Revista Orinoguia Vol, 1,2001 ARTICULOS DE REVISI RESPIRACION EMBRIONARIA, PLACENTARIA Y FETAL EN RUMIANTES. “Agustin Géngora O, ““*Aureliano Hernandez V, “Cristina Rivas RESUMEN Desde tiempo atrés, et intercambio de los gases respiratorios antes delnacimiento ha llamado laatencién de los investigadares, en especial de los embriolégos. Eldesarrollo de técnicas de medicién in vivo anivel deloviducto el itero, la placenta ye feto, han permitide notables avances ‘enel conocimiento de la fisiolagia respiratoria prenatal. La aplicacién de técnicas no invasivas, bajo el modelo in vitro han contribuido de igual manera un mayor conocimiento del metabotismo embrianario. Como resultado de estos avances, el consumo de oxigeno (0,)se perfla como un mareador importante deta viabilidad embrionaria diferente del criterio morfoldgico el cual parece poco confiable. Los avances en este campo, han tenido aplicaciones inmediatas, de allt los éxitas de la biotecnologia reproductiva. El presente trabajo tiene por objeto revisar a la luz del actual conocimiento, los principales ‘mecanismos que intervienen en el transporte de 0, mondxido de carbono (CO), didxido de carbono (CO,) ya importancia que tienen en procesos como ef desarrollo enbrionario, a implantacién y la gestacién; solo con su profundo conocimiento se pueden obtener mejores respuestas en los programas de reproduccién asistida y en ta identificacién de fallas reproductivas relacionadas con estas aspectos. Palabras Clave: Embrién, respiracién, placenta, rumiantes, transporte placentario. “MLV. Me, PHD, Profesor Tuy, Uriversidad de fs Llanes, A.A, 2621 Vilavicancle (Mea), Ea sgugongors60@hoimat com MN MSc. PD. Profesor Tar Unversigad Nacional AA. 170227 Bop Enaiidaheman vsranare url eo 20 TAN. Esudante de Maesta, Universiad Nacional BootsRevista Orinoquia. Vol, 1,2001 ABSTRACT INTRODUCCION Respiratory exchange has been the focus of interes of physiologists fora long time. The development of teckniques which permit in vivo ‘measurements in the fetus and reproductive organs, has allowed a significant development in the understanding of the physiology of prenatal respiration. In vitro studies, have enormously contributed to a better understanding of embryonic metabolism. Oxygen consumption appears to beavvalid indicator ofembryonic viability, in contrast to morphological assessments, which are less reliable. The achievements inthis feld have immediate applications, which are in part responsible for some developments in reproductive biotechnologies. The present work aimed to present the mechanisms of oxygen, carbon ‘monoxide and dioxide carbon exchange and their implication in early embryonic development, implantation and pregnancy. Inorder to obtain ‘good resultsin assisted reproduction programs, and identification ofsome reproductive failures, i is mecessary to understand the mechanisms of prenatal respiration. Key words: Embryo, respiration, fetal and placental respiration, ruminants. estados de desarrollo embrionario y junto con la glucosa, piruvato, lactato yylos aminodcidos constituyen fos prin- Cipales substratos para ia produccién de energia’. Durante la implantacién, ta hipoxia participa como reguladora de los pro- ccesos de angiogénesis y vasculogé- ldependen del O, para su |sobrevivencia. Durante el pro- Jceso de respiracién, las oélu- las obtienen energia en forma de ATP, como producto final de la reaccién controlada del hidrégeno con el O, para formar agua®®. EI, juega un papel importante en la regulacién de muchos de los proce- ‘sos metabélicos durante los primeros 10 resis, fenémenos que permiten, jun- tocon muchos otros de tipo molecular, endoctino, ¢ inmunolégico, el estable- ‘cimiento de un contacto directo entre las circulaciones matemo-fetal*t La respiracién embrionara y fetal pue~ de analizarse, primero, como la toma,de 0, de una fuente externa (sangre materna en el fetoy aire ambiental en clneonato) para garantizar un funcio- namiento homeostatico de todo el or- ganismo. En otro sentido, la respira cién considerada como el