ae bioelisa CHAGAS 3000-1236 LEER CAMBIOS SOMBREADOS: 96 tests 3000-1237 480 tests Test de ELISA para la deteccion de anticuerpos contra Trypanosoma cruzi en suero o plasma humano. ‘Sumario el par verlebrado Se reconoomn tres clares de la erdetneded ura elapa agua cviay Uns etapa rica de lr trac, ‘separadas por una larga fase asintomiética, lamada fase indeterminada, En la primera y tercera etapa diversos érganos, pueden estar alecados y producrse un desenlace feta. Se esta que hasta un 20% de persones con la forma screening de un gran iieto de muestas de sveo en bancos do eangreytboratoros clinics. Principio, bioelisa CHAGAS es un método inmuncerzimdtico en el cual se han recubierto los pocilos de una placa de microttulacién con antigenos recombinants que representan 4 epltopos inmunodominantes de T. cruz! preparados ‘con licencia de Corixa Corporation (Patentada en USA). A diches pocillos se les afiade las muestras de sueros 0 Plasmas 2 analizer. Si en una muestra estén presentes anticuerpos especifios frente a T. cruzi, se formaré un ‘complejo estable con el antigeno que reaubre el pocllo. Después de lavar para extraer todo el material no unido se afiaden IgG de conejo anti-IgG y ant-IgM humanas marcadas con peroxidasa y, si el complejo antigeno/anticuerpo festa presente, el conjugado se uniré con el complejo. Después de un segundo lavado, se afiade el sustrato cenzimatico y el cromégeno. Esta solucién desarrolard un color azul sila muestra es posttva, El color azul cambia a amarilo después de parar la reaccién con acide sullfirco, La intensidad del color es proporcional a la concentracién {de anticuerpos ant-T- cruzi. Los pocilos que contengan muestras negativas no desarrollaran color. 1 MICROPLACA: 128 pocillos recubiertos con antigenos recombinantes de T. cruzi 2. [CONJ[51X) CONJUGADO CONCENTRADO: Anticuerpos de conejo anti-lgG y anti-lgM humanas conjugados con peroxidasa. Contiene colorante rojo, metiolato édico al 0,02% y protenas estabiizadoras. A dir 1/51 con el diluyente del conjugado antes de usarse 3. [DILICONG] DILUYENTE DEL consucaDo: Tampén Tris que contiene colorante amarilo, aditivas y mertiolato s6dico al 0,02%. Para diluir el conjugado ‘concentrado, 5. [WASH|SOLN[10x) SOLUCION DE LAVADO: ‘Tampon fosfato concentrado que contiene Tween 20 al 1% y mertiolato sédico al 0,01%. A iluir 1/10 con ‘agua destiada 0 desionizada antes de utiizarse. 6 TAMPON SUSTRATO: Tampén ctrato-acetato que contiene peréxido de hidrégeno. 7. [SOLNITMB) CROMOGENO: 3,3, 5,5-Tetrametiibenzidina (TMB) disuelta en dimetiisulféxido (DMSO) 8. [CONTROL] CONTROL PosiTiVo: ‘Suero humane inactivado y diluido que contiene anticuerpos contra T. cruzi, Contiene colorante verde y azida sédica < 0,1% como conservante. Listo para user.ie 9, [BONTROLE CONTROL NEGATIVO: ‘Suero humano diluido negative para antl-T. cruzi, Contiene colorante amarillo y azida sédica < 0,1% como cconservante, Listo para usar, 10. [H;SO,[IN] SOLUCION DE PARADA: (s6io en e! kit de 1 placa) ‘Acido sulfrico 1N. Listo para usar. " LAMINAS ADHESIVAS: Para cubrir la placa durante las incubaciones. 12, [BAG] BOLSA DE PLASTICO: Pare guardar le tas ein ver. bioelisa CHAGAS es para el diagnéstico IN VITRO. Para uso exclusivo por profesionales. ATENCION: MATERIAL DE RIESGO BIOLOGICO. El control positivo ha sido Inactivade por calor. Todo el material de origen humano utlizado en la preparacién de este producto ha sido encontrado negativo a la presencia de anticuerpos de los virus HIV-‘/HIV-2 y HCV, asi como a la del antigeno de superficie de la hepatitis B, utilizando un método comercial autorizado. Sin embargo, ‘dado que ningin método puede offecer la total seguridad de la ausencia de agentes infecciosos, este producto debe manejarse con precaucion ~ No permitir que los reactivos entren en contacto con la piel 0 los ojos; si esto ocurre, lavar con abundante cantidad de agua, = Usar guantes. = No pipetear ningén reactivo con ia boca. = No tumar. = Depositar todos los materiales usados en reciplentes adecuados para material blocontaminante. Los restos de muestras, controles, tampones y reactivos aspirados deben recogerse en un recipiente destinado al efecto y autoclavarse una hora a 121°C, 0 tratarse