Universidad de Buenos Aires Facultad de Farmacia y Bioquimica “Analisis de la movilidad electroforética (1) al variar la viscosidad del medio” Integrantes: © ~~ Pech, Romina. © ~—s~Pilla, Romina. a Fausti, Daniela. JTP: Monczor, Federico. Ayudante: Furno, Jorge. Comisi6n: 2BAnalisis de la movilidad electroforética de una particula cargada al variar la viscosidad del medio. Introduccién: La eelectroforesis puede definirse como un fenémeno de migracién que experimentan particulas cargadas eléctricamente al estar bajo la influencia de un campo eléctrico. El llamado “Efecto electroendosmético” se produce cuando la solucién buffer colocada en la cuba eléctrica posee un exceso de cargas positivas (por la aplicacién de un voltaje a un soporte que queda cargado negativamente), estas cargas lograran que las moléculas migren hacia el cétodo independientemente de su carga. Por la teoria de las repulsiones dos moléculas cargadas positivamente o negativamente se repelen, por el contrario cuando sus cargas son opuestas, estas van a atraerse. Por esto se llega a que una vez cargado el soporte las moléculas con cargas positivas van a desplazarse hacia el cétodo y las negativas hacia el énodo, este movimiento esta dado por la fuerza eléctrica, Fe=E.q Donde: E: campo eléctrico. 4g; carga de la particula. E= Av/Ax Donde: V: voltaje aplicado. x: longitud del campo. Toda molécula en movimiento experimenta una fuerza contraria en direccién puesta a su movimiento denominada fuerza de resistencia, por el principio de Stockes esta va ser igual a: Fr=6.0. r.4.¥ Donde: 1: viscosidad del medio. v: velocidad de la particula radio de la particula,Debido a que la fuerza de friccién es proporcional a la velocidad de migracién de Ia particula esta se aceleraré hasta que Ia fuerza viscosa se iguale con la fuerza eléctrica. A partir de ese momento la fuerza neta sobre la particula sera nula y se alcanzara un estado estacionario en el que la particula se moverd a velocidad constante en ese campo dado y a esas condiciones. Fr=Fe 6.n. 1. q.V=E.q Despejando velocidad se obtiene: v= E.qhk Donde: k6nnnv A esta velocidad alcanzada por una particula para un campo eléctrico dado se la denomina movilidad electroforética: w=vE Esta movilidad va a depender de varios factores: > Temperatura: al aumentar la temperatura aumenta la energia cinética. > Presién: idem anterior. > Carga de Ia particula: la velocidad de migracién aumentara cuando hay un incremento de la carga neta de la particula. Esta carga va a depender del pH en que se encuentre esta particula. > Tamafio de la particula: la velocidad de migracién es menor en las moléculas grandes, debido al incremento de las fuerzas de friccién y electroestaticas ejercidas por el medio circundante. > VISCOSIDAD del medio en el que se produce la corrida. > Forma: las moléculas de tamajio similar pero con diferentes formas, exhiben distintas caracteristicas migratorias a causa de los diferentes efectos de friccién y electroestatico. > Fuerza iénica: esta dada por la concentracién del buffer utilizado debido a que en un buffer muy concentrado las particulas no podrin moverse con facilidad, por lo que para un calculo aproximado de la fuerza iénica se utiliza: Para calcular la movilidad electroforética se utiliza:Donde: d: distancia corrida. L: longitud de la tira t: tiempo de corrida. V: voltaje utilizado, abe aclarar que la movilidad electroforética no depende de estas variables sino que se establece esta relacién experimentalmente para la obtencién de esta constante. Las particulas de los buffer arrancan los protones de la muestra utilizada arrancandolos y provocando un exceso de protones en solucién, como por ejemplo: COOH#—> COO +H H0«» OH +H” En este caso el carboxilo unido a la tira de papel se va a ver arrastrado hacia el catodo (negative) por el movimiento de los protones. Para un célculo real del movimiento de las particulas del papel, se utiliza un testigo neutro que al no poseer carga solo va a moverse por el efecto electroendosmético, pudiendo asi calcular para particulas negativas: d=Dp+Dt Y para particulas positivas: d=Dp+Dt Donde: Dt particula testigo (neutra). Dp: particula cargada Esto es debido a que