Las hormonas vegetales Las hormonas vegetales son mensajes o sefales quimicas que las células utilizan para modular su desarrollo y adaptarlo a las condiciones medioambientales lo largo de la evolucién, las ceélulas, en un principio inde- pendientes, se asociaron en complejos pluricelulares, que, con el transcurso del tiempo, constituyeron los organismos superiores. La activi- dad de estos tltimos se repartié. en tejidos y drganos gracias a la mod ficaciOn estructural de grupos de cé- lulas ¥ a su especializacion en dife- rentes funciones. Esta nueva estructuracién_ planted Ja necesidad de un desarrollo armé- nico en el espacio y en el Se requirié también Ia coordinacién de Ia actividad celular en el seno de las nuevas estructuras. Para ello, cada una de las eélulas debia tener informacién procedente de las otras y asimilar ta informacién aportada por el entomo. Habia que crear se- fiales informativas intercelulares. Y se recurrié a moléculas capaces de desencadenar reacciones, 0 respues- tas, en las células receptoras. Estas moigculas, descubiertas.inicialmente en el mundo animal, recibieron el nombre de hormonas (del. término griego que designa la accién de po- nerse en movimiento). Su sintesis, degradacién. 0 simple variacién. de concentracion, en determinadas célu- las, actian de sefiales cuyo significa- retan otras, que tivos de dicha ANTONIO GRANELL y JUAN CAR. BONELL son investigadores del CSIC en el Instituto de Biologta Molecular y Celular de Plantas, centro mixto de la Universidad Politécnica de Valencia y del CSIC. Desde 1990, colaboran en el estudio de la regulacién hormonal del desarrollo y la senescencia de flores y frutos. Carbonell se doctoré por la ‘Auténoma de Madrid en 1973 y amplis su formacién en la Universidad de Ca lifornia en Berkeley. Granell se doctors por la de Valencia en 1987 y complets ‘Sus estudios en la Universidad de Penn- sylvania en Philadelphia, 40 Antonio Granell y Juan Carbonell Tras los experimentos_realizados entre 1926 y 1928 por F.W. Went. en Utrecht, sobre Ia influencia de Ia luz en el crecimiento del coledptilo de avena, el término hormona se aplicé también a los vegetales. (Lid mase coleéptilo a a vaina que en- vuelve al epicdtilo de las semillas de las monocotiledéneas.) Went se pre guntaba si el brote de una planta, que crece en presencia de a luz, informaba de ello a la parte inferior del tallo, las hojas y la raiz, La respuesta. proporcionada por los ex- perimentos de Went Hev6 al descu. brimiento de la auxina, Esta sustan: cia se transportaba desde el Spice, lugar de sfntesis, hasta el colesptilo, zona de respuesta, y provocaba un efecto sobre el crecimiento que pendia de su concentracién. La auxina cumplia, pues, todos los requisitos para considerarse la primera hormona vegetal AA partir de los afios cincuenta fue- ron descubrigndose otras hormonas que afectaban al crecimiento y desa- rrollo vegetal: giberelinas, citoquini- icido abscfsico y etileno, Ademés jonas. propiamente se han identificado otras sus- tancias. —poliaminas, brasindlidos, fcido salicilico, ‘icido jasménico y derivados, oligosacarinas, etcétera—, incluidas @ veces entre as hormonas vegetales. No esté claro que en todos los casos se dé el caracteristico efec- to a distancia de las hormonas, razén por la cual éstas y los compuestos relacionados se agrupan bajo la de- nominacién general de sustancias re- guladoras del crecimiento vegetal o, simplemente, fitorreguladores. Tod Jos cuales comparten una caracteris- tica, @ saber, la de poder regular y alterar el crecimiento y desarrollo de las plantas. Ninguno de los reguladores descri tos en las plantas ejerce una funcién hormonal conocida en los animales, ni el sistema endocrino de éstos guarda equivalente en aquéllas. Ani- chas, males y plantas parecen, pues, haber resuelto el problema de la comunica- in intercelular mediante sefiales qui- micas diferentes. Ello no obsta para que los elementos y los mecanismos intracclulares que gobicman las res- puestas de las plantas a las. hormo- nas se asemejen a los utilizados por los. animales. Las plantas captan la luz. solar, viven inméviles en un entorno y ca recen de un patrén prefijado de de- sarrollo en una fase temprana;_ los animales, por contra, han adquirido capacidad de movimiento, diferentes cestrategias para alimentarse y un pa- tr6n estricto de desarrollo, La enorme capacidad de las plantas para adap- tarse al medio y de los reguladores Vegetales para alterar su patron de desarrollo indican, por un lado, la plasticidad de la célula vegetal y,’por otro, 1a versatilidad y potencialidad de los fitorreguladores. ;Son estas caracteristicas las que determinaron la eleccién de un conjunto diferente de mensajeros quimicos_intercelulares? {Hubo ancestros comunes a animales ¥ plantas con unos mismos mecanis- ‘mos intracelulares de respuesta? Las hormonas vegetales. participan en numerosos procesos fisioldgicos, Y