Professional Documents
Culture Documents
T NG Quan Hydrogel PDF
T NG Quan Hydrogel PDF
Mã số: 60440114
2016
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
Mã số: 60440114
2016
Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc
Bộ môn Hóa học ------ ------
LUẬN VĂN ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI VIỆN KHOA HỌC VẬT LIỆU
VÀ ỨNG DỤNG – VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
VIỆT NAM – TP. HỒ CHÍ MINH
Trong lĩnh vực chữa lành các khuyết tật về xương, các vật liệu
composite được xem là có tiềm năng về chữa lành và tái tạo mô xương bị tổn
thương bởi sự cung cấp ion Ca2+, PO43- từ các hạt nano BCP để tăng cường
quá trình lành xương. Trong nghiên cứu này, hydrogel composite gelatin-
chitosan chứa các hạt nano BCP được điều chế để tái tạo xương. GTA, CHPA
được tổng hợp thông qua tác nhân ghép cặp EDC tại pH = 5 - 6 và được xác
định bởi 1H-NMR. Các hạt nano BCP được tổng hợp bằng phương pháp sóng
siêu âm với tỉ lệ Ca/P = 1,57 trong môi trường pH = 7 và được xác định bởi
SEM, XRD. Hàm lượng TA trong GTA và HPA trong CHPA được xác định
bằng quang phổ kế UV-Vis. Hai dẫn xuất của gelatin, chitosan (CHPA, GTA)
và các hạt nano BCP được sử dụng để điều chế hydrogel composite dưới sự
hiện diện của enzyme HRP và H2O2. Hydrogel GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP được đặc trưng bởi thời gian gel hóa, khối lượng
suy giảm trong dung dịch PBS trong 762h. Đánh giá khả năng khoáng hóa của
vật liệu sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày. Và sau đó, vật liệu được
mô tả bằng XRD, SEM và EDS. Đánh giá tương hợp tế bào của vật liệu thông
qua sự phát triển tế bào gốc của thỏ trên vật liệu. Cuối cùng, vật liệu được cấy
vào đùi thỏ trong 4 tháng và đánh giá lành xương bằng micro-CT.
Từ khóa: hydrogel, hydrogel composite, TA, HPA, GTA, CHPA, hạt nano
BCP, HRP, H2O2, EDC, SBF, PBS.
i
ABSTRACT
ii
TRANG CAM KẾT KẾT QUẢ
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân, các công
việc được trình bày trong luận văn là do tôi thực hiện, kết quả thu được trong
quá trình nghiên cứu là trung thực và chưa được ai công bố.
iii
MỤC LỤC
iv
2.3.4 Tính chất hydrogel ...................................................................................17
2.3.5 Ứng dụng hydrogel trong y sinh ..............................................................19
2.4 Hydrogel composite ....................................................................................22
2.4.1 Khái niệm.................................................................................................22
2.4.2 Vật liệu composite trong tái tạo xương ...................................................22
2.5 Giới thiệu về thành phần, cấu tạo của xương và Biphasic calcium
phosphate (BCP) ...............................................................................................23
2.5.1 Thành phần, cấu tạo của xương ...............................................................23
2.5.2 Biphasic calcium phosphate ....................................................................24
2.6 Tình hình nghiên cứu hydrogel và hydrogel composite trên thế giới ........25
CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM ........................................................................27
3.1 Phương tiện nghiên cứu ..............................................................................27
3.1.1 Hóa chất ...................................................................................................27
3.1.2 Thiết bị và dụng cụ ..................................................................................27
3.2 Các phương pháp khảo sát vật liệu .............................................................28
3.3 Quy trình tổng hợp ......................................................................................28
3.3.1 Tổng hợp BCP .........................................................................................28
3.3.2 Tổng hợp GTA.........................................................................................30
3.3.3 Tổng hợp CHPA ......................................................................................31
3.4 Tổng hợp hydrogel và hydrogel composite ................................................33
3.5 Khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite......................35
3.5.1 Khảo sát hình thái của hydrogel và hydrogel composite .........................35
3.5.2 Khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel và hydrogel composite ............35
3.5.3 Khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và hydrogel composite ......35
3.5.4 Đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel composite .....36
3.5.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel và hydrogel composite
đối với tế bào từ tuỷ xương thỏ ........................................................................36
3.5.6 Phẫu thuật tiêm (ghép) hydrogel và hydrogel composite .......................37
3.5.7 Xem kết quả xương mới hình thành bằng phương pháp micro-CT ........38
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .....................................................39
4.1 Kết quả tổng hợp BCP ................................................................................39
4.1.1 XRD của BCP ..........................................................................................39
4.1.2 Hình SEM của BCP .................................................................................39
4.2 Kết quả tổng hợp GTA ...............................................................................40
v
4.2.1 Phổ 1H-NMR của GTA ............................................................................40
4.2.2 Hàm lượng của TA trong GTA ...............................................................41
4.3 Kết quả tổng hợp CHPA .............................................................................42
4.3.1 Phổ 1H-NMR của CHPA .........................................................................42
4.3.2 Hàm lượng của HPA trong CHPA ..........................................................43
4.4 Kết quả khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite .........44
4.4.1 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA, CHPA, GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP ............................................................................44
4.4.2 Hình thái của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP .......................................................................................................47
4.4.3 Khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP .............................................................................................48
4.4.4 Kết quả đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP .............................................................50
4.4.5 Kết quả đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP đối với tế bào tủy xương thỏ ..............55
4.4.6 Kết quả micro-CT sau khi cấy ghép vật liệu trên thỏ ..............................56
CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ....................................................57
5.1 Kết luận .......................................................................................................57
5.2 Kiến nghị ....................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................59
PHỤ LỤC .........................................................................................................62
vi
DANH MỤC BẢNG
vii
DANH MỤC HÌNH
ix
DANH MỤC PHỤ LỤC
x
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
xi
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU
1
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
- Đánh giá sự tương hợp sinh học thông qua sự bám dính và phát triển
của tế bào tủy xương thỏ trên vật liệu.
- Đánh giá quá trình chữa lành khuyết tật xương của vật liệu trên thỏ.
2
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.1 Chitosan
3
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
4
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
5
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
6
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.2 Gelatin
7
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Loại gelatin A B
Nguồn gốc Da heo Xương heo Da bò Xương bò
Điểm đẳng điện (pI) 7,5 - 9 6,5 - 8 4,8 - 5,2 4,8 - 5,2
Độ nhớt (mPa.s) 1,8 - 5,5 1,8 - 4 2-7 2-7
8
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.2.5.3 Độ nhớt
Độ nhớt cũng quan trọng như khả năng tạo gel và cũng phụ thuộc vào
nhiệt độ lẫn nồng độ. Độ nhớt tỉ lệ thuận với nồng độ dung dịch và tỉ lệ nghịch
với nhiệt độ. Dưới 20 oC dung dịch sẽ tồn tại ở dạng gel (ngoại trừ nồng độ
quá thấp). Trong khoảng 20 - 35 oC, dung dịch vừa tồn tại ở dạng gel vừa tồn
tại ở dạng dung dịch nhớt hoặc ở dạng chất lỏng có độ nhớt không ổ định.
Trên 35 oC, các phân tử gelatin trở nên rời rạc, cho dù có tăng nồng độ gelatin
trong dung dịch thì chúng vẫn không liên kết với nhau [11,12].