resultado bioquimico de Ia toma de O, en las rmitocondrias. Ast, cualquier proceso embrionario que supla las exigencias metabélicas del conceptus para su supervivencia, podré entenderse como sucedaneo de los eventos que resultan en el intercambio de gases nla placenta fetal o en el pulmén del neonate, Appesarde los escasos estudios exis- tentes con relacién al intercambio de Jos gases durante la pre-implantacién e iimplantacién en los rumiantes, es claro que la arquitectura de las mem- branas embrionarias y el tero, no tie- nen durante un lapso importante de laimplantacién, las caracteristicas de lapplacenta madura o del pulmén, que permita un intercambio eficiente del (O2y CO, entre el conceptus y la ma dre. En consecuencia, la superviven- cia del embrién en este periodo, debe depender de mecanismos diferentes al del modelo de respiracién de inter- cambio de gases entre dos fases pro- pio de la placenta madura. RESPIRACION EMBRIONARIA DURANTE EL DESARROLLO TEMPRANO El intercambio de gases durante la gestacién, se ha estudiado desde el Revista Orinoguis Vol 5, 1,2001 momento de la fertilizacién hasta el nacimiento. Este periodo se ha di dido por los bidlogos del desarrollo en ‘embrionario y fetal, Durante ol estado preim-piantatorio, elembrién es altamente dependiente de los sustratos disponibles en el ambiente externo (histotrofo). Existe una competencia por el O, entre el titeto y el embrién, Io cual es indis- pensable para la utilizacién eficiente de los demas substratos 28, El con- sumo de O, en el estado de 1-2 célu- Jas en la rata, elratén y el conejo fue- ron de 0.72, 0.15 y 0.41 mmi O, hue- vvollirrespectivamente, observandose diferencias dentro de una misma es- pecie, a su vez, el consumo por mg! peso seco presenta variaciones, indi ccando este hecho un incremento de la tasa metabdlica del telido respira- torio® Las tensiones de O, in vivoen el tte- ro de ratas adultas variaron durante elcicioestral Los promedios méximos en el diestro fueron de 47.6 mm Hg mientras en el estro de 25.7 mm Hg; ‘estos valores se relacionaron con la accién de los esteroides ovaricos los cuales regulan la contractibilidad vascular, los cambios morfol6gicos y metabdlicos, afectando la disponibii- dad de O,%, En estudios posteriores sobre respi- racion uterina, utilizando igualmente ratas, se relacioné inver-samente la PO, y el consumo de O2:lo cual su giere que durante la implantacién exis- te una competencia entre el utero y el ‘embrién por el O, disponible. Los iTRevista Orinoguia. Vol 5, 1, 2001 cambios en la PO, observados cons- tantemente en los dias 4 y 5, indica- ron un principal sitio de difustén del O,. elcual posiblemente esta relacionado con el lugar de la implantacién #9, En ovocitos de rata cultivados in vitro, el einicio de la meiosis se acompané de un aumento en el consumo de Oz, el cual fue atribuido al proceso mis- mo y no a estimulo hormonal? En ‘embriones de ratén, el consumo de ©, medido por técnicas de utrami- crofluorescencia, se correlacioné positivamante con el tiempo de dura- cién del experimento (5-6 horas). Los valores obtenidos desde el estado de una célula hasta mérula fueron similares, posteriormente aumenta- ron en estado de preblastocisto y ddsminuyeron finalmente en estado de hlastocisto en el dia 6. Se cree que el marcado incremento en el consumo de O, por miligramio de peso seco, desde la fertilizacion hasta el estado de blastocisto, se debe ala attivacién de las vias metaboticas de Emden-Meyerhof y acido tricar- boxtico 78, Las diferencias en las tasas de con- sumo de O, entre especies, depen- de de las diferente velocidades de desarrollo del oocito, El consumo de x por mg/peso seco se inerementa durante el desarrollo temprano lo cual sugiere un aumento diferencial en el costo energético® Un posible efecto de la fertlizacién, sobre la respiracion, resulté insignifi- 12 cante en el ratén, aunque en huevos de equinodermos, se observé un au- mento en el consumo de O, mientras ‘en otras especies, las células man- tuvieron casi el mismo consumo (1. 