REPLICACION DEL ADN Pablo J. Patitio MD, MSc, Dr. Sci ', Maria Teresa Rugeles L, Bact, MS, Dr. Sct: ' Profesor Asociado, Grupo inmunodeficiencias Primarias - Corporacién Biogenesis, 2 Profesora Asociada, Grupo Inmunovirologia Corporacién Biogénosis Faculiad de Medicina, Universidad de Antioquia Introduccién Elmodelo dela dobleélice de ADN propuesto por Watson y Crick permitié suponer un mecanismo para la replicacién del ADN, e! cual fue demostrado posterior- mente por medio de los experimentos realizados por Mathew Meselson y Franklin Sthal a finales dela década de los cincuentas, Para ese momento existian dos hipéte- sis que explicaban la replicacion del ADN, Una era la replicacién semiconservativa, en la que la doble hélice se bre y cada cadena sirve como molde para la sintesis de una nueva cadena; de este manera, la mokécula nucva de ADN quedaba compuesta por uns cadena vieja y wna nueva complementaria a la otra (Figura 1A). La otra hipétesis «ra a replicacion conservativa, en la que de alguna forma se copiaben ambas cadenas de ADN y las molécules re- cién sintetizadas constituian la nueva doble hélice (Figura 1B). El experimento de Meselson y Stahl que demostré la replicacién semiconservativa (Figura 2), consisti en ere cer bacterias en un medio de cultivo que contenia nitré- geno 15 ("N), un isStopo mas pesado del nitrégeno, el cual es incorporado en las bases de la molécula de ADN. Lego se permitio que estas bacterias tivieran un ciclo de replicacion en presencia de "*N (tomo de nitrégeno me- ‘nos pesado), Posteriormente ve purified el ADN becteriano ysse sometié @ centrifugacién, De esta manera, se podria separar él ADN en tres fracciones diferentes: una inferior ‘mas pesada constituida por ADN con *N, una intermedia que contenia ADN conformado tanto por '*N como por N y una superior de ADN con solo “N, El resultado ‘obienido después de un ciclo de replicacin fue una sola ‘banda intermedia, lo que indicat que el ADN de las bac- terias que se originaban despues de un solo ciclo de replicacién contenia tanto "N como !°N, lo cual solo era explicable por el modelo de replicacién semiconservativa Después de varios ciclos de replicacién en presencia de MN se continaeba obteniendo la fraccién de menor peso, to cual confirmaba que la replicacién del ADN era semiconservativa A continuacién se haré una revision de los eventos moleculates relacionados con el fendmeno de teplicacién del ADN, el cual es fundamental para explicar la permna- rrencia y transmisi6n de la informacién genética en todos los sistemas que hoy en dia se consideran como organis ‘mos vivos en la tierra Sitio de origen de la replicacion La replicacién del ADN depende de la existencia de sitios ‘especificos en el genioma que permiten Ia apertura de la Goble hélice y €l ensamblaje de toda la maquinarie ‘enzimética para le copia de les nuevas hebras de ADN. (Figura 3). Aunque se han descrito varios tipos de sitios 119A) 8) s+ fidi di Figura |. ipdesisaltemativas para explicar ta repicacion del ADN. A. Una posbiidad la constiuia ef modelo de replicacion semicenserativa, segin cl cial ln dable hélce se abre y cada eadera sive come melde para Is sinesis de ura cadena nueva artiparacla. B. El modelo alter correspondia a uta repsociie conservative, en la que de alguna forma se copisban amas caderas Je ADN yas roldculas rein sntizadss se tule iuego para conformar una nueva doble helice EM Conservative ‘Semiconservativo Dispersivo. Primera ae seseso yoaCaO weg Serge Bester PS SOBOSO SSSR joan on nn roonse TT Saess Figua 2. La repleacin semicoservava se compro gracias al experimento de Mesekion y Stahl. ste conssti6 en crcer bacteria ficarreme ‘en un medio de eutivo que canenia "N, lego de lo cial esas bacteriae tuvieon un ciclo de replcacin en presencia de "N, Pesteriormene se purified el ADN bacterino y se someié a ceiifugasion, Iv cual perma separa el ADN en tes facclones dierwes: una infeior mas pesade ‘consituida por ADN con "N, ana intermedia que cotenia ADN confermado tanto por "N como pot "™N y una superior de ADN con sol "N. Puesto ‘qu después deur cei de repiciibn sol sbtuvo una banda rtermedia ke demote quest ADN ce at mevas bacteria ena un slo tipo de dable hice conformada por cadenas vias y reccate. Una tercera alterrativa, models diapersiva, en el cual ae distibuiaaletoramerte el ADN _mareado con 'N se desea porgue en el segundo ciclo de