una particula cargada negativamente va a tender a ir hacia el nodo y va a ser arrastrada por el efecto electroendosmético hacia el cétodo, por lo que la distancia que deberia haber recorrido se vio afectada por este efecto y la distancia real de su movimiento sera la sumatoria de la testigo y de su movimiento experimental Caso contrario ocurre con la particula cargada positivamente que se mover hacia el céitodo y esta seré arrastrada por demas por el efecto electroendosmético por lo que su distancia real serd la distancia recorrida por la particula menos la distancia recorrida por la testigo.Hipétesis: Ya que en el trabajo prictico analizamos si varia el Hl, cuando nosotros ‘modificdbamos la longitud de las tiras, el voltaje de la corrida y el tiempo de duracién de esta; y hemos concluido que no varia la movilidad electroforética cuando cambiamos estos pardmetros. Nos hemos preguntado de que manera variaria el jt cuando una molécula cargada €s sometida a una corrida en la cual se modifica la viscosidad del medio solamente (manteniendo su pH constante y también todos los parimetros que analizamos en el trabajo ractico de laboratorio); Nosotros suponemos que la distancia recorrida por dicha molécula cargada disminuye a medida que vamos aumentando la viscosidad del medio en el cual efectuamos la corrida. dp=q/ 62.4. 4h i= a Hl Ac aspartico Testigo neutro (Histidina) Buffer Glicerina Viscosimetro de Ostwald de 50. Picnémetro. Cuba electroforética. Cronémetro. Frasco con agua. Pie os tiras de papel para corrida electroforética de 18 cm. Balanza analitica. Fuentes de poder. Soporte: tiras de papel Whatman Grl Solucién de ninhidrina en etanol al 0.3%. Microcapilares para sembrar. Papel absorbente. Estufa de secado (70-80°C) Guantes de latex. aMétodos Introduccién: Para demostrar nuestra hipétesis utilizamos 4 medios de distinta viscosidad. Para medir esta viscosidad utilizamos el método de Ostwald que se basa en la ley de Poiseuille y nos mide viscosidades relativas. Utilizamos la ecuacién de Poiseuille: Q=AP.n.r/8.1.4 Sabiendoque AP=h.b.g yqueQ=vit reacomodando la ecuacién de poiseuille y reemplazando obtenemos la siguiente ecuacién: n=5.g-.Ah.o.t.rt 8.1.v Manteniendo ta longitud podemos simplificar la formula: "Ia altura “h” el volumen “v” y el radio”r” constantes, m= dl. tl m 62.12 Para averiguar la densidad de las soluciones que necesitaremos en los célculos de viscosidad utilizamos el método de picnometria. Este se basa en la razén entre un liquido incégnita y el agua para determinar densidades relativas, obteniéndose Dr= tig! Vig mino! Vio y, como los voliimenes son iguales, queda Dr= my Mo Métodos: 1. Preparar las soluciones de Buffer y glicerina, medir la densidad y la viscosidad de cada una por los métodos ya mencionados Se determina la densidad de las soluciones por picnometria. Se determina la viscosidad utilizando el viscosimetro de Ostwald, Cargar las cubas con la soluciona medir (200 ml para cada lado de la cuba) y enchufarlas 5. Controlar !a estabilidad det equipo, verificar la posicién del énodo y cétodo, 6. Marcar con lapiz. negro sobre Ia tira de papel a utilizar como soporte de corrida la linea de siembra y 1a posicién de los electrodos (para manipular las tiras de papel utilizar siempre guantes) 7. Desenchufar La fuente, sumergir en la solucién de la cuba la tira a correr, dejar unos segundos para que se moje, retirarla y secarla entre papeles absorbentes 8. Montar la tira en la cuba, teniendo en cuanta la posicién de énodo y cétodo, AYN9. Tapar la cuba. 10. Enchufar el equipo y seleccionar las condiciones de corrida, 11. Dejar estabilizar la cuba durante cinco minutos. 12. Desenchufar y sembrar la muestra y el testigo neutro. 13. Dejar correr en las condiciones que corresponda, desenchufar, secar la tira y colocarla entre papel absorbente, secarla muy bien por presién y llevarla a la estufa donde se termina de secar sobre un vidrio. 14, Sacar de la estufa la tira y aspersionarla con la solucién reveladora (solucién de ninhidrina), con moderacién y volver a colocarla en la estufa hasta sequedad. 15, Marcar la posicién de las manchas reveladas y medir la distancia recorrida. Se tomaré la convencién de considerar como distancia recorrida a la separacién entre las dos fuentes. 