no siempre resulta fécil establecer 1, HORMONAS Y REGULADORES del ‘crecimiento vegetal se agrupan en fami lias, euyos cinco elementos mé sentativos se muestran en (zeatina) y decide abscisico (ABA). En las fotografias se ilustra el aprovechamiento de Ia eapacidad que poseen las hormonas vegetales para diri morfogénesis en cultivos celulares. Va- riando las proporciones de hormonas y reguladores se puede obtener tejido poco diferenciado (callo, zona amarilla) © inducir la diferenciacién de yemas (cona erde, arriba, :quierda), tallos(arri- ba derecha y abajo tzquierda) y raices (abajo derecha). (Fotografias cedidas por L. Roig y ¥. Morenc.) INvESTIOACIONY CHENCIA, abril, 1995si es una sola o la proporcién ade- cuada de varias de ellas 1a que ejer- ce el efecto fisiolégico. ;Cémo abor- dar, pues, el estudio de la accién de tuna hormona en medio de una ma- rata de metabolitos y reacciones? Los investigadores se esfuerzan por em- plear sistemas experimentales apro- piados en los que una determinada hormona desempeia un papel nico © preponderante sobre algin proceso fistologico. fe un tiempo a esta parte se re- cure con frecuencia creciente empleo de mutantes que presentan alteraciones en la sintesis de la hor- mona o en algin elemento de la ¢a- dena de respuesta, En los mutantes ‘el primer tipo, puede darse la sin- tesis. permanente ‘de la. hormona. 0, por contra, tratarse de un blogueo parcial o total. En los mutantes rela tivos a la respuesta, puede existir tina falta de percepcion total 0 par- cial de a hormona o, por el contra- Tio, una respuesta. incesante aunque la hormona no esté presente. Se sabe que las hormonas ejercen una funcién reguladora en el desarro- Ilo normal de Ia planta. Se sabe tam- bign que hormonas y reguladores pueden modificar el programa de de- Sarrollo de las células vegetales. Tres hiechos avalan esta afirmacién: la res- puesta de las plantas, mediada por hhormonas, a. cambios. en el entorno: la respuesta de las células vegetales a diferentes fitohormonas, cuando cre- cen en cultivo in vitro, y la base molecular de la accién de ciertos ft topatégenos "A diferencia de los animales, las plantas manifiestan una notable capa- Cidad para responder ante los cam- bios del entorno modificando su ve- Tocidad de crecimiento e incluso su programa de desarrollo. Una. planta {que erece en una zona frondosa 0 en Th oscuridad tiende a ahilarse ya alargar los. entrenudos de su tallo; cuando aleanza regiones de mayor Tuminosidad, éstos se acortan, Por otra pare, segtn sean las condiciones am Fientales, el meristemo apical puede contimiar formando nuevas hojas fallos, 0 bien modificar su_ programa de desarrollo para transformarse en tun meristemo floral. En el alarga- Imiento.de_los entrenudos yen. la diferenciacién floral se hallan impli- teadas ciertas hormonas. Las plantas se distinguen también por tener células totipotentes, dota- fas de capacided de’ regenerar un forganismo completo aun después de haber aleanzado ellas un clevado gra do de diferenciacién. Por otra parte desde los trabajos pioneros en ela 2 oratorio de F. Skoog. de la Univer- sidad de Wisconsin, se sabe que la adicién de hormonas o fitorregulado- res en cantidades apropiadas a un medio de cultivo, donde crecen células indiferenciadas 0 con diferente grado de diferenciacién, induce la forma- ‘eign de érganos. Segiin la proporcién de auxinas y citoquininas, las células pueden originar tallos, raices 0 tejido indiferenciado. Las proporciones apro- piadas difieren de unas especies a otras; de ahf que Ia regeneracién de las plantas dependa tanto de los fi- torreguladores utilizados como de las especies en las que se ensayan. 'No ha sido el hombre el primero en modificar el patrén de desarrollo y diferenciacién de las plantas alte- rando las concentraciones hormona- les. Ciertos patégenos desarrollaron ingeniosas estrategias millones de afios antes de que el hombre descubriera ‘su existencia. Asi, cuando Agrobacte- rium tumefaciens infecta plantas sus- ceptibles, induce tumores tras la in- corporacién en algin cromosoma de la planta de ADN-T (“transferred DNA"); ese fragmento incorporado forma parte del plismido bacteriano ductor de tumores (“tumor indu- cing”, 0 Ti) Experimentos de mutagénesis del ADN-T, realizados por diferentes grupos de Europa y EE.UU., demos- taron Ia existencia de tres genes, A, B y C, que determinan el fenotipo del tumor, Segdn el gen mutageniza- do, se produce un tumor indiferen- ciado (a* b* c*), un tumor con brotes (@ b* c*) © un tumor con raices (a* bt c). Se averigué més tarde que dichos genes codificaban las enzimas implicadas en la biosintesis de auxi- nas y citoquininas y que las concen- traciones de dichas hormonas deter- minaban el fenotipo del tumor. jodemos aprovechar la capacidad de la bacteria de transferir ADN-T fa plantas susceptibles para introducir genes forineos y producir plantas transgénicas. Con ese