replicaion sto se evidenciaron ds kandes: una de moléeuaslivianasy ota de moléeulas {de peso intermedio, de origen de la replicacién en los gonomas de distintos Segundo, dichas secuencias repetidas son reconocidas ‘onganismos, ellos comparten varias caracteristicas. En por proteinas especificas de unin a sitios de origen, las primer lugar, los sitios de origen son segmenios de ADN cuales son necesatias para permitir que se ensamble la pParticulares que contienen secuencias cortas repetidas. _ADN polimerasa con toda la maquinaria de replicacién, 120Tercero, las secuencias repetitvas cortas son ricas en adeninas y timinas, lo cual facilita el desenrotlamiento de la doble hélice debido a que se requiere menos energia para desestabilizar el apareamiento entre A y T que entre GC, Una vez la doble helice se abre y se une toda la aquinaria enzimética se forma una estructura conocicla como horquilla 0 vértice de replicacién (Figura 3A), En EB. colt el sitio de otigen de la replicacién del ADN consiste de 245 pares de bases y ha sido denominado oriC. Cualquier ADN circular, entre ellos los plismidos, que contengan secuencias oriC son capaces de iniciar y realizar la replicacién en presencia de la maquinaria senzimética de la E, coli, Al comparar el oriC de £. coli con secuencias de inicio de otras bacterias se descubrié ue estas regiones contienen un segmento repetitivo de 9 pb (nanémero) y secuencias repetitivas de 13 pb ricas en AT (13-meros), los cuales son sitios de uni6n de la pro- teina DnaA responsable del inicio de la replicaciéa (Figu- 1a 3B), Por su parte, en los organismos eucariotes, parti- ‘cularmente levaduras, se ha demostrado la presencia de elementos de ADN similares denominados Secuencies de Replicecién Auiénoma (ARS) (Figura 3B) que tienen alk rededor de 100 pares bases de longitud. Los cromosomas de una levadura poseen cerca de 400 secuencias de replicacién auténoma, de tal forma que la duplicacién del ADN puede iniciarse en todos estos sitios. Estudios en células normales y mutantes de levadura indican que la replicacidn se inicia después de que las proteinas denomi- nadas complejo de reconocimiento del origen (ORC) se tunena las ARS, aunque se requieren otras proteinas para que la replicacin tenga lugar Extension de la replicaclon Una vez oeurre el reconocimiento de los sitios de origen de replicacién, se inicia y prosigue la polimerizacién de la nueva cadena de ADN. Sin embargo, existen algunas di- ferencias en la extension de la replicacign dependiendo dela estructura del genoma que se va a duplicar: La mane- 1a mis sencilla como se duplica el ADN se presenta en el ‘genoma lineal de los virus, como por ejemplo en los adenovirus. En este ADN, la maguinaria de replicacién sintetiza una sole cadena a partir del punto de origen de replicacién, que se encuentra en el extremo del ADN li- A) Proteinas do Heli unién al DNA Iniciador: — on ori or of Cebador RNA Sintais da exbasor RNA, Taine earlier Formacion de te peeing 321 ONAporla dos hrqutas einiceson else Go fepheaoon 8) Origen Bacteriano de Replicacion fl 1 2 sa GATCTNTINTATT 201 240 ‘Seouencias de Replicacion Autonoma (ARS) en levaduras 19 B3 sn Figura 3. A Sito de argen de la replicacin del ADN, el cual se abre pura permtir I unin de soda la raguinara necesara pra rear fa copa de lag eadenas molds. B. Tanto en procarotes come cr ewcaritesexisiensccuencia especies pars el inicio de la replcacén del ADN En ambos lipoe de geen ot sitio de crigen de repicsibn conten soeucncis rpeiivas rises en mucledtied de Adenine y Tinian 121neal, 0 sea que ocuure la sintesis unidireccional de una sola cedena; por lo tanio 5 necesario que existan dos sitios de origen de replicacién para poder replicar todo el ADN, uno en cada extremo de la molécula. (Figura 4). ‘Una segunda forma de replicacion consiste en la forma- cién de una sola horquilla de replicecién que permite la sintesis simultdnea de las 2 cadenas de ADN a medida ‘que se desplaza la maquinaria eplicativa; sin embargo, el desplazamiento es en una sola direecién, y por lo tanto la duplicacién de la molécula completa de ADN solo ocurre cen esa direceién. Fsta forma de replicacién se ha descrito «en varios plismidos bacterianos (Figura 4B) Finalmente, Ia forma mis frecuente de replicacién, tanto en eucariotes como en procariotes, consiste en que a par tir de un sitio de origen se forman 2 horquillas de