16. Realizar la corrida del mismo aminodcido en las mismas condiciones, cambiando la solucién puesta en la cuba (0 sea cambiando el medio) 17. Repetir todos los pasos ya mencionados (5 — 14). Resultados obtenidos: (poise) S(g/ml) Ac. aspartico | _w(cm’/seg.V) _| Sol 1/20 0.0114 1015 05+ 0,0596 Sol 4/20 0,0164 1,042 0,2+ 0,0415, {Sol 6/20 10,0250, 1,076 OL 0,0272, Graficamos la distancia en funcion de 1/1, ya que mediante formulas planteamos que... Dist = Nota: W= gL. V = pendiente de mi grafico 6n.r.tDistancia (em) Distancia en funcion de la inversa de la viscosidad + y = 0,0085x - 0,2686 ~R7=0,9559 t | 04 40 425 45 475 50 S25 86 57,5 60 625 65 G75 TO 725 75 775 80 825 85 875 90 1 (1Ipoise) Cuando trabajamos mantuvimos constante la longitud de la tira(1S cm), el voltaje(250 v) y el tiempo de la corrida (300 seg); entonces sabiendo que W es 0,0085, puedo averiguar cuanto vale q / 6m. Obteniendo este dato mediante la formula = q / 6.x. r. 1 conociendo las diferentes viscosidades de mis soluciones, obteniendo las diferentes movilidades electroforéticas.Movilidad electroforética en funcién de la viscosidad del y = -0,4135x + 0,0353, 0,03 0,025 5 0,02 i 0,01 = 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05 0,055 0,06 0,065 Viscosidad del medio (poise)Conclusién: Ante el planteo de la pregunta “;Varia la movilidad electroforética cuando se modifica la viscosidad del medio?”; podemos concluir basindonos en los conocimientos adquiridos durante la cursada y en los datos experimentales obtenidos en el laboratorio que la respuesta a nuestra pregunta es afirmativa, la movilidad electroforética cambia con la modificacién de la viscosidad del medio del medio en el cual realizamos la corrida electroforética. A medida que la viscosidad aumenta podemos observar experimentalmente y fundamentarlo mediante formulas que la movilidad electroforética disminuye. bp=q/ 6.2. re nt Un punto a tener en cuenta es que nosotros, a fin de poder observar un cambio en la distancia recorrida por la particula que sea especificamente debido al aumento de la viscosidad en el medio, realizamos la experiencia manteniendo los datos experimentales, como por ejemplo: el voltaje, el largo de la tira, el tiempo, constantes.Anexo Calculos Ciilculo de la densidad. Método: Picnometria Sagua= 1,000 g/ml Volumen del picnémetro=25 ml. PESO (g) ‘SUSTANCIA (sol | PICNOMETRO [PICNOMETRO CON] PICNOMETRO CON X) _| vAcio ___ AGUA SUSTANCIA Buffer + glicerina 20.296 44.786 45.164 (120) Buffer + glicerina 20.295 791 45.808 (2/40) Buffer + glicerina 20.289 44.796 46656 (6/40) Masa de agua =masa de picnémetro con agua- masa de pienémetro vacio Masa de sol X= masa de pien6metro con sol X- masa de picnémetro vacioMASA (@) ‘SUSTANCIA ‘AGUA ‘SUSTANCIA 1 | Buffer + glicerina 24.490 24.868 (1/20) 2 | Buffer + glicerina 2.496 5.513 (2/40) 3 | Buffer + glicerina 24.507 26.367 (6/40) MA868E18 5, = 1.015g/ ml 24.490¢.mi 25513818 5 1.042¢/ ml 24.496 g:ml 26367818 _, 5, =1.076g/ ml 24.507 g.ml Calculo de la viscosidad Método: viscosimetro de Ostwald 6g Ahar't By Ctes: ‘1 8 *Ah + vNew See BARI Looe ae = Sette Nag SLY 5 syec ARF be, ee ape SUSTANCIA TIEMPO DE ESCURRIMIENTO MINUTOS SEGUNDOS T| Buffer + glicerina (1/20)| 10:35:83 635.83 2| Buffer + glicerina (4/20) 14:48:31 888.31 3 | Buffer + glicerina (6/20)| 21:54:53, 1314.53 4 Agua 9:25:24 565.24 py = 20S 2635.83mlB 868 19-2» oortap, ‘mill_000.565.24seg m= A286 10? p = 0.0164 p. mll.000g.565.24seg = 1076.1314.53m 8568 49-2 » - 9.0950. ‘mill.000g.565.24segCéilculo de la movilidad electroforética a medida que fue aumentando la viscosidad del medio. Segimn el grafico de la distancia en funcién de la inversa de la viscosidad, la pendiente obtenida es m=0.0085em.p _4'5em250V 4 .008 = x 3 0.008Scm p= Seer Gey = 00068. /oml 4 barn 9.00068em.87.726m _ 9 os96em? /segV seg¥ 9.0006 818.60.26 cm =O og 1scortsceve seg) , = 2:00068e40.00em _ 9 O97 20m? /segV seg ‘SUSTANCIA [| W (glem.V) | 1/y (1/p)[n (em"7seg. V) Buffer + glicerina (1/20)| 0.00068 _| 87.72 | _0.0596 Buffer + glicerina (4/20)| 0.00068 | 60.98 | 0.0415 Buffer + glicerina (6/20)| 0.00068 | 40.00 | 0.0272