9
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.3 Hydrogel
10
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.3.2.1 Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp vật lý
Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp vật lý (gel vật lý) là mối
tương tác vật lý giữa các phân tử polymer [18].
Tương tác tạo liên kết hydro: Hydrogel hình thành nhờ tương tác tạo
liên kết hydro có thể được thực hiện bằng cách tăng hoặc giảm nhiệt độ đến
nhiệt độ đông đặc. Poly (vinyl ancohol), hyaluronic acid và methylcellulose…
là những hydrogel điển hình được tạo thành theo phương pháp này. Liên kết
hydro cũng có thể được dùng để tổng hợp hydrogel tiêm được. Hỗn hợp của
hai hay nhiều các polymer tự nhiên có thể có sự đồng bộ về tính lưu biến, có
nghĩa là các thuộc tính đàn hồi, độ nhớt của hỗn hợp polymer giống gel nhiều
hơn so với các thuộc tính này ở từng polymer riêng lẽ. Sự đồng bộ này thường
là kết quả của quá trình tương tác tạo các liên kết hydro giữa các chuỗi
polymer tạo ra sự tương thích trong cấu trúc hình học của các polymer tham
gia [18].
Hydro
to
Hình 2.4 Tương tác tạo liên kết hydro của hyaluronic acid và methylcellulose
Tương tác tại vị trí kỵ nước: Các phân tử polymer có chứa một đầu ưa
nước và một đầu kỵ nước có thể được tạo thành bằng phản ứng trùng hợp hoặc
11
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
bằng cách trực tiếp tạo ra một khối copolymer. Các phân tử polymer này có
thể hòa tan trong nước ở nhiệt độ thấp. Tuy nhiên, khi nhiệt độ tăng, phần kỵ
nước có xu hướng xoay vào trong để giảm thiểu diện tích bề mặt tiếp xúc trực
tiếp với nước. Nhiệt độ mà tại đó xảy ra hiện tượng gel hóa nhưng nó phụ
thuộc vào nồng độ của các polymer, độ dài đầu kỵ nước và cấu trúc hóa học
của polymer [18].
Khối ưa nước
Khối kỵ nước
to
Phần kỵ nước
kk
12
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
thể. Các polymer tự nhiên cũng có thể tạo liên kết ngang bằng tương tác tạo
phức lập thể. Ghép các đồng phân L- và D- có thể tạo ra các hydrogel có tính
chất tương thích sinh học và phân hủy sinh học tốt mà không đòi hỏi việc sử
dụng các điều kiện biến tính khắc nghiệt như dung môi hữu cơ, hóa chất tạo
liên kết ngang [18].
Trộn
2.3.2.2 Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp hóa học
Liên kết ngang hình thành bằng phương pháp hóa học (gel hóa học) là
mối tương tác hóa học giữa các phân tử polymer [19].
Tạo liên kết ngang bằng chất tạo liên kết ngang: Các chất tạo liên kết
ngang như glutaraldehyde, epichlorohydrin,… đã được sử dụng rộng rãi để tạo
liên kết ngang trong các hydrogel tổng hợp lẫn tự nhiên [19].
13
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Tạo liên kết ngang bằng cách polymer hóa gốc tự do: Bằng cách sử
dụng các chất dùng để tạo gốc tự do như chất khơi mào nhạy sáng (tia UV),
chất khơi mào oxi hóa khử N, N, N’, N’-tetramethyl ethylenediamine
(TEMED) và amoni peroxydisulfate (APS)…. Chất khơi mào nhạy sáng tạo
liên kết ngang rất nhanh tuy nhiên khi tiếp xúc với tia UV ở cường độ cao
hoặc thời gian dài ảnh hưởng xấu đến hoạt động trao đổi chất của tế bào và
nhiệt phát sinh trong quá trình tạo liên kết ngang có thể gây hoại tử tế bào. Do
đó, tia UV sử dụng giới hạn 5 mW/cm2 để tránh gây hoại tử tế bào. Khi tăng
nồng độ chất khơi mào sẽ giảm thời gian gel hóa và tăng cường tính cơ học.
Tuy nhiên, nồng độ chất khơi mào cao (10 mM) sẽ gây độc tế bào cao dẫn tới
tỉ lệ sống của tế bào thấp (nhỏ hơn 30%) sau 3 ngày nuôi cấy tế bào [19].
Polymer
Tia gama
Monomer
Ghép bề mặt
Hình 2.9 Tạo liên kết ngang thông qua polymer hóa gốc tự do
Tạo liên kết ngang bằng phản ứng cô ̣ng Michael: Phản ứng cô ̣ng
Michael giữa mô ̣t tác nhân nucleophile (nhóm amine hoă ̣c nhóm thiol) và tác
nhân electrophile (vinyl/acrylate) là phương pháp điề u chế hydrogel. Đă ̣c biê ̣t
đố i với hydrogel cho kỹ thuâ ̣t mô, hydrogel đươ ̣c ta ̣o thành khi trô ̣n hai
polymer mang nhóm nucletrophin và nhóm electrophin. Hydrogel đươ ̣c điề u
chế bằ ng phản ứng cô ̣ng Michael có thời gian gel hóa trung bình (0,5 - 60 s),
đô ̣ bề n cơ ho ̣c trung bình và tính chấ t của hydrogel có thể đươ ̣c điề u chin
̉ h bởi
các nhóm chức và mâ ̣t đô ̣ liên kế t ngang [20].
14
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 2.10 Tạo liên kết bằ ng phản ứng cô ̣ng Michael
Tạo liên kết ngang bằng phản ứng Schiff-base: Phản ứng Schiff-base
hiǹ h thành giữa mô ̣t nhóm aldehyde và mô ̣t nhóm amine thường đươ ̣c sử du ̣ng
để ta ̣o hydrogel liên kế t ngang. Do phản ứng Schiff-base dễ phân hủy bằ ng
quá triǹ h thủy phân liên kế t nhóm amine ở nhiê ̣t đô ̣ thấ p, viê ̣c bổ sung các
thành phầ n như borax (hàn the) có thể ta ̣o điề u kiê ̣n hình thành phản ứng
Schiff-base, làm cho hydrogel tương đố i ổ n đinh ̣ với thời gian gel hóa nhanh
[20].
Hình 2.11 Tạo liên kết ngang bằ ng phản ứng Schiff-base
Tạo liên kết ngang bằng xúc tác enzyme: Enzyme thường cho thấy tính
đặc hiệu cao, có khả năng tránh được phản ứng phụ trong quá trình tạo liên kết
ngang. Điều này giúp kiểm soát và dự đoán các động học của sự gel hóa và
làm tăng tỷ lệ liên kết ngang bằng cách điều chỉnh nồng độ enzyme. Các
enzyme thường được sử dụng để tổng hợp hydrogel như transglutaminase,
tyrosinase, horseradish peroxidase. Các enzyme này thúc đẩy quá trình liên kết
tạo ngang như cho thời gian gel hóa nhanh, đô ̣ bề n cơ ho ̣c tố t, dễ phân hủy
sinh ho ̣c và được thực hiê ̣n trong điề u kiê ̣n sinh lý bin
̀ h thường và không có
bấ t kỳ phản ứng phu ̣ không mong muố n nào. Do đó, chúng được ứng dụng để
tạo liên kết ngang của hydrogel cho các ứng dụng trong lĩnh vực y sinh [20].