replicacién, las cuales se desplazan ea direceiones opucs- tas y permiten la sintesis simultines de ambas cadenas de ‘ADN. En las moléculas de ADN circular (plasmidos, bac- ferias y algunos virus), por lo gencral es suficiemie con que exista in solo sitio de origen de la replicacién, a partir del cual se forman 2 horquillas de replicaciéa, una en cada direccién, las cvales se encuentran en el lado opues- to del efreulo cuando se completa la replicacién (Figura 4C), Bste tipo de replivaciéa se evidencié por medio de 2 Crganes 2 Terminations ‘microscopia electronica, pues es posible visualizarlas de- ‘nominadas burbujas de replicacién en el ADN, las cuales se forman en los sitios de origen y crecen en ambas di- La replicacion completa del genom circular dela bacteria E. coll tarda alrededor de 42 minutos. Puesto que este ‘genoa tiene un poco mis de 4.639.000 pares de bases, se hha calculado que cada horquilla de replicacién, de las dos ‘que se generan en el sitio ori, debe moverse a una veloci- dad aproximada de 1000 pares de bases por segundo, Por ‘suparte,€] genoma de una célla humana se duplica aproxi- ‘madamente en 8 horas y se han obtenido datos que indican ‘que la velocidad de desplazamiento de cada horquille de replicacion en estas edlulas es de unos 100 pares de bases por segundo, por lo tanto deben existir alrededor de 1000 sitios de origen para cubrir todo el genoma, Sin embargo, diferentes experimentos indican que pueden existir entre 10,000 y 100.000 unidades de replicacién (ceplicones) en lun genoma humano, cada uno de los cuales es activo solo darante una parte de las 8 horas de la replicacién, Se ha caleulado que cada replicén en los cromosomas de eucariotes varia entre 15 y 100 mm de longitud (50-300 kilobases) de forma que, al microscopio electrénico, se pueden observar multiples burbujas de replicacién. Figur 4A. En los genomas de ADN lineal, como per semple slgunos sins, la repicavion se origina en cada enremo de It moléula de ADI, 0 sea que saa cadena se stttea de forma unidrecciona, ruses ans a ‘4 ox _—_— a Molbculas: © Cae aoe Figur 4D, tn algun moliats de ADN cic, come Io son ls plismidos, se forms una sola nerglla e replicon gue pemit fy Sitesi nese Ia cadena de ADN nae een, on ese cao la dplacén dela moéculaconplda de ADN ocu en et Sires, 122 Figura 4c. En la gran mayora Ge fos genom a replicacona partir de Ur ato de crigen se forman 2 horquilas de repicacio, as cuales se desplaan en crecienes spueene y permit nace cimuinen de ambas cadena de ADN.Mecanismo molecular de la replicacion delADN Los mecanismos moleculares de la replicacién del ADN hhan sido entendidos gracias a los estudios realizados con la bacteria F. coli, y ahora que se conoce la estructura y funcion de una gran diversidad de genomas eucariotes es evidente que le replicaciénen estos organisms se realiza por proteinas andlogas y ocurte gracias a. reacciones si- milares, Por lo tanto, se hard una descripcion de To que ccurre durante la replicacion en £. coli se especifica- ran las diferencias més importantes que se dan en cucariotes, La replicacion del ADN es un proceso activo y dinémico que requicre de diferentes proteinas, particularmente enzimas que se encargan de abrir la doble hélicey sinttizar las cadenas de ADN complementarias# las existentes, las cuales se describen en ta Tabla 1, De lo anterior se puede deducir que este proceso consume una cantidad importan- tede la energia celular, por lo tanto requiere de un consu- ‘mo constante de ATP, ‘Tabla 1. Proteinas y enzimas necesarias para el proceso de replicacién (Figura 5) Protein ‘Acciona Dad Principal proveina iniciadora de lareplicacién que se une al sito ONC ¢ "Topoisomerasas Ess enzimas son responsables de facilitar el desenrollamiento de la doble hélice, pues tienen la capacidad de realizar cortes en na o ambas caéenas de DNA. De esta forma, se disminuye lz tension que se genera por el earollamienio y superenrollamicnte que ssufre la estructura de DNA en los setes vivos y que podria impedir la apertura de la doble hélice en el vértice de replicacion, topoisomerases tipe | que generan rupturas en una sola eadena de DNA, mientras que las tigo Il producen rupturas en ambas catenas de DNA. (Figura 6) Existen 2 tipos de topoisomerases. Las Hielicasa 0 Dna B ‘complement Ta helivasa se encarga de destruir los puentes de hidrégeno entre las bases jas y asl separar las 