mares 1541546 1519207 1928501 Grape 242 Universidad Autonoma de Nuevo Leén Facultad de Ciencias Biolégicas Métodos Bbésicos en Microbiologia Profesor: M.C. Francisco Javier Sanchez Velazquez Aislamiento y caracterizacién de un microorganismo del pan Flores Sanchez, Emilio Adrian Ibarra Ontiveros, Jorge Martinez Espinoza, Jonathan SailIntroduccién: Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, 0 como contaminantes en equipos mel sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son ttiles en la elaboracion de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposicién de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos favorable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido fen sales 0 carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibidticos, 0 la exposicién del alimento a la irradiacién. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lacteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, ‘espocias, oleaginoses, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como pectinas, carbohidratos como polisacaridos, cidos orgénicos, proteinas y lipides, También pueden causar problemas a través de: (a) sintesis de metabolites toxicos (micotoxinas), (b) resistencia al calor, congelamiento, antibidticos o irraciacion (c) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patégenas. Pueden también causar malos olores y sabores y la ecoloracién de las superficias de alimentos El término moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se sucle reconocer faclimente por su aspacto aterciopelado 0 algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para ‘el consumo. La identificacion y clasificacién de los mohos se basa en observaciones macroscopicas y microscépicas.Material Madios de cultivo y diluyentes: +1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solucién amortiquadora de fosfatos de pH 7.2 6 agua peptonada al 0.1%, ester + 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucién amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 6 agua peptonada al 0.1%, astériles con tapon de algodon*. +4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa® +4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta? Soluciones, reactives e indicadores: * Solucién colorante de lactofenol azul de algodén °, + Colorantes para tincin de Gramb. + Solucién estéril de acido tartarico al 10.0 % *. Material y equipo: + Vaso de licuadora estéril o bolsa para Slomachera. + Motor para licuadora 0 Stomachera. + Pipetas graduadas esteriles de 1 mL con tapén de algodén*.‘nV eldo tarrico 105 ‘eslzar diciones decinaes emplaanda bos con 3.0 da sliion cuyer tom. ek” Piri, ‘ eon neni sae mesons = Sse woe soe aa oat aaa Pala halen en caleodePoun Sapeeie Cees some steno Se malta actateadas con CComtor aquolissplacas que tengan ‘nie 19 2130 colonias So honges iO ovadurasyreportar por Separada come Urcis'o mi ‘ae mucsira, ‘nsleandotompo oo Heseae treubeatn ‘enitiado a 45°C en cada plea SS => ri arts cajas on ee st oe = (=) ‘movimento "etatriosMetodologia Procedimiento: 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri astéril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucién amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 6 agua peptonada al 0.1%. 2, Homogeneizar la muestra con la solucién anterior en un vaso de licuadora ‘esi6ril 0 pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seq en el caso de la llcuadora a velocidad minima, 6 20.0 seg en el Slomacher a una velocidad normal. Esta es la dilticién primaria, 3. Do la suspensién o solucién anterior, tomar 1.0 mL y transferiro a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solucién amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operacion tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe ullizar una pipeta esteril para cada dilucien. 4, Colocar por duplicado en cajas Patri estériles, 1.0 mLde cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estéri 5. Fundir ol modio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrasa y/o de agar extracto de malta estérles. Enfiarlos y mantenerios a ABC. 8, Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de acido tartérico al 10% esterilzado por fitracién en membrana, 0 bien esterlizar la solucion a 121°C1°C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 245°C se le deberd adicioner 0.3 ml. del écido, 0 colocarlas en la caja de Petri teniendo precaucién de que no toque la muestra antes de earegar el medio de cultivo. 7. Después de la acidificacién, utilizar un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborer que se enouentre a 3.5 uliizando un potenciometro. 8. En cada caja de Petri con indoulo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado ylo agar extracto de maita acidificado, fundides y mantenides a 445°C. El tiempo transcurrido entre la preparacién de les diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min 8, Mezclar cuidadosamenta ol medio con seis movimientos dederecha @ izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atras hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo culdado de no humedecercon el medio la tapa de la cajade Petri, Permitir que la mezcla en las cajas Petr solidifique, dejéndolas reposar sobre una superficie horizontal fria 10. Veriicar la esterilidad de fos medios acidificados para lo cual se vertera en una caja de Petri sin inéculo, de 15.0 2 20.0 mL del agar papa dextrosa avidificada y/o agar extracto de matta acidificado. Después de la incubecién estas cajas no deberén presenter desarrollo de colonies. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 2521°C. 12. Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 dias de incubacién. Después de § dias, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 160 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es cificil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificacién de 4 dias de incubacién o incluso las de 3 dias. En este caso, se informa el periodo de incubacién en los resultados de los analisis. 13, Reelizar una tincién hiimeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algod6n, para un examen microscopico y una posible identiicacion de los mohos que se hayan desarrallado. 74. Realizar una tincion de Gram para la observacién microscépica de las levaduras obtenidas, 18. Contar las colonias de cada placa representativa, después de 2, 4 y 5 dias de incubacion (a 26 #1°C o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adeouadas para al informe. Muttiplicar por el inverso dela dilucion. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o millitro (UFC/g 0 mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiante), incubadas a 2521°C durante 5 dias. 48. Descibir las caracteristicas macroscépicas y microscépicas observadas, de los mohos yio levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada 49, Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, 0 si es dificil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 dias de incubacién y aiin a los 3 dias. En este caso se debe informar el periodo de incubacion de 3.6 4 dias, en los resultados del andiiss.BIBLIOGRAFIA, -Horma Oficial Mexicana, NOM-111-55A1-1994, Bienes y Servicios. Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Frazier W. & Westhoff D, (1984) Microbiologia de los Alimentos. 2, ed. Acribie, Espatia, 23-50. Beuchat LR, & Cousin M.A, (2001) “Yeasts and Molds". ln: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. th ed. Downs FP. & Ito K. (Eds.| APHA, Washington. 209- 215. = Pierson M. & Smoot L. (2001) Indieatar Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M, Beuchat L. & Montville T; {Eds.) ASM Press. USA 71-87,