2.0 ml Ogihr”, Las tensiones de O,, medidas direc- tamente en el oviducto y el Utero de hamster, conejo y mono rhesus fue- ron menores que la mitad de la PO, atmostérioo, sin que se observaran di- ferencias entre los dos organos, aun- que se detect6 una disminucion sig- nificativa cerca del sitio de la implan- tacion’®, ‘Se ha estimado el consumo de O2 de ‘embriones bovinos mediante un equi- po multicanal portatil, los valores ob- tenidos fueron de 1.6 n/embrién/hr para el estado de mérulay de 1.5 nly ‘embrién/hr para blastocistos tem- pranos. En el mismo estudio, el con- sumo de O2 no se correlacioné con laevaluacién morfolégica, pero sicon la actividad mitocondrial35. Con otra técnica microfluorescente no invasiva aplicada a blastocistos bovinos pro- dducidos in vivo, se reportan consumos de 02 de 0.5-0.7 nViembriénvhora 28. En cabras, al disminuir las concentra- ciones de 0, de 20% a 7%, 5€ incre ment6 significativamente el nimero do blastémeras, favoreciendo el de- sarrolo de los embriones hasta el @s- tado de blastocisto expandido. En la evaluacién morfol6gica, los ovocitos cultivados in vitro solamente tuvieron: la mitad de las células que poseian los obtenidos in vivot.EIO, aniveles atmostéricos es téxico para muchas células, debido alla for- macién de radicales libres que pro- ducen dafo intracelular y cese de la division embrionatia, La utiizacién de concentraciones de O, menores de las encontradas en elaire (21%), han mejorado las tasas de desarrollo em- brionario*? Recientemente se ha propuesto eluso de técnicas no invasivas para valorar la viablidad embrionaria, mediante el consumo de O,. Estas podrian reem- plazar en un futuro la clasificacién asada en crterios morfolégioos, la cual parece poco confiable%. ‘Aungue se considera el consumo de (0, como un buen Indicador de la sa- Jud meiabdlica del embrién, existe un €escaso conocimiento de la actividad normal de las mitocondrias, a pesar de que la oxidacién de ciertos sustratos en elciclo de Krebs indican que tales organelas contribuyen a la produccién de energia en el conceptus preimplantatoro’ En estudios preliminares, los embrio- res cultivados bajo condiciones nor- males presentaron una distribucién homogénea de las mitocondrias, mientras que en los cultivados en con- iciones deficientes de ©,, se obser- ‘v6 una agregacién de las mitocondrias alrededor del ntcleo, la cual tue aso- ciado con un blaqueo del desarrollo, Existe en la actualidad una gran va- Fiabilidad de los resultados obtenidos tanto in vivocome in vitro, lo cual pue- de reflejar las diferentes condiciones ‘en que se llevan a cabo los experi- Revista Orinoquia Vol §, 1.2001 mentos y las técnicas de medicién, Asi los resultados obtenidos in vivo se encuentren cercanos a los rea- les, dejan un gran interrogante dado que se han desarrollado bajo anes- tesia, lo cual afecta las condiciones, fisiolégicas. FUNCION DEI OXIGENO EN EL DESARROLLO VASCULAR DURANTE LA IMPLANTACION. Las membranas embrionarias de ‘vines y bovinos durante las prime- ras fases de la implantacién poseen grandes zonas avasculares'®, las cuales estan posibiemente relaciona- das con un ambiente hip6xico, ol cual estimularia Ia angiogénesis. La hipoxia podria “regular en alta” la pro- duccién de mRNA para el factor de crecimiento de endotelio vascular (VEGF) que estimularia a la vez, la proliferacién e invasién de las células deltrofoblasto". El proceso de angiogénesis 0 neovascularizacion es crtico para el normal crecimiento, desarrollo y funcionalidad de la placenta. Se cree que el crecimiento vascular Gtero- placental esta regulado por factores angiogénicos producidos localrmente. Se han encontrado muchos factores angiogénicos en, o producidos porel Utero y las membranas fetales de muchos mamiferos. En las ovejas, la actividad mitégena de las cétulas endoteliales es producida por el endometrio Gnicamente durante la 13Rovista Orinoguia. Vol S, 1,201 prefiez temprana, que es un period durante el cual ocurre el mas drama- tico crecimiento vascular endometrial. Aunque se sabe que la actividad mit6gena