2 cadenas originales de DNA una vez la topoisomerasa elimina el superenollamiento, Debido a la etraccién que existe entre los puentes de hidrégeno que se Torman enize las cadenas complementaris, la separacién de dichas cadenas de DNA recuiere del consumo de ATP. (Figura 7) (SsB) (Figuras 8A y 8B) Frotcinas unidoras de [ELDNA de cadena sencilla es inestable y tiende @ unitse a fa cadena complementeria o| DNA de cadena sencilla | puede formar estructuras dentro de la misma cadena que eviten la replicacion. Las} proteinas unidoras de DNA de cadena sencilla interactiian con cf DNA una vez la helicasa separa la doble hélice, lo cual permite que ésta se mantenga abierta y estable. Primasa oDaa G {La primasa es una polimerasa de RNA que s@ encaiga de sintetizar una secueneia coria de RNA denominado iniciador 0 cebador, et cual permite que la DNA polimerasainicie | la sintesis del DNA. Esta RNA primesa se encuentra formando parte de un agregado de | proteinas junto con le helicasa y todo el conjunto se denomina primosoma, | DINA polimerasas Las DNA polimerasas se encargan de la polimerizacion del DNA gracias a que tienen la rposibilidad de seleccionar el deoxinuclestido trifosfato (ANTP) libre que es apropiado para aparearse al deoxinuclestido presente en Ia cadena molde y formar un enlace fosfodiester covalente con el deoxinuclestido precedente en la cadena que se esti formando, Las DNA polimerasas son un conglomerado de diferentes subunidades protcicas, de manera que constituyen holoenzimas. Existen formas diferentes de la DNA polimerasa, En los organismos procariotes ia DINA polimerass | aunque parctpa cena replicacién del DNA, estd mas involuerada en los procesos de reparacién; el papel de la DNA pol II no esti claramente establecido, mientras que Ia DNA pol Ill es la principal enzima responsable de la sintesis de las cadenas complementarias de DNA. Una limitante que tienen las DNA polimerasas es que no pueden der inicio a la sintesis de DNA sobre una cadena sencilla de DNA, pues siempre necesitan de un grupo 3'OH libre al cual puedan unir un dNTP. Por eso se requiere la prinasa descrita anieriormente, Una ver se inicia Ia sintesis del DNA, el cebador de RNA es eliminado por la RNasa Hy el espacio que queda se completa por la DNA polimerasa I. De otro lado, las edtulas eucariotes contienen § DNA polimerasas: a, 8, , 8. L localizade en mitocondria y es la responsable de 1a replicacién del DNA mitocondrial; fas polimerasas ct, 8 y € estin més involuctadas en replicacién de DNA nuclear micntras que la pol juegs un papel importante en el proceso de reparacién, pol y esta Ligesa ‘La DNA pol | es incapaz de hacer un enlace covalente entre los grupos 70H y SYfosfato cuando quedan adyacente, por lo tanto se necesita una ligasa de DNA para _unir estos grupos y ast sellar los espacios que queden en el DNA. 123| feeiéneintotzada DNA olmerasa on ‘hebra rotted Abrazadara | ouepommanen oes ia Sone Da htet®a | prmosoma primasa Proteinas uridoras de el DMA de cadena eencita Cargador dela ‘abrazadera Figura S. a esta figura ee prtentan ls divers moliculas que son necesrss pare e process de sininis Je une nucys moléeula de ADN ea a borguilla de eplicaten, Deserrrotiamiento ‘401 DNA parenteral 0-9 0-8 Torsion de ts tlamentos ‘Ge ONA delante dela herquila ce repieacion Fimuma 6, Durant la repliaciin st sb la dable hie del ADN ol wétice de replicas Io Ruptura transtona sive ‘como eslabén gratis para la rotacion lore del DNA Para dsmiait fs tein que genera este supermolamierio se require de las tpoivomerass, encims que proicen cores en ura 9 ames cadens SeADN, Secuencia de la replicacién Enla figura 9 se presenta un esquema del modelo que hoy se conoce como el més aproximado 4 la secuencia de ‘eventos moleculares que acurren durante el proceso de copiado ds! ADN, ‘Como se deseribid antes, el inicio de la replicacién en cl sitio ort depeade de la union dela proteina llamada Dna, 124 la cual interactia com las secuiencias especifias en el ori, Joque conduce a la formacidn de un complejo inicial que contiene entre 10 y 20 subunidades de protetnas. La union dela Dna acstas secucncias facilita la separaciOn inicial de la doble cadena de ADN y el reclutamicnto de las de- mis proteinas que consttuirin la unidad de replicacién. Fste proceso requicre energia suministrada por ATP y genera lo que se ha llamado el complejo abierto,Una vez a