IENFINF MICROBIOL 2073 99 (4): 169-173, CCARACTENINICAS STRUCTURALES Y FUNGIONALES BEL VN Rota Escerefo Abraham Nog eménae? Madigal Paloma Guadaupe” ajar Guenero wae” ‘Gurmén Peres CrtionRicorda* Castaneda Achufigu Fatima Densct Caracteristicas estructurales y funcionales del Virus de la Resumen El origen del virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (ViH-1) ha sido polémico y de interés desde que esta enfermedad fue identificada a principios de los afios 80. Su origen se remonta a la transmisién a humanos del retrovirus que infecta a poblaciones de chimpances en Africa central desde hace aproximadamente cien afios, La intensas investigaciones nos permite disponer de un tratamiento antiretroviral que, si bien no puede terradicar la infeccién por el VIH, mantiene suprimida la replicacion viral incrementa el numero de linfocitos CD4+, disminuye la morbimortalidad, mejora la calidad de vida y previene la transmision sexual del VIH, Sin embargo, no es posible entender estos fendmenos sin un conocimiento detallado de la biologia del VIH-1 y os mecanismos due se han seleccionado en este asombroso agente para infectar una célula clave como el linfocito T CO4+ y ‘evacir la respuesta inmune. En este estucio se realiz6 una revision bibliogrtica sobre las caracteristicas estructu- rales-morfologicas, el ciclo vital, el tratamiento antiretroviral y algunos métodos de laborstorio para la deteccion interpretacion de resistencias del VIH-1 Palabras clave: Virus de a Inmunodefciancia Humane tipo 1, ttamiento antiretroviral, mecanismos de resistencia, genotvo, enotipo. Abstract ‘The origin of human immunodeficiency virus ype 1 {HI1) has been controversial and interesting since the disease ‘was identified in the early 80s, It dates back to human transmission of retroviruses that infect populations of chim- ppanzees in central Aftica about 100 years ago. The intensive research conducted allows us to have an antiretroviral regimen, while it cannot eradicate HIV infection, remains suppressed viral replication, increases the number of CD4 ++, decrease morbidity and mortality, improve quality of life and prevent sexual transmission of HIV. However, not is, possible to understand these phenamena without detailed knowledge of the biology of HIV-1 and the mechanisms that have been selected in this amazing agent to infect a cel key and CD4 + T lymphooyte and evade the immune response. So in this study we reviewed the literature on structural-morphological characteristics, lif cycle, antiretro- viral treatment and some laboratory methods for the detection and interpretation of resistance of HIV.1 resistance. Keywords: Human Immunodeficiency Virus Type 1 Aniretoviral Therapy, Mechanisms of Resistance, Genotype, Phenovype Introduccién El origen del virus de la inmunodeficiencia humana tipo _células Ty @ largo plazo se manifiesta por la susceptibil: 1 (ViH-1) ha sido polémico y de interés desde que esta dad @ enfermedades oportunistas. Los retrovirus contienen enfermedad fue identficada @ principias de los aios 80. su informacion genética en forma de ARN, incompatible Lo que se sabe es que el VIH es un virus perteneciente a con el ADN de la célula huésped. Pare lograr dicha com la familia Retroviridae, Este tipo de virus se caracteriza por patibiidad, se requiere de una enzima caracteristica de invadir el sistema inmune. El dafo al sistema inmune se los retvovius; transcriptasa reversa, El VIH pertenece al manifiesta mediante la destruccién de las células CO4 0 género Jentvinus, caracterizados por produit infecciones s cer Structural and functional characteristics Inmunodeficiencia Humana | of the Human Immunodeficiency Virus “Laboratorio de invastigacon y Desarala Fatmacéutea, Centra Ospartamento eobiologa, Divs Universitario de Ciencias Exactae Ingenieiss, CUCE!, Universi Universidad de Gusdoa, dad de Gusdalajer, Guadeljara, Jasco, México, Dierecion electronica Correapondencia: OF Abranam No’ Rosas Escarefo uadalaare Jalisco México. 163)164) AcTUALIO;DES con laigos periodos de latencia que conduce a un desarrollo tardio dela enfermedad, Estos virus se encuentran en diver 05 animales, tales coma gatos, ovejas, caballos y ganado. Sin embargo, a lentivrus més interesante en téiminos de la investigacién sobre los origenes del VIH es el vis de la inmunodeficiencia do los simios (SN). En la actualidad, se conocen dos vatiedades de VIM; tipo 1 [VIH-1) y el tipo 2 (VIH.2}. Filogensticamente, el VIH-2 yel VIS (vis de inmunodeficiencia en simios) tienen Luna similtud del 75% en su secuencia de sus nucleétidos, mientras que e! VIH-1 y VIH-2 tienen una similitud del 60%.! Se han encontrado tres genotipos del VIH-1: M (main, prin cipal), 0 (outer, atipico) y N (new, nuevo}, Muncialmente ppredomina el grupo genémico M, él cual se ha dividide en fonce subtipos IA, B, C, D, E, F G,H, |, Jy Kby en cepas recombinantes entre ellos, denominados CRF (formas recombinantes circulantes), Las CRF se forman por recom: binacian de fregmentos genémicos de distintos subtipos. Actualmente se han descrito mas de 30 CRF y su nimero 'e incrementa constantemente.? Estructura y morfologia del VIH-1 EIVIH es una pantcula