propésito, se emplean_plismidos desarmados, es decir, plésmidos que mantienen’ los genes que permiten introducir ADN en una planta y en los que los genes atogénicos, que provocarian altera- jones en el desarrollo del vegetal, se sustituyen por los genes que se desea introducir. Las plantas transgé- nicas son en todo igual a las norma- les, salvo en el caricter determinado pof el gen introducido. Se ha recu- rrido a esta estrategia para incorporar diversos tipos de genes, incluidos al- gunos que modifican Ia biosintesis ‘de hormonas.. Para averiguar en qué procesos interviene una hormona, podemos ‘adoptar varias estrategias experimen- tales. Por ejemplo, estudiar la corre Tacién entre aumentos 0 disminucio- nes de la concentracién endogena de luna hormona y un_ proceso fisioldgico determinado (crecimiento, desarrollo, cambio metabélico u otros), Una se~ gunda estrategia consiste en inhibir Ta produceién de una hormona, ob- Servar qué proceso queda afectado y, por fin, tratar de restituir el compor- tamiento normal mediante la adicién cexégena de Ia hormona. ‘Tenemos un ejemplo de la primera estrategia en la correlacidn existente entre el bajo nivel de giberelinas y Ia préctica ausencia de entrenudos en algunas plantas enanas de guisante. {Qué ocurre si aplicamos, desde fuera, icido giberélico? Los entrenudos se alargany alcanzan_ un tamaflo igual al de las plantas silvestres. Conviene tener presente, sin embargo, que, bien muchos procesos se alteran con a adicién exégena de hormonas, no todos los efectos observados permi- ten deducir que la hormona esta pre- sente de forma natural y, por tanto, desempefia un papel fisiolégico. 1 inhibicién de Ia sintesis hormo- nal se ha realizado experimen talmente mediante aplicacién de in- hibidores quimicos. El avance de las téenicas de ingenieria genética nos facilita ahora nuevas estrategias que permiten bloquear Ia sintesis de una hormona en particular. Para ello, se introduce un segmento de ADN de ‘un gen, que determina una enzima de la biosintesis de una hormona, en frientacién contraria a 1a que se en ccuentra de forma natural. Este ADN produce un ARN antisentido, que es tun ARN complementario del ARN mensajero, El ARN antisentido impi- de que cl ARN mensajero se traduzea en Ta enzima correspondiente y, por tanto, que se sintetice la hormona. En este contexto, en el laboratorio de A. Theologis, del Centro de Expre- sidn Genética de Plantas en Albany, se consiguié introducir en plantas de tomate un gen quimérico disefiado para bloguear la sintesis de etileno a nivel de la ACC sintasa (enzima {que sintetiza el dcido amino ciclopro- Pano carboxilico, metabolito precursor el etileno). Este gen estaba constitui- do por dos elementos: el promotor 355 del virus del mosaico de la co- liflor (cuya funcién es que el gen se exprese siempre) y el segmento de ADN de tomate que se transcribe en el ARN antisentido. (EI ARN antisen- tido bloquen el ARNm de la ACC sintasa e inhibe la sintesis de In en- ima.) El gen quimérico se insert6 en IxVESTIGACONY CIENCIA, abil, 1995el ADN-T, de un plésmido Ti desar- ‘mado, el cual permiti6 1a transforma- cién estable de plantas de tomate. En las plantas transgénicas se ob- servé una reducci6n significative de Ia sintesis de etileno. ;Por qué? Por: que el ARN antisentido producido por el ADN fordneo se uniG al ARN mensajero de Ia ACC sintasa, lo que comporté una fuerte caida de los ni- yeles de la enzima. Al no haber pro- duccién de precursor, disminuyo la de etileno. Por consiguiente, el fruto ‘no madur6, al menos durante el. pe~ fodo normal, Maduracién que si se aleanz6 con la adicién externa de tileno. De todo ello se inferia que Ja ausencia de maduracién debiase 4 la ausencia de etileno endégeno y no 4 otros factores que pudieran haberse alterado durante el experimento. ‘De forma similar, en el Laboratorio de D. Grierson, de la Universidad de Nottingham, se'logr6 bloquear la sin- tesis de la ACC oxidasa, enzima que cataliza la formacién de etileno a partir de amino ciclopropano carbo- xilico, Se consiguid introduciendo el ‘gen antisentido correspondiente. Se fobtuvo asf la inhibicién de la sinte- sis de etileno y la acumulacién de niveles altos de ACC. ‘Asimismo, se pueden introducir ge- nes que determinan las enzimas que, por otra via metabélica, pueden eli minar algunos de los precursores de la sintesis de una hormona. A este respect, H.J, Klee y colaboradores, de la compaiia Monsanto, introduje- ron en plantas de tomate el gen, de origen bacteriano, que codifica la ‘ACC desaminasa. Esta enzima, que cataliza la degradacion de ACC en fcido a-cetobutirico, no esti presente de forma natural en el tomate, pero Ja planta la sintetizé tras la introduc cién y expresién del gen bacteriano. La accién de In enzima provocé el consumo de ACC a través de una nueva ruta. El bloqueo de 1a sintesis del til no por cualquiera de los proc mientos descritos impide la