Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013

ANALISIS EKSPRESI KLON GEN CVPDr DALAM SEL Escherichia coli

A.A. Putu Sri Mahayani
UNTAG Surabaya
aap.srimahayani@gmail.com

ABSTRACT

The effort to control CVPD was done, but it did not fulfil the expectation
properly. One of the new approach to control the CVPD plant diseases were
genetics approach expedient i.e. by isolating and resistant gene cloning or
resistant against CVPD.
Jeruk kingkit was far family of citrus plant which was resistant to CVPD.
One of genetics transformation technique by Agrobacterium vector , have been
isolated and cloned from DNA fragments successfully that were contain genes for
resistance against CVPD disease (CVPDr gene) from Triphasia trifolia (Jeruk
kingkit). Those DNA fragments were cloned in plasmid of pUC18 vector and were
cared in the Escherichia coli JM109 cell, so that this research aims to detect
CVPDr gene expression in the Escherichia coli JM109 cell, to compare CVPDr gene
expression in the Escherichia coli JM109 cell with proteins which were isolated
from T. trifolia and Siamese citrus.
The bacteria were cultivated at liquid LB medium by adding agarose gel
1.5 g that contain ampicillin 100 ppm, and those bacteria were cultured at
agarose gel LB medium that contain ampicillin 100 ppm. Colonies of growth
bacterium were taken to be isolated their plasmids with the DNA agarose gel
electrophoresis 1%. Obtainable DNA were cut by restriction enzymes endonuclease
EcoRI and BamHI. Bacteria proteins were compared with the citrus plan proteins.
Protein molecules which were yield from CVPDr gene cloning in the Escherichia
coli JM109more or less 17 kDa its large. The similar large molecules exist at the
sample proteins which were isolated from T. trifolia (Jeruk kingkit) .

Kata kunci: Bakteri Escherichia coli JM109, CVPD, Jeruk kingkit., T. trifolia.

vektor Diaphorina citri (Subandiyah,

PENDAHULUAN 2001) .
Gejala khas CVPD adalah daun
Di Indonesia penyakit yang terlihat menguning dengan tulang-
menimbulkan kerusakan dan kerugian tulang daun menjadi lebih hijau. Daun
tanaman jeruk yang paling penting tidak dapat berkembang dengan baik
adalah CVPD (Setiawan dan sehingga daun menjadi lebih kecil,
Trisnawati, 1999). buah menjadi kecil-kecil, keras, dan
CVPD (Citrus Vein Phloem kulitnya menjadi menguning. Daun
Degeneration) merupakan penyakit tanaman yang terserang CVPD
terpenting dan penyebab utama mengalami klorosis dengan gejala
kehilangan hasil perkebunan jeruk di menyerupai defisiensi unsur nitrogen,
hampir semua negara terutama Asia seng, mangan dan zat besi (Setiawan
dan Afrika. CVPD disebabkan oleh dan Trisnawati, 1999).
bakteri gram negatif Liberobacter Penyebab penyakit CVPD
asiaticum yang ditularkan serangga awalnya diperkirakan adalah virus.
Sejalan dengan perkembangan