estérica de 90 1201m de diametro que posee una bicaps lipidica que toma de la céluls huss. ped, cuya envoltura externa es une bicaps ipidica en la que Se insertan unes eapiculas formades por i glicaproteinas virales, gp 120 y gp 41, las cuales estén asociadas no cova- lentemente en la superficie del virion? El nucleaide central 0 nucieocapside, se refiore a la porcién central del vius, es una estructura tubular proteica ENFINF MICROBIOL 2012 88 (4): 103-173 {que alberga en su interior la informacién genética en dos ‘cadens idénticas de ARN. El material genético vital posee ‘wes genes estructurales (pol, gag, env] y sels genes regula- ores (nef, tet, rev, vp, wif y ypu). Adem, en el estado de provirus al genoma esté tlanqueado por Unas secuencias fopetidas largas (LTR, long terminal repeats}* que partic pan en a integracién del genoma vitico en el genoma dela ‘célula huésped y que contienen log elementos raguladores dela tanscripcién vital y de la poliadenlacién (figura 1}2 El producto de la traduceién del gen gag es la pol. proteina precursora Gag. Durante la traducci6n, el extreme amino terminal de esta proteina es miistiado, lo que desencadena su ascciacién con la membrana de la célula infectada, Durante la maduracinvirice esta proteina es pro- Ccosada por una proteasa codficeda por el gen pol dando lugar ala proteina de la matriz p17, la proteina de la cépside 24 y las protelnas dela nucleocdpside pB y p7. Ei producta del gen pol es la poliproteina Pol cuyo procesamiento da lugar las tres enzimas vircas: la proteasa (p11, la RT (p66) p51) y la integrasa {p32}, El gen env se encuentra situade ‘en el extremo 3” del genome y se expresa como una glico- proteina precursora Gp 160, que es proceseda por proteasas Ccolulares dando lugar a las proteinas de ls envuelts Gp120 (de superficie} y p41 (transmembrane). Los genes tat y rev por su parte coditican las proteinas regulacores, encargadas de actvar le transeripcion y promover el transport al cito: plasma de los ARN mensajeros (ARNm) respectivamente. Por uitimo, los genes vit, pt, ypu y nef codfican las pro: teinas accesories cuye funcion es partciper activamente en los procesos de localizacion nuclear del complejo de prein tegracion en ls maduracién y liberecion extracelular de los vittones (cusdro 1)° Figura 1 Genoma del Virus de la Inmunodeficiencia Humana Proteines estructuralen a Enzimaticas ee ioe ProteinasCuadro 1 Regiin genémica que codifca la proteina de la cépside. E| precursor es la proteina p55 miristilads, que se procesa a p17 (matriz), p24 (cdpside), proteinas p7 (nucleocépside) y p6, por la proteasa viral. Gag ‘sociados con la membrana plasmatica, donde tiene lugar el ensamblaje del virus, P17, Proteina que favorece el anclaje en la membrana y dirige al complejo de prentegracién hacia el cleo 24, Proteina de la capside 7. Proteine responsable del reconocimiento y la incorporacion del ARN al vrén y ademas interviene en Ia transcripcian inverse faciltandola 6. Proteina responsable de la incorporecién de ls proteina accesoria Vpr (producto de la traduccion del gen vpr) al virin en formacién y de Ie interaccion con la membrana de la célula que hace posible sgemacion Region genémica que cotiice @ las enzimss virles: protease, transcriptase reverse e integresa . Estes {enzimas se producen como une poliproteina precursora Gag Pol, que es procesada por la protease viral P10. Proteasa, actus cortando las piezas de las proteinas Gag, Pol y de ls Gag. Esta proteina escinde al precursor Gag. P15, ARNasa. Presente en la subunidad pB6 de la transcriptase reverse, cuya funcién es eliminar Ie pln- tila de ARN vital de duplex ARN/ADN, PI. Integrasa que realiza la inserci6n del ADN proviral en el genoma de la célula huésped. Esta realize tes funeiones: actividad exonucleasa, endonucleaca y ligaca PSI. Transtiptasa inverea cuya {uncién ala sintesis del ADN de dable eadena del provirus usando como patron la cadena singular de! ARN viral La proteina Env se encarga de la formacién de la bicapa lipidicay todas sus estructuras incluyendo a 72 ‘espiculas espaciadas formando las proteinas virales. Pdi: es un proteina transmembranal dentro de las espiculas de la membrana se encuentre relaclonada con la p120 para la fusion a la célula a invadit 120: son la cabeza externa de espiculas de membrana y se relacionan con la pd. Estas son las encar gadas de la fiacién alas células CD4, Proteinas reguladoras | Tat: ransactivador de la expresion génica del VIH. Uno de los dos factores virales esenciales reguladores (Taty Rev) para la expresion de genes del VIH, Rev. El segundo factor regulador necesario para la expresion del VIH. Encargado de twansportar selectivamente el ARNm completo hacia el citoplasmea Vi (p23): promueve ls maduracién y la infectvided de la particule vrics \Vpr (p15): facta la entrada al nicleo del complejo de pre-intagracién, \Vpu (p16): aumenta la iberacion de los vinones y promueve la degradacién de CD4 en el reticulo endoplasmstico, [Not (p27}: Proteina que se encarge de inducir la produccién de quimiocinas facilita la activacion de celulas T en reposo y desregular la expresion de la subpoblacion de Iinfocitos T cooperadores {CD4) y del complejo principal de histocompatibiided (MHC) clase 1166) Ciclo biolégico del VIH-1 Dada su nula capacidad de auterreplicacién, debido a que carece de ADN y otros organelos auxiiares en este proceso, es necesario que invaca una célula huésped. De ‘manera general, las células eucariotas que cuenten con los receptores CD4 y correceptores CCRS y CXCR4.” ET ciclo biologico del VIH- se dive en dos etapas bien diferencisdas: la primera etapa del ciclo comprende desde el reconocimiento celular hasta le integracion del ADN viral al ADN huésped. El reconocimiento celular esta directamente relacionado con la sensibilidad los receptores CD4 en un linfocito T4. La intersccién entre los ‘compiejos proteicos que se encuentran inmersos en le envoltura de! virus, estan compuestos por dos glucoprote nas (9p120 y gp} y cuando el gp 120 se une a los recep: tores de la célua diana, euniiado por los correceptores, es denominado acoplamiento, Esta unign origina un cambio cconformacional en gp120, que permite plegarse @ gpa e inserter sus termingles no polares en la membrane celular, Y.gp41 fusion la envoltura viral con la membrana cellar peimitiendo el ingreso y fragmentacién del nucleocépside dando paso la liberacién de las componentes virogenét cas-enziméticos.” Une ver liberado el ARN en e! citoplasma celular, la transeriptasa reverse comienza el proceso de retrotrans. cipcion (transformacién de ARN viral a ADN vial). Dicho ‘proceso incia en e! sitio activo de la polimerass, que trans- ‘otra el ARN vital en una cadena complementaria de ADN, dando origen a una doble hélice de ARNADN, Posterior: ‘mente, l sitio de la ribonucleasa separa la doble cadena de ARN-ADN eliminendo la cadena simple de ARN. Nueva: ‘mente o! sitio de la polimerasa sintetiza una secuencia con- senso la Secuencia simple de nucledtidos retratranscrita, formando una eadene itil de ADN viral. Seguidarente, la integrasa crea extremas cohesivos en la cadena de ADN viel, consecuentemente, la cadena de ADN viral es inte ‘arada al genoma de la célula huésped, finalizando ast la primera mitad de su ciclo bial6gico.* La segunda etapa dl cico biolégico del VIH-1 com- prende desde la biosintesis de los componentes viraies| hasta la salida de los viriones. La iniciacién de la trnscrip- cién del provirus, depende de factores celulares y virsles {que interaccionan con las secuencias reguladoras localiza ddas en ls region US de la LTR. Estos elementos colulares ‘50 unen al promotor vial y aumentan la expresion genética del VIF-I en respuesta a la estimulacién celular por dife- fentes mecanismos, como citoquinas exogenas, y perm. ton la formacién y activacién del complejo transeripeionel primario con la ARN polimerasa ll celuiar EI ARN generac {es procesado en el nicieo y transportado al citoplasme ‘con ayuda de la proteina viral Rey, donde se taduce dando las distintas proteinas viles, que visjan hasta los centros de ensamblaje para formar los nuevos viriones, que son liberades mediante un proceso de gemacién a través de la membrana plasmatica® Una enzima fundamental en la formacién de los vitones es la proteasa viral, enzima que provoca la tuptura de la poliproteina Gag en proteinas dela ‘cépside y nucleocapside (p6, p8, p17, p24} y de la polipro- leina Pol precursora de todas las enzimas virales del VIH-1 (protease, integrasa y transcriptasa reversa), La madura- ‘ién final de los viriones y el ensamblaje correcto de las proteinas virales se produce al final de ciclo infectivo. Este ‘compleje (ahora denominado nucleocépside) abandona la Célula llevandose consigo un fragmento membranal dando {in al proceso de ensamble y slid del virén figura 2)2 Figura 2 Ciclo biolégico del VIH-1Variabilidad genética La acumulacién de secuencias genémicas del VIH, tas la primera caracterizacion molecular en 1983, puso en evi dencia la extraordinaria diversidad de este retrovirus, Esta diversidad se genera, prineipalmente, durante el proceso de replicacion del genoma vial, @ través de los errores que comete la retrotranscriptase, y convierte al VIH en uno de los organismos descritas de mayor tasa evolutiva, Esta tase, entendida como la cantidad de cambios en el genoma por unided de tiempo, es el resultado sinérgico de una combinacion de factores, la recombinacign y la introduccién de mutaciones, que tienen lugar durante el proceso de retrotranscripcion Recombinacién Los retrovirus presentan un elevaco potencial de recom- binacién, debido a que este proceso constituye una parte iniinseca de su ciclo repicativo normal. La alta frecuencia de recombinacién homsloga observads en los retrovirus, es consecuencia de ls naturaleza diploide del genoma vitica, Para que la recombinacién homdiaga acute, se requiere la co.infeceién o re-infeccién de una eéiula por dos virus distintos y el empaquetamiento de dos genomas vinicos distintos en una misma paticula vial [heterocigoto)-°Este mmecanismo sirve para mediar la reparacién de genomas viales defectives, aumentar la diversidad viral y acelerat la propagacién de mutaciones ventajosae entre las cuasi especies virales. El potencial aumento de la varabilidad rmediads por la recombinacién confiere a los