các thuộc tính này ở từng polymer riêng lẽ. Sự đồng bộ này thường
là kết quả của quá trình tương tác tạo các liên kết hydro giữa các chuỗi
polymer tạo ra sự tương thích trong cấu trúc hình học của các polymer tham
gia [18].
Hydro
to
Hình 2.4 Tương tác tạo liên kết hydro của hyaluronic acid và methylcellulose
Tương tác tại vị trí kỵ nước: Các phân tử polymer có chứa một đầu ưa
nước và một đầu kỵ nước có thể được tạo thành bằng phản ứng trùng hợp hoặc
11
bằng cách trực tiếp tạo ra một khối copolymer. Các phân tử polymer này có
thể hòa tan trong nước ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng, phần kỵ
nước có xu hướng xoay vào trong để giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc trực
tiếp với nước. Nhiệt độ mà tại đó xảy ra hiện tượng gel hóa nhưng nó phụ
thuộc vào nồng độ của các polymer, độ dài đầu kỵ nước và cấu trúc hóa học
của polymer [18].
Khối ưa nước
Khối kỵ nước
to
Phần kỵ nước
kk
Hình 2.5 Tương tác kỵ nước

Tương tác ion: Đã được nghiên cứu rộng rãi để tạo liên kết ngang trong
quá trình gel hóa. Một lợi thế của phương pháp này là sự phân hủy sinh học có
thể xảy ra như sự phân ly ion trong ngoại bào, phá vỡ mạng lưới liên kết
ngang. Tương tác ion có thể xảy ra giữa một phân tử polymer và một phân tử
nhỏ hoặc giữa hai phân tử polymer trái dấu để tạo thành hydrogel [18].
Polymer điện tích trái dấu
Phân tử liên kết ngang với

điện tích trái dấu
l 2.6 Tương tác ion

Hình
Tương tác tạo phức lập thể: Xảy ra giữa các chuỗi polymer hoặc các
phân tử nhỏ có thành phần hóa học tương tự nhưng lập thể khác nhau. Đặc
biệt, tương tác lập thể xảy ra mạnh mẽ giữa các khối polylactide với L- và D- lập
12
thể. Các polymer tự nhiên cũng có thể tạo liên kết ngang bằng tương tác tạo
phức lập thể. Ghép các đồng phân L- và D- có thể tạo ra các hydrogel có tính
chất tương thích sinh học và phân hủy sinh học tốt mà không đòi hỏi việc sử
dụng các điều kiện biến tính khắc nghiệt như dung môi hữu cơ, hóa chất tạo
liên kết ngang [18].
Trộn
Phức lập thể
Hình 2.7 Tương tác lập thể D - lactide và L - lactide
2.3.2.2 Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp hóa học
Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp hóa học (gel hóa học) là
mối tương tác hóa học giữa các phân tử polymer [19].
Tạo liên kết ngang bằng chất tạo liên kết ngang: Các chất tạo liên kết
ngang như glutaraldehyde, epichlorohydrin,… đã được sử dụng rộng rãi để tạo
liên kết ngang trong các hydrogel tổng hợp lẫn tự nhiên [19].
Hình 2.8 Tạo liên kết ngang bằng glutaraldehyde
13
Tạo liên kết ngang bằng cách polymer hóa gốc tự do: Bằng cách sử
dụng các chất dùng để tạo gốc tự do như chất khơi mào nhạy sáng (tia UV),
chất khơi mào oxi hóa khử N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine
(TEMED) và amoni peroxydisulfate (APS)…. Chất khơi mào nhạy sáng tạo
liên kết ngang rất nhanh tuy nhiên khi tiếp xúc với tia UV ở cường độ cao
hoặc thời gian dài ảnh hưởng xấu đến hoạt động trao đổi chất của tế bào và
nhiệt phát sinh trong quá trình tạo liên kết ngang có thể gây hoại tử tế bào. Do
đó, tia UV sử dụng giới hạn 5 mW/cm2 để tránh gây hoại tử tế bào. Khi tăng
nồng độ chất khơi mào sẽ giảm thời gian gel hóa và tăng cường tính cơ học.
Tuy nhiên, nồng độ chất khơi mào cao (10 mM) sẽ gây độc tế bào cao dẫn tới
tỉ lệ sống của tế bào thấp (nhỏ hơn 30%) sau 3 ngày nuôi cấy tế bào [19].
Polymer
Tia gama
Bề mặt hoạt hóa
Monomer
Ghép bề mặt
Hình 2.9 Tạo liên kết ngang thông qua polymer hóa gốc tự do
Tạo liên kết ngang bằng phản ứng cô ̣ng Michael: Phản ứng cô ̣ng
Michael giữa mô ̣t tác nhân nucleophile (nhóm amine hoă ̣c nhóm thiol) và tác
nhân electrophile (vinyl/acrylate) là phương pháp điề u chế hydrogel. Đă ̣c biê ̣t
đố i với hydrogel cho kỹ thuâ ̣t mô, hydrogel đươ ̣c ta ̣o thành khi trô ̣n hai
polymer mang nhóm nucletrophin và nhóm electrophin. Hydrogel đươ ̣c điề u
chế bằ ng phản ứng cô ̣ng Michael có thời gian gel hóa trung bình (0,5 - 60 s),
đô ̣ bề n cơ ho ̣c trung bình và tính chấ t của hydrogel có thể đươ ̣c điề u chin
̉ h bởi
các nhóm chức và mâ ̣t đô ̣ liên kế t ngang [20].
14
Hình 2.10 Tạo liên kết bằ ng phản ứng cô ̣ng Michael
Tạo liên kết ngang bằng phản ứng Schiff-base: Phản ứng Schiff-base
hiǹ h thành giữa mô ̣t nhóm aldehyde và mô ̣t nhóm amine thường đươ ̣c sử du ̣ng
để ta ̣o hydrogel liên kế t ngang. Do phản ứng Schiff-base dễ phân hủy bằ ng
quá triǹ h thủy phân liên kế t nhóm amine ở nhiê ̣t đô ̣ thấ p, viê ̣c bổ sung các
thành phầ n như borax (hàn the) có thể ta ̣o điề u kiê ̣n hình thành phản ứng
Schiff-base, làm cho hydrogel tương đố i ổ n đinh ̣ với thời gian gel hóa nhanh
[20].
Hình 2.11 Tạo liên kết ngang bằ ng phản ứng Schiff-base
Tạo liên kết ngang bằng xúc tác enzyme: Enzyme thường cho thấy tính
đặc hiệu cao, có khả năng tránh được phản ứng phụ trong quá trình tạo liên kết
ngang. Điều này giúp kiểm soát và dự đoán các động học của sự gel hóa và
làm tăng tỷ lệ liên kết ngang bằng cách điều chỉnh nồng độ enzyme. Các
enzyme thường được sử dụng để tổng hợp hydrogel như transglutaminase,
tyrosinase, horseradish peroxidase. Các enzyme này thúc đẩy quá trình liên kết
tạo ngang như cho thời gian gel hóa nhanh, đô ̣ bề n cơ ho ̣c tố t, dễ phân hủy
sinh ho ̣c và được thực hiê ̣n trong điề u kiê ̣n sinh lý bin
̀ h thường và không có
bấ t kỳ phản ứng phu ̣ không mong muố n nào. Do đó, chúng được ứng dụng để
tạo liên kết ngang của hydrogel cho các ứng dụng trong lĩnh vực y sinh [20].
15
Hình 2.12 Liên kết ngang hình thành với sự hiện diện HRP và H2O2
2.3.3 Cơ chế xúc tác vòng của enzyme HRP với sự hiện diện H2O2
Horseradish peroxidase (HRP): Là mô ̣t chuỗi đơn loa ̣i β-hemoprotein,
có vai trò xúc tác các nhóm phenol hoă ̣c dẫn xuấ t của anilin trong polymer với
sự hiê ̣n diê ̣n của H2O2 để ta ̣o ra liên kế t ngang và hin
̀ h thành hydrogel. Phản
ứng tạo liên kết ngang carbon - carbon hình thành ở vị trí ortho của 2 phân tử
phenol hoặc carbon - oxygen ở vị trí ortho của phenoxy và gốc tự do phenoxyl
(Hình 4.12) [21].
Cơ chế xúc tác vòng của enzyme HRP
Bước 1: Quá trình xúc tác vòng có sự tương tác giữa Fe(III) của enzyme
ở trạng thái nghỉ với H2O2, sau đó một phân tử nước được giải phóng với 2
electron oxi hóa của heme sắt hình thành hợp chất A. Hợp chất A có trạng thái
oxy hóa cao gồm Fe(IV) oxoferryl và gốc cation porphyrin (Por.+FeIV=O)
[21].
Bước 2: Chuyển 2 electron đơn, làm cho hợp chất A được đưa về trạng
thái nghỉ. Việc giảm một electron đầu tiên của gốc cation porphyrin cần sự
hiện diện của chất nền phenol hoặc dẫn xuất anilin để hình thành hợp chất B
(Fe(IV)=O). Việc giảm một electron thứ hai giúp đưa hợp chất B về trạng thái
nghỉ [21].
16
Hình 2.13 Cơ chế xúc tác vòng của HRP dưới sự hiện diện của H2O2
2.3.4 Tính chất hydrogel

Hydrogel có các tính chất đặc trưng như độ trương nở, độ bền cơ học và
tính tương thích và phân hủy sinh học định hướng theo các ứng dụng khác
nhau trong lĩnh vực kỹ thuật, công nghệ, dược phẩm và y sinh học
[16,17,22,23].
2.3.4.1 Tính trương nở

Không có khái niệm về khối lượng phân tử của hydrogel bởi vì thành
phần, cấu trúc của hydrogel được đặc trưng bởi các chuỗi polymer liên kết với
nhau qua các liên kết vật lý hoặc hóa học. Khả năng trương nở của hydrogel
được xác định bởi khoảng không gian có sẵn bên trong hydrogel để chứa nước
thông qua tương tác polymer - nước. Bởi vì lực tương tác giữa polymer và
nước quyết định sự trương nở của hydrogel. Về cơ bản, tính ưa nước của
hydrogel làm cho lực tương tác giữa polymer với nước trở nên mạnh hơn và
hydrogel sẽ trương nở trong nước.
Độ trương thấp Độ trương cao
Hàm lượng nước

Hàm lượng chất rắn
Hình 2.14 Sự trương nở của hydrogel

17
Khi thành phần, cấu trúc polymer càng ưa nước thì tương tác polymer -
nước càng mạnh. Hydrogel chứa các nhóm chức ưa nước trương lên trong
nước cho kết quả tương tác polymer - nước. Nếu thành phần, cấu trúc
hydrogel chứa các ion, hiện tượng thẩm thấu phát sinh bởi các ion bù trừ điện
tích do sự khác biệt nồng độ ion trong gel và dung dịch bên ngoài. Các điện
tích ion trên khung sườn polymer đẩy nhau trong dung dịch nước và phát sinh
sự trương nở đáng kể trong không gian do việc hấp thụ nước.
Hydrogel được phân thành 2 dạng là không có ion và có ion (anion,
cation và ion lưỡng tính) cũng như những hydrogel với các sườn chứa các
nhóm ưa nước và kỵ nước.
(i) Hydrogel không có ion: Ví dụ như poly (N-vinyl-pyrrolidone) và poly
(ethylene oxide), trương lên trong môi trường nước duy nhất do các tương tác
polymer - nước.
(ii) Hydrogel ion: Trương nở phụ thuộc vào pH của môi trường nước, tức
là phụ thuộc vào mức độ phân ly của các chuỗi ion. Sự thay đổi pH có thể thay
đổi tổng thể các đặc tính ion.
Sự hấp thụ nước của hydrogel phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mật độ
liên kết ngang, mật độ điện tích, bản chất của dung dịch, thành phần, cấu trúc
xốp của hydrogel. Trong đó yếu tố mật độ liên kết ngang ảnh hưởng đến độ
trương nở của hydrogel nhất bởi vì mật độ liên kết ngang càng cao thì khoảng
cách giữa các chuỗi polymer càng ngắn dẫn đến khả năng trương nở của
hydrogel càng thấp.
2.3.4.2 Tính cơ học