ISSN 2302-2612 33

penguasaan ilmu dan teknologi serta
penelitian lebih lanjut tentang
penyebab penyakit CVPD, diketahui
bahwa penyebab penyakit CVPD
adalah bakteri (Sandrine et al.,
1996). Berdasarkan analogi terhadap
MLO, penyebab CVPD disebut BLO
(bacterium like organism) atau GO
(greening organism) (Nakashima et
al., 1996).
Kondisi lingkungan pertanaman
jeruk di Indonesia yang beragam,
diduga dapat menyebabkan mutasi
dan variasi genetik pada bakteri
CVPD, karena mutasi dan variasi
genetik pada makhluk hidup dapat
dipengaruhi lingkungan (Gardner,
1991), sehingga pengendalian CVPD
dilakukan terhadap vektor dan
patogen. Pengendalian vektor
dilakukan dengan menggunakan
insektisida dan pengendalian hayati.
Pengendalian patogen pada pohon
terinfeksi dilakukan dengan injeksi
tanaman dengan antibiotik seperti
tetrasiklin hidroklorida, pemotongan
bagian tanaman bergejala,
pembongkaran tanaman sakit dan
menggantinya dengan tanaman sehat
(Da Graca, 1991).
Semua tanaman jeruk budidaya
rentan terhadap serangan penyakit
CVPD. Berbagai usaha pengendalian
telah dilakukan tetapi belum memberi
harapan yang memadai, salah satu
pendekatan baru dalam usaha
pengendalian penyakit CVPD adalah
upaya pendekatan secara genetik
yaitu dengan mengisolasi dan
mengklon gen ketahanan terhadap
CVPD (Wirawan & Subandiyah, 2000).
Fragmen DNA tersebut diklon
dalam plasmid vektor pUC18 dan
dipelihara dalam sel E. coli JM109.
Klon plasmid rekombinan itu disebut
pWR27 (Wirawan et al., 1998).
Jeruk kinkit (Triphasia trifolia)
berasal dari Cina. Di Indonesia di
tanam di pekarangan mempunyai daun
majemuk ganda tiga, anak daun
berbentuk bulat telur, tepinya
beringgit, pada ketiak daun terdapat
duri lurus, agak panjang, bunga
ISSN 2302-2612
Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013
berwarna putih berbau harum. Buah
buni, berongga tiga masing-masing
berisi satu biji pipih (Anonim, 1988).
Hasil penelitian Wirawan &
Subandiyah (2000) menunjukkan
bahwa tanaman jeruk kinkit
menunjukkan tanda potensial sebagai
tanaman yang tahan terhadap
serangan penyakit CVPD, sedangkan
jeruk siam tidak tahan CVPD.
Beberapa jenis tanaman daun
jeruk terserang CVPD dapat dilihat
pada Gambar 1.
Gambar 1. Beberapa Jenis Daun
Jeruk
a. Daun jeruk siam tersera ng
CVPD (sakit)
b. Daun jer uk sia m tida k
terserang CVPD (sehat)
c. Daun jeruk kink it
Bakteri Escherichia coli
digunakan dalam kloning sebagai
organisme inang untuk rekombinan
molekul DNA. Salah satu langkah
dalam kloning adalah pemulihan
vektor. Vektor adalah wahana dimana
DNA asing dipindahkan ke organisme
inang baru dan dapat diekspresikan
dari DNA asing di dalam inang baru
(Brown, 1991).
Molekul DNA sel E. coli hampir
1000 kali lebih panjang dari selnya
sendiri dan karenanya harus betul-
betul berlipat untuk dapat masuk ke
dalam badan inti yang biasanya
berukuran 1 mm. Dinding luar sel E.
coli dilapisi oleh selongsong atau
kapsul yang terbentuk dari senyawa
berlendir (Sambrook et al., 2001).
Bakteri E. coli biasanya hidup
pada usus pencernaan manusia dan
hewan berdarah panas.
Pertumbuhannya membutuhkan zat
makanan berupa unsur bahan organik
seperti karbon, hidrogen, nitrogen,
34
 Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013

fosfor, belerang, oksigen, ion MATERI DAN METODA

anorganik seperti kalium, natrium,
besi, magnesium, kalsium klorida, dan Penelitian ini nenggunakan
vitamin. Kebutuhan gizi dan sumber- metode survei dan test yang
sumber energi metabolik pada dilakukan terhadap obyek dan
berbagai bakteri sangat beragam. penelitian. Adapun rancangan
Bakteri yang sedang tumbuh salah prosedurnya dibuat sebagai berikut ini
satu unsur tersebut harus ada. Ciri :
khas bakteri E. coli antara lain 1. Pengambilan sample terhadap
kemampuan perlekatan pada sel inang daun jeruk kinkit dan daun
dan invasi sel pada jaringan inang jeruk siam.
(Jawetz et al., 1996). 2. Dilakukan uji di labolatrium
Faktor pertumbuhan adalah bioteknologi pertanian jurusan
suatu senyawa organik yang harus ada hama dan penyakit tumbuhan
dalam sel supaya sel tersebut dapat fakultas pertanian universitas
tumbuh, tetapi sel tidak dapat Udayana Denpasar .
mensintesisnya. Faktor-faktor yang 3. Dari hasil labolatrium kita
harus diperhatikan selama dapat mengetahui bahwa daun
pertumbuhan bakteri E. coli adalah jeruk kinkit tahan terhadap
zat makanan, pH, suhu, udara, serta serangan CVPD
adanya ion-ion anorganik (Sambrook
et al., 2001).
PEMBAHASAN