endotelial depende de una molécula con masa molecular relati- vamente alta (100 Kda.) y que es muy labil, ésta no ha sido caracterizada; sin embargo, existen estudios en los cuales se identiicaron los mitégenos producidos en ol endometrio ovino en las células endoteliales y en las célu- las 373 durante la prefiez tempra- nada. Se establecié que la produccién mitogénica endotelial es més fuerte en el dia 24 de gestacién, y que est relacionada inmunolégicamente con Factor de Crecimiento Fibroblastico. ‘También pudo establecerse la presen- cia del (VEGF) el cual se hallé en can- tidades importantes en los tejidos fe- tal y placental en los dias 24 y 120 de prefiez por medio de estudios inmunohistoquimicos44. EI VEGF es un mitégeno potente y especitico de las células endoteliales vasculares y promueve la neovascu- larizacion in vivo. Es una proteina dimérica ligada a la heparina con un peso molecular de 45.000 que fue ais- lada y purficada en condiciones nor- males de células de la pituitaria bovi- na. Se han identificado otros factores de crecimiento similares al VEGF, en varios tipos de células tanto transfor- madas como normales. La secuencia de amino acidos del VEGF se con- serva através dela escala filogénica y posee similitudes con las cadenas 14 Ay B del Factor de Crecimiento Plaquetario24. Varios estudios indican que el VEGF puede tener un papel especifico en el desarrollo y mantenimiento de los va~ 08 sanguineos. El VEGF ejerce un potente efecto mitégeno sobre las Células endoteliales vasculares deri- vadas tanto de los vasos pequefios como de los grandes, aunque se han podido observar efectos no prolife- rativos en una variedad de otros tipos celulares in vitro. ‘Muchas evidencias de que el VEGF desempea un papel fisiolégico han surgido como resultado de estudios de hibridacién in situ, en los cuales ‘se ha observado que el MRNA VEGF cesté.ampliamente distribuido en orga- os vascularizados y se expresa en altos niveles en las reas de prolifera- cién vascular activa. En el ovario, por ejemplo, existe una relacién temporal entre la expresién del mRNA del VEGF y el crecimiento de los vasos, capilares en el cuerpo liteo24. Recientes estudios han demostrado que el VEGF lodinado (|-VEGF) pue- de ligarse de forma reversible y con alta afinidad a sitios ubicados en una variedad de cultivos de células endoteliales y también se unen a si- tios de muchos tipos celulares que no han sido estimuladas a la proliferacion por el VEGF. Sin embargo, algunas células en cultivo pueden exhibirdife- rentes caracteristicas en lds sitios de unién a las vistas en oélulas in vivo, ‘asi como muchas propiedades funcio- nales y fenotipicas pueden ser modi-ficadas por condiciones del medio ambiente celular24. La angiogénesis ocurre en estados que generan una red de interacciones ‘cooperativas que incluyer: () Una fase de iniciacién, caracterizada por el in- ccremento de la permeabilidad vas- colar. (i) Progresién, constituida por laproducci6n de enzimas proteoiticas que degradan|a matrix extracelular y ppromueven la migracién de las célu- las endoteliales y el ingreso de célu- Jas en un ciclo celularo una respues- ta apoptética. (i) Diferenciacién en ‘huevos vasos. iv) La estabilizacion y maduracién de los vasos por me- diadores moleculares que reunen cé- lulas mesenquimaies en las paredes de los vasos?. EI mas poderoso inductor del VEGT y de sus receptores es la hipoxia; ‘cuando el oxigeno alrededor de las élulas empieza a limitarse, un com- plejo que liga DNA, que contiene tan- to el factor de transcripcién HIF-1 como el adaptador transcriptional p 800, se forma en las oélulas endo- teliales, el oval inicia la transcripcién del gen det VEGF, de esta forma se Incrementa la oxigenacién de los tej- dos formando nuevos vasos®. Ladeteccién temprana del VEGF, atin después de que éste se haya ligado a sus receptores endoteliales, es un increment del calcio citoplasmatico. EI VEGF induce el incremento de la concentracién de calcio intracelular que puede activar el dxido nitrico sintetasa, una enzima