15
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 2.12 Liên kết ngang hình thành với sự hiện diện HRP và H2O2
2.3.3 Cơ chế xúc tác vòng của enzyme HRP với sự hiện diện H2O2
Horseradish peroxidase (HRP): Là mô ̣t chuỗi đơn loa ̣i β-hemoprotein,
có vai trò xúc tác các nhóm phenol hoă ̣c dẫn xuấ t của anilin trong polymer với
sự hiê ̣n diê ̣n của H2O2 để ta ̣o ra liên kế t ngang và hin
̀ h thành hydrogel. Phản
ứng tạo liên kết ngang carbon - carbon hình thành ở vị trí ortho của 2 phân tử
phenol hoặc carbon - oxygen ở vị trí ortho của phenoxy và gốc tự do phenoxyl
(Hình 4.12) [21].
Cơ chế xúc tác vòng của enzyme HRP
Bước 1: Quá trình xúc tác vòng có sự tương tác giữa Fe(III) của enzyme
ở trạng thái nghỉ với H2O2, sau đó một phân tử nước được giải phóng với 2
electron oxi hóa của heme sắt hình thành hợp chất A. Hợp chất A có trạng thái
oxy hóa cao gồm Fe(IV) oxoferryl và gốc cation porphyrin (Por.+FeIV=O)
[21].
Bước 2: Chuyển 2 electron đơn, làm cho hợp chất A được đưa về trạng
thái nghỉ. Việc giảm một electron đầu tiên của gốc cation porphyrin cần sự
hiện diện của chất nền phenol hoặc dẫn xuất anilin để hình thành hợp chất B
(Fe(IV)=O). Việc giảm một electron thứ hai giúp đưa hợp chất B về trạng thái
nghỉ [21].
16
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 2.13 Cơ chế xúc tác vòng của HRP dưới sự hiện diện của H2O2
Khi thành phần, cấu trúc polymer càng ưa nước thì tương tác polymer -
nước càng mạnh. Hydrogel chứa các nhóm chức ưa nước trương lên trong
nước cho kết quả tương tác polymer - nước. Nếu thành phần, cấu trúc
hydrogel chứa các ion, hiện tượng thẩm thấu phát sinh bởi các ion bù trừ điện
tích do sự khác biệt nồng độ ion trong gel và dung dịch bên ngoài. Các điện
tích ion trên khung sườn polymer đẩy nhau trong dung dịch nước và phát sinh
sự trương nở đáng kể trong không gian do việc hấp thụ nước.
Hydrogel được phân thành 2 dạng là không có ion và có ion (anion,
cation và ion lưỡng tính) cũng như những hydrogel với các sườn chứa các
nhóm ưa nước và kỵ nước.
(i) Hydrogel không có ion: Ví dụ như poly (N-vinyl-pyrrolidone) và poly
(ethylene oxide), trương lên trong môi trường nước duy nhất do các tương tác
polymer - nước.
(ii) Hydrogel ion: Trương nở phụ thuộc vào pH của môi trường nước, tức
là phụ thuộc vào mức độ phân ly của các chuỗi ion. Sự thay đổi pH có thể thay
đổi tổng thể các đặc tính ion.
Sự hấp thụ nước của hydrogel phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mật độ
liên kết ngang, mật độ điện tích, bản chất của dung dịch, thành phần, cấu trúc
xốp của hydrogel. Trong đó yếu tố mật độ liên kết ngang ảnh hưởng đến độ
trương nở của hydrogel nhất bởi vì mật độ liên kết ngang càng cao thì khoảng
cách giữa các chuỗi polymer càng ngắn dẫn đến khả năng trương nở của
hydrogel càng thấp.
18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
19
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
nhạy sáng, độ nhạy áp suất. Tốc độ hòa tan thuốc giảm khi tăng trọng lượng
phân tử thuốc [22].
Hệ thống chứa: Lõi thuốc được bao bọc bởi một màng hydrogel cho
phép sự khuếch tán của thuốc qua màng. Khi tiếp xúc với nước, nước khuếch
tán vào hệ thống và hòa tan thuốc tạo ra một nồng độ bão hòa tương đương
của thuốc (Cs). Thuốc khuếch tán qua màng đến môi trường bên ngoài và
nồng độ giảm xuống dưới Cs. Chất rắn thuốc có mặt trong lõi tan, nồng độ trở
lại Cs và quá trình lặp lại cho đến khi hạt rắn thuốc tan hết. Loại hệ thống
mang thuốc này chủ yếu được sử dụng để dẫn truyền các tác nhân hoạt động
qua miệng, mắt, tuyến tử cung hoặc thẩm thấu qua da.
20
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.3.5.3 Kỹ thuật mô
Kỹ thuật mô đang là một lĩnh vực quan trọng trong y học tái tạo. Nó gồm
ba thành phần cơ bản : Tế bào hoặc mô, khung và cấy ghép. Kỹ thuật mô được
sử dụng rộng rãi để khôi phục lại chức năng của một mô hoặc các cơ quan bị
tổn thương. Trong thực tế, các tế bào của bệnh nhân là thường kết hợp với một
khung để tạo ra tế bào mới. Khung có thể được tạo thành từ gốm sứ hoặc
polymer, đó có thể là vĩnh viễn hoặc tạm thời. Kích thước lỗ của các khung
nên được > 80 μm. Điều này là cần thiết cho việc di chuyển tế bào vào lõi của
khung, mạch máu cung cấp chất dinh dưỡng cho các tế bào và lấy đi các sản
phẩm trao đổi chất ra khỏi tế bào. Các khung tạo thành từ polymer là những
hydrogel được ứng dụng cho kĩ thuật mô. Mỗi năm hàng ngàn bệnh nhân mất
mô và hư hỏng nội tạng vì bệnh tật hoặc chấn thương được cứu sống [22].
21
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
không virus. Việc cung cấp các gen vào tế bào vật chủ bằng cách sử dụng một
virus sử dụng có khả năng kết hợp DNA vào tế bào vật chủ. Để đáp ứng mục
đích này nhiều virus đã được sử dụng. Các vector virus được sử dụng vì chúng
có thể tải nạp và biểu hiện gen cao. Đồng thời, việc sử dụng vector virus khá
hạn chế vì chúng có thể tạo ra phản ứng miễn dịch hoặc đột biến của các tế
bào chuyển nạp. Do đó, các nhà khoa học hướng đến nghiên cứu và sử dụng
các polymer như poly-L-lysine (PLL), polyamidoamine dendrimer (PAMAM),
polyethylenimine (PEI), PGA, PLA và PLGA cho chuyển gen. Mặc dù
PAMAM và PEI có thể cung cấp hiệu quả thâm chuyển cao nhưng sử dụng
chúng bị hạn chế do phân hủy kém. Đây là lý do tại sao việc sử dụng các
polyme phân hủy sinh học như PLA, PLGA và PGA [22].
22
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.5 Giới thiệu về thành phần, cấu tạo của xương và Biphasic calcium
phosphate (BCP)
23
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 2.18 BCP (a) dạng bột, viên và các khối đặc, xốp (b) dạng gel
Do đó, vật liệu composite chứa calcium phosphate có thể đáp ứng các
yêu cầu của vật liệu y sinh dùng cho xương. Bởi vì, vật liệu composite này có
thành phần, cấu trúc tương tự xương, tương hợp sinh học, suy giảm sinh học.