Pembiakan Bakteri
Hasil pembiakan bakteri E.
coli JM109 yang membawa gen CVPD r
yang diklon pada pUC18 (pWR27) dan
pUC18 yang dipelihara pada sel E. coli
JM109 dapat terlihat dengan
tumbuhnya koloni pada media LB agar
yang mengandung 100 ppm ampicillin.
Koloni-koloni yang tumbuh
merupakan gen CVPD r yang diklon
pada pUC18 dalam sel E. coli JM109
(pWR27). Bakteri tersebut membawa
plasmid yang menyandi gen tahan
terhadap ampicillin. Koloni-koloni
yang tumbuh merupakan pUC18 yang
dipelihara pada sel E. coli JM109.
pUC18 merupakan vektor kloning
membawa paling sedikit satu gen yang
memberikan resistensi terhadap
ampicillin pada sel tuan rumah dan
seleksi untuk transformasi dengan
menanam sel pada medium agar yang
mengandung ampicillin (Brown, 1991).
Bakteri dapat ditumbuhkan
tanpa banyak kesulitan karena
campuran nutrien penting yang
seimbang pada konsentrasi yang tepat
Gambar 2. Kerangka Konsep dan penggunaan antibiotik yang sesuai
Penelitian menyebabkan bakteri tersebut

ISSN 2302-2612 35
 Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013

tumbuh. Bakteri E. coli adalah bakteri Covalenthy Closed Circular (CCC) DNA
berbentuk batang dengan ukuran yang mempunyai struktur terteir yang
panjang 1 – 3 mm serta lebar 0,4 – 0,7 tahan terhadap denaturasi maka utas
mm, bersifat gram negatif, tidak tunggal akan melekat bersama lebih
berkapsul, dapat bergerak aktif erat, sehingga berasosiasi kembali
karena mempunyai flagela peritrik, lebih cepat sehingga mudah
bersifat aerob. Suhu untuk terdenaturasi, oleh karena itu bila
pertumbuhan berkisar 4 0 C-46 0 C denaturasi diterapkan maka DNA
dengan suhu optimum 37 0 C. kromosom akan terdenaturasi dan
Sedangkan pH optimum untuk berpresipitasi sehingga DNA plasmid
pertumbuhan adalah 7,0 – 7,5 akan tetap utuh (Sambrook et al.,
(minimum 4,0 dan maksimum 8,5). 2001).
Bakteri E. coli relatif peka terhadap
suhu dan pemanasan (Jawetz et al., Pemotongan DNA Plasmid dengan
1996). Enzim Endonuklease Restriksi
Hasil pemotongan DNA
Isolasi DNA Plasmid Bakteri plasmid bakteri E. coli JM109 yang
Hasil isolasi DNA plasmid mengandung gen CVPD r yang diklon
bakteri E. coli JM109 yang pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang
r
mengandung gen CVPD yang diklon dipelihara pada sel E. coli JM109
pada pUC18 (pWR27) dan pUC18 yang dengan enzim endonuklease restriksi
dipelihara pada sel E. coli JM109 Pemberian enzim endonuklease
dapat terlihat dengan terbentuknya restriksi untuk memotong DNA
pita DNA pada elektroforesis 1 % menjadi fragmen-fragmen dengan
agarose. panjang yang berbeda-beda. Enzim
Hal ini menunjukkan bahwa endonuklease restriksi akan
memisahnya kedua jenis DNA yaitu menempati suatu molekul DNA dan
DNA plasmid dan DNA kromosom bergeser sepanjang heliks DNA hingga
bakteri yang besar jumlahnya mengenali urutan pasangan basa
terdapat dalam sel. Plasmid yang spesifik untuk berhenti bergeser,
paling besar ukurannya hanya 8% kemudian enzim endonuklease
ukuran kromosom E. coli dan restriksi akan memotong DNA pada
kebanyakan plasmid lebih kecil dari urutan pasangan basa spesifik.
ukuran tersebut, oleh karena itu Tempat urutan pasangan basa spesifik
pemecahan sel harus dilakukan ini disebut juga situs restriksi.
dengan pelan-pelan untuk mencegah Pemotongan DNA dengan enzim
pemecahan DNA bakteri secara endonuklease restriksi mengenal
menyeluruh (Brown, 1991). urutan spesifik pada molekul DNA
Kebanyakan plasmid terdapat yang dipotong. Enzim Eco RI yang
dalam bentuk molekul DNA berunting disintesis oleh E. coli mempunyai
rangkap. Kedua unting DNA urutan pengenal GAATTC. Enzim Bam
merupakan lingkaran utuh, HI yang disintesis oleh Bacillus
molekulnya digambarkan sebagai CCC amynololique faciens mempunyai
(Covalenthy Closed Circular) DNA urutan pengenal GGATCC. Ujung-
yang berarti lingkaran tertutup ujung hasil pemotongan dengan enzim
kovalen. Covalenthy Closed Circular endonuklease restriksi Eco RI dan Bam
DNA bila satu unting yang utuh HI . Ujung-ujung Pemotongan Enzim
molekulnya digambarkan sebagai OC Eco RI dan Bam HI
DNA atau lingkaran terbuka (open Pemotongan molekul DNA
circles), sedangkan DNA kromosom dengan tepat perlu pada
lebih longgar dan mempunyai ukuran yang pembentukan DNA rekombinan
sangat panjang, sehingga mudah (kloning gen). Vektor dipotong posisi
dipisahkan sewaktu isolasi. tunggal untuk membuka lingkaran