retrovirus la capacidad para responder ripidamente @ cambios de presién selectiva, bien sea inmunolégica o farmacolégica, mediante la répida generacién de las variantes més aptas para eludir esas presiones, al albergar el conjunto de muta- clones mas adecuado." Tasa de mutacién de la RT del VIH-1 Una de las caractetisticas més importante del VIH es su extraordinaria veriablidad genetics, debide @ que tiene un sistema de replicacion que comete un gran numero de errores durante la polimenzacion y a que no existen mecs: rismmos de correccién. La base bioquimica de la diferencia fen ls tasas de error entre los genes vires y los de la lula huésped, 6s a ausencia de un mecanismo eficiente de reparacion en las polimerasas ¥ retrotranscriptasas de los ARN vireles (actividad exonucieasa 2-5) razén por la cual los nucle6tidos incorporsdos por error (mutacion) no son eliminades. Diversas evidencias experimentales han demostrado que la transcriptasa reversa tiene una tase de ‘mutacin muy alta, en promedio de 1.4 x 10° errores por par de bases en cad ciclo de replicaci6n; en cada portador ol vitus se producen diariamente 10” viriones nuevas, lo cual favorece la mutacin de! misma.” Come consecuen- cia del proceso de mutacién, las poblaciones vrales no son idénticas, sin embargo éstas se encuentran genéticamente relacionadas; @ esto se le denomina cuesiespecies. Las cuasiespecies estén sometidas continuamente @ un pro: cces0 de competencia, variacion y seleccion que permite al virus adeptarse eficazmente al huésped." Virus aislados de lun mismo portador, son filogenéticamente mas proximos entre si, que con aquellas variantes de individuos no rela cionadas epidemiologicamente. Cuando estos provienen do diferentes portadores, la relacion entre los virus de una regién es directamente propercicnal al tiempo que el virus lleva presente en esa poblaeién yal numero de cepas que iniciaron su difusién, Si durante e! proceso de retrotrans: cripcion y antes de la integracién dos cepas diferentes del virus infectan una misma célula y los genomas de los pro- virus involucrados se integran en el ncleo, se produce una recombinacién que se expresa como una forma recombi ante citculante (CRF), Hoy en dia, mas de la mitad de los virus aislados son recombinantes, lo cual puede brindar mayor resistencia que las mutaciones puntuales."" La variabidad genética influye cirectamente en la respuesta de! tratamiento antiretrowral. Se ha demostrado que los distintos subtipos y CRF del VIH-T presentan una sensibildad distinta ante los watamientos entiretrovirales factuales, generada a partir de la ata capacidad adaptativa de! virus al huésped por as distintas actividades tarmaco: logicas que aiteran e! ambiente ordinario de replioacion. La presién ejercida por el farmaco en el tratamiento antiretrow ral genera una sustituci6n dela poblacin sensible al fmaco| por una poblacién resistente, sin embargo las poblaciones sensibies no se eliminan completamente y pasan a ser reser vorios. Conseouentement si exista un case dela presién del ‘armaco, ya sea por falta de adherencia al tratamiento @ por cambio del mismo, volverdn a predominar las poblaciones inicialmente sensibles." Distribucién geografica Se ha estimado mediante modelos mateméticos, que el VIH-1 surgié aproximadamente en los afios treinta en Africa En este continente, coexisten todos los subtipos del grupo sgenémico M (main), con predominio del subtipo C, poste: Formente, la infeccién por ViH- del grupo M se expands ‘mundiaimente. La infeccion del grupo O es menos comin: supone menos del 10% en Camerdn,” aungue se han des. caito ya casos en Europa y Estados Unidos. La infeccion del ‘rupo N se localiza en Africa Central - Occidental, mas con: ‘retamente en Camertin.™ En América y Europa predomina el subtipo 8, on la x Unién Soviétice el subtipo A, mientras que en el Sureste asiético precomina Ia forma recombinante AE, en tanto, al sur de Asia hay prevalencia del subtipo C y formas recom: binantes BC: sin embargo, 2 nivel mundial preciomina ol subtipo C."%Si bien el subtipo B predomina en América, texisten marcades diferencias en la frecuencia de sus formes recombinantes; por ejemplo, se observa que aproximada- ‘mente @! 20% de los afectados de todo e! continente rest dn en Brasil, del cual ms del 10% corresponde al subtipo Co ala forma recombinante BF mientras que el resto de 167168 Centro y Sudemérice, presenta una prevalencia de inteccion dol subtipo no B que va del 2 al 10%. En Nortesmérica, las infecciones por ol subtipo no B, representan sélo el 2% (figura 3)" Figura 3 Dishibucién geogréfica del VIH-1 me > Mc ma, ar Bac , oA ™@ > @ Sin datos Mine @ b,c, Tratamiento antiretroviral El principal objetivo de la terapia antiretroviral es reducir la carga viral (CV) a niveles indetectables en el paciente, es decira nivoles inferiores a 50 copias por miltro en unlapso do 24 semanas de iniciado e) tratamiento, y usar come ‘minimo tes diferentes férmacos en mado simulténes con objetivo de atacar diferentes blancos y en consecuencia fbtener una mayor eficiencia fermacoldgica, (Department of Health and Human Services, 2012) 2 Los antietrovirales (ARV) actuales no eliminan