proteina DnaA se une al oni y permite el rechi- tamiento de las proteinas necesarias para dar origen a la replicacién, la doble hétice de ADN se separa por accién de la helicasa también conocida como DnaB (Figura 7) ‘Una molécula de Dna, es un heximero de subunidades idénticas que forma una abrazadera alrededor de vada wna de las dos cadenas sencillas de ADN que sparecen en el ‘complejo abierto; esta unién tambien requiere de ATP Esta Ihclicasa se desplaza a largo del ADN y utiliza la energia liberada por la hidrélisis del ATP para destrur los pucntes de hidrégeno y ssi separar las cadenas de ADN. Como ‘ocurre con otras proteinas que se unen al ADN, las helicusas exhiben diteccionalidad con respecto al desenrollamiento, Por tanto la.DnaB se mueve a lo largo dela cadena sencilla de ADN que se abre hacia el extremo 3°. La proteina no se desprende del ADN hasta que al- ‘canza el final de la cadene © hasta que es retirada por otra proteina. La reasoeiacién entre las eadenas de ADN que se han separado se evita gracias a la accion de las protel- ‘has SBB, las cuales interactdan con las cadenas de ADN una vez estin separadas (Figura 8). Proteinas uridoras Got DNAde cadena sencilla Hobra rotrasada Figura 7. Durante la formacién de le orqulla de epic fn heliass se cxcarga de destrui los puentes de hid/Ogene enire las bases ‘complementarias en el vértice y de est manera loga sepuat las dos 2s de ADN. Este proceso es dependinte del consumo Ay amin A Dono, Proteina unidora de DNA de cadena sencilla 8) 7 pera lider @ Mondmeros oe proteinas unicoras 4 @ de DNA de cadena sencila & e NA polimerasa en, @ & @ eo Proteinas de unién enderezan ta cadena Figur 8. A. Las proteinasunidors de ADN de cadena sencilla interactan con las bases nitropencas libres en est malécua. B, EL ADN de cadens ‘senza e& inestale y tence a unis ala cadena complemeniaria 0 puede forvarestucturas devo de fa misma eadera que even la repicacion, ‘us protelnas nidoras de ADN de eadera sencil lo esabiizan en una cenformacion linea 125‘A continuacion se produce la union de la RNA polimerasa del compicjo de replicecién o primasa (DnaG) sobre un fragmento del ADN de cadena sencilla. Esto ocurre gra- cias ala interaccién entre el hexamero de Dna ya unido al ADN y la primasa (complejo conocido como primosoma). La primasa sintetiza un fragmento corto de RNA (15 nucledtidos) complementario al ADN de cade- nha sencilla que se encuentra enel sitio ori Esta secuencia permite que la ADN pol III inicie 1a adicion de deoxirribonucledtides al extremo 3 y de esta forma se extends la nueva molécula de ADN de doble cadena (Fi- ura 10) A medida que ocurre la replicacién s¢ forman 2 horgui- lias, una en cada direceién de la doble hélice y cada una de ellas permite la replicacién simultinea de ambas cade- ras de ADN, Debido aque la ADN polimerasa solo puede extender el ADN en la direccion 5*a 3" la cadcna de ADN ue es complementaria ala cadena 3'=35? original es la \iniea que se puede sintetizar de manera continua, por 10 cual se denomina cadena lider 0 conductora, Por su pat- ‘la sintesis de la cadena complementaria a la que tiene cl sentido 5°=3" ocurre de forma discontinue pues de- pende de la formacion de fragmentos independientes de ADN, conocidos como fragmentos de Okazaki y esta cadena se denomina cadena teragada (Figura 11). Movimiento de la horquila de replicacién’ Dp ¢ /Y\_ 0) Patinerace i La razén para que las ADN polimerasas solo acttien en direccion 5'=>3} esa diferencia en laestabilidad quimica que existe entre los extremos de los nucledtidos’ el grupo trifostato presente en el extremo 5° de los nucledtids libres es muy inestable en las condiciones iSnicas y de pH dela célula yse puede desdoblar ficilmentea monofosfato Yirofostato inorginico, lo cual impide que se unan nue- ‘os nucledtidos al extremo 5", Por su pare, el extremo 3 de los nvclestidos tiene un grupo OH que siempre esté disponible para reaccionar cone! nucledtido que adiciona Ja polimerase (Figura 12A). Ademas, una polimerizacion del ADN de 3°a 5 limitarfa la posibilidad de corregir una insereién inadecueda de nucledtidos (Figura 12B), ‘A medida que se va desplazando la horquilla de replicacién y se abre espacio suficiente se inicia 1a replicacidn de la cadena molde que tiene direecién 5°23" por medio de la formacién de fragmentos de Okazaki. Para la sintesis de la cadena lider solo se necesita un