Tính cơ học của hydrogel là yếu tố rất quan trọng vì vậy việc đánh giá
tính cơ học của hydrogel rất cần thiết để tối ưu tính chất này của hydrogel
nhằm phục vụ các ứng dụng y sinh khác nhau.
Mật độ liên kết ngang ảnh hưởng đến cơ tính của hydrogel, tăng độ liên
kết ngang trong hydrogel, độ bền cơ lý của hydrogel cao hơn nhưng sự biến
dạng của hydrogel giảm làm hydrogel giòn hơn. Do đó, cần một mức độ tối ưu
của liên kết ngang để đạt được một hydrogel tương đối bền và đàn hồi.
Đối với những ứng dụng khác nhau thì yêu cầu quan trọng nhất là
hydrogel có thể duy trì hình dạng của nó trong tình trạng trương nở hay ẩm
ướt. Liên kết giữa các chuỗi polymer là cần thiết để cải thiện các tính chất cơ
học của hydrogel. Do đó, nhiều phương pháp đã được sử dụng để đo độ bền cơ
học của hydrogel như đo độ dãn, độ nén, độ cứng.
18
2.3.4.3 Tính phân hủy sinh học

Sự phân hủy của hydrogel rất cần thiết trong quá trình tái tạo mô, khối
lượng phân hủy của vật liệu cấy ghép phải phù hợp với tốc độ hình thành mô
mới và các phân tử giải phóng ra trong quá trình phân hủy không độc đối với
tế bào.
Mật độ liên kết ngang ảnh hưởng đến tính chất cơ học và khối lượng
phân hủy của hydrogel. Do đó, cần hiểu, kiểm soát được cơ chế, khối lượng
suy giảm của mỗi loại vật liệu sử dụng.
Hydrogel có 3 cơ chế suy giảm cơ bản: thủy phân, suy giảm bởi enzyme,
và suy giảm do quá trình hòa tan. Phần lớn các hydrogel tổng hợp suy giảm
thông qua quá trình thủy phân của các liên kết ester. Những hydrogel suy giảm
bởi enzyme có khối lượng suy giảm khác nhau trong nghiên cứu in vitro và in
vivo, vì trong cơ thể động vật có rất nhiều loại enzyme.
2.3.4.4 Tính tương hợp sinh học

Hydrogel tương hợp sinh học và không gây độc là yếu tố quan trọng để
ứng dụng trong lĩnh vực y sinh. Hầu hết các polymer sử dụng trong y sinh phải
thử nghiệm về khả năng gây độc trong cơ thể.
Hydrogel cung cấp môi trường thích hợp để tế bào di chuyển, tăng
trưởng và biệt hóa. Những vật liệu dùng để tạo gel khi tồn tại trong cơ thể sẽ
thúc đẩy những chức năng của tế bào cho những ứng dụng đặc biệt như tăng
độ bám dính, tăng trưởng và biệt hóa của tế bào nên thúc đẩy phát triển mô.
Những polymer tạo hydrogel cần thiết không gây độc cho tế bào, không kích
hoạt phản ứng miễn dịch nhưng chúng cần phải thúc đẩy được sự bám dính và
phát triển của tế bào.
2.3.5 Ứng dụng hydrogel trong y sinh
2.3.5.1 Truyền tải thuốc

Hydrogel đã được ứng dụng là tác nhân mang thuốc từ lâu. Hydrogel
mang thuốc khi tiếp xúc với môi trường nước, nước thâm nhập vào hydrogel
và hòa tan thuốc. Khuếch tán là hiện tượng mà thuốc hòa tan và khuếch tán ra
khỏi hydrogel vào môi trường nước xung quanh. Hiện tượng khuếch tán chủ
yếu là do các chuyển động Brown. Hydrogel sử dụng mang thuốc được phân
loại thành các gel chứa và gel nền. Sự khuếch tán của thuốc thông qua
hydrogel có thể bị ảnh hưởng bởi tính chất của hydrogel như độ nhạy pH, độ
19
nhạy sáng, độ nhạy áp suất. Tốc độ hòa tan thuốc giảm khi tăng trọng lượng
phân tử thuốc [22].
Hệ thống chứa: Lõi thuốc được bao bọc bởi một màng hydrogel cho
phép sự khuếch tán của thuốc qua màng. Khi tiếp xúc với nước, nước khuếch
tán vào hệ thống và hòa tan thuốc tạo ra một nồng độ bão hòa tương đương
của thuốc (Cs). Thuốc khuếch tán qua màng đến môi trường bên ngoài và
nồng độ giảm xuống dưới Cs. Chất rắn thuốc có mặt trong lõi tan, nồng độ trở
lại Cs và quá trình lặp lại cho đến khi hạt rắn thuốc tan hết. Loại hệ thống
mang thuốc này chủ yếu được sử dụng để dẫn truyền các tác nhân hoạt động
qua miệng, mắt, tuyến tử cung hoặc thẩm thấu qua da.
Hình 2.15 Truyền tải thuốc bằng hệ thống chứa.

Hệ thống nền: Các tác nhân hoạt động trong hệ thống nền là những chất
rắn đồng nhất phân tán trong hệ thống. Việc truyền tải thuốc từ chất nền phụ
thuộc vào tính chất của chất nền. Khi chất nền được đặt vào môi trường nước,
nước bắt đầu khuếch tán vào chất nền và hydrat hóa. Hydrat hóa chất nền bắt
đầu từ bề mặt và tiếp tục về phía trung tâm của lõi. Việc phóng thích thuốc
phụ thuộc vào sự khuếch tán của nước vào chất nền tiếp theo là sự tan rã của
thuốc cuối cùng là sự khuếch tán của thuốc hòa tan từ chất nền.
Hình 2.16 Truyền tải thuốc bằng hệ thống nền
20
2.3.5.2 Chữa lành vết thương

Hydrogel là chất nền chứa nhiều liên kết ngang giữa các polymer do đó
nó có khả năng hấp thụ và giữ nhiều nước trong mạng lưới cấu trúc của nó.
Hydrogel hoạt động như một loại băng ẩm làm lành vết thương có khả năng
hấp thụ và giữ lại các dịch tiết của vết thương cùng với các tác nhân bên ngoài
như vi khuẩn trong mạng lưới cấu trúc của nó. Hydrogel còn thúc đẩy sự tăng
sinh nguyên bào bằng cách giảm mất nước từ bề mặt vết thương và bảo vệ vết
thương khỏi các yếu tố độc hại từ bên ngoài cần thiết cho vết thương lành
nhanh chóng. Hydrogel duy trì một vi khí hậu cho các phản ứng sinh tổng hợp
trên bề mặt vết thương cần thiết cho hoạt động tế bào. Tăng sinh nguyên bào
sợi giúp cho việc kéo da non làm lành vết thương. Nhờ vào tác động giữ ẩm
của hydrogel mà các tế bào sừng có thể di chuyển trên bề mặt vết thương.
Hydrogel có thể trong suốt tùy theo bản chất của polymer và tác động đệm,
làm mát trên bề mặt vết thương. Hydrogel trong suốt giúp cho việc giám sát
vết thương dễ dàng mà không cần tháo băng vết thương. Quá trình hình thành
mạch máu có thể được bắt đầu bằng cách sử dụng băng hydrogel bán hút ẩm.
Mạch máu của vết thương được đảm bảo sự tăng trưởng của mô hạt bằng cách
duy trì cung cấp đủ oxy và chất dinh dưỡng cho bề mặt vết thương. Lá
hydrogel được đắp trên bề mặt vết thương với sự hỗ trợ của vải hoặc màng
polymer và được giữ trên bề mặt vết thương bằng chất kết dính hoặc băng
[22].
2.3.5.3 Kỹ thuật mô
Kỹ thuật mô đang là một lĩnh vực quan trọng trong y học tái tạo. Nó gồm
ba thành phần cơ bản : Tế bào hoặc mô, khung và cấy ghép. Kỹ thuật mô được
sử dụng rộng rãi để khôi phục lại chức năng của một mô hoặc các cơ quan bị
tổn thương. Trong thực tế, các tế bào của bệnh nhân là thường kết hợp với một
khung để tạo ra tế bào mới. Khung có thể được tạo thành từ gốm sứ hoặc
polymer, đó có thể là vĩnh viễn hoặc tạm thời. Kích thước lỗ của các khung
nên được > 80 μm. Điều này là cần thiết cho việc di chuyển tế bào vào lõi của
khung, mạch máu cung cấp chất dinh dưỡng cho các tế bào và lấy đi các sản
phẩm trao đổi chất ra khỏi tế bào. Các khung tạo thành từ polymer là những
hydrogel được ứng dụng cho kĩ thuật mô. Mỗi năm hàng ngàn bệnh nhân mất
mô và hư hỏng nội tạng vì bệnh tật hoặc chấn thương được cứu sống [22].
2.3.5.4 Chuyển gen

Chuyển gen được định nghĩa là sự kết hợp của các hạt DNA bên ngoài
vào tế bào vật chủ và có thể được hòa giải bằng các phương pháp virus và
21
không virus. Việc cung cấp các gen vào tế bào vật chủ bằng cách sử dụng một
virus sử dụng có khả năng kết hợp DNA vào tế bào vật chủ. Để đáp ứng mục
đích này nhiều virus đã được sử dụng. Các vector virus được sử dụng vì chúng
có thể tải nạp và biểu hiện gen cao. Đồng thời, việc sử dụng vector virus khá
hạn chế vì chúng có thể tạo ra phản ứng miễn dịch hoặc đột biến của các tế
bào chuyển nạp. Do đó, các nhà khoa học hướng đến nghiên cứu và sử dụng
các polymer như poly-L-lysine (PLL), polyamidoamine dendrimer (PAMAM),
polyethylenimine (PEI), PGA, PLA và PLGA cho chuyển gen. Mặc dù
PAMAM và PEI có thể cung cấp hiệu quả thâm chuyển cao nhưng sử dụng
chúng bị hạn chế do phân hủy kém. Đây là lý do tại sao việc sử dụng các
polyme phân hủy sinh học như PLA, PLGA và PGA [22].
2.4 Hydrogel composite
2.4.1 Khái niệm

Vật liệu composite là vật liệu tổng hợp từ hai hay nhiều vật liệu khác
nhau tạo lên vật liệu mới kết hợp được các tính năng của những vật liệu ban
đầu [23].
Hydrogel composite là vật liệu composite bao gồm polymer và các hạt
gia cường. Polymer có thể là polymer tự nhiên hay tổng hợp [23].
2.4.2 Vật liệu composite trong tái tạo xương