ol virus VIH-1 del organism huésped, sino que actian en diferentes estadios bioldgicos limitando su replicacién y asi ‘mismo evitan el deterira del sistema inmune del paciente. Seha observado que los sujetos infectacios generan mayor resistencia cuando son tratades con una sola clase de ‘armaco (monoterapia) sin embargo, la resistencia a dos ‘0 mas farmacos de distinta clase es menos probable. La terapia antiretroviral combinada es eficaz enol tratamiento del VIH sin importar el subtipo del cual se trate, sin embargo la resistencia ante los farmacos difiere segin la vanante del virus. Una terapia antirreoviral de gran actividad (TARGA) combina tres a mas clases de farmacos que actuarin en dlistintos estadios biolégicos del virus en el huésped, y por lo tanto posee una mayor eficiencia terapéutica Inhibiclores de la fusion y de la entrada La inhibicion de los mecenismas de entrada y fusion del VIH-1 8 los linfocitos CD4 constituye una nueve estrstegia en el ta tamiento entiretovial; los inhibidores ce la entrada actuan bloqueendo el corteceptor CCAS impidiendo la entrada de! vitus la elu, los virus con tropismo dual (CXCR4-CCRE) y los CXCR4 son resistentes @ este tipo de férmco, en cambio los inhbidores dela fusién se unen al dominio HR del gp inibiendo el cambio conformacional de esta glucoproteia, feitando asi le fusion entre la envolture del virus y la mem: brana de las células CD4.*Este ito ha demastrado efcien- ‘ia en el tratamiento de pacientes altamente pre-tratados con fracaso virolégico y mulrresistentes. Sin embargo, la gran tivetsidad (20-40%) en la region enw, pronostica que este crupo de férmacos tendrén una probabiided de desarrolar resistencis natural y emergente, Inhibidores de la transcriptasa reversa Ls transcriptase reversa esté compuesta por dos subuni ddades denominadas p66 y p51. El sitio soto de la enzima se encuentra en la subunkled p65 formads por el dominio ppolimerasa unico al dominio ARNasa, Esta clase de térmacos se clasifican en dos grupos con base en sus carscteriticas|moleculates que determinan su mecsnisma de accién: fos infibidores do I wanscriptasa inverse andlogos de nucles- sidos 0 nucledticos (IAN) y los inhibidores de la tanscrip- tesa inversa no anélogos # nucledsidos (/TINAN). Los ITIAN paseen una estructura similar a los nucledsidos naturales ¥ como éstas, necesitan estar tifastonilados por una fos- foquinasa para ser biolégicamante activos. Una vez fosfo- rlades compiten con los dNTP para ser incorporados a la cadena de ADN sintetizada por la transcriptasa reversa; al carecer de Un grupo hidtoxilo en la posiciin 2 del azicar interrumpe el procese de sintesis y los nuevos nuclestidos fo se unen a la cadena de ADN sintetizada.” En cambio los ITINAN no requieren activacion metablica; no se incor poran ala cadena de ADN en formacién, en su lugar se tunen de forma no competitiva a un sitio cereano al centro catalitico de la enzima, una regién hidrofébica de la subu- nikdad p66. La unin produce un cambio conformacional en la enzima imposibilitando la palimerizacién del ADN. Estos farmacos son inutiles en el tratamiento de la nfeccién por VIH- subtipo © y contra infecciones del VIH2. Algunas ccepas del subtipo F muestran una mener sensibiidad a estos farmacos.™ Inhibidores de la integrase La integracion cromosémica del AON viral en el genoma del huésped es una etapa crucial en le replicacion del \VIK-1, Esta clase de férmacos evita la integracion del ADN virel en el genoma de la célula huésped y no tiene ninguna accién sobre la enzima que lieve a cabo este proceso. Sin embargo, la gama de farmacos utiizados para este props: sito es muy limitade Inhibidores de la proteasa Estos farmacos se unen selectivamente al sitio activo de la protease, compitiendo con sus sustratos naturales gag 'y gag-po! dando como resultado la formacien de particulas vireles inmadures, y por consiguiente no infecciosas, pat cularmente se habla de [a inhibicion de le aspartproteasa dol virus que es esencial pare le catalisis proteica.”” Fracaso terapéutico El fracaso de un régimen antiretroviral se define como el incremento de las concentiaciones de ARN viral en un paciente en quien no se detectaba previamente el vius, pesar de un tratamiento ininterrumpido por ese régimen, (Depantmment of Health and Human Services, 2012). El fracaso clinico ccurte cuando el paciente sufre alguna enfermedad oportunista exceptuando cuando ésta se desarrolia entre los primeros 38 meses de tratamiento fen pacientes con inmunosupresién avanzada, Un fracaso inmunolégice refiere que en un periode de entre 4 y 7 afios no se logra mantener un recuento de células CD4 superior a 350.500 x ml, o cuando no se increments ol recuento de las rmismas a niveles que van de 60-100 sobre el recuento basal al lograr Ia supresién virolégica, En cambio, un fracaso viro- legico ecurre cuando la carga viral es detectable despues dde 24 semanas de tratamiento, o bien después de haber logrado niveles indetectables ("50 copias por mitra} ‘estos aon nuevamente detectades en dos determinaciones| consecutivas; sin embergo, pueden ser detectedas carges ‘ales inferoces 2 1000 copies por mili, y esto no siem- re 