Calcium phosphate thúc đẩy sự khoáng hoá, cải thiện tính chất cơ học của vật
liệu cấy ghép trước đây. Calcium phosphate phân tán trong polymer tự nhiên
sẽ cung cấp mầm cho sự hình thành lớp tạo khoáng cũng như di chuyển tế bào
xương đến vùng xương bị tổn thương thúc đẩy quá trình tái tạo xương và đựợc
kỳ vọng nhiều nhất trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương.
2.6 Tình hình nghiên cứu hydrogel và hydrogel composite trên thế giới
Năm 2012, Lih cùng cộng sự tiến hành điều chế Chitosan-poly (ethylene
glycol)-tyramine (CPT) hydrogel đã nhanh chóng hình thành tại chỗ với với sự
hiện diện enzyme HRP và H2O2 để tìm hiểu hoạt động kết dính mô [29].
Năm 2013, Khaled R. Mohamed nghiên cứu in vitro của composite nano-
hydroxyapatite/chitosan-gelatin về sự tạo khoáng của composite, bằng các
phương pháp UV-Vis khảo sát nồng độ ion calcium, phosphate trong dung
dịch SBF sau khi ngâm composite. SEM, FTIR chứng minh sự tạo thành của
khoáng apatite sau 7 ngày ngâm composite trong dung dịch SBF. Trong
nghiên cứu tác giả tổng hợp hydroxyapatite bằng phương pháp kết tủa H3PO4
và Ca(OH)2. Gelatin trong composite không tạo liên kết hóa học với chitosan
nên gelatin dễ tan vào dung dịch dẫn đến sự suy giảm của composite tăng khi
tăng lượng polymer. Composite không có thành phần, cấu trúc xốp nên tế bào
chỉ có thể phát triển trên bề mặt vật liệu [30].
Năm 2013, Pasqui D nghiên cứu carboxylmethyl cellulose/HAp
composite ứng dụng làm vật liệu cho xương. Tế bào xương MG63 phát triển
tốt trên carboxylmethyl cellulose/HAp composite, thành phần, cấu trúc xốp
của vật liệu giúp tế bào xâm nhập và phát triển bên trong vật liệu. Tuy nhiên
sự suy giảm của vật liệu chưa được đề cập [31].
Năm 2013, tiến sĩ Trần Ngọc Quyển và các cộng sự, đã điều chế được
gel hình thành tại chỗ của dẫn xuất chitosan là rutin-tyramine-chitosan-PEG
25
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
26
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
3.1.2.1 Thiết bị
Cân điện tử - HADAM AEP-250G (4 số lẻ).
Tủ sấy, máy khuấy từ có hiệu chỉnh nhiệt độ, Ominilab, Đài Loan.
Máy đo pH, Fisher Scientific, Đức.
27
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
3.1.2.2 Dụng cụ
Bình cầu cổ nhám một cổ Pipette
Ống nhỏ giọt Phễu lọc hút chân không
Ống đong Cá từ
Máy khuấy từ Eppendorf
Máy sấy Micropipet 20 - 200 µL
Túi thẩm tách Spectra Por Regenerated Cellulose Membrane, MWCO
6000 - 8000 Da.
hoặc HCl 5%. Sau đó, nhỏ từ từ dung dịch Na2HPO4.2H2O vào dung dịch
CaCl2.2H2O rồi điều chỉnh pH = 7, ổn định trong suốt quá trình phản ứng bằng
dung dịch NaOH 1 M.
Dung dịch huyền phù sau 12 h được lọc bằng máy lọc hút chân không,
sau đó lượng tủa thu được sấy ở nhiệt độ 80 oC, lượng tủa sau khi sấy khô
được nghiền mịn rồi nung ở nhiệt độ 750 oC trong 2 h thu được sản phẩm.
CaCl2 Na2HPO4
Sonicator BCP
pH = 7, 12h
29
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
BCP được tổng hợp bằng phương pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm. Sử
dụng phương pháp phân tích XRD để xác định thành phần, cấu trúc và phương
pháp SEM để xác định hình thái, kích thước của BCP.
2 g gelatin trong
30 mL H2O
Nhiệt độ 40 oC
pH = 6, khuấy 24 h
Thẩm tách
Đông khô
Sản phẩm
30
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
31
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
1g chitosan trong
40 mL H2O
pH = 1, nhiệt độ phòng
pH = 5, khuấy 24 h
Thẩm tách
Đông khô
Sản phẩm
Sử dụng phổ cộng từ hạt nhân 1H-NMR để xác định thành phần, cấu trúc
của chitosan - HPA (CHPA).
33
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
20 mg GTA 20 mg GTA
5:1 28 mg BCP 28 mg BCP
4 mg CHPA 4 mg CHPA
14 mg GTA 14 mg GTA
2:1 28 mg BCP 28 mg BCP
7 mg CHPA 7 mg CHPA
9,3 mg GTA 9,3 mg GTA
1:1 28 mg BCP 28 mg BCP
9,3 mg CHPA 9,3 mg CHPA
28 mg GTA 28 mg GTA
1:0 28 mg BCP 28 mg BCP
0 mg CHPA 0 mg CHPA
5,6 mg GTA 5,6 mg GTA
0,5:1 28 mg BCP 28 mg BCP
11,2 mg CHPA 11,2 mg CHPA
Hình 3.6 Tổng hợp hydrogel composite GTA-CHPA/BCP với sự hiện diện
của HRP và H2O2
34
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
3.5 Khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite
3.5.2 Khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel và hydrogel composite
Tiến hành khảo sát thời gian gel hóa của hydrogel GTA, CHPA, GTA-
CHPA-2G:1C và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C (với nồng độ
và thể tích của HRP, H2O2 sử dụng để tổng hợp các hydrogel và hydrogel
composite trên như mục (i), (ii), (iii), trang 33 và khối lượng 2G:1C tương ứng
Bảng 3.1). Thời gian hình thành gel là thời gian các chất tương tác, phản ứng
để hình thành liên kết ngang. Do đó, thời gian tạo gel được xác định từ khi các
chất phản ứng với nhau đến khi gel đặc lại và không chảy được nữa khi dốc
ngược xuống.
3.5.3 Khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và hydrogel composite
Chuẩn bị dung dịch PBS chứa enzyme collagenase
Cân 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4, 0,24 g KH2PO4, 16 mg
enzyme collagenase hòa tan hoàn toàn trong 1 L nước cất, pH = 7,4.
Tiến hành khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel và
hydrogel composite như sau:
(i) Chuẩn bị mẫu hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP như (Bảng 3.1) với nồng độ H2O2 0,05% và HRP 0,07 mg/mL.