con hipociorito sédico @ una concentracion final del 10%, durante 30 minutos. (Los restos que contengan Acido deben ser neutralizados antes de afiadir el hipoctorite sédico) = Algunos reactivos de este kit contienen azida sédica como conservante. La azida sédica puede reaccionar ‘con tuberias y desagles de plomo o cobre dando lugar a azidas metalicas altamente explosivas. Al desechar los restos de reactivos, deje correr agua abundante. Precauciones de manejo: = iustar el lavador al tipo de placa utitzado (fondo plan), para realizar un buen lavado. = No mezdiar reactivos procedentes de cferentes lates = Nousar los Senn a fo dea = Deben extremarse las precauciones para evitar contami los reactvos, Uslizar una nueva punta desechable para pipstear cada musstra o reactivo. = Es muy importante preparar la solucion de sustrato-TMB justo 6-10 minutos antes de ser empleada Manteneria en un recipiente bien tapado y al abrigo de fa uz. = Restos de jabones yo agentes oxidantes en los recipientes utlizados para la preparacion de la solucién sustrato-TMB, pueden interfer en la reaccion, En caso de que se utlicen recipientes de vidio, es ‘conveniente lavarios con Acido sulfurice clorhidrico 1N, enjuagarios bien con agua desilada y secarlos antes de usarios. Usar preteriblemente material plastco desechable. inaciones microbianas y contaminacién cruzada entreConservacién y estabilidad Los componentes permaneceran inalterades hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta, si se conservan entre 2-8°C. La bolsa que contiene la microplaca debe llevarse a temperatura ambiente antes de abritla para evitar ‘condensacién en los pociios. Una vez abierta fa bolsa, ia microplaca es estable por 3 meses guardada @ 2-8°C en 'a bolsa de plastica bien cerrada, con la bolsita de silicagel. La solucién de lavado, una vez diluida, es estable durante dos semanas si se conserva entre 2-8°C. Una vez diluido, el conjugado debe ser utiizado en el mismo dia. Guardar el cromégeno al abrigo de la luz. La solucion sustrato-TMB una vez preparada no es estable, por lo ‘que se deben seguir estrictamente las indicaciones para su utllzacién. Presentaciones disponibles ~ Kitde 1 placa (86 tests) [REF] 3000-1236. Contiene: + placa, 1 x 0,35 ml conjugado concentrado, 1 x 16 mi cliuyente del conlugado, 1 x 20 ml dluyente de muestras, 2 x 50 ml solucién de lavado concentrada, 1 x 14 mi tampén sustrato, 1 x 1,5 ml cromégeno, 1 x 2 mi Control positva, x 3 mi contol negative, 1 x-12 mi solucion de parada, 1 bolsa de pldstico y lamines adhesives ~ Kite 5 placas (5 x 96 tests) REF] 3000-1237. Contene:§ pacas, 1x 1,3 mi eanlugado concentado, 1x 70 ml luyente del conjugado, 1x 120 rdiuyente cde muestrs, 9x 7100 ml solucion de lavado concentrada, 5 x14 mi tampon sustato, 1X 1.5 ml stomogent, 18m contol postive, 17 ml contra negative, 1 bolsa de plastic y larinas achesivas. Material necesario no incluido ~ Agua destilada 0 desionizada, + Pipetas muiticanal y micropipetas (10 ul, 100 pi, 200 ul) y puntas desechables. = Incubador a 37°C + 1°C. = Cronémetro, ~ _Lector de microplacas con fitro de 450 nm. Recomendable filtro de referencia de 620 6 630 nm, ~ Sistema de lavado manual o automatico, ‘Solucién de parads (kit de 5 placas): acico sulfurico 1N. También puede emplearse Acido sultirico 2N 6 4. Recoleccion de la muestra Usar suero fresco o plasma (EDTA). Otros anticoagulantes deben ser comprobades antes de ultlizarse. Les ‘muestras pueden ser conservadas durante 3 dias entre 2-8°C. Si es por un periodo de tiempo mas largo las muestras deben ser congeladas (-20°C). Debe evitarse congelar y descongelar las muestras repetidamente Parliculas en suspensién deben eliminarse por centrifugacién. Los sueros o plasmas no deben ser inactivados por calor, ya que puede conducir a resultados incorrectes, Procesamiento automatico Esta prueba permite su uso de modo automético 0 semiautomitico en diferentes instrumentos. Es muy importante validar cualquier sistema automético para demostrar que los resultados obtenidos para las muestras ‘son equivalentes a los obtenidos empietndose el ensayo manual, Se recomienda que el usuario valide periddicamente @linetrumento, Si encuentra cualquier dificultad en