08 0 Ser sindnima de un facaso vrolagien; cuando esto sucede no es recamendable alterar e tatamiento en curso, pero debe aumentarse la vigilancia sobre el paciente.” Implicaciones clinicas El subtipo 8 del VIH-T tion una mayor incidencia en paises desarrollados, motwo por el cual, en general, los métodos de diagnéstico, desarrollo de terapia ARV e investigacion estén encaminados @ este subtipo. La alta tasa de muta cian del VIH puede generar diferente sensibilad a cistin tos farmacos, y por consiguiente distintos. tratamientos para cada variable del VIH. Los métodos de diagnéstica se ven afectadas por estas variantes del virus, pues segun studios realizados, un método de diagnéstica para el subtipo B puede resultar en un falso negativo pare un sub- tipo no:B, por lo cual es importante incorporer técnicas de diagnéstico especticas para subtipos no-B. Algunas téc: ricas moleculates de cuantiicacion de carga vial utiizan primers (secuencias especticas complementarias al AON, viral de entre 18 y 25 bases}, que estén disefiados espe: cificamente para secuencias cel subtipo-B, y al aplicarlas 2 un subtipo no-8, existe la posibilidad de no hibridar en el genome del vius y por consecuencia, erraren e! disgnds: tico y futuro tratamiento. La respuesta ante el tratamiento [ARV es cistinta entre diferentes subtipos del VIH-1, debido 8 que cade varinte presenta distints sensiblided & ls pre: sién de! féimaco, par ejemplo, os ARV ITINAN ofrecen una bala actividad frente al grupo VIH-2, 0 una total ineficiencia fn el grupo O del ViH-1." Métodos de laboratorio para la detecci6n de resistencias e interpretaci6n de resistencias Debide a la resistencia farmacolégica presentada en algu: os individues bajo tratamiento ARV se tuvo la necesidad de disefiar métodas o técnicas que ayudaren a detectar las, rmutaciones, esto para modificar el tratamiento en curse Existen das meétodos basieos utiizados para determinar la resistencia de cepas de virus frente a los férmacos ARV'S; gonctipiticacién y fenatipficacion.® La genotipficacion es | método que se basa en el andlisis del genoms del virus pare identificar mutaciones presentes asociadas con la ineficiencia terapéutica a los ARV. Es un marcador indirecto de la resistencia e identifica Imutaciones antes de ser expresadas, es un proceso simple yrépido, menos complejo técnicamente, y mas econémico comparado con la fenotipificacion." Este ditimo es un método directo y cuantitativo de sensibilidad a uno 0 més ‘armacos, a partir de la concentracién de férmaco nece- seria para reducir la replicacién del agente patogeno. La resistencia fenotipica se expresa comparando el aumento 169170 de la concentracién de férmaco para inhibir el agente paté- ‘geno, comparade con el virus de relerencia (ld ope}, por el aumento del C50 0 de ICQO. Las veces que se haya incrementado la dosis durante el proceso, define le resis- tencia fenotipica. El proceso es lento (minimo dos sema- nas para obtener resuitados), técricamente complejo, de {ci intorpretacién y permite identifiar resistencia a uno (0 mas fatmacos que actdan en la misma diana terapéutica (eesistencia eruzad).” Genotipificacién (interpretacion) La interpretacion de un genotipo requiete de un cono: cimiento profundo de como y 3 qué nivel afecta cada rmutacién en e! tratamiento ARV en curso 0 proximo a ‘administrar. Existen tres métodos de interpretacion del genotipo: fenotipo virtual, elgoritmos informticas y con- sulta de un experto o especialista en el area, El fenotipo virtual se basa en e! anélisis compare: tivo de la secuencia de interés con una base de datos que Contiene codones de resistencia identificedos y su impacto ene! tratamiento. Estas bases de datos se actualzen perio: dicamente debido @ le alta tasa de mutacion de! virus. Los algoritmos informéticos son estrategias de interpretacion de Fesistencie cualtatva, baséndose en la presencia de patro- nes de mutacin en ei genotipo e indican sila resistencia es posible, presente o ausente. En ocasiones estas herramien- tas no son suficientes pera una adecuada intexpretacion de las mutaciones que presenta, por ello es necesaria la intervencién de un especialista en el area para que el diag: néstica sea preciso y por ende se esclarezcan las dudas que dificutan el diagnostic. Cuando ee efectian ambas métodas en una misma ‘muestra, se obtienen resultados discordantes en la meyorla de las ocasiones; esto debido a diversos factores que inter vienen en ello. Entre cichas factores sobresaien los errores {éenicas en is fenotipficacién que no permiten identifica la existencia de mezcias genotipicas. La presencia de mutacio- nes transicionales que no sen identificadas par el fentipo, ‘mas si por ol genatipa. Mutaciones antagonistas, que aur que ce genera resistencia a un farmaco, causa hipersensib lidad a un segundo, pero existe la posibiidad de que en éste ‘se presenten mulaciones de resistencia indetectables par el {enotipo. Existen mutaciones que no pueden ser detectadas fen la genotipficacion; este debido a algunos algontmos de interpretacion que no consideran ciertas mutaciones rlacio- hhadas con la resistencia, pero que su efecto si puede ser detectable con un