ISSN 2302-2612 36
 Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013

sehingga molekul DNA baru dapat magnesium, kalsium dan vitamin

diinsersikan. Vektor harus dipotong (Jawetz et al., 1996).
pada posisi yang sama sebab
pemotongan secara random tidak Analisis Total Protein Bakteri
memuaskan DNA pUC18 (Sambrook et dengan Total Protein Daun Jeruk
al., 2001). Kinkit dan Jeruk Siam
Tempat pemotongan enzim
restriksi pada molekul DNA, Analisis total protein bakteri
meninggalkan bekasnya berupa dengan total protein daun jeruk kinkit
tonjolan ujung 5’. Ujung-ujung ini dan daun jeruk siam dilakukan dengan
dapat mengadakan ikatan hidrogen teknik elektroforesis menggunakan gel
dengan ujung DNA lainnya yang poliakrilamid sebagai pemisah. Gel
dipotong oleh enzim yang sama. poliakrilamid dapat memisahkan
Potongan enzim restriksi atau protein berdasarkan massanya.
fragmen restriksi yang ujungnya tidak Protein dalam gel dapat dilihat
rata atau menonjol dinamakan ujung setelah diwarnai dengan biru
lengket, tetapi ada pula enzim coomassie yang ditandai oleh adanya
endonuklease restriksi yang pita. Hasil analisis protein bakteri
memotong membentuk ujung tumpul dengan protein tanaman jeruk kinkit
(Brown, 1991). DNA pUC18 (Sambrook dan daun jeruk siam dapat dilihat
et al., 2001) pada Gambar 3.

Analisis Total Protein Bakteri

Analisis total protein bakteri
dilakukan dengan teknik
elektroforesis menggunakan gel
poliakrilamid sebagai pemisah. Gel
poliakrilamid dapat memisahkan
protein berdasarkan massanya.
Protein dalam gel dapat dilihat
setelah diwarnai dengan biru
coomassie yang ditandai oleh adanya Gambar 3. Analisis Total Protein
pita. Hasil analisis protein bakteri E. Bakteri dengan Jeruk Kinkit dan Jeruk
coli JM109 yang mengandung gen Siam
CVPD r yang diklon pada pUC18 Ket: M (Marker Protein) Lajur 1,2 pWR27
(pWR27) dan pUC18 yang dipelihara Lajur 3,4 Jeruk Kinkit, Lajur 5 jeruk siam
pada sel E. coli JM109 sehat, Lajur 6,7 jeruk siam sakit. Tanda
Berdasarkan analisis protein panah menunjukkan pita protein tahan
tersebut, dapat terlihat bahwa CVPD.
protein khas terlihat lebih kurang 17
Protein khas terdapat lebih
kDa yaitu pada CVPD r yang diklon
pada pUC18 dalam sel E. coli JM109 kurang pada 17 kDa yang merupakan
(pWR27 ,sedangkan pada pUC18 tidak protein tahan terhadap CVPD yang
terdapat pada jeruk kinkit dan
terlihat adanya gen tahan CVPD
pWR27. Hal ini disebabkan jeruk
Hal ini disebabkan karena
kinkit mempunyai ketahanan terhadap
bakteri patogen mempunyai
kemampuan perlekatan pada sel CVPD. Perbedaan pembentukan
kloning, dimana untuk pertumbuhan molekul protein tersebut
kemungkinan merupakan reaksi
bakteri membutuhkan zat molekul
molekuler tanaman, pada jeruk siam
berupa unsur bahan organik yaitu
karbon, hidrogen, nitrogen, fosfor, sehat maupun sakit tidak terlihat
belerang, oksigen, ion anorganik adanya pita lebih kurang pada 17 kDa
seperti kalium, natrium, besi, sebab jeruk siam tidak memiliki
ketahanan terhadap serangan
ISSN 2302-2612 37
 Jurnal Agroknow Vol 1 No 1 Tahun 2013