madura- cién del fruto del tomate, lo que demuestra el papel inductor dela hormona y Ia posibilidad de contro- lar este proceso a través de téenicas biol6gicas La via biosintética del etileno es corta, y se conocen ya muchos de Jos elementos que intervienen en su regulacién, No ocurre asi con otras hormonas, En el caso de las gibere~ Tinas, una superfamilia de mas de oventa compuestos, ha habido que determinar cuales de ellos revisten interés fisiolégico. El andlisis de mu- tantes en matz por B.O. Phinney y su grupo, de la Universidad de Ca- InvEsTIGACiON Y CENCIA abil, 1995 Jifornia en Los Angeles, y otros tra~ bajos en arroz y guisante han permi- tido establecer que s6lo unas pocas giberelinas (GAi y GAs, fundamen- talmente) desempefian un papel hor- ‘monal en las plantas. Yiene mucho que progresar todavia la fisiolog(a vegetal en el co- nocimiento de la regulacién de la biosintesis de Ia mayoria de las hor- monas. El numero elevado de conju- gados (hormonas unidas a otros me- tabolitos) dificulta Ia identificacién de los que tienen un papel activo 0 factan como precursores 0 secuestra- dores de las hormonas, Falta por identificar, ademés, las enzimas regu- ladoras y, en definitiva, las rutas bio sintéticas que operan in vivo. Muy a menudo, son estas formas conjugadas Jas més abundantes y las que se transportan de una parte a otra de 1a planta, Otras veces es el precursor de la hormona activa el que viaja (caso del ACC). {Son éstos, conju- gados y precursores, las formas mas rapidas y versitiles de disponer de tun sistema de mensajeros intercelula- res que permita a la planta ajustarse @ las variaciones en el medio am- biente o es una mera consecuencia a ee es a ar i. 3 eee ae ne aa roe Ae worn ees otis a “0 i Ween E ee pretties cama TRANSFERASA o_o we ; I : eect Fe = th ee an : on be y aes Poriners es on Serco 2, DURANTE LA INFECCION de aina planta por Agrobacterium tumefaciens, el Jiieroorganismo transfiere a las cGlulas vegetales un fragmento de ADN (el ADN-T) contenido en el plésmide Ti. TADN-T es portador de genes (A, B, C) que permiten fn sintesis de Acido indolacético (auxina) y de isopentenitadenina, precursor de la mor. Segin sufra la mutagénesis uno wo on Fenotipos “que son las hormonas responsables del fenof tro de los genes, se desarrollaran tumores o del tu- 43del cardcter de metabolito secundario de las hormonas vegetales? Pese a la variedad de tamafos y de estructuras quimicas (desde el eti- Teno, un gas, de estructura muy sen- cilla, hasta las giberelinas y citogui- ninas, de estructura compleja), puede considerarse que todas las hormonas vegetales son moléculas de bajo peso molecular y de conformacién rigida, A diferencia de proteinas y écidos hucleicos, las hormonas no ‘procesan informacién por sf mismas; su accién depende del procesamiento de la se- fal en los tejidos 0 células que tie~ nen la capacidad para reconocer dicha sefial_y transformarla en informacién Se ha comprobado que las hormo- ‘S animales necesitan interaccionar con algtin tipo de receptor que inicie la transducecién de la sefal, es de cir, que, una ver reconocida ésta, la hormona active la cadena apropiada de reacciones que darin lugar a la respuesta fisiol6gica. Diferentes célu- Jas pueden transformar una misma se- 3. LA DEFIC! tas mutantes de guisante nana provoc ale 1, que es Ia giberel ceancen Ia altura de una planta si 44 {CIA DE GIBERELINAS en plan- ‘enanismo juierda). Los mutantes nana’ tienen bloquenda la 4 por tanto, la sintesis de ww activa inductora del alar> cael alargamiento de los entrenudos determina que las plantas nana tratadas (centro) al vestre (derecha). fial en diferentes informaciones, segtin la baterfa de receptores disponibles de acuerdo con el lugar que ocupan y en raz6n de la funcién que reali zan en un momento determinado, Lt gccion hormonal depende, pues, de la concentracién de la hor- mona, de Ia presencia y caracteristi cas del receptor y de los elementos que estin involucrados en la cadena de transduccién de la seal. El co plejo hormona-receptor, esto es, el receptor activado, constituye el ‘pri- mer eslabén de la cadena de la trans- duccién de la seflal que provoca una respuesta primaria; ésta, a su ver, inicia una serie de cambios que, en Conjunto, integran una respuesta com. pleja, 1a’ respuesta fisiolégica. Como parte de esta respuesta, la activacion © represién de genes constituye uno de los elementos clave, Las estrategias experimentales mas utilizadas para estudiar Ia accién hor monal en las plantas han sido dos. En primer lugar, la bis queda de receptores y el mentos de la transduccién de la seiial hormonal, mi diante la identificacién de proteinas que se unen a hormonas y mediante la identificacion de genes cuya mutacién altera la cé pacidad de percepcién o de accién de las mismas. En segundo lugar, el andlisis molecular de’ genes cuya expresién esté modificada por hormonas; andlisis que se