Vật liệu composite sinh học dùng cho xương phải tương đồng về thành
phần, cấu trúc và thành phần của xương, đặc biệt vật liệu phải tương hợp sinh
học, phân hủy sinh học, thành phần và cấu trúc ba chiều xốp phù hợp với sự
phát triển của tế bào. Thành phần, cấu trúc xốp giúp vật liệu hấp thụ máu thúc
đẩy quá trình lành xương. Do đó, vật liệu composite trong tái tạo xương phải
đạt được các ưu điểm như [23]:
Tính tạo xương: Vật liệu có khả năng liên kết trực tiếp với xương.
Tính kích tạo xương: Khả năng kích thích tế bào gốc biệt hóa thành tế
bào xương.
Tính dẫn tạo xương: Khả năng kích thích sự di chuyển tế bào gốc từ mô
xương vào khoảng trống trong vật liệu.
Tính tự tiêu sinh học: Vật liệu ghép tự tiêu đi trong một khoảng thời
gian thích hợp tạo khoảng trống cho sự tạo xương mới.
22
2.5 Giới thiệu về thành phần, cấu tạo của xương và Biphasic calcium
phosphate (BCP)
2.5.1 Thành phần, cấu tạo của xương

Xương là vật liệu dạng composite có thành phần bao gồm chất nền hữu
cơ, các khoáng chất, tế bào và nước [24].
Xương có tính cơ học do kết hợp được tính giòn của khoáng chất với tính
đàn hồi của chất nền hữu cơ. Vì thế, xương thực hiện được chức năng cơ học
và cân bằng nội môi. Đảm nhận các vai trò trong việc tạo hình cơ thể, tạo các
khoang chứa cơ quan nội tạng, hỗ trợ quá trình vận động đồng thời cũng là nơi
sản sinh các tế bào máu, lưu trữ và cung cấp các ion khoáng [25].
Chất nền hữu cơ: Xương bao gồm những tế bào sống nằm bên trong
chất nền hữu cơ và khoáng. Chất nền hữu cơ chứa thành phần hữu cơ (phần
lớn là collagen) và thành phần vô cơ (chủ yếu là các hydroxyapatite). Trong
đó, thành phần hữu cơ chiếm khoảng 30% khối lượng xương và 70% khối
lượng xương là hydroxyapatite. Bên cạnh đó, các bó sợi collagen tạo nên tính
co dãn và kết hợp với các tinh thể hydroxyapatite phân bố bên trong giữa các
sợi collagen tạo nên tính chịu nén của xương [26].
Chất nền vô cơ: Khoáng vô cơ của xương thường là các muối của
calcium và phosphate, trong đó thành phần chính là hydroxyapatite
[Ca10(PO4)6(OH)2]. Phân tích các khoáng chất trong xương cho thấy tỉ lệ mol
Ca/P từ 1,3 đến 1,9. Tỉ lệ này phụ thuộc sự đóng góp của các phosphate hữu
cơ trong chất nền xương và bản chất của các khoáng chất trong xương [27].
Hiện tượng tạo khoáng xương đặc biệt được quan tâm bởi sự tạo khoáng
xương liên quan quá trình hình thành xương. Các kết quả của nhiều nghiên
cứu khoa học cho thấy cơ chế tạo khoáng xương được thực hiện thông qua các
quá trình tạo khoáng sinh học trong môi trường tế bào. Quá trình tạo khoáng
ban đầu tập trung ở nhiều vùng dọc theo bó sợi collagen. Khi các tinh thể
khoáng chất đầu tiên được hình thành ở các vị trí riêng lẽ và chúng tiếp tục
phát triển bằng một quá trình kéo dài thông qua sự kết tụ. Trong quá trình tạo
khoáng kích thước, hình dạng các mầm tinh thể apatite được điều chỉnh bởi
chất nền collagen và chất nền protein cho nên các mầm tinh thể này luôn có
kích thước nano [28].
23
Hình 2.17 Cấu tạo của xương
2.5.2 Biphasic calcium phosphate

Calcium phosphate là một thành phần rất quan trọng của vật liệu mới cho
lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương. Calcium phosphate có tiềm năng rất lớn
cho ghép xương vì chúng có tính tương hợp sinh học, tính dẫn tạo xương, tính
kích tạo xương và có khả năng tạo liên kết trực tiếp với xương. Ngoài ra, quá
trình calcium phosphate tan dần cung cấp ion Ca2+ và PO43- có lợi cho quá
trình hình thành xương. Quá trình suy giảm của calcium phosphate dẫn đến kết
tủa carbonate apatite có thành phần và cấu trúc tương tự với các khoáng chất
sinh học của xương.
Calcium phosphate được dùng trong lĩnh vực y sinh được biết đến như:
hydroxyapatite (HAp), β-tricalcium phosphate (β-TCP), calcium phosphate vô
định hình (ACPs) và calcium phosphate pha kép (BCP), chúng không những
khác nhau về thành phần mà còn khác nhau về độ tan, tính tương hợp sinh học
và tính chất cơ lý.
Calcium phosphate là vật liệu có hoạt tính sinh học và được sử dụng rộng
rãi cho việc sửa chữa các mô xương. Calcium phosphate hỗ trợ tế bào xương
bám và phát triển, kích thích sự hình thành xương mới. Sự kích tạo xương là
khả năng của vật liệu kích thích tế bào gốc biệt hóa thành tế bào xương. Sự
kích tạo xương của các loại calcium phosphate phụ thuộc vào từng loại
calcium phosphate và có xu hướng sau: β-TCP>BCP>HAp>ACPs
BCP là hỗn hợp của HAp và β-TCP và được quan tâm nghiên cứu do
BCP ảnh hưởng tốt đến quá trình tái tạo xương hơn HAp hoặc β-TCP. BCP có
tốc độ tan phù hợp với thời gian tái tạo của xương và có khả năng kích thích
tạo xương [1,2].
24
Hình 2.18 BCP (a) dạng bột, viên và các khối đặc, xốp (b) dạng gel
Do đó, vật liệu composite chứa calcium phosphate có thể đáp ứng các
yêu cầu của vật liệu y sinh dùng cho xương. Bởi vì, vật liệu composite này có
thành phần, cấu trúc tương tự xương, tương hợp sinh học, suy giảm sinh học.
Calcium phosphate thúc đẩy sự khoáng hoá, cải thiện tính chất cơ học của vật
liệu cấy ghép trước đây. Calcium phosphate phân tán trong polymer tự nhiên
sẽ cung cấp mầm cho sự hình thành lớp tạo khoáng cũng như di chuyển tế bào
xương đến vùng xương bị tổn thương thúc đẩy quá trình tái tạo xương và đựợc
kỳ vọng nhiều nhất trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương.
2.6 Tình hình nghiên cứu hydrogel và hydrogel composite trên thế giới
Năm 2012, Lih cùng cộng sự tiến hành điều chế Chitosan-poly (ethylene
glycol)-tyramine (CPT) hydrogel đã nhanh chóng hình thành tại chỗ với với sự
hiện diện enzyme HRP và H2O2 để tìm hiểu hoạt động kết dính mô [29].
Năm 2013, Khaled R. Mohamed nghiên cứu in vitro của composite nano-
hydroxyapatite/chitosan-gelatin về sự tạo khoáng của composite, bằng các
phương pháp UV-Vis khảo sát nồng độ ion calcium, phosphate trong dung
dịch SBF sau khi ngâm composite. SEM, FTIR chứng minh sự tạo thành của
khoáng apatite sau 7 ngày ngâm composite trong dung dịch SBF. Trong
nghiên cứu tác giả tổng hợp hydroxyapatite bằng phương pháp kết tủa H3PO4
và Ca(OH)2. Gelatin trong composite không tạo liên kết hóa học với chitosan
nên gelatin dễ tan vào dung dịch dẫn đến sự suy giảm của composite tăng khi
tăng lượng polymer. Composite không có thành phần, cấu trúc xốp nên tế bào
chỉ có thể phát triển trên bề mặt vật liệu [30].
Năm 2013, Pasqui D nghiên cứu carboxylmethyl cellulose/HAp
composite ứng dụng làm vật liệu cho xương. Tế bào xương MG63 phát triển
tốt trên carboxylmethyl cellulose/HAp composite, thành phần, cấu trúc xốp
của vật liệu giúp tế bào xâm nhập và phát triển bên trong vật liệu. Tuy nhiên
sự suy giảm của vật liệu chưa được đề cập [31].
Năm 2013, tiến sĩ Trần Ngọc Quyển và các cộng sự, đã điều chế được
gel hình thành tại chỗ của dẫn xuất chitosan là rutin-tyramine-chitosan-PEG
25
dưới dự hiện diện của enzyme horseradish peroxidase (HRP) và hydrogen

peroxide (H2O2) và áp dụng cho điều trị vết thương ở da [32].
Năm 2014, Nguyen và các cộng sự đã tổng hợp hydrogel composite
Hyaluronic axit (HyA)-Gelatin (Gel)/biphasic calcium phosphate (BCP) ứng
dụng trong tái tạo xương. Các lỗ xốp của vật liệu liên thông với nhau và có
tính cơ học tốt (lực nén 2,8±0,15 MPa) nên có thể ứng dụng thay thế cho
xương. Vật liệu HyA-Gel/BCP có tính tương hợp sinh học tốt. Ngoài ra, in
vivo cho thấy HyA-Gel/BCP sau khi cấy ghép 3 tháng xương mới được hình
thành và tạo khoáng với tốc độ nhanh [33].
Năm 2014, tiến sĩ Trần Ngọc Quyển và các cộng sự tiến hành tổng hợp
dẫn xuất chitosan gồm tyramine-tetronic-chitosan (TTeC) mang các hạt
khoáng xương nano biphasic calcium phosphate (BCP) ứng dụng cho việc tái
tạo xương [34].
Năm 2015, Nguyễn Thị Phương, Viện Khoa học Vật liệu và Ứng dụng
đã tiến hành nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trong cấy ghép và tái tạo xương
trên cơ sở hydrogel composit sinh học gồm biphasic calcium phosphate và
polymer sinh học (gelatin, chitosan) ứng dụng trong tái tạo xương [23].
26
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Hóa chất

 Chitosan - Acros organics
 Gelatin - Sigma Aldrich
 Tris (CH2OH)3CNH2 - Sigma Aldrich
 4-hydroxyphenylacetic acid (HPA) - Acros organics
 Tyramine (TA) - Acros organics
 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide (EDC) - Acros organics
 Hydrogen peroxide (H2O2) - Acros organics
 Horsera dish peroxidase (HRP) - Acros organics
 Sodium chloride (NaCl) - Scharlau
 Calcium chloride (CaCl2.2H2O) - Merck
 Trisodium phosphate (Na3PO4.12H2O) - Merck
 Sodium hydroxyte (NaOH) - Merck
 Sodium bicarbonate (NaHCO3) - Merck
 Disodiumhydrophosphate (Na2HPO4.2H2O) - Merck
 Potassium chloride (KCl) - Merck
 Magiesium chloride MgCl2.6H2O - Merck
 Sodium chloride (NaCl) - Scharlau
 Hydrochloric acid (HCl) - Merck
 Sodium sulphate (Na2SO4) - Merck
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ
3.1.2.1 Thiết bị
 Cân điện tử - HADAM AEP-250G (4 số lẻ).
 Tủ sấy, máy khuấy từ có hiệu chỉnh nhiệt độ, Ominilab, Đài Loan.
 Máy đo pH, Fisher Scientific, Đức.
27
 Bể siêu âm hiệu Bransonic, USA, tần số 42 kHz, công suất 100 W.