la programacién y ajuste de los procesadores automaticus de Biokit, por favor contacte con su distribuidor. PROCEDIMIENTO (Ver esquema del procedimiento) Operaciones previas Todos los reactivos deben estar a temperatura ambiente (20-25°C) antes de empezar el ensayo. Los reactivos liquidos deben homogeneizarse euavernente antes de usarlos. Diluir la solucién de favado concentrada 1/10 con agua destilada o desionizada, Para una placa mezclar 60 mi de Solucién de lavado concentrada con 450 mi de agua. En caso de no utlizar una placa completa preparar el \volumen proporcional de solucién, Diluic et conjugado concentrado 1/51 con el diluyente del conjugado, de acuerdo con la tabla 4. Para el kit de 1 placa, si se utiliza ta placa entera, afiadir 300 ul del conjugado concentrado directamente al vial que contiene 18 mide diluyente del conjugado, Mezclar suavemente. TABLA Tiras requetidag TT z 6 S 10, 12 |Dituyente dei con). 4.0 | 2.0 60 | 80 |~400 | 12.0 ‘Conjugade éoncentrade ul | 20 [40 420_[ 160 | ~200 [240Realizacién de la prueba 4. Utiizar solamente e| numero de tires necesario para el test. Reservar 6 pocillos para blanco y controles Dosificar 200 iil de diluyente de las muestras al resto de los pocilos. A continuacién, dosificar 10 il de cada ‘muestra en los pocilles previamente designados. 2. Dosificar 200 11 de control negativo a 3 pocilos y 200 il de control positive a 2 pociios. NO DILUIR LOS CONTROLES. YA ESTAN LISTOS PARA USAR. Dejar un pocilo vacio para el blanco de sustrato. 3. Cubrirla placa con una lamina adhesiva, agitarla suavemente e incubar durante 1 hora a 37°C. 4. Desechar fa lamina adhesiva. Aspirar el contenido de los posilos y llenatlos completamente (aproximadamente 350 ul) con solucién de lavado diluida. Repetir el proceso de aspiracién lavado 3 veces mas. Asegurarse de que cada columna de pocilos esté en remojo al menos 15 segundos antes del nuevo ciclo de aspiracién, Después del iitimo lavado golpear la placa invertida sobre un papel absorbente para eliminar cualquier exceso de liquido en los pocillos. 5. Traneferir 100 yl de conjugado diluido a todos los pocilos de la placa, a excepcién del pocilo para el bianco de sustrato, 6 Cubrir la placa con una lamina adhesiva e incubar durante 30 minutos @ 37°C. 7. Durante los titimes 5-10 minutos de esta incubacién, preparar la solucién de sustrato-cromégeno. Para una placa afiadir 280 yl de la solucién de cromégeno (TMB) a un vial de tampén sustrato (14 mi) y mezelar bien. Sino se utliza toda la placa, preparar la cantidad necesaria segin indica la tabla 2. La solucion final debe ser incoora, descartar en caso de que se vwuelva azul TABLA2 Tresrequendas 2 [4 é ee Tampon susitatoml | 10 | 20 | 40 | 60 | 80 | 700 | 120 ‘Cromageno (TMB) ul [20 40 80, 420__|_160_| 200 [240 NOTA: El TMB esté disuetto en DMSO. Dado que Ia temperatura de fusién del DMSO es de 18°C, é! cromégeno debe alcanzar una temperatura de 20-25°C y agitarse bien antes de usarlo, Es normal que el cromégeno presente un color amariento. 8 Desechar la lamina adhesiva. Aspirar y lavar la placa como en el punto 4 9. Affadir 100 pl de sustrato-TMB a todos los pocillos, 40. Incubar sin cubrir durante 30 minutos a temperatura ambiente (20-25°C). 44. Afiadir 100 il de solucién de parada a cada pocilo, guardando la misma secuencia y con los mismos intervalos observadas en la adicién del sustrato-TME, 412. Ajustar el cero del lector con el pocillo del blanco @ 450 nm y leer la absorbancia de cada uno de los pocillos, fen el plazo maximo de 30 minutos. Se recomienda hacer lectura bicromatica utilzando fitro de referencia de 620 - 630 nm, Control de calidad Los resultados de un ensayo son vidos si se cumplen los siguientes crterios: 1. Blanco det euetrato. El valor de absorbancia debe ser inferior 0 igual a 0,100, 2. Media del control negativo (CNx). La absorbancia de cada control negativo debe ser menor o igual a 0,200 después de restar el blanco. Si alguno de los valores no entra dentro de este margen debe descartarse y recalcularse la media. Si son dos los valores que estan fuera de este margen, la prueba deberd repetirseEjempio: 0,045 0.043 0041 Total__0,128 CNx = 0,12973 = 0,043 En este ejemplo no se ha de descartar ningtin valor. 