realiza a través de la caracterizacion de secuen- cias de ADN reguladoras, la identificacién de protet- nas que se enlazan a las secuene adoras y la expresién. de los. promoto- res de dichos genes en plan- La busqueda directa de receptores hormonales se bas6, al principio, en el ais lamiento. de protefnas que se detectaban por unirse a moléculas de hormona mat cadas radiactivamente. Para localizar receptores se re- éerivades hormona Jes marcados quimicamente, derivados fotosensibles (que se anclan en el receptor al sufrir una modificacién es- tructural tipos (anticuerpos de topo. logia similar al conjugado hormonal ¥ que se prepa. ran utilizando, por antigeno, anticuer- os contra el conjugado hormonal). No todas las proteinas que se en- Jazan a hormonas son receptores. Las hormonas se pueden unir especifica- mente a otras proteinas; por ejemplo, de forma enzi transportadores: inespecifiea se unen también a otras moléculas y estructuras, En el co- le6ptilo de maiz, se ha identificado y caracterizado la protefna que se tune a la auxina, o ABP (“Auxin-Bin- ding Protein”), que se localiza en el reticulo endopiasmatico y en Ia parte exterior de 1a membrana plasmitica, La secuencia de nuclestides de un gen que codificaba la ABP y Ia de aminoficidos de la proteina fueron ob- tenidas al mismo tiempo por N. Ino: hara_y colaboradores, de la Univer sidad’ de Osaka, y por otros grupos de la Universidad de Bonn y del Instituto Max Planck de Colonia. Los anticuerpos. preparados contra la ABP bloquean la hiperpolarizacion de membranas de protoplastos de ta bbaco inducida por auxinas, Ademés, cierto péptido, cuya secuencia es la de la regién terminal catboxilica de la ABP, provoca modificaciones en los canales que regulan la entrada y salida del ion K* a través de la membrana celular; estas alteraciones, de la misma naturaleza que las_pro: vocadas por altas concentraciones de auxina, curren en tan s6lo un par de minutos y producen una alcalini- zacién del pH citosdlico, Esta simi litud y rapidez del efecto sugieren gue la ABP podria ser responsable de la respuesta primaria a la auxin: {Ser finalmente la ABP un verdade- Fo receptor de auxinas? Los avances més significativos en la identificacién de los elementos que, ademas del receptor. integran una cadena de transduccién de la se- jial hormonal se han obtenido del anilisis molecular de genes euya mu- tacion afecta a la respuesta hormo- nal. En buena medida, este progreso se ha debido al empleo, como siste- ma experimental, de Arabidopsis. tha- liana, planta que posee uno de los genomas més pequeios, En plantas silvestres de Arabidop- sis que crecen en la oscuridad, el etileno induce lo que se llama la triple respuesta: inhibicién del creci ‘miento del hipocdtilo (parte del eje aulinar que se halla debajo de los cotiledones) y de la raiz, engrosa- miento del hipocdtilo y acentuacién de la curvatura apical. En el labora- torio de J. Ecker, del instituto de ciencias vegetales de Ia Universidad de Pennsylvania, se han aislado mu: tantes de Arabidopsis que presentan alterada la sensibilidad al etileno, En: InvesniaaciON ¥ Cex, abril, 1995tre ellos, destacan Jos mutantes ein (ethylene insensitive), que son insen- sibles al tratamiento con etileno, y Jos ctr (constitutive triple response), {que manifiestan siempre la triple res- puesta, incluso en ausencia de etile- no, Otro mutante, el his (hiookless, sin curvatura apical), presenta altera- ciones en solo una de las tres 1 puestas al etileno. Do rsts con og resulta ob- tenidos, la secuencia ordenada ‘de actuacién de los productos de es- tos genes parece ser Etr/Ein! ~ Ctr— Ein3 — Hls, Se conoce la base molecu- lar de alguna de esas mutaciones por anilisis de la secuencia de los co- rrespondientes genes, tanto del alelo normal como los genes de los alelos ‘mutantes. La comparacién de la se- cuencia del gen CTR con las secuen- cias de otros genes sugiere que la proteina determinada por el mismo es una serintreonin quinasa, similar a las proteinas Raf. Estas proteinas forman parte de la cascada de qui- nasas de la ruta de la proteina Ras, via de importancia decisiva en el control del. crecimiento en organis mos muy dispares: levaduras, nema todos, mosca de la fruta y ser huma: no, Por otra parte, el producto del gen EIN3 tiene una secuencia pare~ ida a ciertos factores de transcrip- cién, lo que sugiere que participaria en la activaciOn de una serie de ge- hes, que, a su vez, actuarian sobre otros y configurarian asf la respuesta fisiol6gica. El andlisis molecular de mutantes de Arabidopsis que no presentan la triple respuesta ha permitido a C. Chang, S.F. Kwok, A. Bleecker y E. Meye~ rowitz, del Instituto de ‘Tecnologia de California, idemtificar el gen ETR (ethylene triple response), uno de los que controlan la triple respuesta. La proteina determinada por ese gen cons- ta de 738 aminodcidos, posee una re- gidn amino-terminal hidrofébica