 Lò nung hiệu Labetherm L08/14, Đức, nhiệt độ nung lớn nhất 1000
o
C, tại Viện Công nghệ hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam tại TP. Hồ Chí Minh.
 Máy đông khô chân không FDU - 2100 Eyela, Nhật Bản, đông khô ở
o
-80 C, tại Viện Công nghệ hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam.
3.1.2.2 Dụng cụ
 Bình cầu cổ nhám một cổ  Pipette
 Ống nhỏ giọt  Phễu lọc hút chân không
 Ống đong  Cá từ
 Máy khuấy từ  Eppendorf
 Máy sấy  Micropipet 20 - 200 µL
 Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane, MWCO
6000 - 8000 Da.
3.2 Các phương pháp khảo sát vật liệu

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được thực hiện trên máy cộng
hưởng từ hạt nhân Bruker AC 500, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam tại Hà Nội.
- Phân tích nhiễu xạ tia X (XRD), thực hiện trên máy Bruker D5005
(Đức) thuộc trung tâm Manar Đại học Quốc gia.
- Quan sát hình thái mẫu, phân tích nguyên tố bằng máy FESEM (JSM-
635F, JEOL), tại Viện Công nghệ hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.
- Quang phổ kế UV – Vis
3.3 Quy trình tổng hợp
3.3.1 Tổng hợp BCP

 Thí nghiệm với tỉ lệ Ca/P: 1.57 và pH = 7
Hòa tan 6,93 g CaCl2.2H2O trong 100 mL H2O cho vào bể siêu âm điều
chỉnh pH = 7 bằng dung dịch NaOH 1 M và 5,34 g Na2HPO4.2H2O trong 100
mL H2O cho vào bể siêu âm điều chỉnh pH = 7 bằng dung dịch NaOH 1 M
28
hoặc HCl 5%. Sau đó, nhỏ từ từ dung dịch Na2HPO4.2H2O vào dung dịch
CaCl2.2H2O rồi điều chỉnh pH = 7, ổn định trong suốt quá trình phản ứng bằng
dung dịch NaOH 1 M.
Dung dịch huyền phù sau 12 h được lọc bằng máy lọc hút chân không,
sau đó lượng tủa thu được sấy ở nhiệt độ 80 oC, lượng tủa sau khi sấy khô
được nghiền mịn rồi nung ở nhiệt độ 750 oC trong 2 h thu được sản phẩm.
CaCl2 Na2HPO4
Sonicator BCP
pH = 7, 12h
Washing Calcination 750 oC
Filtration Drying 80oC
Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp BCP
29
BCP được tổng hợp bằng phương pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm. Sử
dụng phương pháp phân tích XRD để xác định thành phần, cấu trúc và phương
pháp SEM để xác định hình thái, kích thước của BCP.
3.3.2 Tổng hợp GTA
3.3.2.1 Quy trình tổng hợp GTA

Hòa tan 2 g gelatin trong 30 mL H2O ở nhiệt độ 40 oC. Sau khi gelatin
tan hoàn toàn thêm 1 g tyramine rồi tiếp tục khuấy tan. Sau đó, để nguội đến
nhiệt độ phòng, cho thêm 250 mg EDC vào dung dịch phản ứng, điều chỉnh
pH = 6 bằng dung dịch HCl 5% và khuấy đều ở nhiệt phòng trong 24 h rồi
thẩm tách dung dịch bằng màng Spectra Pork Cellulose Ester Membrane, MW
6000 - 8000 Da trong 3 ngày. Dung dịch sau khi thẩm tách đem đông khô thu
được sản phẩm.
2 g gelatin trong
30 mL H2O
Nhiệt độ 40 oC
Dung dịch gelatin 1 g tyramine
Gelatin - tyramine 250 mg EDC
pH = 6, khuấy 24 h
Thẩm tách
Thời gian: 3 ngày
Đông khô
Sản phẩm
30
Hình 3.2 Sơ đồ tổng hợp GTA
Hình 3.3 Phản ứng tổng hợp GTA

Sử dụng phổ cộng từ hạt nhân 1H-NMR để xác định thành phần, cấu trúc
của gelatin - tyramine (GTA).
3.3.2.2 Xác định hàm lượng của TA trong GTA

Xác định hàm lượng của TA trong GTA bằng phương pháp UV-Vis. Đo
độ hấp thu A của dung dịch GTA ở nồng độ 0,1 mg/mL và dùng đường chuẩn
của nồng độ TA tại 0,15; 0,075; 0,0375; 0,01875; 0,009375 mg/mL và độ hấp
thu A tại bước sóng 275 nm để xác định lượng TA trong GTA.
3.3.3 Tổng hợp CHPA
3.3.3.1 Quy trình tổng hợp CHPA

Hòa tan 1 g chitosan trong 40 mL H2O tại pH = 1 ở nhiệt độ phòng. Sau
khi chitosan hòa tan hoàn toàn thêm vào 0,24 g HPA rồi tiếp tục khuấy tan.
Sau đó cho 450 mg EDC vào dung dịch phản ứng, điều chỉnh pH = 5 bằng
dung dịch NaOH 1 M, khuấy trong 24 h rồi thẩm tách dung dịch bằng màng
Spectra Pork Cellulose Ester Membrane, MW 6000 - 8000 Da trong 3 ngày.
Dung dịch sau khi thẩm tách được đông khô thu được sản phẩm.
31
1g chitosan trong
40 mL H2O
pH = 1, nhiệt độ phòng
Dung dịch chitosan 0,24 g HPA
Chitosan - HPA 450 mg EDC
pH = 5, khuấy 24 h
Thẩm tách
Thời gian: 3 ngày
Đông khô
Sản phẩm
Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp CHPA
Hình 3.5 Phản ứng tổng hợp CHPA

32
Sử dụng phổ cộng từ hạt nhân 1H-NMR để xác định thành phần, cấu trúc
của chitosan - HPA (CHPA).
3.3.3.2 Xác định hàm lượng HPA trong CHPA

Xác định hàm lượng của HPA trong CHPA bằng phương pháp UV-Vis.
Đo độ hấp thu A của dung dịch CHPA ở nồng độ 0,1 mg/mL và dùng đường
chuẩn của nồng độ HPA tại 0,15; 0,075; 0,0375; 0,01875; 0,009375 mg/mL và
độ hấp thu A tại bước sóng 275 nm để xác định lượng HPA trong CHPA.
3.4 Tổng hợp hydrogel và hydrogel composite

 Tổng hợp hydrogel GTA, CHPA và GTA-CHPA
(i) Hòa tan vào 2 eppendorf mỗi mẫu 10 mg GTA trong 90 μL nước cất.
Sau đó thêm 15 μL H2O2 với nồng độ thay đổi lần lượt 0,015%; 0,03%;
0,04%; 0,05%; 0,06%; 0,07% vào eppendorf thứ nhất và 15 μL HRP với nồng
độ cố định 0,05 mg/mL vào eppendorf thứ hai.
(ii) Hòa tan vào 2 eppendorf mỗi mẫu 10 mg CHPA trong 190 μL nước
cất. Sau đó thêm 30 μL H2O2 với nồng độ thay đổi lần lượt 0,046%; 0,06%;
0,075%; 0,09%; 0,1%; 0,12%; 0,18% vào eppendorf thứ nhất và 30 μL HRP
với nồng độ cố định 0,07 mg/mL vào eppendorf thứ hai.
(iii) Cân khối lượng GTA, CHPA tương ứng (Bảng 3.1) và pha thành
dung dịch GTA 10%, CHPA 5%. Sau đó, cho dung dịch GTA-CHPA vào
eppendorf thứ nhất chứa 45 μL H2O2 nồng độ thay đổi lần lượt 0,05%;
0,075%; 0,1%; 0,15%; 0,2% và 45 μL HRP nồng độ cố định 0,07 mg/mL vào
eppendorf thứ hai.
(iv) Trộn đều 2 eppendorf (i), (ii), (iii), sau đó trộn chung 2 dung dịch
polymer trong 2 eppendorf (i), (ii), (iii) lại với nhau. Hydrogel sẽ bắt đầu hình
thành và thời gian tạo gel được xác định từ khi 2 dung dịch polymer được trộn
với nhau đến khi gel hình thành. Nhận biết sự hình thành gel bằng cách lật
ngược eppendorf khi dung dịch sẽ không chảy được nữa.
 Tổng hợp hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
Cách điều chế hydrogel composite GTA-CHPA/BCP tương tự hydrogel
GTA-CHPA nhưng đối với hydrogel composite thì thêm BCP vào từng dung
dịch polymer trước khi tạo gel (khối lượng BCP - Bảng 3.1).
33
Bảng 3.1 Công thức tổng hợp hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
Tỉ lệ Dung dịch polymer chứa Dung dịch polymer chứa HRP

G:C
H2O2 0,05% 0,07 mg/mL
(wt/wt)
20 mg GTA 20 mg GTA
5:1 28 mg BCP 28 mg BCP
4 mg CHPA 4 mg CHPA
14 mg GTA 14 mg GTA
7 mg CHPA 7 mg CHPA
9,3 mg GTA 9,3 mg GTA
9,3 mg CHPA 9,3 mg CHPA
28 mg GTA 28 mg GTA
0 mg CHPA 0 mg CHPA
5,6 mg GTA 5,6 mg GTA
0,5:1 28 mg BCP 28 mg BCP
11,2 mg CHPA 11,2 mg CHPA
Hình 3.6 Tổng hợp hydrogel composite GTA-CHPA/BCP với sự hiện diện
của HRP và H2O2
34
3.5 Khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite
3.5.1 Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composite

Mẫu hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP sau
khi điều chế, được làm khô bằng phương pháp đông khô. Sau đó, quan sát
hình thái mẫu bằng máy FESEM.
3.5.2 Khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel và hydrogel composite
Tiến hành khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel GTA, CHPA, GTA-
CHPA-2G:1C và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C (với nồng độ
và thể tích của HRP, H2O2 sử dụng để tổng hợp các hydrogel và hydrogel
composite trên như mục (i), (ii), (iii), trang 33 và khối lượng 2G:1C tương ứng
Bảng 3.1). Thời gian hình thành gel là thời gian các chất tương tác, phản ứng
để hình thành liên kết ngang. Do đó, thời gian tạo gel được xác định từ khi các
chất phản ứng với nhau đến khi gel đặc lại và không chảy được nữa khi dốc
ngược xuống.
3.5.3 Khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và hydrogel composite
 Chuẩn bị dung dịch PBS chứa enzyme collagenase
Cân 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 16 mg
enzyme collagenase hòa tan hoàn toàn trong 1 L nước cất, pH = 7,4.
 Tiến hành khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và
hydrogel composite như sau:
(i) Chuẩn bị mẫu hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP như (Bảng 3.1) với nồng độ H2O2 0,05% và HRP 0,07 mg/mL.
(ii) Tiến hành ngâm các mẫu hydrogel GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP trong dung dịch PBS. Khối lượng suy giảm của
hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP được xác
định bằng phương pháp trọng lượng theo thời gian. Mẫu hydrogel GTA-
CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP sau khi tổng hợp được cân để
xác định khối lượng (Wo). Sau đó, ngâm trong các eppendorf chứa 1mL dung
dịch PBS, ở nhiệt độ phòng và pH = 7,4 trong các khoảng thời gian ngâm 3 h,
6 h, 18 h, 42 h, 90 h, 186 h, 378 h, 762 h. Sau các khoảng thời gian trên dung
dịch PBS được loại bỏ và tránh gây ảnh hưởng lên đến phần mẫu gel chưa suy
giảm, cân khối lượng hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP. Mẫu gel trên tiếp tục được ủ trong dung dịch PBS mới, khảo sát
35
với khoảng thời gian tiếp theo. Phần trăm khối lượng mẫu gel suy giảm được
tính theo công thức sau :
wo  wt
% khối lượng suy giảm =  100%
wo
Trong đó:
wo: Khối lượng gel (mg) ban đầu.
wt: Khối lượng gel còn lại sau khoảng thời gian (t) đã bị giảm cấp.
3.5.4 Đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel composite
 Chuẩn bị dung dịch SBF: 8,035 g NaCl; 0,355 g NaHCO3; 0,225 g
KCl; 0,231 g K2HPO4.3H2O; 0,311 g MgCl2.6H2O; 39 mL HCl 1 M; 0,292 g
CaCl2; 0,072 g Na2SO4; 6,118 g (CH2OH)3CNH2 hòa tan hoàn toàn trong 1 L
nước cất, pH = 7,4.
 Tiến hành đánh giá khả năng khoáng hóa của hydrogel và
hydrogel composite như sau:
(i) Chuẩn bị mẫu gồm: hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-
5G:1C và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-
5G:1C như (Bảng 3.1) với nồng độ H2O2 0,05% và HRP 0,07 mg/mL.
(ii) Mẫu hydrogel và hydrogel composite trên sau khi tổng hợp đem đông
khô và cắt thành khối tam giác 0,5 cm3, sau đó ngâm trong ống tuýp nhựa
chứa 10 mL dung dịch SBF. Sau thời gian ngâm 28 ngày, mẫu đựợc rửa bằng
nước cất để loại bỏ các muối tan và đông khô mẫu. Phân tích quá trình hình
thành khoáng trên bề mặt hydrogel và hydrogel composite trên bằng XRD,
SEM và EDS.
3.5.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel và hydrogel
composite đối với tế bào từ tuỷ xương thỏ
Sau khi vô trùng mẫu hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C. Mẫu được đặt trong đĩa cấy 24 giếng, tế
bào gốc từ tủy xương thỏ được cấy lên vật liệu với mật độ 5.104 tế bào/giếng.
Sau thời gian 5 ngày tế bào được nhuộm với DAPI (20 mg/mL) trong 10 phút
ở nhiệt độ phòng, mẫu được rửa 3 lần bằng dung dịch PBS. Tế bào sống và
hình thái phát triển trên hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-5G:1C được quan sát qua kính hiển vi huỳnh quang.
36
3.5.6 Phẫu thuật tiêm (ghép) hydrogel và hydrogel composite