iniciador de RNA en el sitio de inicio de ta replicacion, mientras que para la cade- na rezagade se sintetiza un iniciador para cada fragmento de Okazaki. Esto ocurre porque a RNA primasa se va 3° es porque si se aiclonaran nuclides dd de conegi la ntereiin anormal de un nuceitide, puss no habra pesbildad de eotar el enlace de ata is ep go ele pos ale once sla ik » Cataract ve Ene, oes Femme § —=_ dasasanaaauat aaa’ | Recessei ear Hear erasata Remi a eer Figura 13. A Poeto ue! liners Solo puede actarextendiendo la eadera spat de un grupo drole 3, inicio dels potimeriasin| G21 ADN requicre de oa polimerasa conocea como prim; esa erima copia in mole de ADN pr formar en ponies (eebador) de RNA Pana sinsis dela cadens lider solo se necesita un iniiador de RNA en e ito de inicio de fe replisacin, mints cue part cadena ezapada se ‘Snietza un niiador pars cada fngmenio de Okara. B.A medida que e ve desplarde I hori de ropsnein 7 0 are eapusio wlihote ‘nisi oasis de cada rouazaca mediante Is formacdn d= fragments Je Okazahl. Este vue payse Ta RNA phase Se ¥a Gsplaano) en la horqila de epicaiony sintetza ls fragments de RNA intervals regulars. Luezo lz ADN polmerasa continu la sintesis de I cadera asa el simvent cedador de RNA. el cual ee cliimado por unt mucleesa y 5®, 30H 3 ia i © a i I i IB Ri8/8.8) a ett. , Eneee: eo PASO 1 Uso de ATP Bs Bs Paso2 Figura 14. Cuunto la ADN poinerasa excuena la cadena de ADN del siguiente Fragmento de Okazaki x desprende y entra on fanciin na ‘ADN ligase que une les nuclecos adjaceites, ‘expeco se lena por otra ADN potimeras. Algo muy importante en el proceso de replicacién es que en cada horauilla de replicacién existe un solo complejo macromolecular encargado de la replicacién de ambas cadenas de ADN (lider y rezageda). Esto se logra gracias aque la cadena rezagada ysu molde de ADN se plegan de tal forma que la ADN polimerasa responsable de la sinte- sis de Ia cadena conductora se coloca en contacto con la ADN polimerasa que esté sintetizando la cadena rezaga- da. Gracias a este plegemiento, e! extremo final de un fragmento de Okazaki queda cerca al sitio donde se sinte- tiza el iniciador de RNA para dar inicio a otro fragmento de replicacién (Figura 9), En los ongenismos procariotes cada fragmento de Okazaki tiene una longitud entre 1000 y 2000 aueleStidos, mien- tras en los eucariotes éstos son mucho mas cortos, va- rian entre 100 y 200 nucledtidos. Ademés, como se men- cioné antes la velocidad de polimerizacién es mucho ma- or en procariotes que en eucariotes. Como ya se men- ioné anteriormente, para subsanar esta menor velocidad de la maquinaria de replicacién, los cromosomas eucariotes tienen miiltiples sitios de origen de la replicacion, cada uno de los cuales constituye una unidiad de replicacién, Estructura de la polimerasa ‘Seguin se describié previamente, la ADN pol Ill de E. coli, 9 una holocazime compucsta de 10 polipepiides deren tes, que en total tiene un peso molecular mayor de 600 129kDa (Figura 15). La parte central de la enzima esta com- puesta de 3 subunidades: la subunidad «, la cual coatic~ ne ¢l sitio activo para la adicién de nucleétidos, Ia subunldad & que posee la actividad exonucleasa $°=53" que le permite climinar los nucleétides. que se colocan incorrectamente, y la subunidad ¢, euya funcién no se ‘conoce. Elresto de los polipéptidas de a holoenzima per- ‘miten que la ADN pol III tenga una alta procesividad (ca- pacidad de agregar nucleétidos), de tal manera gue pucde Adicionar alrededor de 5 x 10° nucledtidos antes de sepa rarse del molde de ADN. La subumidad fi forma undimero en forma de rosca alrededor de la doble hélice recién for- mada. Este dimero se une al centro catalitico de la enzima y lomantiene en posicién cerca al extremo 3" de la cade- ‘ha que esta sintetizando. Una vez se asocia con el ADN, el dlimero de la subunidad funciona como una abrazadere ‘que se desplaza alo largo del ADN a medida que la ADN polimerasa se mueve. Cinco de las subunidades de Ia hholoeazima (y, 8, 8', x y ‘¥) conforman el complejo de- nominado 7, el eual por una parte permite la ubicacion de las subunidades 8 alrededor del duplex de ADN y también se encargn de desarmar la abrazadera de esia subunidad tuna vez.se ha completado la sintesis dela cadena de ADN. Estas reacciones requieren de hidrdlisis de ATP como fuen- te de energia. La iitima subunidad de Ia polimerasa (t) permite la dimerizacion de las porciones centrales de las 0s ADN polimerasas, lo que permite la formacién de un Figura 15, La ADN pol Il de & col ¢ ura holsnzime compuest de 1 poliperridos ciertes. La parte certal de Is ens els cempvesia ‘de 3 subuinidaes: lo subusidad « a sual ceniene el tio active paral ‘divin de auclekidos, la subunidad e que posee ia actiicad exonveleasa S538 ylastbnidd: 130 bloque tinico de polimerizacion de ADN que sintetiza si- multineamente la cadena lider y 1a rezagada, FI centro de la potimerasa que sintetiza Ia cadena lider, lunida a su abrazadera de subunidad i, se desplaza en la dircccién del movimiento de la horquilla de replicacién sintetizando dicha cadena de ADN. Esta polimerasa sigue estrechamente el desplazamiento de le helicasa, que a su vez esta unida a la cadena de ADN que sirve de molde para la cadena rezagada y que va scparando a la doble hélice en el vertice de replicacién. Debido 2 ésto, el cen- tro catalitico de Ia ADN potimerasa permanece tnido al ‘mpolde de ADN y por lo tanto la sintesis de la cadena lider jcurre de mancra continua. Por su parte, la polimerizaciéa discontinua de Ia cadena rezagada, se puede dar de mane- ra simultanea con la de la cadena lider, gracias a que las ADN polimerasas forman un solo blogue. Una vez la tumidad central de la polimerasa de la cadena rezagada com- peta un fragmento de Okazaki se disocia del molde de DN, pero permanece unida la subunidad t, Simulténea- mente, una moKécule de primasa se une a la helicasa © inicia la sintesis de otto iniciador de RNA. El complejo ‘ADN-Iniciador trae una nueva abrazadera de subunidades B alrededor de si mismo, lo cual es seguido por la union de Ia porcién central de la polimerasa para proceder con la polimerizacién del ADN a partir del iniciador de RNA. Tambien se ha demostrado que existe, ademés de la rela ci6n funcional, una unin fisica entre las polimerasas y el Primosoma, pues una de las subunidades x establece un contacto con la helicasa en la horquilla de replicaci6n. Esta interaccién es importante para el proveso de polimerizacién pues acelera el desdoblamiento de a doble hélice de una velocidad de alrededor de 35 pares de bases por segundo a casi 1000 pares de bases por segundo, Las investigaciones realizadas acerca del proveso de replicacion del ADN en células eucariotas han revelado que ocurre de forma muy similar a To encontrado en £, coli, Las proteinas encontredas son estructural y funcionalmente relacionadas a las bacterianas. La replicacidn del ADN eucariote ocurre bidireccionalmente, ‘partir de iniciadores de RNA sintetizados poruna primasa, con la sintesis continua de Ia cadena lider y discontinua de la cadena redagada. Sin embargo, una diferencia im- Portante es que en le horquilla de replicacién del ADN eucariota funcionan dos ADN polimerasas diferentes, la ADN polimerasa «ty la 8, La polimerizacién del ADN es iniciads por la ADNpol a, la cual ego es desplazada por una protefna similar a la subunidad Pi de la ADN pol if y reeniplazada porla ADN pol 8, Este mecanismo inerementa la procesividad de Ia polimerasa y de esta forma puede sintetizar fragmentos mas grandes de ADN antes de que se separe del replisoma,Fidelidad de la replicacion ‘La supervivencia de un organismo depende de que se ga- rantive la copia ficl desu genoma, Un error en la copia del ADN de la eélula que resulte en una mutacién permanen- te podria ser responsable de eliminacién de la progenie de dicha célula. Se ha estimado que en £, coli, la probabili- dad de que ocurra y permanezea la insercién de un nucleétide equivocado es de alrededor de 10”. En otras palabras, solamente | de cada mil millones denucledtidos incorporados estd apareado erroneamente. La bacteria £. coli posee un genoma de alrededor de 4x 10° nucledtides, de acuerdo con estos datos, menos de 1 nucledtido se ‘modifica con cada 100 replicaciones, o que representa Ia tasa de matacién esponiinea de la bacteria. Esta fidelidad de replicacién depende de las actividades de prueba de lectura y de mucleasa que poseen las hholocnzimas de ADN polimerasa. La prueba de lectura permite verfiear que haya sido insertada la base correcta en la cadena nueva de ADN, mieniras que la actividad de nucleasa consiste en coctar deoxinuclestidos y asi elimi- nar errores que pudiera haber introdueido (Figura 16). Replicacién en los extremos de los cromosomas eucariotes ‘A diferencia de los cromosomas bacterianos, los cuales on circulares, los cromosomas eucaristicos son lineales Polimerizacién Y terminan en unos extremes especializados denomina- dos telémeros. Los telémeros consisten de secuencias repetitivas de oligémeros con alto contenido de G en la cadena que tiene direceién $'=53" hacia el telémero. La presencia de estas secuencias altamente repetitivas es necesaria para permit la replicacién de los extremos de Jos cromosomas. A medida que la horquilla de replicacién se acerca al fin del eromosoma, la sintesis de Ia cadena lider continua hasta que finaliza el eromosoma y la doble hélice nueva se libera. Sin embargo, la cadena rezagada no se puede sintetizar totalmente porque su sintesis es discontinua. Una ver se elimina el dkimo inicindor de RNA no existe una cadena de ADN que permita la aeci6n de ta ADN polimerasa para llenar cl espacio dejado por el ini- ciador. Por lo tanto, se nezesita de un mecanistno espe- cial de replicacion para evitar que el cromosoma se acor- te con cada division celular. 1a secuencia de ADN de los telmeros es similar en di- ‘yersos organismos como protozoos, hongos, plantas y mamiferos. Los telomeros consisten en repeticiones en tandem (una detras de la otra) de secuencias cortas que coniienen un blogue de nucleotides de Guanina. En hu- ‘anos, eta secueneia es GGGTTA y contiene cerca de 10,000 nuclediides. La telomerasa reeonoce las regiones ricas en guanina existentes en el telmero_y adiciona nucle6tidos en direccion 5° 3°. La telomerasa es una enzima con actividad de transcriptasa reversa que se encarga de la replicacién de los telomeros Hebra plantilla Edicion Figura 16, La Nidedad de a repiacion depende de as actividades de prueba de lesturay de nucleasa que poste la ADN pelimerasa La prucba de lectura permite verifcar que haya sido insertaca la base correcta en la cadena nueva de ADN, mientras que la actividad de nucleasa elimina eoxinucledtidos ertneos, 131(Figura 17). Esta enzinia es una ribonucleoprotefna en En las oélulas de muchos organismos, Ia longitud de Tos ‘cuya porcida proteica contiene un sitio activo que es ca-_teldmeros se incrementa sustancialmente en las etepas pz de agregar deoxirribonuclestidos sobre un molde de tempranas del desarrollo, La mayoria de las células RNA y contiene ademis el molde de RNA nezesatio para _somiticas humanas se eplican en ausencia de telomerasa, la sintesis del ADN. De esta manera, al adicionarse varias Io que hace que se eliminen gradualmente las secuencias secuencias de telomerasa, se prolonga el exiremio 3° de la telomericas repetitivas que se adicionaron durante ls eta- sadena de ADN que cs moldc de la cadena rezagads, y pas de desarrollo, Se ha sugerido que la duracién de las luna ver esta cadena esta lo suficientemente extendida, se _eélulas en un individuo esté determinada por el mimero de sintetizan iniciadores de RNA que permiten la repeticiones teloméricas con las que estas células comen- polimerizacién del ADN, La edicién de un ndmero varia~ _zaroa, pues a medida que ocurran divisiones celulares de ble de secuencias de telomerasa es lo que explica que los sus eéiulas sométicas va disminuyendo la longitud de los telémeros tengan oligémeros repatitivos (Figura 18), eromosomas hasta un momento critica en el que las o8- lulas mueren, Telomerase “Dedos" gion RNA, do la telomerase sada come mole "Palma Sitio activo de la Telomerasa 5 Vigura 17 La telomerasa 68 unt ribonustegprotcina con aciiyidad de Resto del resign sintetizedo ‘ranscrptasa reverst. que se encarga de lt repliacion de los telamems Le cromosome poreibn protein de eta encima contine un sitio ectivo que os eapar de ‘repr deovinibouclebidos sobre un mole de RNA, mienras que la porion Ge RNA sine de molde pura sitesi del ADN en el extremo del cremosama. Hebra parental 5 GEERT TOCCCTTSCOTTOGOCTTO | ACCC. cadena rezagada, | recien sintetizada Union de ta Telomerasa incompleta | EEE TTSCCCTTEGSTTGGSGTTG + Fc ACCES | A ETT CCCCTTGGGTTGGGGTIGGGGTTGGEGTTG 3s Fh ACER | al i aiiaiETTCCCCTTGGGTIGGGGTIGGGGT TesosTTs 3 3 (GaRREIAACCCC CCCAACCCCAACCCC Fiat 18. Gracias In adic de varias seevencias de RNA del telomerase prolongs ete 3° ela cadena de ADN que et mole de a caena reaaguca; una vez dicka cadena ests Jo suicentenente extend, se sntenizan iicadores de RNA que pemiten la polimerizacion del ADN fan en el extreme del eromosona 132