(ii) Tiến hành ngâm các mẫu hydrogel GTA-CHPA và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP trong dung dịch PBS. Khối lượng suy giảm của
hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP được xác
định bằng phương pháp trọng lượng theo thời gian. Mẫu hydrogel GTA-
CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP sau khi tổng hợp được cân để
xác định khối lượng (Wo). Sau đó, ngâm trong các eppendorf chứa 1mL dung
dịch PBS, ở nhiệt độ phòng và pH = 7,4 trong các khoảng thời gian ngâm 3 h,
6 h, 18 h, 42 h, 90 h, 186 h, 378 h, 762 h. Sau các khoảng thời gian trên dung
dịch PBS được loại bỏ và tránh gây ảnh hưởng lên đến phần mẫu gel chưa suy
giảm, cân khối lượng hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP. Mẫu gel trên tiếp tục được ủ trong dung dịch PBS mới, khảo sát
35
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
với khoảng thời gian tiếp theo. Phần trăm khối lượng mẫu gel suy giảm được
tính theo công thức sau :
wo wt
% khối lượng suy giảm = 100%
wo
Trong đó:
wo: Khối lượng gel (mg) ban đầu.
wt: Khối lượng gel còn lại sau khoảng thời gian (t) đã bị giảm cấp.
3.5.4 Đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel và hydrogel composite
Chuẩn bị dung dịch SBF: 8,035 g NaCl; 0,355 g NaHCO3; 0,225 g
KCl; 0,231 g K2HPO4.3H2O; 0,311 g MgCl2.6H2O; 39 mL HCl 1 M; 0,292 g
CaCl2; 0,072 g Na2SO4; 6,118 g (CH2OH)3CNH2 hòa tan hoàn toàn trong 1 L
nước cất, pH = 7,4.
Tiến hành đánh giá khả năng khoáng hóa của hydrogel và
hydrogel composite như sau:
(i) Chuẩn bị mẫu gồm: hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-
5G:1C và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-
5G:1C như (Bảng 3.1) với nồng độ H2O2 0,05% và HRP 0,07 mg/mL.
(ii) Mẫu hydrogel và hydrogel composite trên sau khi tổng hợp đem đông
khô và cắt thành khối tam giác 0,5 cm3, sau đó ngâm trong ống tuýp nhựa
chứa 10 mL dung dịch SBF. Sau thời gian ngâm 28 ngày, mẫu đựợc rửa bằng
nước cất để loại bỏ các muối tan và đông khô mẫu. Phân tích quá trình hình
thành khoáng trên bề mặt hydrogel và hydrogel composite trên bằng XRD,
SEM và EDS.
3.5.5 Đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel và hydrogel
composite đối với tế bào từ tuỷ xương thỏ
Sau khi vô trùng mẫu hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C. Mẫu được đặt trong đĩa cấy 24 giếng, tế
bào gốc từ tủy xương thỏ được cấy lên vật liệu với mật độ 5.104 tế bào/giếng.
Sau thời gian 5 ngày tế bào được nhuộm với DAPI (20 mg/mL) trong 10 phút
ở nhiệt độ phòng, mẫu được rửa 3 lần bằng dung dịch PBS. Tế bào sống và
hình thái phát triển trên hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-5G:1C được quan sát qua kính hiển vi huỳnh quang.
36
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
37
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
a) b) c)
d) e) f)
Hình 3.7 Quy trình phẫu thuật thỏ tiêm (ghép) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C
Hình 3.8 Thí nghiệm in vivo trên thỏ (A) lỗ khoan, (B) mẫu hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C
3.5.7 Xem kết quả xương mới hình thành bằng phương pháp micro-CT
Sử dụng hệ thống micro-CT (Skyscan 1072, SKYSCAN, Kontich, Bỉ) để
quét mẫu xương. Hình cắt lát thu được tại vị trí phẫu thuật cho biết mật độ
xương mới hình thành.
38
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 4.1 Giản đồ XRD của BCP với tỉ lệ mol Ca/P = 1,57 tại pH = 7
Kết quả phân tích XRD ở 2-theta (o) cho các tín hiệu đặc trưng của β-
TCP: 25,80o, 27,77o, 31,03o, 34,37o và của HAp: 25,90o, 31,86o, 32,90o,
34,22o, 39,70o, 46,69o, 49,51o, 53,27o [1,23,35]. Điều này khẳng định rằng với
tỉ lệ mol Ca/P = 1,57 tại pH = 7 thì BCP (β-TCP và HAp) đã được tổng hợp
thành công.
Hình 4.2 Hình SEM của BCP tổng hợp bằng phương pháp sóng siêu âm với tỉ
lệ Ca/P = 1,57 tại pH = 7
40
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
2.65 và δ 2.88 (m, -CH2CH2-, TA). Một số tín hiệu của amino acids trong phổ
1
H-NMR δ (ppm): δ 4.58 (-CH-, proline); δ 4.27 (-CH-, hydroxyproline); δ
3.88 (-CH-, alanine); δ 1.34 (-CH3, alanine); δ 3.57 (-CH2-, glycine); δ 2.23 (-
CH2-, glutamic acid); δ 1.60 (-CH2-, arginine); δ 3.14 (-CH2-, phenylalanine);
δ 7.20, 7.23 và 7.29 (-CH-, phenylalanine). Điều này chứng tỏ GTA đã được
tổng hợp thành công.
41
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Phương trình đường chuẩn của TA với độ tuyến tính R2 = 0,9995 thích
hợp cho việc định lượng hàm lượng TA có trong polymer GTA. Kết quả tính
toán hàm lượng TA trong mẫu nghiên cứu GTA trình bày ở (Bảng 4.2).
Bảng 4.2 Kết quả tính toán lượng TA trong GTA
STT Đại lượng Kết quả
1 Độ hấp thu A của GTA 0,12105
2 Nồng độ TA: CTA (mg/mL) 0,00958
3 Khối lượng TA trong 1 mg GTA: mTA (mg) 0,00958
4 Khối lượng TA trong 10 mg GTA: mTA (mg) 0,0958
5 Số mol TA có trong 10 mg GTA: nTA (mmol) 0,000699
Theo nghiên cứu của Kurisawa [36] số mol H2O2 tối thiểu cần phản ứng
với TA trong GTA là 60% số mol TA. Trên cơ sở đó, lượng H2O2 tối thiểu cần
phản ứng với TA trong 10 mg GTA để tạo gel là 0,014% trong dung dịch
GTA 10%. Ngoài ra nồng độ H2O2 không sử dụng cao hơn 0,25% vì sẽ gây
độc đối với tế bào [37].
42
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Phổ 1H-NMR của CHPA trong D2O (Hình 4.5) cho các tín hiệu đặc trưng
của chitosan và HPA với độ dịch chuyển δ (ppm): δ 2.05 (s, -COCH3,
chitosan); δ 4.21 (d, C1(H), chitosan), δ 3.22 (m, -C2(H), chitosan); δ 3.43-3.92
(m, C3+4+5+6(H), chitosan); δ 2.89 (d, -CH2-, HPA); δ 6.89 và δ 7.22 (d, -
CHCH-, HPA). Điều này chứng tỏ CHPA đã được tổng hợp thành công.
43
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Phương trình đường chuẩn của HPA với độ tuyến tính R2 = 0,9982 thích
hợp cho việc định lượng hàm lượng của HPA trong polymer CHPA. Kết quả
tính toán hàm lượng HPA trong mẫu nghiên cứu CHPA trình bày (Bảng 4.4).