 Quy trình phẫu thuật tiêm (ghép) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C trên thỏ gồm (4 thỏ làm mẫu
đối chứng, 4 thỏ tiêm hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và 4 thỏ tiêm hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C).
 Chích thuốc mê
 Cố định thỏ, chọn vùng phẫu thuật, cạo lông vùng phẫu thuật
 Cô lập vùng phẫu thuật, sát trùng vùng phẫu thuật
 Rạch da, lật vạt
 Khoan lỗ với kích thước (chiều cao/đường kính là 5/5 mm)
 Bơm rửa nước muối sinh lý, kiểm soát chảy máu
 Vị trí ghép: Lấp đầy vật liệu ghép vào lỗ khoan, nhồi nén cho đầy
đến miệng lỗ khoan. Đặt màng - khâu kín.
 Vị trí đối chứng: Bơm rửa sạch bằng nước muối sinh lý, kiểm soát
chảy máu. Đặt màng - chống xâm lấn.
 Cố định màng - chống xâm lấn tại vị trí phẫu thuật bằng 2 vít kim
loại đường kính 2 mm cắm vào vùng xương lành 2 bên miệng lỗ khoan, cách
thành lỗ khoan 1 mm. Sau khi lành vết thương, bộc lộ vị trí nghiên cứu dựa
vào dấu sẹo lưu trên da, sẽ nối 2 điểm này lại để xác định tâm lỗ khoan, làm
cơ sở cho việc lấy mẫu mô đúng vị trí nghiên cứu.
 Sau phẫu thuật thỏ được theo dõi vết thương như các dấu hiệu
nhiễm trùng ( vết thương sưng, mép vạt vết thương chảy dịch có mùi hôi) và
chích kháng sinh trong 14 ngày).
37
a) b) c)
d) e) f)
Hình 3.7 Quy trình phẫu thuật thỏ tiêm (ghép) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C
Hình 3.8 Thí nghiệm in vivo trên thỏ (A) lỗ khoan, (B) mẫu hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C
3.5.7 Xem kết quả xương mới hình thành bằng phương pháp micro-CT
Sử dụng hệ thống micro-CT (Skyscan 1072, SKYSCAN, Kontich, Bỉ) để
quét mẫu xương. Hình cắt lát thu được tại vị trí phẫu thuật cho biết mật độ
xương mới hình thành.
38
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
4.1 Kết quả tổng hợp BCP
4.1.1 XRD của BCP

Phân tích cấu trúc pha của BCP bằng phương pháp nhiễu xạ XRD được
trình bày ở (Hình 4.1).
Hình 4.1 Giản đồ XRD của BCP với tỉ lệ mol Ca/P = 1,57 tại pH = 7
Kết quả phân tích XRD ở 2-theta (o) cho các tín hiệu đặc trưng của β-
TCP: 25,80o, 27,77o, 31,03o, 34,37o và của HAp: 25,90o, 31,86o, 32,90o,
34,22o, 39,70o, 46,69o, 49,51o, 53,27o [1,23,35]. Điều này khẳng định rằng với
tỉ lệ mol Ca/P = 1,57 tại pH = 7 thì BCP (β-TCP và HAp) đã được tổng hợp
thành công.
4.1.2 Hình SEM của BCP

Kết quả hình thái của BCP sau khi tổng hợp được quan sát bằng SEM
(Hình 4.2) cho thấy phương pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm cho sản phẩm
kích thước nano, kích thước các hạt tương đối đồng đều và nằm trong khoảng
60 - 100nm.
Điều này có thể được giải thích bởi sóng siêu âm làm tăng hiệu ứng hóa
học và hiệu ứng vật lý, quá trình tạo-vỡ bọt xảy ra gần bề mặt của pha lỏng-
rắn làm giảm sự tích tụ của các hạt. Ngoài ra, sóng siêu âm tăng tốc độ tạo
mầm tinh thể dẫn đến sản phẩm tạo thành có kích thước nhỏ hơn khi không sử
dụng sóng siêu âm. Vì vậy, trong nghiên cứu này sử dụng phương pháp kết tủa
kết hợp sóng siêu âm để tổng hợp BCP.
39
Hình 4.2 Hình SEM của BCP tổng hợp bằng phương pháp sóng siêu âm với tỉ
lệ Ca/P = 1,57 tại pH = 7
4.2 Kết quả tổng hợp GTA
4.2.1 Phổ 1H-NMR của GTA

Kết quả phân tích thành phần và cấu trúc của GTA bằng phổ cộng hưởng
từ hạt nhân 1H-NMR trong D2O thể hiện (Phụ lục PL1.1-PL1.2).
Hình 4.3 Phổ 1H-NMR của GTA trong D2O

Phổ 1H-NMR của GTA trong D2O (Hình 4.3) cho các tín hiệu đặc trưng
của tyramine với độ dịch chuyển δ (ppm): δ 6.75 và δ 7.11 (d, -CHCH-, TA), δ
40
2.65 và δ 2.88 (m, -CH2CH2-, TA). Một số tín hiệu của amino acids trong phổ
1
H-NMR δ (ppm): δ 4.58 (-CH-, proline); δ 4.27 (-CH-, hydroxyproline); δ
3.88 (-CH-, alanine); δ 1.34 (-CH3, alanine); δ 3.57 (-CH2-, glycine); δ 2.23 (-
CH2-, glutamic acid); δ 1.60 (-CH2-, arginine); δ 3.14 (-CH2-, phenylalanine);
δ 7.20, 7.23 và 7.29 (-CH-, phenylalanine). Điều này chứng tỏ GTA đã được
tổng hợp thành công.
4.2.2 Hàm lượng của TA trong GTA

Kết quả đo độ hấp thu A của TA và GTA thu được bằng UV-Vis (λ =
275 nm) được trình bày (Bảng 4.1).
Bảng 4.1 Độ hấp thu A (λ = 275 nm) của dung dịch TA và GTA
Nồng độ (mg/mL) Độ hấp thu A
Dung dịch chuẩn TA Dung dịch polymer GTA TA GTA
0,15 0,1 1,08772 0,12105
0,075 0,56313
0,0375 0,31239
0,01875 0,19764
0,009375 0,1112
Dựa vào kết quả đo được (Bảng 4.1), thiết lập phương trình đường chuẩn
của TA (Hình 4.4).
Hình 4.4 Phương trình đường chuẩn của TA
41
Phương trình đường chuẩn của TA với độ tuyến tính R2 = 0,9995 thích
hợp cho việc định lượng hàm lượng TA có trong polymer GTA. Kết quả tính
toán hàm lượng TA trong mẫu nghiên cứu GTA trình bày ở (Bảng 4.2).
Bảng 4.2 Kết quả tính toán lượng TA trong GTA
STT Đại lượng Kết quả
1 Độ hấp thu A của GTA 0,12105
2 Nồng độ TA: CTA (mg/mL) 0,00958
3 Khối lượng TA trong 1 mg GTA: mTA (mg) 0,00958
4 Khối lượng TA trong 10 mg GTA: mTA (mg) 0,0958
5 Số mol TA có trong 10 mg GTA: nTA (mmol) 0,000699
Theo nghiên cứu của Kurisawa [36] số mol H2O2 tối thiểu cần phản ứng
với TA trong GTA là 60% số mol TA. Trên cơ sở đó, lượng H2O2 tối thiểu cần
phản ứng với TA trong 10 mg GTA để tạo gel là 0,014% trong dung dịch
GTA 10%. Ngoài ra nồng độ H2O2 không sử dụng cao hơn 0,25% vì sẽ gây
độc đối với tế bào [37].
4.3 Kết quả tổng hợp CHPA
4.3.1 Phổ 1H-NMR của CHPA

Kết quả phân tích thành phần và cấu trúc của CHPA bằng phổ cộng
hưởng từ hạt nhân 1H-NMR trong D2O được thể hiện (Phụ lục PL1.3 - PL1.4).
Hình 4.5 Phổ 1H-NMR của CHPA trong D2O
42
Phổ 1H-NMR của CHPA trong D2O (Hình 4.5) cho các tín hiệu đặc trưng
của chitosan và HPA với độ dịch chuyển δ (ppm): δ 2.05 (s, -COCH3,
chitosan); δ 4.21 (d, C1(H), chitosan), δ 3.22 (m, -C2(H), chitosan); δ 3.43-3.92
(m, C3+4+5+6(H), chitosan); δ 2.89 (d, -CH2-, HPA); δ 6.89 và δ 7.22 (d, -
CHCH-, HPA). Điều này chứng tỏ CHPA đã được tổng hợp thành công.
4.3.2 Hàm lượng của HPA trong CHPA