y pre- senta dos regiones de caracterfsticas similares a dos proteinas independien- tes y ya encontradas en bacterias. La primera regién, que abarca desde el faminofcido 326 hasta el 562, mues- tra homologia con una histidin qu nasa que se autofosforila; In segunda regién, que comprende del aminodci- do 610 al 729, revela caracteristicas de un regulador de respuesta de los sistemas procariotas. Ast pues, parece que la proteina vegetal integraria los dos elementos de un sistema de dos ‘componentes, cuya funciGn en los pro- ariotas es la deteccién y transmision de sefiales desde el exterior hacia el interior de 1a eélula. El andlisis de cuatro mutantes err obtenidos en Arabidopsis revela que Jos cuatro tienen alterada la. secuen cia en la regién amino-terminal hi- drofabiea y que la mutacién es do- minante. Las plantas silvestres, que deberian mostrar la triple respuesta en atmdsfera de ctileno, se convier- ten en insensibles a éste si se trans- forman mediante 1a introducci6n del gen mutante efr-/. {Es la proteina Etr uun receptor, 0 parte de un complejo receptor, para el etileno? Lo sea 0 no, lo que si parece claro es que Etr y Ctr forman parte de una cadena de Tespuesta con un mecanismo intrace- lular similar al gue poseen toda una serie de organismos repartidos a lo largo de la escala evolutiva El andlisis molecular de los genes regulados por hormonas puede ayu- dar a desentrafar los mecanismos de la accién hormonal. Para conseguir este objetivo, se recurre, en primer lugar, al aislamiento de polipéptidos (Cig CHC -CH-COOH I 1 00, NH CCis- CH, COOH. 4, INHIBICION DE LA BIOSINTESIS det etileno, Puede con- Scquirse por tratamiento con compuestos quimicos: aminoeto- Sitiniglicina (AVG) ¥ dcido o-aminoisobutirico (A1B); también, ‘de forma permanente y desde dentro mediante bloqueo de la INVESTIGACION Y CIENCIA, abril, 1995 cexpresién de los genes de la biosintesis del etileno con genes “ntisentido de la ACC sintasa y ACC oxidasa. Se inhibe, ade- ‘is, por eliminacién del precursor (ACC) introdueiendo un gen bacteriano que determina la ACC desaminasa, 45i Eu Als or a> cir a> mp cin 3 ent ‘Aa! —> val tere 5 Phe ys! —> Tyr ‘Ala —> The Pavan ers erie ert aria ETA NH ‘cooH DOMINIO HIDROFOBICO SISTEMA DE 008 COMPONENTES. EEE tn PROSATIOTAS I HISTIOINAKINASA REGULADOR DE (AUTOFOSFORILACION) —_-RESPUESTA Gus ys ors Asp Gu ett mat —> ADN-T ot 15 a DOMINIO KINASA cm 5, ACCION DE UNA HORMONA VEGETAL. Para su estudio, se parte de la hip6- tesis, ya demostrada en animales, de que In hormona interacciona con un receptor. La interaccién hormona-receptor se transmite a una serie de elementos, que cons- tituyen la cadena de transduccién de sefial. Las células o tejidos efectores (diana) presentan una respuesta fisioldgica, modulada por sus propios factores especificos. La utilizacion de mutantes en la respuesta de la planta Arabidopsis rhaliana al etileno (CAL) ha permitido identificar alguno de los elementos de Ia cadena de transduccién de la sefial hormonal, Las plantas normales de Arabidopsis responden al etileno pre- ‘Sentando Ia triple respuesta: 1) inhibicin del crecimiento del hipocdiilo y de la rata; 2) engrosamiento del hipocétilo, y 3) resalte de la curvatura apical. Se emplean ‘diversos tipos de mutantes. Los insensibles al etileno (et, ein? y ein3) muestran siempre un fenotipo de plintula erecida en ausencia de etileno; los mutantes de respuesta constitutiva (ed?) manifiestan la triple respuesta incluso em ausencia de cetileno exdgeno, Algunos, como el ids, desarrollan sélo alguna de las caracteristicas de la triple respuesta. En experimentos con dobles mutantes se establece luego la Secuencia de actuacién de los productos génicos. Los genes identificades que forma parte de la cadena de respuesta al etileno parecen tener funciones similares a otros Wegrados en la cadena de transduccidn de seial en otros organismes. El anali de Ia secuencia del gen E7R indica que codifica una proteina que agrapa dos ele imentos similares al sensor y regulador, presentes como dos proteinas en sistemas de ‘respuesta a seflales extracelulares en procariotas. La secuencia de la proteina CTR, fa su vez, podria relacionarse con Ser-Thr quinasas del tipo Raf presentes en anima. Tes; tal vex forma parte de una cascada de fosforilaciones encargadas de la trans- duccién de la sefial hormonal. 