métedo fenatipico, Los patrones comple- Jos de un genotipado dificltan su interpretacion a causa de informacion incompleta sobre mutaciones secundarias. ‘Ambos métedos, aunque uiiles para la deteccién de la resistencia, comparten algunas limitaciones como la dificultad de deteccién cuando la poblacién mutada es inferior al 20% de la poblacién viral total, ola CVP = 1000 Ccopiasiml, Gracias & los avances cientficos y a la inves- tigacion latente en esta érea, se ha logrado superar esas limitaciones aunque estos adelantos no formen parte de la técnica mas utlizada por las restriciones econémicas que representan Resistencia del VIH a los farmacos antirretrovirales Una resistencia es el decrementa en la actividad inti ‘seca del férmaco antiretroviral debido @ una modificacion fen su diana biolégica, a consecuencia de un mecanismo de adaptacién viriea, Una vez presentada la resistencia a tratamiento ARV en curso, es necesario identiticar ante ‘ual 0 cusles farmacos se ha desarrolado esta condicién, siendo clave para una modificacion en el tratamiento. La deneracién de resistencia en los férmacos ARV actusles varla entre téxmacos de distintas familias @ incluso entre farmacos de una misma. Segin la sensiblidad a la rests tencia a les farmaces, éstos pueden clasificarse como far ‘macos de baja barrera genética y férmacos de alta barrera genética, Los férmacos que poseen baje berrera genética piercen su activided intrinseca con una sola vatiante de ‘mutaci6n, por ejemplo algunos ITIAN @ ITINAN pueden totnarse ineficientes con s6lo un cambio de nuclestida en 1 blanco biolégico, en cambio aquellos que presentan alte barrera. genética, fequieren de miltiples mocificaciones genémicas en e! sitio de accién, tal es el caso delos IP que presentan una buena barrera genética, pues requieren cos ‘mutaciones primarias y dos a tes mutsciones secundarias para perder su efecto debide a que la proteasa viral puede ‘ular en diversas posioiones sin perder su actividad enc mtica.** Asi mismo, la generacion de resistencia se ve propiciada por problemas en la adherencia, potencia y en la farmacocinética del ARV, Mecanismos de resistencia Los codones que confotman el genoma estén compuestos or tipletes de nucledtidos que codifican pare un ami ‘noScido especifica, cuanda uno de estos codones sufte luna mutacin, es decir, cuando un nucleétide especifico 5 sustituide por otto, posiblemente se codticaré para un ‘aminodcido distinto el determinado. Al codén resultante © ccausente de dichs permutacién se le conoce como codon de resistencia, De acuerdo con el aminoécide temple 2ado, sera la nomenclature de le mutacin iniciando con la let espacitica que identifica al aminodcido de secuencia wild type, posteriormente se coloca el numero que indica la posicién del codén en el genoma pare conclu con la letra correspondiente al aminoacid reemplazante, Resistencia a inhibidores de entrada La resistencia a este tipo de férmacos es causada por Inhibicién, ya sea de la union vitus-céula, dela interaccion ccan el co-receptor, asi como de la fusion celular, donde la participacién de|as glucoproteinas gp 120 gp 41 es indi pensable, La gran plasticidad caracteristica de la gp 120 Se ve reflejada en el imitado nimero de mutaciones que ‘afectan ala union del vius a intocito CD4* La resistencia a este tipo de farmacos es conse- cuencia de la modifcacién en la glucoproteina gp 41. Se han detectado mutaciones de resistencia presentes en los ‘cadones con posicion 36-40, y 42-45 de la porcién HR de festa misma glucoproteina, en especial las mutaciones G36 DIS, IST, VaBAIMIE, O39R, Q40H.NAZT Y N43D generenresistencia a enfuvirtide."” Existe evidencie de que las, Imutaciones en la region del asa V3 y en las ragiones \2, C3 VA de la gp 120, asi como de la gp 47, también gene: ran resistencia, pero en este caso se refieven a un fracaso terapéutico a maravioc, farmaco considerado antagonista del co-receptor CCAS, La presencia de mutaciones permite que el varus pueda unirse 8 CCRS, aun con maraviroc pre sente, dando lugar @ un antagonismo no campetitvo, y de esta manere disminuyendo la sensibilidad del organismo al antiretroviral. Resistencia a inhibidores de la transcriptasa inversa, analogos a nucledsides/ nuclestidos Los ITIAN necesitan ser fosfotilados para ser incorporados fn la cadena de ADN en formacién, Uno de las mecanis: mos de resistencia ante esta familia de férmacos es la pirofosforoisis, que consiste en la remocién de los TIAN Incomoredas mediante hidiolisis; la tanseriptasa reverse ‘muteda permite el acercamiento al andlago incorporado de ATP que ataca el enlace fosfodiéster que une al ITIAN a la cadena de ADN. Este tipo de resistencia se da por muta clones asociadas a timidina (TAM). Otro mecanismo de resistencia es dado por impedimentos estéricos causedos, por cambios estructureles edyacentes al sitio catalitico de la trenscriptasa reversa, permitiondo a la enzime diserimi- nar a los ITAN e incluir@ los sustratos necesarios para el tensamble de ia cadena de ADN vial, jemplo de este tipo de mutaciones es el complejo O151M, un conjunto de ‘mutaciones que brindan una resistencia contra la mayorla de los ITIAN; la primera de estas mutaciones ocurre cerca de! sitio de unin del ITIAN y lentamente se van generando mas mutaciones que incrementan la resistencia vital, este complejo es raro en el VIH-1.