Kết quả đo độ hấp thu A của HPA và CHPA thu được bằng UV-Vis (λ =
275 nm) trình bày (Bảng 4.3).
Bảng 4.3 Độ hấp thu A (λ = 275 nm) của dung dịch HPA và CHPA
Nồng độ (mg/mL) Độ hấp thu A
Dung dịch chuẩn HPA Dung dịch polymer CHPA HPA CHPA
0,15 0,1 1,02196 0,48606
0,075 0,50357
0,0375 0,28572
0,01875 0,17911
0,009375 0,11405
Dựa vào kết quả đo được (Bảng 4.3), thiết lập phương trình đường chuẩn
của HPA (Hình 4.6).
Hình 4.6 Phương trình đường chuẩn của HPA
43
Phương trình đường chuẩn của HPA với độ tuyến tính R2 = 0,9982 thích
hợp cho việc định lượng hàm lượng của HPA trong polymer CHPA. Kết quả
tính toán hàm lượng HPA trong mẫu nghiên cứu CHPA trình bày (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Kết quả tính toán lượng HPA trong CHPA
STT Đại lượng Kết quả
1 Độ hấp thu A của CHPA 0,48606
2 Nồng độ HPA: CHPA (mg/mL) 0,06828
3 Khối lượng HPA trong 1 mg CHPA: mHPA (mg) 0,06828
4 Khối lượng HPA trong 10 mg CHPA: mHPA (mg) 0,6828
5 Số mol HPA có trong 10 mg CHPA: nHPA (mmol) 0,004492
Theo nghiên cứu của Kurisawa [36] số mol H2O2 tối thiểu cần phản ứng
với HPA trong CHPA là 60% số mol HPA. Trên cơ sở đó, lượng H2O2 tối
thiểu cần phản ứng với HPA trong 10 mg CHPA để tạo gel là 0,046% trong
dung dịch CHPA 5%. Ngoài ra nồng độ H2O2 không sử dụng cao hơn 0,25%
vì sẽ gây độc đối với tế bào [37].
4.4 Kết quả khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite
4.4.1 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA, CHPA, GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
Thời gian gel hóa của hydrogel và hydrogel composite là thông số có ý
nghĩa trong việc định hướng ứng dụng vật liệu như tiêm hydrogel (hydrogel
composite) trực tiếp vào vết thương hay định hình hydrogel (hydrogel
composite) trước khi ghép vào vết thương. Kết quả khảo sát thời gian gel hóa
của hydrogel và hydrogel composite được thể hiện ở (Hình 4.7, 4.8, 4.9).
44
Hình 4.7 Thời gian gel hóa của GTA với nồng độ HRP 0,05 mg/mL
Thời gian gel hóa của GTA (Hình 4.7) thay đổi trong khoảng khá rộng.
Với nồng độ HRP là 0,05 mg/mL, nồng độ H2O2 tăng từ 0,015 - 0,05% thì quá
trình đóng rắn gel nhanh dần tương ứng với thời gian gel hóa giảm dần và khi
tăng nồng độ H2O2 từ 0,05 - 0,07% quá trình đóng rắn gel chậm dần tương ứng
với thời gian gel hóa tăng dần. Hiện tượng trên được giải thích là do ở nồng độ
H2O2/HRP cao thì sự phân hủy H2O2 càng nhiều và gốc phenolic được sinh ra
bởi HRP càng tăng nên thời gian tạo gel giảm nhưng nếu nồng độ H2O2/HRP
quá cao thì enzyme bị ức chế làm cho thời gian tạo gel tăng lên.
Hình 4.8 Thời gian gel hóa của CHPA với nồng độ HRP 0,07 mg/mL
Thời gian gel hóa của CHPA (Hình 4.8) thay đổi trong khoảng khá rộng.
Với nồng độ HRP là 0,07 mg/mL, nồng độ H2O2 tăng từ 0,046 - 0,075% thì
quá trình đóng rắn gel nhanh dần tương ứng với thời gian gel hóa giảm dần và
khi tăng nồng độ H2O2 từ 0,075 - 0,18% quá trình đóng rắn gel chậm dần
45
tương ứng với thời gian gel hóa tăng dần. Hiện tượng này cũng được giải thích
như trên là do ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình tạo gel.
Hình 4.9 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C với nồng độ HRP 0,07 mg/mL
Kết quả khảo sát thời gian gel hóa (Hình 4.9) cho ta thấy thời gian gel
hóa của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C chậm hơn so với hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-2G:1C nhưng nhìn chung sự chêch lệch là không lớn. Điều
này được giải thích do tương tác của các hạt BCP với gelatin và chitosan.
Nhóm chức OH, NH2, COOH của gelatin và nhóm chức NH2 của chitosan liên
kết hydrogen với nhóm OH của HAp trong BCP. Ngoài ra, còn có liên kết tạo
phức của nhóm NH2 của gelatin và chitosan với ion Ca2+ của BCP [38-41].
Các liên kết giữa các hạt nano BCP với gelatin và chitosan làm cho mật độ
liên kết của hydrogel composite tăng do đó thời gian tạo gel của hydrogel
composite giảm. Trái lại, BCP làm tăng độ nhớt của dung dịch nên ảnh hưởng
đến quá trình khuếch tán xúc tác dẫn đến thời gian tạo liên kết ngang tăng
dần. Do đó, thời gian gel hóa của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP ít
thay đổi so với hydrogel GTA-CHPA.
Do đó, thời gian gel hóa có thể điều chỉnh phù hợp với nhu cầu thực tiễn
ứng dụng bằng cách thay đổi lượng H2O2 hoặc HRP trong dung dịch hydrogel
GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP.
46
4.4.2 Hình thái của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-

CHPA/BCP
Hình thái của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-5G:1C và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C sau
khi tổng hợp và đông khô được xác định bằng phương pháp SEM được thể
hiện (Hình 4.10 và 4.11).
Hình 4.10 Hình SEM (a) hydrogel GTA-CHPA-2G:1C-0 ngày và (b) GTA-
CHPA-5G:1C-0 ngày
Hình 4.11 Hình SEM (a) của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C-0

ngày và (b) GTA-CHPA/BCP-5G:1C-0 ngày
Hình SEM với thang phóng đại 100 µm và 10 µm (Hình 4.10 và 4.11)
được sử dụng để khảo sát hình thái của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP. Kết quả cho thấy hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP có cấu trúc xốp. Trong khi vật liệu
được tổng hợp bằng phương pháp đúc không có cấu trúc xốp như hydrogel và
hydrogel composite.
Cấu trúc xốp của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP tạo khoảng cư trú cho tế bào dịch chuyển và lưu thông các yếu tố
chuyển hóa tạo xương. Ngoài ra, tế bào và mạch máu có thể phát triển bên
trong các lỗ xốp của vật liệu giúp xương phát triển bên trong vật liệu. Do đó,
cấu trúc xốp của hydrogel và hydrogel composite phù hợp cho ứng dụng trong
lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương [41,42].
47
4.4.3 Khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel

composite GTA-CHPA/BCP
Khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP trong dung dịch PBS được trình bày ở biểu đồ (Hình 4.12
và 4.13).
Hình 4.12 Biểu đồ % khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA trong
dung dịch PBS
Hình 4.13 Biểu đồ % khối lượng suy giảm của hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP trong dung dịch PBS
48
Enzyme collagenase là một enzyme thủy phân có trong cơ thể động vật,
có tác dụng phá vỡ các liên kết peptide trong collagen. Trong nghiên cứu này
dung dịch PBS chứa enzyme collagenase được sử dụng để khảo sát khối lượng
suy giảm của hydrogel và hydrogel composite thông qua sự bẻ gãy các liên kết
peptide. Kết quả khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP trong dung dịch PBS cho thấy hydrogel
không có BCP khối lượng suy giảm nhanh hơn so với hydrogel composite có
BCP.
9.7 4.1
17.1 8.3
11.0 46.8
-4.3 10.0
-9.3 24.3
-100.0 0.0
6.7 19.2
111.3 30.3
166.4 35.7
103.2 51.3
41.4 23.3
-100.0 0.0
49
Điều này được giải thích là do tương tác của các hạt nano BCP với
gelatin và chitosan. Nhóm chức OH, NH2, COOH của gelatin và nhóm chức
NH2 của chitosan liên kết hydrogen với nhóm OH của HAp trong BCP. Ngoài
ra, còn có liên kết tạo phức của nhóm NH2 của gelatin và chitosan với ion Ca2+
của BCP [38-41]. Các liên kết giữa các hạt nano BCP với gelatin và chitosan
làm cho mật độ liên kết của hydrogel composite tăng làm cho gel GTA-
CHPA/BCP bền vững hơn so với gel GTA-CHPA. Vì vậy hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP có khối lượng suy giảm trong dung dịch PBS chậm hơn so
với hydrogel GTA-CHPA.
Khối lượng suy giảm 100% của hydrogel GTA-CHPA-5G:0C sau 42 h
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:0C sau 90 h không phù hợp để
ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương. Ta thấy khối lượng suy
giảm của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C và GTA-CHPA/BCP-
2G:1C sau 762 h lần lượt là 82,99%; 69,55% thích hợp cho ứng dụng chữa
lành khuyết tật của xương. Do đó, trong nghiên cứu này tiến hành đánh giá
khả năng tạo khoáng của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-5G:1C
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C
trong dung dịch giả sinh học SBF. Nhằm đưa ra đánh giá khách quan hơn về
tác dụng của hydrogel và hydrogel composite đối với việc chữa lành khuyết tật
của xương.
4.4.4 Kết quả đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
4.4.4.1 Giản đồ nhiễu xạ XRD

Phân tích cấu trúc pha của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-
5G:1C trước và sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày được xác định
bằng phương pháp nhiễu xạ XRD (Hình 4.14 và 4.15). Khẳng định sự hình
thành khoáng apatit của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C và
GTA-CHPA/BCP-5G:1C sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày. Giản đồ
nhiễu xạ XRD của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C và GTA-
CHPA/BCP-5G:1C trước khi ngâm SBF có các tín hiệu đặc trưng của tinh thể
β-TCP: 25,80o, 27,77o, 31,03o, 34,37o và HAp: 25,90o, 31,86o, 32,90o, 34,22o,
39,70o, 46,69o, 49,51o, 53,27o. Sau khi ngâm hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-2G:1C và GTA-CHPA/BCP-5G:1C trong dung dịch SBF 28 ngày
50
giản đồ nhiễu xạ XRD xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của CaCO3 tại vị
trí 2-theta (o) 26,34o, 27,72o, 41,28o [1,23,35,43]. Điều này khẳng định sự tạo
thành khoáng apatit của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C và
GTA-CHPA/BCP-5G:1C sau khi ngâm trong dung dịch SBF. Bên cạnh đó,
hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và GTA-CHPA-5G:1C không có sự cung cấp
Ca2+ và PO43- từ BCP nên quá trình tạo khoáng chậm nên không quan sát được
rõ các tín hiệu đặc trưng của CaCO3 trong kết quả phân tích này. Trên cơ sở
đó kết quả thực nghiệm của nghiên cứu cho thấy hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP có hiệu quả trong quá trình hình thành và phát triển của khoáng
aptite carbonate.

