ACOPLE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA-ESPECTROMETRIS DE MASAS

INSTRUMENTACIÓN Y APLICAIONES

Luz Karime Luna Parada

2097715

Docente
Dra. Elena Stashenko

Electiva Técnica Profesional: Cromatografía de Gases

Universidad Industrial de Santander
Facultad de Ciencias
Escuela de Química
Bucaramanga
2011
 INTRODUCCIÓN

El poder de separación de la cromatografía acoplada con la selectividad y los límites de detección

otorgados por la espectrometría de masas permiten analizar muestras muy complejas con un
grado de confianza alto. Así, se convierte en una técnica instrumental extremadamente versátil,
cuyas raíces se encuentran en la aplicación a la cromatografía líquida de las teorías e
instrumentación que han sido desarrollados para cromatografía de gases. Como su nombre lo
indica, la instrumentación consta de un cromatografo líquido conectada, mediante una interfaz
adecuada, a un espectrómetro de masas. 1

Cromatografía líquida (LC por sus siglas en inglés) combinada con espectrometría de masas ha
creado una herramienta analítica “ideal” para el laboratorio. Aunque la técnica preferida para la
separación de una mezcla y proporcionar la identificación definitiva de sus componentes hasta
finales del siglo XX fue cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas, ésta ha
presentado limitaciones en tres aspectos fundamentales como son: la volatilidad de la muestra, el
hecho que se requiera extracción en muestras acuosas asi como, la degradación térmica
presentada en el horno GC.2

Las ventajas de LC/MS frente a GC/MS está en los siguientes factores: no todos los compuestos
son volátiles como para que puedan ser eluidos por una columna de GC por lo que LC es capaz de
analizar una gama más amplia de compuestos; Las mezclas acuosas deben ser extraídas o
derivatizadas antes de que puedan ser inyectadas lo cual le agrega tiempo y costos al análisis, de
igual manera, la temperatura del horno, variable principal en la separación de los compuestos de
una mezcla, puede generar la degradación de las sustancias. Los compuestos mas lábiles
presentan mayor polaridad o masa molecular alta por lo que son analizadas frecuentemente por
LC/MS como es el caso de proteínas.3

Figura 1. Sistema modelo LC/MS

1
Advances in LC–MS Instrumentation, Journal of Chromatography Library, Vol. 72, 2007 Elsevier B.V. All
rights reserved
2
McMaster, Marvin C. LC/MS A Practical User’s Guide, Wiley Interscience.1 Edición, New York, 2005
3
L.R. Zinder, J.J. Kirkland, J.L. Glajch, Practical HPLC Method development, 2ª Edición, Wiley, New York, 1997
En general, la solución de la muestra a analizar es inyectada en una columna de HPLC donde los
compuestos se separan en función de la interacción química de las partículas de la fase
estacionaria y el solvente que eluye a través de la columna (fase móvil). Una vez que los
compuestos se han separado en distintos picos cromatográficos, necesitan ser introducidos en el
espectrómetro de masas para su respectivo análisis. Esto incluye todo lo que sale de la columna:
los compuestos separados, restos de disolvente y reactivos volátiles. El disolvente y contaminante
deben evaporarse, y los compuestos de interés en los picos deben ser ionizados en una interfaz
apropiada para que puedan ser detectados por el espectrométro de masas.

La interface tiene dos funciones principales que son: extracción del solvente y la ionización de la
muestra de interés. La primera función se da ya que los caudales producidos por un HPLC son muy
grandes para la interfaz pequeña que tiene el espectrómetro de masas, por esta razón la interfaz
debe ser capaz de eliminar la mayoría de de los disolventes volátiles sin la eliminación de los
compuestos de interés. Este equilibrio se logra mediante la combinación de calentadores, presión
reducida y gas nebulizador que volatilice y arrastre los componentes no deseados. La segunda
función principal de la interfaz es la de ionizar los compuestos de interés, ya que muchos de los
componentes que eluyen del HPLC son compuestos no cargados. La ionización de moléculas no
cargadas se lleva a cabo rociando también gotas de solvente desde un capilar eléctricamente
cargado o a través de una aguja descarga coronal durante las etapas finales de la evaporación.