calcio- calmodulina dependiente ubicada en Rovista Orinoquia Vol S, 1.2001 las células endoteliales, que conduce a la vasorelajacién. Se demostré re- cientemente que el VEGF es un vasodilatador dependiante del dxido nitrioo en las arterias coronarias de los ccaninos y mas recientemente, la ex- presion de este gene fue detectada ena placenta y las membranas fetales de ovinos™. ‘Se puso en evidencia la principal fun- ccién del VEGF como factor angio- génico, a través de varios experimen tos en los cuales se interrumpié el normal uncionamiento del VEGF y/o del receptor mismo, Asi mismo se de- mostré que es necesaria la expresién de ambos alelos del VEGF para que suceda la angiogénesis durante el desarrollo. En conclusién, lainhibicién del recep- tordel VEGF ola expresién defectuo- sa de uno 0 ambos de los alelos del VEGF, resultan on un fenotipo embrio- nario etal. Los anteriores resultados demuestran que el VEGF juega un papel importantisimo en el crecimien- to vascular normal o patoldgico. La ‘magnitud de este papel en la regula- Ci6n del crecimiento vascular y la per- meabilidad en el endometrio y en a Interfase matero-fotal atin no esté entendidat". Enel humano yel cur la arquitectu- ra vascular difiere con la altitud; éste mismo efecto se ha encontrado en ovejas, en donde se presenta un au- mento de la superficie de absorcién materno-fetal en respuesta a la hipoxia, lo que garantiza un mayor intercambio de sustancias?”. sRevista Ofinoquia. Vol, 1, 2001 ‘Aiin no se conoce con exactitud los mecanismos y consecuencias de la hipoxia en el desarrollo vascular. Es- tudios in vitro en explantes de vasos sanguineos humanos han abierto el Interrogante si existe una respuesta directa del citotrofoblasto a las varia clones de la PO, oi porel contrario, la respuesta es mediada por factores liberados por otros componentes del tejido hipéxico por ejemplo el Sincitiotrofoblasto 0 por macréfagos de los vasos*®, ‘Se han propuesto varios candidatos como mediadores de las sefiales hipéxicas, entre ellos el factor de cre- cimiento epidérmico (EFC), produc do por el sincitiotrofoblasto que tiene accién mitogénica sobre el trofoblasto, elfactor transformante del crecimien- to- (TGF-a) y el factor de necrosis, tumoral-a (TNF-a) producido por los macr6tagos. Otros factores relaciona- dos, son el factor estimulante de co- lonias-1 (CSF-1) (producido por las células mesenquimales), el factor transformante del crecimiento 81 (TGF-B1) y B2 (TGF-82) producido porlos macréfagos?s, Elaumento en la expresién de recep- tores en el endotelio hipéxico induce Un incremento en la produccién del factor de crecimiento fibroblastico ba- sico (bFGF) por los macrétagos, el cual aumenta la proliferacién celular, alavez el factor de crecimiento celu- larderivado de plaquetas (PDECGF) de posible origen trofoblastico y el fac- tor de crecimiento derivado de plaquetas-B (PDGF-B) también se consideran importantes®. 16 No se conoce cémo el conceptus atrae los capilares matemnos, ni como manipula el suministro sanguineo y la estructura endometrial en la pre- fiez temprana, aunque se cree que los factores de crecimiento produci- dos alrededor del embrién cumplen estas funciones®, El factor de crecimiento fibrobléstico basico (bFGF) se expresa en una amplia variedad de tejidos adultos y fetales y se ha relacionadocon el con- trol de la proliferacién y diferenciacion celular durante el desarrollo embrio- nario, su actividad mitogénica influye en la proliferacién de varios tipos de células, entre ellas fibroblastos y o&- lulas del misculo liso’. Ademas de otra variedad de células obtenidas de cultivos de mesodermo" tras funciones atribuidas a los fac- tores de crecimiento son las de mo- dular una variedad de procesos celu- lares, como el control de los cambios celulares involucrados en la remodelacién del ttero, previo a la implantacién del embrién'®, ‘Se han identiticado dos isoformas del FGF: FGF-1 y F@F-2conocidas como acida y basica, respectivamente. El FGF-2 se ha aislado de la placenta humana y en tejidos endometriales de ovinos®,