SBF 28 ngày
51

SBF 28 ngày
4.4.4.2 Hình SEM và EDS

Khả năng tạo khoáng được sử dụng để dự đoán các hoạt tính sinh học
của vật liệu trong nghiên cứu in vitro, in vivo chẳng hạn như khả năng tạo
mầm và phát triển tinh thể apatite carbonate trên bề mặt của vật liệu.
Do đó, tiến hành ngâm hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-
5G:1C trong dung dịch SBF sau 28 ngày và thu được kết quả thể hiện (Hình
4.16, 4.17, 4.18, 4.19).
52
 Hydrogel GTA-CHPA
dung dịch SBF 28 ngày
dung dịch SBF 28 ngày
Kết quả hình SEM (Hình 4.16 và 4.17) với thang phóng đại 1μm cho
thấy hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và GTA-CHPA-5G:1C vẫn giữ được cấu
trúc xốp. Hình SEM với thang phóng đại 10μm cho thấy bề mặt hydrogel
GTA-CHPA-2G:1C và GTA-CHPA-5G:1C xuất hiện các tinh thể tạo khoáng.
Kết quả phân tích EDS (Phụ lục PL1.5-PL1.6) cho thấy khoáng tạo thành gồm
các nguyên tố Ca, C, O, P, sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày và xuất
hiện nguyên tố Si do lớp silic phủ lên mẫu để phân tích EDS. Phần trăm các
nguyên tố tham gia tạo khoáng được thể hiện (Bảng 4.5).
sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày
Phần trăm khối lượng (%)
Mẫu hydrogel
P Ca C O
GTA-CHPA-2-1-28 ngày 7,71 81,76 9,88
GTA-CHPA-5-1-28 ngày 9,99 5,94 26,37 39,50
53
 Hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
Hình 4.18 SEM và EDS của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C

Hình 4.19 SEM và EDS của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C

Kết quả hình SEM (Hình 4.18 và 4.19) với thang phóng đại 1μm
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C vẫn
giữ được cấu trúc xốp. Hình SEM với thang phóng đại 30μm cho thấy bề mặt
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C xuất
hiện các tinh thể tạo khoáng. Phân tích EDS (Phụ lục PL1.7-PL1.8) cho thấy
các tinh thể khoáng hình thành ngoài nguyên tố Na còn xuất hiện thêm các
nguyên tố C, O, P, Ca là các nguyên tố cấu thành calcium phosphate, calcium
carbonate. Kết quả phân tích EDS cho thấy phần lớn mầm tinh thể chứa các
nguyên tố Ca, P, O, C là nguyên tố cấu thành calcium phosphate và calcium
carbonate. Phần trăm các nguyên tố tham gia tạo khoáng thể hiện (Bảng 4.6).
composite sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày
Phần trăm khối lượng (%)
Mẫu hydrogel composite
Na P Ca C O
GTA-CHPA/ BCP-2-1-28 ngày 0,65 13,48 31,36 46,18 7,65
GTA-CHPA/ BCP-5-1-28 ngày 0,84 19,01 35,97 13,33 27,42
54
Từ kết quả phân tích EDS (Bảng 4.5 và 4.6) cho thấy hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C cho kết tạo khoáng tốt
hơn so với hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-5G:1C. Được giải
thích là do BCP tăng cường khả năng tạo khoáng với vai trò như các mầm
apatite carbonate, đồng thời cũng là nguồn cung cấp ion Ca2+ và PO43- cho quá
trình phát triển mầm tinh thể và tinh thể apatite carbonate [41]. Bên cạnh đó, tỉ
lệ gelatin/chitosan lớn cũng góp phần thúc đẩy quá trình tạo khoáng của vật
liệu. Cho thấy ngoài chức năng bám dính tế bào xương gelatin còn có khả
năng kích thích sự phát triển tế bào xương.
Kết luận: Hydrogel composite GTA-CHPA/BCP có ảnh hưởng với
xương tốt hơn so với hydrogel GTA-CHPA.
4.4.5 Kết quả đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel GTA-CHPA
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP đối với tế bào tủy xương thỏ
Khảo sát sự bám dính và phát triển của tế bào tủy xương thỏ trên
hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-
5G:1C được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhân tế bào màu xanh
sau khi nhuộm tế bào với thuốc nhuộm DAPI. Kết quả (Hình 4.20) cho thấy
sau 5 ngày tế bào bám và phát triển tốt trên vật liêu. Do đó có thể khẳng định
tính tương hợp sinh học của vật liệu đối với tế bào tủy xương thỏ. Chitosan
tương hợp sinh học, có khả năng bám dính tế bào tốt nhưng khả năng kích
thích tế bào phát triển kém nên mật độ tế bào bám dính trên vật liệu hydrogel
GTA-CHPA-5G:1C thấp hơn mật độ tế bào bám dính trên hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-5G:1C. Ngoài ra, hydrogel composite GTA-CHPA/BCP có
sự cung cấp Ca, P từ BCP để kích thích và thúc đẩy sự phát triển của tế bào.
Hình 4.20 Sự bám dính và phát triển của tế bào từ tủy xương thỏ trên vật liệu
(a) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và (b) hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-5G:1C
Kết quả thu được cho thấy hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP có nhiều tiềm năng ứng dụng trong tái tạo mô xương.
55
4.4.6 Kết quả micro-CT sau khi cấy ghép vật liệu trên thỏ
Kết quả sau khi phẫu thuật 4 tháng (Hình 4.21), quan sát hình ảnh micro-
CT của các mẫu xương, hình ảnh cắt lát cho thấy xương mới hình thành trong
vùng phẫu thuật. Mẫu hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C lấp đầy lỗ
khoan trong khi đó hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và mẫu đối chứng xương
mới có hình thành nhưng chưa lấp đầy lỗ khoan xương. Các kết quả thu được
cho thấy vật liệu hydrogel composite có nhiều tiềm năng trong tái tạo các
khuyết tật và tổn thương xương động vật.
Hình 4.21 Ảnh Micro-CT (khối xương - mặt cắt lát) của mẫu xương (a) bình
thường, (b) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C, (c) hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-5G:1C và (d) đối chứng
56
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1 Kết luận

Đề tài với nội dung là ”Điều chế in situ hydrogel composite gelatin-
chitosan/BCP và đánh giá khả năng khoáng hóa trong dung dịch SBF” Sau
thời gian thực hiện đã thu được các kết quả như sau :
- Tổng hợp thành công CHPA, GTA và khảo sát thời gian gel hóa của
GTA-CHPA.
- Tổng hợp thành công các hạt nano BCP.
- Điều chế thành công hydrogel, hydrogel composite bằng phản ứng
enzyme HRP trong sự hiện diện của H2O2 với các tỉ lệ gelatin/chitosan là 1G :
0C; 0,5G : 1C; 1G : 1C; 2G : 1G; 5G : 1C.
- Thời gian gel hóa của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP nhìn chung giảm khi tăng nồng độ H2O2 từ 0,05 - 0,2%.
Thời gian gel hóa nhanh nhất của hydrogel và hydrogel composite lần lượt đạt
được là 39s, 35s.
- Hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP vẫn
giữ được cấu trúc xốp trước và sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày.
- Thời gian khối lượng suy giảm trong PBS của vật liệu được xem có ý
nghĩa trong ứng dụng tái tạo xương của hydrogel composite tại tỉ lệ 5G : 1C và
2G : 1C với khối lượng suy giảm lần lượt là 82,99%; 69,55% sau 762h.
- Quá trình khoáng hóa của vật liệu trong dung dịch SBF 28 ngày cho
thấy hydrogel composite tạo khoáng tốt hơn hydrogel. Với hàm lượng Ca, P
bám trên bề mặt vật liệu tốt nhất của hydrogel và hydrogel composite lần lượt
là Ca (5,94%), P (9,99%); Ca(35,97%), P(19,01%).
- Vật liệu thu được có độ tương hợp sinh học cao, kích thích tế bào phát
triển.
- Hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C tăng cường quá trình tái
tạo xương trên thỏ.
5.2 Kiến nghị

Đề tài này đã dừng lại ở mức độ đánh giá sự bám dính, phát triển của tế
bào tủy xương thỏ trên vật liệu và cấy ghép vật liệu trên xương đùi thỏ. Đề tài
nghiên cứu này cho thấy tiềm năng của các hạt nano BCP trong việc cung cấp
ion Ca2+, PO43- cho quá trình lành mô xương bị tổn thương.
57
Để đưa đề tài này ứng dụng trong cuộc sống thì cần phải tiến hành đo độ
bền cơ học của vật liệu như đo độ dãn, độ nén, độ cứng. Tiến hành thử nghiệm
trên các động vật cấp cao hơn như chó, khỉ…
58
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Amera, A., et al., 2011. Synthesis and characterization of porous biphasic
calcium phosphate scaffold from fifferent porogens for possible bone tissue
engineering applications. Science of Sintering, 43: 183-192.
[2] Y.C.Chai, et al., 2012. Current views on calcium phosphate osteogenicity
and the translation into effective bone regeneration strategies. Acta
Biomaterialia, 8: 3876-3887.
[3] Dutta, P.K., Dutta, J., and Tripathi, V.S., 2004. Chitin and chitosan:
Chemistry, properties and applications. Journal of scientific & industrial
research, 63: 20-31.
[4] G.Kumbar, S., Laurencin, C. T., and Deng, M., 2014. Natural and synthetic
biomedical polymers.
[5] Mazaki, T., Shiozaki, Y, et al., 2014. A novel, visible light-induced,
rapidly cross-linkable gelatin scaffold for osteochondral tissue engineering.
Scientific report.
[6] Đặng Xuân Dự, 2015. Nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hiệu ứng đồng
vận H2O2/ bức xạ gamma coban-60 để chế tạo oligochitosan. Luận án tiến sĩ.
Đại học Huế-Trường Đại học Khoa Học.
[7] Nguyễn Thị Thùy Trang, 2011. Nghiên cứu sử dụng chitosan chiết tách từ
vỏ tôm làm tác nhân hấp phụ một số ion kim loại nặng trong môi trường nước.
Luận văn thạc sĩ. Đại học Đà Nẵng.
[8] Jing. S. B., L. Li, D. Ji. Y. Takiguchi, T. Yamaguchi., 1997. Effect of
chitosan on renal function in patients with chronic renal failure, J. Pharm.
Pharmacol. Jun, 49 (7): 721-723.
[9] Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào và cộng sự, 2006.
Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia trong sản xuất giò
lụa, bánh cuốn. Viện dinh dưỡng. Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực
phẩm Việt Nam.
[10] Mariod, A.A. and Adam, H.F., 2013. Review : gelatin, source, extraction
and industrial applications. Acta Scientiarum Polonorum Technol Aliment,
135-147.
[11] Phan Thị Ngọc Bích, 2008. Nghiên cứu chế biến kẹo nha đam. Đồ án tốt
nghiệp - Đại học Cần thơ.
[12] Phan Thị Trúc Mai, 2012. Nghiên cứu quy trình sản xuất gelatin da cá tra
bằng phương pháp kiềm. Đồ án tốt nghiệp Đại học. Đại học Cần Thơ.
[13] Hà Thị Cẩm Chi, 2012. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm và nồng độ
gelatin đến cấu trúc keo gum xoài. Đồ án tốt nghiệp - Đại học Cần Thơ.
[14] Kalia, S. and Avérous L., 2011. Biopolymers: biomedical and
environmental applications.
[15] Enas M.Ahmed, 2015. Hydrogel: preparation, characterization and
applications. Journal of advanced research, 6: 105-121.
[16] Hoàng Dương Thanh, 2014. Tổng hợp vật liệu polyme dạng hydrogel
nhạy nhiệt. Luận án tiến sĩ. Viện Hóa học-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam-Hà Nội.
59
[17] Nilimanka Das, 2013. Preparation methods and properties of hydrogel: A