°® Resistencia a inhibidores de la transcriptasa inversa no andloges a nucledsides Los farmacos de este tipo se unen a un sitio hidrofébico cercano al centro cataltico de la enzima, donde mediante luna unién alastérice efactua le inhibicidn. Cabe destacar que a diferencia de los ITIAN, este tipo de férmacos no requieren de activactin celular, sdemas de que actdan inhi biend Ia actividad de la enzima dicectamente. La mayorla de las mutaciones de resistencia a astos ARVS se encuen ttan en al sitio hidrofébico donde afectan la unién de! far rmaco y surespectiva diana; una sola mutacién eneste sitio puede generar alto nivel de resistencia a los ARVS de este tipo, dependiendo de le modalided dela terepia en que se administra este farmaco." Los ITINAN de primera generacién presentaban tune baja bartera genética ademés de resistencia cruzada, siende las principales mutaciones L1001, K103N, VIO6A/M, ‘V108}, Y181Ci, ¥182L.y G190AVS que generan MOR (mult ‘rogoresistencia) @ NVP y EFV, Debido a este fracaso terapéutico surgieron los ITINAN de segunda generacion, que presentaban shore lune mayor barters genética debide a las modificaciones en su flexiblidad molecular que factite su adaptecién a este medio aun en presencia de mutaciones. Pare generar resistencia en esta nueva generacién se requiere de tres © mas mutaciones de las hasta ahora 17 klentiicadas: CCARACTENINICAS ESTRUCTURALES Y FUNGIONALES BEL VIN 80), ABEG, L1001, KIOTEH/P VI06i, E1385A, VI7ED/FT, YIBICIN, GIS0S/A y M2301, mismas que son identifica. das mediante métodes genetipicas auxliados de algont- mos para la deteccion de resistencias. Resistencia a inhibidores de Ia integrasa Lis enzima encargada de incorporer el ADN viral al de! hues: ped est conformada por 288 aminadcidos, codificade por {21 gen pol. Hoy en dia se dispone de dos tatmacos capaces de inhibi a funcién de esta enzima (raltegravir y elviteges- vi). Diversos estudios demuestran la resistencia cruzada centr raltegraviy elvitegravir y a baja barrera genética que los caracteriza, xisten dos esténdares principales de resistencia a inhibidores de la protessa, en los codones de la posicién 148 y 155, distinguidos como le ruta de Q1ABHIKIR y a de NIS5H. Ambos patrones incluyen mutaciones secundatias L74M+E138A y E198K © G140S para O148H/KIR; siendo la combinacién mas frecuente Q148H.G140S que produce una disminucién (hasta diez veces) en la sensibilidad al férmaco.® La ruta 0 mutacién primatia NIS6H incluye a L74M, 920, TO7A, £920 + T97A, YASH, GI63K/R, V1 110 D232N lunque en ios estudios realizados se encontr6 evidencia para la determinacién de un tercer pattén conformado por Y1a3RIC-+L74All, TS7A, 203M, S230R. Resistencia a inhibidores de la proteasa Estos ARVS poseen una amplia barrera genética por lo que para que presenten resistencia se requiere de tres @ mas Imutaciones, Dicha resistencia se ve generando de manera lenta y secuencial segun van apareciendo los cambios. Exis- ten mutaciones primarias que afectan los codones 30, 32, 46, 47,48, 50,54, 76, 82, 84, 8By 90, y mutaciones secunds- tias en las codones 10, 20, 24, 36, 63, 64,71, 77 y 93 Las mutaciones primarias son especificas de cada farmaco y aparecen de maneta répida tras la presion que ete ejetce de manera selectwva, Requieren de un aumento el férmaco para poder surtr efecto, debido = que dichas mutaciones causan una disminucién en la afinidad del mismo por su diana biolégies. En presencia de la terapia con IF las cepas resistentes suelen aumentarse en relacién| 4 las vatiantes salvajes; mientias que en ausencia de Ia presién del farmaco suelen encontrarse en minoria, siendo las variantes wild type las cepas dominantes, Cabe desta- ‘car que las mutaciones primarias no generan resistencias ‘ruzadas entre los diversos IP Las mutaciones secundarias son congecuencie de la existencia de una © varias mutaciones primatias. Que aunque se presenten lejos del sitio activo de la proteass, al sumarse estos errores replicativos, se eleva el grado de resistencia y la capacidad de reproduecién del vitus, por lo que podemos destacar una importante resistencia cruzada Debido a esto, la més alta resistencia del virus hacia los [ARV se asocie con el tracaso terapéutico de los férmacos mas utlizados en le terapia antiretroviral, los inhibidores de la proteasa™ Las mutaciones en los codones 23, 82, 84 y 90 son enominades erteneamente mutaciones universales de rmulttresistencie a inhibidores de la protease, puesto que 171172 existe evidencia de que algunas de las mutaciones no api ccan de manera general como posible resistencia a los I; fen ol casa de la mutacién 33F no tiene relevancia al menos para JI y s6lo genere un bajo grado de resistencia Mecanismos de resistencia a nivel celular La tesistencia ante ARV no solamente es producto de mutaciones gendticas del virus, algunos cambios fisiold icos de las edlulas infectadas dificultan o impiden que @l farmaco llegue a su sitio de accién. 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