3. Media del control positive (CPx) La media de la absorbancia de los controles positivos debe ser igual o superior a 0,600 después de restar el blanco. Sila media es inferior a este valor el andlisis debera repetiree. Ejempio: [lcpmreT postive |" TAbsorbancis) 4 1,538 2 4,551 Total 3,087 CPx = 3,087/2 = 1,544 Resultados 4. Calcular el valor umbral afadiendo 0,300 a la media del control negativo, Valor umbral = CNx + 0,300 Ejemplo: — CNx= 0,043 Valor umbral = 0,043 + 0,300 = 0,243 2. Dividir la absorbancia de la muestra por el valor umbral Positive: ratio absorbancialvalor umbral > 1,0 Negative: ratio absorbancialvalor umbral <0, Dudeso: ratio absorbancia/valor umbral > 0,9 <1, Interpretacién de los resultados Un esultado posttivo indica infeccién por T. cruzi, Débese tener en cuenta la historia clinica del paciente. Limitaciones del procedimiento Toda muestra que haya dado un resultado positive © dudoso debe analizarse de nuevo por duplicado, Si el resultado es repetidamente positive o dudoso, deberla analizarse con otra prueba, Para el correcto funcionamiento det kit debe seguirse estrictamente las instrucciones descritas. Cualquier desviacién puede dar origen a resultados aberrantes, Como en todos los inmunoensayos muy sensibles, existe la posibilidad de resultados positivos que no se repiten, Un resultado negativo no excluye la posibilidad de exposicién o infeccién por T. cruzi Caracteristicas funcionales Evaluaciones El funcionamiento del kit bloelisa CHAGAS se ha evaluado en varios estudios en comparacién con otros ensayos Comerciales analizando muestras de donantes de sangre y muestras previamente clasificadas como negativas 0 Positivas de anticuerpos frente a T. cruzi ~ En una evaluacién realizada en un banoo de sangre, se probaron 3024 muestras de donantes en paralelo con los métodos ullizados en rutina para el onbado de anticuerpos frente a Chagas (EIA, HA e IFA), De éstas, 21 fueron eactivas con el bioelisa CHAGAS. Siete (7) fueron confimadas como postivas. Por tanto, la eensibilidad ‘obtenida fue del 100% y la especficiad del 99,5%, considerando todas las muestras inicialmente reactivas En ora evaluacién en banco de sangre 2723 muestras se analizaron en paralelo con los métodos utiizados en rutina para el cribado de anticuerpos de Chagas (EIA, HA e IFA), Del total, 72 fueron reactivas con e! bioelisa CHAGAS. Dos (2) se confirmaron como positivas verdaderas. Por tanto. la sensibildad obtenida fue del 100% y la especificidad en el cribado fue del 97,4%,- _ Enun tercer banco de sangre, 2655 muestras se analizaron en paralelo con los métodos utlizados en rutina para el cribado de anticuerpos de Chagas (EIA, HA e IFA). De éstas, 57 muestras fueron reactivas con el bioolisa CHAGAS. Diez (10) se confrmaron como posttvas. En esta evaluacién la sensiblidad obtenida fue el 100% y la ospeciticidad en el cribado del 98,2%. - Se analizé un panel de 498 muestras previamente clasificadas como positivas (18) 6 negativas (480). La sensibilidad obtenida fue del 100% y la especificidad del 98,3%, = Se ensayé un panel de 115 muestras previamente ciasificadas como positivas verdaderas. Los resultados de todas ias muestras fueron positives, obteniéndose una sensibllidad del 100%. ~ Se analizaron 796 muestras caracterizadas como negatives, de las cuales 4 presentaron resultado positive ‘con el bioelisa CHAGAS. En este estudio la espeoificidad obienida fue del 99.5% Procision Reproduciilidad intra-ensayo Los coeficientes de variaci6n obtenidos para los valores de absorbancia de 24 replicados de una muestra positiva fueron det 2,5%, 4,2% y 3,1% en tres lotes estudiados, Reproduciilidad inter-ensayor ‘Tres muestras positivas de distintos niveles se probaron en 3 ensayos diferentes. Los coeficientes de variacion ‘obtenidos para los ratios absorbancialvalor umbral de las 3 muestras fueron del 4.6%, 3.5% y 8, 7%.bioelisa CHAGAS 3000-1236 3000-1237 96 tests 480 tests Procedural flow chart / Esquema del procedimiento/ Schematischer Ablaut / ‘Schéma de la procédure / Schema del procedimento / Esquema do procedimentoVache roriaaitamerta2: | otrsimiescong tot rneimihaocrg 90 ameUped \ atnomibeoag kb amertoe supe EADAHO selleoid t-0008 SeSt-0o0e