Bảng 4.4 Kết quả tính toán lượng HPA trong CHPA
STT Đại lượng Kết quả
1 Độ hấp thu A của CHPA 0,48606
2 Nồng độ HPA: CHPA (mg/mL) 0,06828
3 Khối lượng HPA trong 1 mg CHPA: mHPA (mg) 0,06828
4 Khối lượng HPA trong 10 mg CHPA: mHPA (mg) 0,6828
5 Số mol HPA có trong 10 mg CHPA: nHPA (mmol) 0,004492
Theo nghiên cứu của Kurisawa [36] số mol H2O2 tối thiểu cần phản ứng
với HPA trong CHPA là 60% số mol HPA. Trên cơ sở đó, lượng H2O2 tối
thiểu cần phản ứng với HPA trong 10 mg CHPA để tạo gel là 0,046% trong
dung dịch CHPA 5%. Ngoài ra nồng độ H2O2 không sử dụng cao hơn 0,25%
vì sẽ gây độc đối với tế bào [37].
4.4 Kết quả khảo sát các tính chất của hydrogel và hydrogel composite
4.4.1 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA, CHPA, GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
Thời gian gel hóa của hydrogel và hydrogel composite là thông số có ý
nghĩa trong việc định hướng ứng dụng vật liệu như tiêm hydrogel (hydrogel
composite) trực tiếp vào vết thương hay định hình hydrogel (hydrogel
composite) trước khi ghép vào vết thương. Kết quả khảo sát thời gian gel hóa
của hydrogel và hydrogel composite được thể hiện ở (Hình 4.7, 4.8, 4.9).
44
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 4.7 Thời gian gel hóa của GTA với nồng độ HRP 0,05 mg/mL
Thời gian gel hóa của GTA (Hình 4.7) thay đổi trong khoảng khá rộng.
Với nồng độ HRP là 0,05 mg/mL, nồng độ H2O2 tăng từ 0,015 - 0,05% thì quá
trình đóng rắn gel nhanh dần tương ứng với thời gian gel hóa giảm dần và khi
tăng nồng độ H2O2 từ 0,05 - 0,07% quá trình đóng rắn gel chậm dần tương ứng
với thời gian gel hóa tăng dần. Hiện tượng trên được giải thích là do ở nồng độ
H2O2/HRP cao thì sự phân hủy H2O2 càng nhiều và gốc phenolic được sinh ra
bởi HRP càng tăng nên thời gian tạo gel giảm nhưng nếu nồng độ H2O2/HRP
quá cao thì enzyme bị ức chế làm cho thời gian tạo gel tăng lên.
Hình 4.8 Thời gian gel hóa của CHPA với nồng độ HRP 0,07 mg/mL
Thời gian gel hóa của CHPA (Hình 4.8) thay đổi trong khoảng khá rộng.
Với nồng độ HRP là 0,07 mg/mL, nồng độ H2O2 tăng từ 0,046 - 0,075% thì
quá trình đóng rắn gel nhanh dần tương ứng với thời gian gel hóa giảm dần và
khi tăng nồng độ H2O2 từ 0,075 - 0,18% quá trình đóng rắn gel chậm dần
45
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
tương ứng với thời gian gel hóa tăng dần. Hiện tượng này cũng được giải thích
như trên là do ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình tạo gel.
Hình 4.9 Thời gian gel hóa của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và hydrogel
composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C với nồng độ HRP 0,07 mg/mL
Kết quả khảo sát thời gian gel hóa (Hình 4.9) cho ta thấy thời gian gel
hóa của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C chậm hơn so với hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-2G:1C nhưng nhìn chung sự chêch lệch là không lớn. Điều
này được giải thích do tương tác của các hạt BCP với gelatin và chitosan.
Nhóm chức OH, NH2, COOH của gelatin và nhóm chức NH2 của chitosan liên
kết hydrogen với nhóm OH của HAp trong BCP. Ngoài ra, còn có liên kết tạo
phức của nhóm NH2 của gelatin và chitosan với ion Ca2+ của BCP [38-41].
Các liên kết giữa các hạt nano BCP với gelatin và chitosan làm cho mật độ
liên kết của hydrogel composite tăng do đó thời gian tạo gel của hydrogel
composite giảm. Trái lại, BCP làm tăng độ nhớt của dung dịch nên ảnh hưởng
đến quá trình khuếch tán xúc tác dẫn đến thời gian tạo liên kết ngang tăng
dần. Do đó, thời gian gel hóa của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP ít
thay đổi so với hydrogel GTA-CHPA.
Do đó, thời gian gel hóa có thể điều chỉnh phù hợp với nhu cầu thực tiễn
ứng dụng bằng cách thay đổi lượng H2O2 hoặc HRP trong dung dịch hydrogel
GTA-CHPA và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP.
46
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 4.10 Hình SEM (a) hydrogel GTA-CHPA-2G:1C-0 ngày và (b) GTA-
CHPA-5G:1C-0 ngày
47
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hình 4.12 Biểu đồ % khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA trong
dung dịch PBS
Hình 4.13 Biểu đồ % khối lượng suy giảm của hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP trong dung dịch PBS
48
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Enzyme collagenase là một enzyme thủy phân có trong cơ thể động vật,
có tác dụng phá vỡ các liên kết peptide trong collagen. Trong nghiên cứu này
dung dịch PBS chứa enzyme collagenase được sử dụng để khảo sát khối lượng
suy giảm của hydrogel và hydrogel composite thông qua sự bẻ gãy các liên kết
peptide. Kết quả khảo sát khối lượng suy giảm của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP trong dung dịch PBS cho thấy hydrogel
không có BCP khối lượng suy giảm nhanh hơn so với hydrogel composite có
BCP.
9.7 4.1
17.1 8.3
11.0 46.8
-4.3 10.0
-9.3 24.3
-100.0 0.0
6.7 19.2
111.3 30.3
166.4 35.7
103.2 51.3
41.4 23.3
-100.0 0.0
49
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Điều này được giải thích là do tương tác của các hạt nano BCP với
gelatin và chitosan. Nhóm chức OH, NH2, COOH của gelatin và nhóm chức
NH2 của chitosan liên kết hydrogen với nhóm OH của HAp trong BCP. Ngoài
ra, còn có liên kết tạo phức của nhóm NH2 của gelatin và chitosan với ion Ca2+
của BCP [38-41]. Các liên kết giữa các hạt nano BCP với gelatin và chitosan
làm cho mật độ liên kết của hydrogel composite tăng làm cho gel GTA-
CHPA/BCP bền vững hơn so với gel GTA-CHPA. Vì vậy hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP có khối lượng suy giảm trong dung dịch PBS chậm hơn so
với hydrogel GTA-CHPA.
Khối lượng suy giảm 100% của hydrogel GTA-CHPA-5G:0C sau 42 h
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:0C sau 90 h không phù hợp để
ứng dụng trong lĩnh vực cấy ghép và tái tạo xương. Ta thấy khối lượng suy
giảm của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C và GTA-CHPA/BCP-
2G:1C sau 762 h lần lượt là 82,99%; 69,55% thích hợp cho ứng dụng chữa
lành khuyết tật của xương. Do đó, trong nghiên cứu này tiến hành đánh giá
khả năng tạo khoáng của hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-5G:1C
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C
trong dung dịch giả sinh học SBF. Nhằm đưa ra đánh giá khách quan hơn về
tác dụng của hydrogel và hydrogel composite đối với việc chữa lành khuyết tật
của xương.