INTERFACES A PRESIÓN ATMOSFÉRICA

Los sistemas de LC/MS vienen equipados con interfaces donde el solvente es removido mientras
que las muestras se ionizan para su introducción dentro del ambiente de alto vacio del
espectrómetro de masas. Los dos tipos de interfaces más comunes en los equipos LC/MS son:
Electrospray (ES) e Ionización química a presión atmosférica (APCI). Los sistemas más comerciales
son equipados con ambas interfaces Permite cambiar la polaridad de ionización de la interfaz ya
sea a modo de ionización negativa, para proporcionar iones desprotonada, o al modo de
ionización positiva, para dar iones moleculares o aductos de solvente. Ambas interfaces de presión
atmosférica son robustos y están diseñados para evitar la contaminación del espectrómetro de
masas.4

Electrospray o electronebulización (ES)

La interface electrospray se recomienda para usarla con compuestos ionizables altamente polares.
Es una técnica de ionización muy suave que resulta en poca fragmentación. Es independiente de la
concentración, por lo que se resta a microflujo de sistemas miniaturizados de HPLC.
En ESI se produce la ionización de los analitos a presión atmosférica, mediante la aplicación de una
diferencia de potencial entre el extremo del capilar por donde fluye la muestra líquida
(normalmente a flujos comprendidos entre 1 y 100 µL/min) y el contraelectrodo situado en la
4
Allen, Mark, and Bob Shushan, “Atmospheric Pressure Ionization–Mass Spectrometry Detection for Liquid
Chromatography and Capillary Electrophoresis,” LC/GC, 11(2), 112–126, 1993.
entrada del espectrómetro.5 Por efecto de este intenso gradiente eléctrico, la muestra emerge del
capilar en forma de un aerosol de pequeñas gotas cargadas. A medida que estas gotas avanzan
hacia el orificio de entrada del espectrómetro, su tamaño se va reduciendo, se van desolvatando,
hasta que las fuerzas culombianas de repulsión entre los iones con múltiple carga generados en su
interior son capaces de vencer la tensión superficial. En ese momento pasan a la fase gaseosa.

Figura 2. Esquema de la interfaz de electrospray

En algunas ocasiones se suele favorecer la desolvatación de las gotas y la obtención de iones en

fase gas empleando N2 como gas seco, a alta presión y a temperatura moderada. En general, la
nebulización se facilita mediante la introducción de un flujo de nitrógeno, lo que además permite
la introducción de flujos mayores de líquido. Globalmente el proceso de ionización genera iones
moleculares multicargados, lo que permite el análisis de moléculas de elevada masa molecular
empleando analizadores con intervalos de m/z convencionales, siendo los cuadrupolos, las
trampas iónicas y los analizadores de tiempo-de-vuelo los mas empleados.

Ionización química a presión atmosférica (APCI) 

La ionización química a presión atmosférica apareció en el mercado de la espectrometría de

masas acoplado a cromatografía líquida a finales de la década de 19806. En su fuente la fase móvil
se introduce a través de una cámara de vaporización cilíndrica que se encuentra a elevada
temperatura, lo que provoca la evaporación del efluente cromatográfico. La ionización se induce
aplicando un elevado voltaje (± 3-5 kV) a un electrodo en forma de aguja, lo que produce una
corriente de hasta 10 µA. Esta corriente eléctrica origina un plasma de iones de la fase móvil que

5
W.M.A. Niessen, Liquid Chromatography-Mass Spectrometry, Chromatographic Science Series, vol.79, 2nd
Edición, New Cork 1999
6
Perkin Elmer Sciex, The API Book, Perkin Elmer Sciex Instruments, Toronto, Canada, 1992 y sus referencias
provoca un proceso de ionización química. La ionización química a presión atmosférica es una
técnica de ionización suave, aunque en algunos casos además de los iones correspondientes a la
molécula protonada o desprotonada pueden aparecer fragmentos en el espectro

a.

b.
Figura 3. a. Diagrama de interface APCI; b. Representación esquemática de una fuente
de API con un nebulizador de calentamiento.

La aguja genera descarga de corriente de aproximadamente 2-3 µA, los cuales ionizan el aire
produciendo iones primarios (Fig. 4), los cuales reaccionan rápidamente (10 -6 s) transfieriendo su
carga a las moléculas del solvente en una reacción controlada por la energía de recombinación de
los iones primarios sí mismos, para producir la efectiva ionización química de los iones reactantes.
Estos son caracterizados por un tiempo de vida media un poco mas largos (0.5x10 -3s) y reaccionan
con las moléculas del analito.
 Figura 4. Esquema del fenómeno de ionización química

APCI permite un acoplamiento LC-MS muy robusto y versátil. En general, las principales ventajas
que se pueden citar son: es conveniente para analitos volátiles o semivolatiles, se pueden usar
caudales de 1-2 mL/min sin ningún problema, buena sensibilidad entre otras cualidades. Mientras
que en las desventajas se pueden nombrar: No existe fragmentación por lo cual no arroja
información estructural, Puede ocurrir alguna degradación térmica y buffer inorgánicos muy
concentrados pueden causar problemas.