46 y de mensajeros cuya sintesis se in- Guce, © se reprime, por la accién de alguna hormona; en segundo lugar, a la identificacién y andlisis de tas se- cuencias reguladoras de los genes y de proteinas que se enlazan a las mismas; y, por dltimo, a la introduc- cin, en plantas transgénicas, de los genes especificamente regulados por hhormonas, para descubrir su funci6n En algunos genes regulados por hor- monas se ha demostrado la existencia de elementos de respuesta a hormo- nas (“hormone responsive elements”, ‘© HRE) en la region 5’ del gen, es decir, en la zona del promotor. En el estudio de estos promotores se han definido secuencias, reconocidas es- pecificamente por ciertas proteinas, cuya presencia se requiere para que cl gen esté controlado por la hormo- na, La pérdida de HRE, o la altera ccidn de su secuencia por mutacién, provoca Ia pérdida parcial 0 total de Ia sensibilidad a Ia hormona, por Io que se puede sugerir que actian a modo de reostatos moduladores de ta expresién del gen. Brtymgste shontrio del Instituto de Biologia Molecular y Celular de Plantas, hemos investigado la ex- presidn del gen de una tiolproteasa durante la senescencia de ovarios no polinizados de guisante. La apli Cidn de giberelinas al ovario evita la senescencia del ovario e impide la expresién del gen de la tiolproteasa; en cambio, promueve Ia fructificacién partenocérpica (desarrollo de_frutos sin semillas). Para observar la expre- sin del gen de la tiolproteasa se cons truye un gen quimérico, mediante la uunién de una secuencia’ de 1,5 kilo- bases del extremo 5’ del gen de la tiolproteasa al gen delator gus (que codifica la enzima B-glucuronida Una vex introducido el gen. quimérico en flores, que expresan_transitoria- mente el gen de la tiolproteasa, se deteeta por el color azul resultante de Ia actividad de la enzima -glucuro- niidasa sobre un sustrato cromogénico ue se affade exgenamente. La apli ion de esta técnica a segmentos mo- dificados de ADN permite delimitar las secuencias responsables del con- trol hormonal de la expresién génica El estudio de genes regulados por aiberelinas y por ‘cide abscisico ha dado lugar a la identifieacién de se- cuencias reguladoras GARE (“gibbe- rellic_acid regulatory elements”). y ABRE (“abscisic acid regulatory ele~ ments”), respectivamente. La identificacién y anilisis de nue- vos ARN mensajeros y de prot inducidos por hormonas a tiempos muy cortos ha permitido aislar algu- IavesmiGacion y Ciencia, aril, 1995nos de los eslabones de la cade: transduccién de sefial de auxinas Asi, en el laboratorio de Theol se ha demostrado que la expresién d dos genes (IAAI ¢ IAA2) se activa a Jos cuatro u ocho minutos por Ia ac~ ign de las auxinas. IAAL e TAA2 son proteinas nucleares de vida media muy corta (de seis a ocho minutos de vida media) que presentan homologia con factores de transcripeién encontrados fen procariotas. ,Son estas. protefnas el otro extremo de Ia cadena de trans duccién de Ia seal a auxinas? ‘Conocidas las secuencias de ADN de respuesta a hormonas, podemos investigar en qué células o tejidos se produce la acumulacién de una hor- mona, objetivo dificil de alcanzar por otros métodos; basta con intro: ducir el promotor de un gen regula- do por hormonas acoplado a un gen delator. Entre varios ejemplos, Y. Li, G. Hagen y T.J. Guilfoyle, de la Universidad de Missouri, constr ron un gen quimérico utilizando el promotor del gen SAUR de soja (gen cuya funcién se desconoce, aunque se activa por auxinas), ligado a la secuencia codificante del gen GUS. Este gen quimérico se introdujo en plantas de tabaco por transformaci6n mediada por Agrobacterium tume faciens, Las células que contenfan auxinas activaban el promotor SAUR y. por ende, elator GUS, tects al anadir un sustrato cromoy nico y producirse un color azul La seleccién vegetal de especies de interés agricola se venia haciendo Ta expresion del gen cuya actividad se de- 6. EXPRESION de una tiolproteasa re: ulada por hormonas en tejidos Morales Senescentes de guisante. EL ARNm de la tolproteasa se cl Gyulo y el se aprecia ida por N. Harris se realiza sentido de ARN a las células de dichos Srganos. Tratamiento del ovario con aeldo gi berdlico reprime su expresiOn y pri cl desarrollo del fruto. Para estudi regiones del ADN responsables de resign génica regulada por hormonas, smo 5° del gen de la tine a un gen delator (el gen de jolproteasa y se Beglucu- conjun pistola de particulas. Las eélulas que !dquirido el gen quimérico y expresan la easa, expresan también la gl sa, que se detecta por el colo fazul que produce con el sustrato cromo- séenico X-plue (abajo). La fotografia inf Fior nos ha sido cedida por D. Orzaez Investioncion ¥ CENCIA, abril, 1995 x funcidn de caracteristicas que, aun Sin saberse, estaban ligadas a la pre- sencia o ausencia de hormonas vege. s Por ejemplo, pretendiendo ob: ener variedades que exigieran menos y no sufrieran encamado, fe- 9 Este que dificulta la recolec: facilta el ataque de predadores fenos, se seleccionaron plantas Enanas de trigo con entrenudos cor- tos y fuertes. Pues bien, las plantas con entrenudos cortos tienen niveles més bajos de giberelinas. Por contra, ‘un mayor nivel en algunas hormonas endégenas (principalmente auxinas, giberelinas y citoquininas) es el fac tor operante en la seleccién de frutos sin semillas. Por ultimo, la practica y pat de la combustién en recintos cerra- dos para producir atmésferas que fa cilitaban la desverdizacién y madura- cién de frutos