4.4.4 Kết quả đánh giá khả năng tạo khoáng của hydrogel GTA-CHPA và
hydrogel composite GTA-CHPA/BCP
50
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
giản đồ nhiễu xạ XRD xuất hiện thêm các tín hiệu đặc trưng của CaCO3 tại vị
trí 2-theta (o) 26,34o, 27,72o, 41,28o [1,23,35,43]. Điều này khẳng định sự tạo
thành khoáng apatit của hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-2G:1C và
GTA-CHPA/BCP-5G:1C sau khi ngâm trong dung dịch SBF. Bên cạnh đó,
hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và GTA-CHPA-5G:1C không có sự cung cấp
Ca2+ và PO43- từ BCP nên quá trình tạo khoáng chậm nên không quan sát được
rõ các tín hiệu đặc trưng của CaCO3 trong kết quả phân tích này. Trên cơ sở
đó kết quả thực nghiệm của nghiên cứu cho thấy hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP có hiệu quả trong quá trình hình thành và phát triển của khoáng
aptite carbonate.
51
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
52
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Hydrogel GTA-CHPA
Hình 4.16 SEM và EDS của hydrogel GTA-CHPA-1C:2G sau khi ngâm trong
dung dịch SBF 28 ngày
Hình 4.17 SEM và EDS của hydrogel GTA-CHPA-1C:5G sau khi ngâm trong
dung dịch SBF 28 ngày
Kết quả hình SEM (Hình 4.16 và 4.17) với thang phóng đại 1μm cho
thấy hydrogel GTA-CHPA-2G:1C và GTA-CHPA-5G:1C vẫn giữ được cấu
trúc xốp. Hình SEM với thang phóng đại 10μm cho thấy bề mặt hydrogel
GTA-CHPA-2G:1C và GTA-CHPA-5G:1C xuất hiện các tinh thể tạo khoáng.
Kết quả phân tích EDS (Phụ lục PL1.5-PL1.6) cho thấy khoáng tạo thành gồm
các nguyên tố Ca, C, O, P, sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày và xuất
hiện nguyên tố Si do lớp silic phủ lên mẫu để phân tích EDS. Phần trăm các
nguyên tố tham gia tạo khoáng được thể hiện (Bảng 4.5).
Bảng 4.5 Thành phần trăm các nguyên tố trong phân tích EDS của hydrogel
sau khi ngâm trong dung dịch SBF 28 ngày
Phần trăm khối lượng (%)
Mẫu hydrogel
P Ca C O
GTA-CHPA-2-1-28 ngày 7,71 81,76 9,88
GTA-CHPA-5-1-28 ngày 9,99 5,94 26,37 39,50
53
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
54
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Từ kết quả phân tích EDS (Bảng 4.5 và 4.6) cho thấy hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-2G:1C, GTA-CHPA/BCP-5G:1C cho kết tạo khoáng tốt
hơn so với hydrogel GTA-CHPA-2G:1C, GTA-CHPA-5G:1C. Được giải
thích là do BCP tăng cường khả năng tạo khoáng với vai trò như các mầm
apatite carbonate, đồng thời cũng là nguồn cung cấp ion Ca2+ và PO43- cho quá
trình phát triển mầm tinh thể và tinh thể apatite carbonate [41]. Bên cạnh đó, tỉ
lệ gelatin/chitosan lớn cũng góp phần thúc đẩy quá trình tạo khoáng của vật
liệu. Cho thấy ngoài chức năng bám dính tế bào xương gelatin còn có khả
năng kích thích sự phát triển tế bào xương.
Kết luận: Hydrogel composite GTA-CHPA/BCP có ảnh hưởng với
xương tốt hơn so với hydrogel GTA-CHPA.
4.4.5 Kết quả đánh giá tính tương hợp sinh học của hydrogel GTA-CHPA
và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP đối với tế bào tủy xương thỏ
Khảo sát sự bám dính và phát triển của tế bào tủy xương thỏ trên
hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-
5G:1C được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Nhân tế bào màu xanh
sau khi nhuộm tế bào với thuốc nhuộm DAPI. Kết quả (Hình 4.20) cho thấy
sau 5 ngày tế bào bám và phát triển tốt trên vật liêu. Do đó có thể khẳng định
tính tương hợp sinh học của vật liệu đối với tế bào tủy xương thỏ. Chitosan
tương hợp sinh học, có khả năng bám dính tế bào tốt nhưng khả năng kích
thích tế bào phát triển kém nên mật độ tế bào bám dính trên vật liệu hydrogel
GTA-CHPA-5G:1C thấp hơn mật độ tế bào bám dính trên hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP-5G:1C. Ngoài ra, hydrogel composite GTA-CHPA/BCP có
sự cung cấp Ca, P từ BCP để kích thích và thúc đẩy sự phát triển của tế bào.
Hình 4.20 Sự bám dính và phát triển của tế bào từ tủy xương thỏ trên vật liệu
(a) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và (b) hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-5G:1C
Kết quả thu được cho thấy hydrogel GTA-CHPA và hydrogel composite
GTA-CHPA/BCP có nhiều tiềm năng ứng dụng trong tái tạo mô xương.
55
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
4.4.6 Kết quả micro-CT sau khi cấy ghép vật liệu trên thỏ
Kết quả sau khi phẫu thuật 4 tháng (Hình 4.21), quan sát hình ảnh micro-
CT của các mẫu xương, hình ảnh cắt lát cho thấy xương mới hình thành trong
vùng phẫu thuật. Mẫu hydrogel composite GTA-CHPA/BCP-5G:1C lấp đầy lỗ
khoan trong khi đó hydrogel GTA-CHPA-5G:1C và mẫu đối chứng xương
mới có hình thành nhưng chưa lấp đầy lỗ khoan xương. Các kết quả thu được
cho thấy vật liệu hydrogel composite có nhiều tiềm năng trong tái tạo các
khuyết tật và tổn thương xương động vật.
Hình 4.21 Ảnh Micro-CT (khối xương - mặt cắt lát) của mẫu xương (a) bình
thường, (b) hydrogel GTA-CHPA-5G:1C, (c) hydrogel composite GTA-
CHPA/BCP-5G:1C và (d) đối chứng
56
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
57
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Để đưa đề tài này ứng dụng trong cuộc sống thì cần phải tiến hành đo độ
bền cơ học của vật liệu như đo độ dãn, độ nén, độ cứng. Tiến hành thử nghiệm
trên các động vật cấp cao hơn như chó, khỉ…
58
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
[1] Amera, A., et al., 2011. Synthesis and characterization of porous biphasic
calcium phosphate scaffold from fifferent porogens for possible bone tissue
engineering applications. Science of Sintering, 43: 183-192.
[2] Y.C.Chai, et al., 2012. Current views on calcium phosphate osteogenicity
and the translation into effective bone regeneration strategies. Acta
Biomaterialia, 8: 3876-3887.
[3] Dutta, P.K., Dutta, J., and Tripathi, V.S., 2004. Chitin and chitosan:
Chemistry, properties and applications. Journal of scientific & industrial
research, 63: 20-31.
[4] G.Kumbar, S., Laurencin, C. T., and Deng, M., 2014. Natural and synthetic
biomedical polymers.
[5] Mazaki, T., Shiozaki, Y, et al., 2014. A novel, visible light-induced,
rapidly cross-linkable gelatin scaffold for osteochondral tissue engineering.
Scientific report.
[6] Đặng Xuân Dự, 2015. Nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hiệu ứng đồng
vận H2O2/ bức xạ gamma coban-60 để chế tạo oligochitosan. Luận án tiến sĩ.