APCI HPLC-MS es una técnica muy potente y robusta para el análisis de rutina en diferentes
campos:7

•Química farmacéutica y la farmacología (caracterización de las drogas y sus impurezas, las

investigaciones metabólicas y farmacocinéticas, etc).
•Química clínica y bioquímica
• Biotecnologías (seguimiento de fermentación)
• Química de los alimentos y la agricultura, entre otros.

esta última técnica de ionización se ve menos afectada por componentes iónicos presentes en la
matriz, aunque la elevada temperatura de trabajo del APCI limita su aplicación a sustancias no
termolábiles.

OTRAS INTERFACES

Fotoionización a presión atmosférica (APPI)

7
F. Mazzini, E. Alpi, P. Salvadori and T. Netscher, Eur. J. Org. Chem., (2003) 2840–2844.
F. Mazzini, A. Mandoli, P. Salvadori, T. Netscher and T. Rosenau, Eur. J. Org. Chem., (2004) 4864–4869.
F. Mazzini, T. Netscher and P. Salvadori, Tetrahedron, 61 (2005) 813–817.
La fuente de fotoionización a presión atmosférica (APPI) ha sido introducida recientemente por
Syage y Evans8 aplicada a compuestos de poca polaridad. Esta fuente representa una alternativa a
la APCI y ES9. Compuestos con poca o ninguna polaridad se ionizan insuficientemente por fuentes
APCI y ES.

Figura 5. Representación esquemática de la fuente de ionización APPI 10

Es asi como surge la fotoionización a presión atmosférica (APPI) 11 En 2001, Syrage y Evans12
introdujeron una variante de las fuentes de ionización a presión atmosféricas (API), basada en la
ionización de un solo fotón (APPI), en el que se vaporiza la muestra usando un nebulizador con
calefacción, antes de comenzar la ionización (Fig. 5).

El paso de ionización se inicia por una radiación en la región visible/ultravioleta, generalmente

producida por descarga de una lámpara. La absorción de un fotón por una molécula M, hace
comenzar el proceso de fotoionización. Esta foto-absorción produce una expulsión de electrones
para formar el catión correspondiente al radical molecular [M+•].

El uso de APPI está poco aplicado, sin embargo se encuentran en la literatura trabajos como
análisis de flavonoides, esteroides y drogas.13

8
J. A. Syage, M. D. Evans, Spectroscopy 16 (2001)14
9
Cole RB (ed). Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation and Applications.
John Wiley: New York, 1997
10
Borrego, A. Estudio analítico de especies metálicas, biomoléculas y metalobiomoléculas en alimentos
como marcadores de calidad y autenticidad. Tesis Doctoral. ISBN: 978-84-96826-85-4
11
T. J. Kauppila, R. Kostiainen, A. P. Bruins, Rapid Commun. Mass Spectrom.18 (2004) 808; C. Rentel, S.
Strohschein, K. Albert, E. Bayer, Anal. Chem. 70 (1998) 4394, . Marwah, P. Marwah, H. J. Lardy, Chromatogr.
A 964 (2002)13
12
J. A. Syage, M. D. Evans, Spectroscopy 16 (2001)14
13
. Moriwaki, M. Ishitake, S. Yoshikawa, H. Miyakoda, Anal. Sci. 20 (2004) 375, J. P. Rauha, H. Vuorela, R.
Kostiainen, J. Mass Spectrom. 37 (2002)1269, A. Leinonen, T. Kuuranne, R. Kostiainen, J. Mass Spectrom. 37
(2002) 693.
Nanospray

De la fuente de electrospray nace otras variantes entre la que se destaca la nanospry (nES) que
trabaja con caudales por debajo de 1µL/min que fue desarrollada por Wilm y Mann en el año de
1995. De las variaciones existentes, esta es la mas sensibles y permite analizar muestras en las
que se dispone de poco volumen o el analito a analizar se encuentra en una concentración muy
baja.

A diferencia del ES, el nES tiene el diámetro interno de 1 o 2µm, asi el volumen de inyección de
muestra es de 0.2 a 2 µL, introducidos directamente en la aguja que produce el aerosol, asi la nES
tiene como características principales: consumo minimo de muestra, mayor eficiencia en la
ionización y en el numero de iones sometidos al análisis de masas.

Además, la fuente nESI presenta algunas ventajas respecto a otras fuentes de ionización como la
ausencia completa de cualquier contaminación cruzada, pocas oportunidades para la pérdida de la
muestra, y la capacidad de escoger y cambiar el disolvente a voluntad, aún durante un análisis. 14

14
G. Christopher Herbert, R. A.W Johnstone, Mass Spectrometry Basic. Ed. CRC Press LLC, Florida, 2000