penyakit CVPD. Akibatnya protein N. Omston. 1996 Medika

transpot ion sel tanaman akan Microbiology. Edisi 20. Buku
terganggu yang mengakibatkan sel Kedokteran EGC. Jakarta.
tanaman kekurangan mineral atau Setiawan, A. I. & Y. Trisnawati. 1999.
unsur hara tertentu (Setiawan dan Peluang Usaha dan
Trisnawati, 1999). Pembudidayaan Jeruk Siem.
Jeruk siam yang terserang Penebar Swadaya. Jakarta.
CVPD agar protein dapat berfungsi Sambrook, J., E. F. Miniatis, T. 2001.
dengan baik maka protein yang Molecular Cloning. A
berperan sebagai protein transpot Laboratorium Manual. 3nd. ED.
akan mengikat senyawa spesifik. Cold Spring Harbour Laboratory
Menurut Toha (2001) suatu senyawa Press, New York.
yang akan ditranspot harus berikatan Subandiyah, S. 2001. Bioteknologi untuk
terlebih dahulu dengan protein identifikasi dan deteksi patogen
transpot spesifik sehingga nantinya tumbuhan. Makalah Seminar
senyawa tersebut akan mampu dibawa Regional VPFI Komda Jateng dan
melewati membran. DIY di Universitas Wangsa
Menggala, Yogyakarta. 3 Pebruari
KESIMPULAN 2001.
Tjitrosoepomo, G. 1981. Taksonomi
1. Klon gen CVPD r dapat Tumbuhan. Bhratara Karya
diekspresikan dalam sel E. coli Aksara. Jakarta.
JM109. Toha. A. A. H. 2001 Deoxyribo Nucleac
2. Molekul protein yang dihasilkan Acid. Keanekaragaman,
dari klon gen CVPD r dalam sel E. Ekspresi, Rekayasa dan Efek
coli JM109 mempunyai besar Pemanfaatannya. Seri Biokimia.
molekul lebih kurang 17 kDa. Penerbit Alfabeta. Bandung.
3. Molekul protein dengan besar Wirawan, I. G. P. 1996. Molekular
molekul yang sama juga ditemukan Mechanism of Grown Gall
pada sampel protein yang diisolasi Tumor Induction by
dari jeruk kinkit. Agrobacterium Tumefaciens.
Graduate Course of Biochemical
regulation, Graduate Scholl of
DAFTAR PUSTAKA Agriculture Sciences Nagoya
University, Nagoya Japan.
Anonim. 1988. Ensiklopedi Indonesia. Wirawan, I. G. P., N. Arya., S.
PT. Ichtiar Baru – Van Hoeve Subandiyah. 1998. Isolasi Loci
Jakarta. Resisten terhadap CVPD dengan
Brown, T.A.1991. Pengantar Kloning Metode Transformasi
Gen. Alih Bahasa : Soemiati, Menggunakan Agrobacterium
A.M. Yayasan Essentia Medika. Tumefaciens. Laporan Riset
Yogyakarta. Unggulan Terpadu V. Kantor
Da Graca, J.V. 1991 Citrus greening Menteri Negara Riset Teknologi.
disease. Phytopathol 29 : 109- Dewan Riset Nasional. Jakarta.
36. Departemen of Microbiology Wirawan, I. G. P., & S. Subandiyah. 2000.
and Plant Pathology. University Penelitian Aspek Biologi
of Natal. Platermaritzburg south Molekul Penyakit CVPD
Africa. Tanaman Jeruk. Seminar Sehari
Gardner, E.J 1991. Principles of Genetic. Perhimpunan Fotopatologi
New York : John Wiley & Sons. Indonesia. Malang.
Jawetz, E. J. L. Melnik, E. A. Adelberg,
G.F. Brooks, J. S. Butel , and L.

ISSN 2302-2612 38