Đại học Huế-Trường Đại học Khoa Học.
[7] Nguyễn Thị Thùy Trang, 2011. Nghiên cứu sử dụng chitosan chiết tách từ
vỏ tôm làm tác nhân hấp phụ một số ion kim loại nặng trong môi trường nước.
Luận văn thạc sĩ. Đại học Đà Nẵng.
[8] Jing. S. B., L. Li, D. Ji. Y. Takiguchi, T. Yamaguchi., 1997. Effect of
chitosan on renal function in patients with chronic renal failure, J. Pharm.
Pharmacol. Jun, 49 (7): 721-723.
[9] Đào Tố Quyên, Nguyễn Thị Lâm, Hà Thị Anh Đào và cộng sự, 2006.
Nghiên cứu thử nghiệm PDP (chitosan) làm chất phụ gia trong sản xuất giò
lụa, bánh cuốn. Viện dinh dưỡng. Trung tâm kỹ thuật an toàn vệ sinh thực
phẩm Việt Nam.
[10] Mariod, A.A. and Adam, H.F., 2013. Review : gelatin, source, extraction
and industrial applications. Acta Scientiarum Polonorum Technol Aliment,
135-147.
[11] Phan Thị Ngọc Bích, 2008. Nghiên cứu chế biến kẹo nha đam. Đồ án tốt
nghiệp - Đại học Cần thơ.
[12] Phan Thị Trúc Mai, 2012. Nghiên cứu quy trình sản xuất gelatin da cá tra
bằng phương pháp kiềm. Đồ án tốt nghiệp Đại học. Đại học Cần Thơ.
[13] Hà Thị Cẩm Chi, 2012. Khảo sát ảnh hưởng của độ ẩm và nồng độ
gelatin đến cấu trúc keo gum xoài. Đồ án tốt nghiệp - Đại học Cần Thơ.
[14] Kalia, S. and Avérous L., 2011. Biopolymers: biomedical and
environmental applications.
[15] Enas M.Ahmed, 2015. Hydrogel: preparation, characterization and
applications. Journal of advanced research, 6: 105-121.
[16] Hoàng Dương Thanh, 2014. Tổng hợp vật liệu polyme dạng hydrogel
nhạy nhiệt. Luận án tiến sĩ. Viện Hóa học-Viện Hàn Lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam-Hà Nội.
59
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
60
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
[32] Tran, N.Q., et al., 2013. In situ forming and rutin-releasing chitosan
hydrogels as anjectable dressings for dermal wound healing.
Biomacromolecules.
[33] Linh Thuy Ba Nguyen and Byong-Taek Lee., 2014. A combination of
biphasic calcium phosphate scaffold with hyaluronic axit-gelatin hydrogel as a
new tool for bone regeneration. Tissue engineering part A, 20: 1993-2004.
[34] Tran, N.Q., C.K, Nguyen and Nguyen, T.P., 2014. Enzyme-mediated in
situ preparation of biocompatible hydrogel composites from chitosan
derivative and biphasic calcium phosphate nanoparticles for bone
regeneration. Advances in natural sciences: nanoscience and nanotechnology.
[35] Angelescu N., Ungureanu D.N., and Anghelina F.V., 2011. Synthesis and
charaterization of hydroxyapatite obtained in different experimental conditions.
The scientific bulletin of VALAHIA University-materials and mechanics.
[36] Kurisawa M., Chung J. E., Yang Y. Y., Gao S. J., 2005. Injectable
biodegradable hydrogels composed of hyaluronic axit-tyramin conjugates for
drug delivery and tissue engineering. Chem Commun (Camb), 34: 4312-4314
[37] Veitch N.C.,2004. Horseradish peroxidase: a modern view of a classic
enzyme, Phytochemistry 2004. (3)65: 649-659.
[38] Baynton K. J., Bewtra J. K., Biswas N., Taylor K. E.,1994. Inactivation
of horseradish peroxidase by phenol and hydrogen peroxid: a kinetic
investigation. Biochim Biophys Acta, (2) 1206: 272-278.
[39] Yuji Y, Fen Y, Junfeng C, Fujing Z, Xiulan L, Kangde Y., 2003.
Preparation and characterization of macroporous chitosan-gelatin/β-tricalcium
phosphate composit scaffolds for bone tissue engineering, J Biomed Mater
Res., 67A: 844-855.
[40] Junjie L, Yan D, Jun Y, Yuji Y, Hong Z, Fanglian Y, Haibin W, Kangde
Y., 2009. Surface characterization and biocompatibility of micro- and nano-
hydroxyapatite/chitosan-gelatin network films, Materials Science and
Engineering C, 29: 1207-1215.
[41] Hoffman A. S, 2003. Hydrogel for biomedical application. Adv Drug Del
Rev, 43: 3-12.
[42] Ngoc Quyen Tran, Yoon Ki Joung, Eugene Lih, K. Min Park, Ki Dong
Park., 2010. Supramolecular hydrogels exhibiting fast in situ gel forming and
adjustable degradation properties. Biomacromol, 11: 617-625.
[43] Abdullahi Shafiu Kamba, Maznah Ismail, Tengku Azmi Tengku Ibrahim,
and Zuki Abu Bakar Zakaria, 2013. Synthesis and characterisation of calcium
carbonate aragonite nanocrystals from cockle shell powder (Anadara granosa).
Journal of Nanomaterials.
61
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
PHỤ LỤC
62
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
63
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
64
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
65
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 5,000
Date : 2016/04/14
Pixel : 512 x 384
003
10
10 µm
µm
003
1000 Acquisition Parameter
900 Instrument : 7401F
800 Acc. Voltage : 15.0 kV
700 Probe Current: 1.00000 nA
600 PHA mode : T4
Counts
C
500 Real Time : 12.30 sec
400 Live Time : 10.00 sec
300 O Ca Dead Time : 18 %
200 Si Ca Counting Rate: 1342 cps
100
Energy Range : 0 - 20 keV
0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV
Thin Film Standardless Standard Quantitative Analysis
Fitting Coefficient : 0.6689
Element (keV) Mass% Counts Error% Atom% Compound Mass% Cation K
C K (Ref.) 0.277 81.76 2007.67 0.00 89.10 1.0000
O K 0.525 9.88 627.39 0.04 8.08 0.3866
Si K 1.739 0.66 51.42 1.12 0.31 0.3132
Ca K 3.690 7.71 358.14 0.18 2.52 0.5285
Total 100.00 100.00
66
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 5,000
Date : 2016/04/14
009
Pixel : 512 x 384
10
10 µm
µm
009
300 Acquisition Parameter
270 Instrument : 7401F
240 Acc. Voltage : 15.0 kV
210 Probe Current: 1.00000 nA
180 PHA mode : T4
Counts
0
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV
67
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 1,000
Date : 2016/04/14
Pixel : 512 x 384
O
600 Real Time : 72.70 sec
450 Live Time : 60.00 sec
Na Ca
300 F Dead Time : 17 %
150 Counting Rate: 1168 cps
0 Energy Range : 0 - 20 keV
0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00
keV
68
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC BÙI THANH THÁI
Title : IMG1
---------------------------
Instrument : 7401F
Volt : 15.00 kV
Mag. : x 1,000
Date : 2016/04/14
Pixel : 512 x 384
keV
69