se empleaba mucho antes de saberse que el etileno era el principio activo de este efecto. Us sz sons, veld gunas hormonas y reguladores cen Ios procesos enumerados, se trat6 de obtener el mismo resultado median- te la aplicacién exdgena de fitohor- monas y reguladores. La aplicacién del cycocel, que, al parecer, inhibe la sintesis de giberelinas, acorté la ongitud de los entrenudos y, por tanto, redujo el encamado de varie~ dades de trigo cuyo tallo era inicial mente més alto, A su vez, el empleo de auxinas, giberelinas y citoquininas aGEN REGULADO POR ETILENO ae ATG oA ate [AGROBACTERIUM VECTOR AGROBACTERIUM VECTOR PROTEINA DULCE FRUTA TRopicaL, ata Tos hha permitido mejorar el cuajado y las caracterfsticas (tamaio y calidad en particular) de determinados frutos ‘Tambien, la utilizacion de atmésferas de etileno ha sustituido a las pricti- ceas de combustion. Por su. parte, la aplicacion del fitorregulador écido absefsico, al provocar la abscision de las flores del algodén, faciita su re- cogida. Y, por ultimo, la utilizacién de hormonas vegetales es decisiva en el cultivo in vitro, de_ importantes repercusiones en la propagacidn clo- nal de plantas, en Ia obtenciGn de plantas libres de virus y en la con- Secucién de metabolitos. secundarios de alto valor aftadide. El empleo de hormonas en Ia agri- ‘cultura comicnza a abordarse desde tuna nueva perspectiva. Se dispone de téenieas que permiten dirigir los pro- esos del desarrollo controlado por hhormonas desde el interior del vege- tal. Estas técnicas son més respetuo- sas con el medio ambiente, al evitar el uso extemo de productos. quimi 48 cos. Recordemos la inhibicién de la sintesis de etileno mediante la intro- duccién de genes que dirigen el blo- queo de la produccién de las enzi- ‘mas implicadas en su biosintesis 0 reducen el nivel de algunos de sus precursores. Gracias a ello se puede recolectar frutos que no sobremadu- ran y, por tanto, resisten mejor el transporte, un periodo de almacena- miento mas largo y los efectos de ‘numerosos pat6genos que alacan a los frutos sobremaduros. La madura- cién de estos frutos puede controlar- se mediante Ia aplicaciGa ex6gena de Ia fitohormona. La mejora vegetal recurre también al empleo de promotores de genes regulados por hormonas. La secuen- cia nucleotidica del promotor se it twoduce ligada a genes que pueden desarrollar nuevas propiedades. Se puede inducir la actividad de estos genes en el momento de I prescacia (© ausencia de la hormona, 0 de su aplicacién exégena. L. Petiarrubia. 7.LAS REGIONES REGULADORAS de ns gees controlades por hormonas sir- Se mucstra la expresion de [nérico constituido por las secuencias re- Zoladoras del promotor del gen F8 de to- fate y por la regién codificante del gen de la proteina dulce monelina de la planta tropical Taumatococeus danielli. De esta forma, la regulacién, durante Ia madu- racién del fruto, depende de etileno. Este {gen se introduce en plantas de tomate por fransformacién mediada por Agrobacte- rium. En las plantas transgénicas, tanto {a proteina EX como la monelina se pro- ducen durante Ia maduracién del fruto inducida de forma natural por etileno. La presencia de monelina confiere un sa- bor dulce al fruto de tomate, sin aumen- tar el nivel de azicares. R. Kim, J. Giovannoni, S-H Kim, en el laboratorio de R. Fischer, de la Uni- versidad de California en Berkeley, cconsiguieron introducir el “sabor dulce” cen [os tomates sin aumentar su nivel de azticares, y asegurando que esta ca- racterfstica apareciera a lo largo de la maduracién o tras el tratamiento con etileno. Para ello construyeron un gen quimérico con el promotor del gen ES (gen de funcién desconocida, que se activa en frutos de tomate al ini- cio de Ia maduracién y mediante tra- tamiento con etileno), seguido de la secuencia de ADN que codifica una protefna de sabor muy dulce, la mo- nelina (aislada de Tawmatococeus da- nielli, un fruto tropical) ‘Las piezas del rompecabezas de Jas hormonas vegetales estin empe~ zando a encajar en un cuadro coheren- te. Surgen nuevas perspectivas para este capitulo de la fisiologia vegetal y Ia agricultura, algunas convertidas ya en realidades, Un buen ejemplo fs la presencia en el mercado del primer tomate transgénico que pre~ Senta resistencia a la sobremadura: cién, fruto de la investigacién sobre las bases moleculares de la accién de una hormona vegetal. BIBLIOGRAFIA COMPLEMENTARIA, Fisiovoala y Bloguinaca VEGETAL. Di do por J. Azcén-Bieto y M. Talon. Capi- tulos 12 a 17. Imeramericana McGraw- Hill, Madrid 1993. (CELLULAR SIGNALING: NEW INSIGHTS INTO, ‘TW ACTIONOF THE PLANT GROWTH HOR. | Moxe AUXIN, M. H.M. Goldsmith, Proc Nail. Acad. Sei. USA, vol 90, péginas 11442-11445, 1993 ‘THe ROLES OF PHYTOHORMONES 18 DEVE. LOPMENT AS STUDIED IN TRANSGENIC Pests, HJ. Klee y C.P. Romano. Cri- tical Reviews in Plant Science, vol. 13, pags, 311-324, 1994. Invesmaaciony CENcxA, abil, 1995