review. International journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, 5(3):
112-117.
[18] Hoare, T.R., and Kohane, D.S., 2008. Hydrogels in drug delivery:
progress and challenges. polymer, 49(8): 1993-2007.
[19] Gulrez, S.K.H., Al-Assaf, S., and Phillips, G.O., 2011. Hydrogels:
methods of preparation, characterisation and applications. Progress in
molecular and environmental bioengineering-from analysis and modeling to
technology applications, 5: 125-131.
[20] Huaping Tan and Kacey G. MarraOttenbrite., 2010. Jnjectable,
biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials, 3:
1746-1767.
[21] Guzik, U., et al., 2014. Immobilization as a strategyfor improving enzyme
properties-application to oxidoreductases. Molecules, 19: 8995-9018. [22] Pal,
K., Banthia, A.K., and Majuma, D. K., 2009. Polymeric hydrogels:
characterization and biomedical applications-a mini review. Designed
monomers and polymers, 12: 197-220.
[23] Nguyễn Thị Phương, 2015. Nghiên cứu tổng hợp vật liệu mới trong cấy
ghép và tái tạo xương trên cơ sở hydrogel composit sinh học gồm biphasic
calcium phosphate và polymer sinh học (gelatin, chitosan). Luận án tiến sĩ.
Viện Khoa học Vật liệu ứng dụng-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam-TP.Hồ Chí Minh.
[24] Mazhuga, P.M., 1984. Mechanisms of cartilage precursor replacement by
bone in the mammalian skeleton. Acta Biol. Hung., 35: 219-225.
[25] Boskey A.L., 2001. Bone mineralization. 3rd ed. CRC Press, Boca Raton,
FL, USA. pp: 51-134
[26] Knott, L. and Bailey A.J., 1998. Collagen cross-links in mineralizing
tissues: a review of their chemistry, function, and clinical relevance, Bone.
22(3): 181-187.
[27] Gokhale, J., Robey, P.G., and Boskey, A.L., 2001. Osteoporosis. San
Diego: Academic Press. pp: 51-92.
[28] Jeffrey O. Hollinger, Thomas A. Einhorn, Bruce A. Doll, and Charles
Sfeir., 2005. Bone tissue engineering. CRC Press, Boca Raton, FL, USA. pp:
92-113.
[29] Lih, E., et al., 2012. Rapidly curable chitosan-PEG hydrogels as tissue
adhesives for hemostasis and wound healing. Acta biomaterialia, 8: 3261-
3269.
[30] Khaled R. Mohamed, Hanan H. Beherei and Zenab M. El-Rashidy, 2014.
In vitro study of nano hydroxyapatite/chitosan–gelatin composites for
bioapplication. Journal of Advanced Research, 5(2): 2201-2208.
[31] Pasqui D., Torricelli P., De Cagna M., Fini M., and Barbucci R., 2014.
Carboxymethyl cellulose-hydroxyapatite hybrid hydrogel as a composite
material for bone tissue engineering applications. Journal biomed mater Res A,
102(5): 1568-1579.
60
[32] Tran, N.Q., et al., 2013. In situ forming and rutin-releasing chitosan
hydrogels as anjectable dressings for dermal wound healing.
Biomacromolecules.
[33] Linh Thuy Ba Nguyen and Byong-Taek Lee., 2014. A combination of
biphasic calcium phosphate scaffold with hyaluronic axit-gelatin hydrogel as a
new tool for bone regeneration. Tissue engineering part A, 20: 1993-2004.
[34] Tran, N.Q., C.K, Nguyen and Nguyen, T.P., 2014. Enzyme-mediated in
situ preparation of biocompatible hydrogel composites from chitosan
derivative and biphasic calcium phosphate nanoparticles for bone
regeneration. Advances in natural sciences: nanoscience and nanotechnology.
[35] Angelescu N., Ungureanu D.N., and Anghelina F.V., 2011. Synthesis and
charaterization of hydroxyapatite obtained in different experimental conditions.
The scientific bulletin of VALAHIA University-materials and mechanics.
[36] Kurisawa M., Chung J. E., Yang Y. Y., Gao S. J., 2005. Injectable
biodegradable hydrogels composed of hyaluronic axit-tyramin conjugates for
drug delivery and tissue engineering. Chem Commun (Camb), 34: 4312-4314
[37] Veitch N.C.,2004. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic
enzyme, Phytochemistry 2004. (3)65: 649-659.
[38] Baynton K. J., Bewtra J. K., Biswas N., Taylor K. E.,1994. Inactivation
of horseradish peroxidase by phenol and hydrogen peroxid: a kinetic
investigation. Biochim Biophys Acta, (2) 1206: 272-278.
[39] Yuji Y, Fen Y, Junfeng C, Fujing Z, Xiulan L, Kangde Y., 2003.
Preparation and characterization of macroporous chitosan-gelatin/β-tricalcium
phosphate composit scaffolds for bone tissue engineering, J Biomed Mater
Res., 67A: 844-855.
[40] Junjie L, Yan D, Jun Y, Yuji Y, Hong Z, Fanglian Y, Haibin W, Kangde
Y., 2009. Surface characterization and biocompatibility of micro- and nano-
hydroxyapatite/chitosan-gelatin network films, Materials Science and
Engineering C, 29: 1207-1215.
[41] Hoffman A. S, 2003. Hydrogel for biomedical application. Adv Drug Del
Rev, 43: 3-12.
[42] Ngoc Quyen Tran, Yoon Ki Joung, Eugene Lih, K. Min Park, Ki Dong
Park., 2010. Supramolecular hydrogels exhibiting fast in situ gel forming and
adjustable degradation properties. Biomacromol, 11: 617-625.
[43] Abdullahi Shafiu Kamba, Maznah Ismail, Tengku Azmi Tengku Ibrahim,
and Zuki Abu Bakar Zakaria, 2013. Synthesis and characterisation of calcium
carbonate aragonite nanocrystals from cockle shell powder (Anadara granosa).
Journal of Nanomaterials.
61
PHỤ LỤC
PL1.1 Phổ 1H NMR của GTA trong D2O
62
PL1.2 Phổ dãn rộng 1H NMR của GTA trong D2O
63
PL1.3 Phổ 1H NMR của CHPA trong D2O
64
PL1.4 Phổ dãn rộng 1H NMR của CHPA trong D2O
65
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 5,000
Date : 2016/04/14
Pixel : 512 x 384
003
10
10 µm
µm
003
1000 Acquisition Parameter
900 Instrument : 7401F
800 Acc. Voltage : 15.0 kV
700 Probe Current: 1.00000 nA
600 PHA mode : T4
Counts
C
500 Real Time : 12.30 sec
400 Live Time : 10.00 sec
300 O Ca Dead Time : 18 %
200 Si Ca Counting Rate: 1342 cps
100
Energy Range : 0 - 20 keV
0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV
Thin Film Standardless Standard Quantitative Analysis
Fitting Coefficient : 0.6689
Element (keV) Mass% Counts Error% Atom% Compound Mass% Cation K
C K (Ref.) 0.277 81.76 2007.67 0.00 89.10 1.0000
O K 0.525 9.88 627.39 0.04 8.08 0.3866
Si K 1.739 0.66 51.42 1.12 0.31 0.3132
Ca K 3.690 7.71 358.14 0.18 2.52 0.5285
Total 100.00 100.00
PL1.5 SEM và EDS của GTA-CHPA-2G:1C-28ngày
66
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 5,000
Date : 2016/04/14
009
Pixel : 512 x 384
10
10 µm
µm
009
180 PHA mode : T4
Counts

CO
Si
90 Dead Time : 14 %
P Ca
60 Counting Rate: 750 cps
Ca
30 Energy Range : 0 - 20 keV
0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV

C K 0.277 39.50 286.83 0.01 54.31 2.5867
O K (Ref.) 0.525 26.37 495.26 0.01 27.21 1.0000
Si K 1.739 18.21 422.27 0.04 10.71 0.8101
P K 2.013 9.99 195.20 0.08 5.32 0.9610
Ca K 3.690 5.94 81.61 0.24 2.45 1.3671
Total 100.00 100.00
PL1.6 SEM và EDS của GTA-CHPA-5G:1C-28 ngày
67
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 1,000
Date : 2016/04/14
Pixel : 512 x 384

C
P Ca
750 PHA mode : T4
Counts
O
Na Ca
300 F Dead Time : 17 %
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV

C K 0.277 46.18 5522.71 0.00 68.60 1.8921
O K 0.525 7.65 2367.69 0.03 8.54 0.7315
F K 0.677 0.67 228.77 0.36 0.63 0.6632
Na K 1.041 0.65 260.61 0.46 0.50 0.5627
P K 2.013 13.48 4339.95 0.03 7.77 0.7029
Ca K (Ref.) 3.690 31.36 7096.76 0.02 13.96 1.0000
Total 100.00 100.00
PL1.7 SEM và EDS của GTA-CHPA/BCP-2G:1C-28 ngày
68
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 1,000
Date : 2016/04/14
Pixel : 512 x 384

P
O Acc. Voltage : 15.0 kV
400 Ca
Probe Current: 1.00000 nA
C
320 PHA mode : T4
Counts

F Live Time : 60.00 sec
160
Na Ca Dead Time : 13 %
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV

C K 0.277 27.42 1191.78 0.01 47.13 1.8921
O K 0.525 13.33 1498.45 0.02 17.20 0.7315
F K 0.677 3.43 424.94 0.09 3.72 0.6632
Na K 1.041 0.84 123.23 0.47 0.76 0.5627
P K 2.013 19.01 2223.75 0.03 12.67 0.7029
Ca K (Ref.) 3.690 35.97 2957.96 0.03 18.53 1.0000
Total 100.00 100.00
PL1.8 SEM và EDS của GTA-CHPA/BCP-5G:1C-28 ngày
69

T NG Quan Hydrogel PDF

Uploaded by

Document Information

Original Title

Copyright

Available Formats

Share this document

Share or Embed Document

Sharing Options

Did you find this document useful?

Is this content inappropriate?

Copyright:

Available Formats

T NG Quan Hydrogel PDF

Uploaded by

Copyright:

Available Formats

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÙI THANH THÁI

ĐIỀU CHẾ IN SITU HYDROGEL COMPOSITE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

BÙI THANH THÁI

ĐIỀU CHẾ IN SITU HYDROGEL COMPOSITE

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

Ts. TRẦN NGỌC QUYỂN

Nội dung nhận xét:

Xin chân thành cảm ơn!

Bùi Thanh Thái

In the field of healing bone defects, several kinds of composite materials

Cần Thơ, ngày 25 tháng 5 năm 2016

Bùi Thanh Thái

TÓM TẮT ........................................................................................................... i

Bảng 2.1 Đặc điểm gelatin loại A và B ............................................................. 8

Hình 2.1 Phản ứng deacetyl hóa chitin tạo chitosan.......................................... 3

PL1.1 Phổ 1H NMR của GTA trong D2O ....................................................... 62

SBF Stimulates body fluid

1.1 Lý do chọn đề tài

1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.2.1 Đối tượng nghiên cứu

1.2.2 Phạm vi nghiên cứu

1.3 Ý nghĩa khoa học

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN

2.2.1 Nguồn gốc của chitosan trong tự nhiên

Hình 2.1 Phản ứng deacetyl hóa chitin tạo chitosan

2.2.2 Đặc điểm cấu tạo

Hình 2.2 Cấu trúc chitosan

2.2.3 Tính chất

2.2.3.1 Tính chất vật lý

2.2.3.2 Tính chất sinh học

2.2.4 Ứng dụng của chitosan trong y sinh

2.2.4.1 Điều trị bỏng

2.2.4.2 Điều trị mắt

2.2.4.3 Cầm máu

2.2.4.4 Truyền tải thuốc

2.2.1 Nguồn gốc của gelatin trong tự nhiên

Hình 2.3 Cấu trúc gelatin

2.2.2 Khái niệm

2.2.3 Phân loại gelatin

2.2.4 Tính chất vật lý

2.2.5 Tính chất hóa học

2.2.5.1 Cơ chế gel gelatin

2.2.5.2 Độ bền gel

2.2.5.4 Điểm đẳng điện (pI)

2.2.5.5 Tính lưỡng tính

2.2.5.6 Tính hòa tan

2.2.6 Ứng dụng của gelatin trong y sinh

2.3.1 Khái niệm

2.3.2 Phân loại

Hình 2.5 Tương tác kỵ nước

Polymer điện tích trái dấu

Phân tử liên kết ngang với

l 2.6 Tương tác ion

Phức lập thể

Hình 2.7 Tương tác lập thể D - lactide và L - lactide

Hình 2.8 Tạo liên kết ngang bằng glutaraldehyde

Bề mặt hoạt hóa

2.3.4 Tính chất hydrogel