VISI (2012) 20 (1) 838-852

Peranan Subtipe miRNA pada Keadaan Post Infark Miokardium

Christine Verawaty Sibuea

ABSTRACT
microRNAs (miRNAs) are single strands of non-coding RNA molecules
consisting of 20-24 nucleotides, and a post-transcriptional regulator of gene
expression by inhibiting translation of mRNA in protein synthesis or causing mRNA
degradation. Many studies have found the function of miRNAs in regulating various
growth and physiological functions and pathological conditions, even when
miRNAs increasingly involved in the regulation of physiological and pathological
conditions of the heart. In the pathophysiology of myocardial infarction, many
subtypes Mirna have an important role, as well as on the state of post-myocardial
infarction. Some cardiacspecific miRNAs, including mir-1, mir-133a, and mir-208,
plays an important role in maintaining growth and cardiac function, and in many
previous studies mir-1, mir-133a, mir-499, and mir-208 high in the blood of
patients with myocardial infarction compared with those from patients without
myocardial infarction. In addition, mir-21 has a protective effect against ischemia-
cell apoptosis. To test miRs role in human pathology, most studies using high-
through put method to analyze the expression of mir in clinical samples. Right now,
AntimiRNA oligonucleotides have become the tools necessary to research
miRNAdan also been suggested to be a potential therapeutic agent.
-------------
Key Words: microRNA, myocardial infarction, cardiacspecific miRNAs, antimiRNA

Pendahuluan
MicroRNAs (miRNAs) adalah untaian tunggal molekul RNA non-coding
yang terdiri dari 20-24 nukleotida, dan merupakan regulator ekspresi gen paska
transkripsi.1,2 Dengan bekerja pada pada mRNA, mereka menghambat translasi
mRNA dalam sintesis protein atau menyebabkan degradasi mRNA. miRNAs telah
ditemukan untuk mengatur berbagai fungsi perkembangan dan fisiologis
(misalnya diferensiasi stem sel, neurogenesis, haematopoiesis, immunoreaksi, dan
metabolisme (Fazi dan Nervi, 2008; Williams, 2008). Mereka terkait dengan
berbagai kondisi patologi; seperti kanker, penyakit autoimun, inflamasi dan
gangguan neurodegeneratif (Williams, 2008). Ada bukti yang menunjukkan
bahwa miRNAs juga semakin terlibat dalam regulasi fisiologis dan kondisi
patologis jantung (Scalbert dan Bril, 2008). 1
Infark miokardium telah lama menjadi penyebab utama kematian di negara
maju.Infark miokardium yang disebabkan oklusi arteri koroner merupakan
penyebab utama morbiditas dan mortalitas manusia. Hal ini dikarenakan
hilangnya aliran darah ke otot ventrikel kiri jantung setelah infark miokardium.3,4
Ada diperkirakan sebanyak 1.000 miRNAs disandikan oleh genom
manusia.4 Beberapa laporan terbaru menunjukkan bahwa miRNAs memainkan
peran penting dalam patofisiologi infark miokardium. Yang et al. menemukan
838
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

bahwa mir-1, meningkat di dalam jantung manusia dengan penyakit jantung

koroner dan di dalam jantung tikus dengan infark miokardium. Perubahan ekspresi
hasil mir-1 di dalam jantung manusia dengan penyakit arteri koroner masih
kontroversial, karena penelitian terbaru telah menunjukkan bahwa ekspresi mir-1
cenderung down regulated di dalam jantung manusia dengan penyakit arteri
koroner. Keterlibatan potensi miRNAs di infark miokardium juga disarankan
dalam penelitian mir-126 pada tikus, di mana Wang et al. telah menemukan
bahwa tingkat kelangsungan hidup pada tikus mir-126 setelah infark miokardium
berkurang secara signifikan dibandingkan pada tikus liar. Peneliti juga
menemukan bahwa mir-29 memainkan peran penting dalam fibrosis jantung
selama proses perbaikan setelah infark miokardium. Dalam iskemia reperfusi in
vitro, ditemukan bahwa, di dalam hati tikus yang diinjeksikan dengan mir-21,
ukuran infark miokardium setelah iskemia reperfusi in vitro berkurang. Hebatnya,
ekspresi mir-21 secara signifikan down regulated di daerah infark, tapi up
regulated di daerah-daerah perbatasan. 5
Tabel 1 Studi tentang delesi miRNA-encoding genes dan gen yang berhubungan 6
Genes Target
Functions Phenotype after gene deletion
deleted Genes
Further process pre-miRNA to Lethality in early embryonic stages,
Dicer-1 produce mature miRNA depletion of
multipotent stem celss, embryonics
  stem cells
unable to diffrentiate, lost of
  epigenetic silencing
  of centromeric sequences.
 
A core component of the functional Lethality at mid-gestation, lethality in
Agronaute-2 miRNA-included early
  silencing complex (miRISC) embryonic stages.
   
a cofactor that is required for Lethality ie early embryonic stages,
Dgcr8 Drosha function embryonic
  stem cells unable to differentiate.
   
Encodes miR-1, promotes muscle Cardiac morphogenetic and
Mir-1-2 cell differentiation, HAND2, IRX5 electrophysiological
inhibits cell proliferation, controls defects, fatal with
  the thickness of variablepenetrance.
  the ventricular wall  
   
Spesifically expressed in Leaky vessels, hemorrhage and partial
Mir-126 endothelium, governs vascular spred-1 embryonic
lethality, due to a loss of vascular
  integrity and angiogenesis integrity and
defects in endothelial cell
  proliferation, migration
and angiogenesis; the subset of
  mutant animals
that survive displays ? Defective
  cardiac neovascu-
839
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

  larization after myocardial infarction.

   
Spesifically expressed in mature Expanded lymphocyte B1 population,
Mir-150 lymphocytes, modula- c-Myb decreased
tes lymphocyte differentiation and lymphocyte B2, increased
  immune response. immunoglobulin pro-
  duction and increased c-Myb.
   
prominently expressed in many Defective adaptive immunity,fibrosis
Nir-155 hemopoietic cell types, c-MAF and
involved in mammalian innate and infiltration of the lung, defects in
  adaptive immunity, germinal centre
reaction (decreased interleukin-2,
  viral infection and oncogenesis. interferon-ϒ),
decreased production of
  immunoglobulin.
   
nearly exclusively expressed in neutrophilia, which could be due to
Mir-223 bone marrow, modulates Mef2c expanded
hematopoietic diffrentiation as neutrophil progenitor population and
  induced during leneage senescent
diffrentiation, a fine-tuner
  ofgranulocyte production and characteristics.
  the inflammatory responses.  
       

Biogenesis microRNAs
miRs pendek ( ± 22 nukleotida) ditemukan sebagai regulator pada elegans
caenorhabditis. 2,3,7,8,9,10 Segera setelah penemuan mereka, peran penting dalam
mengatur ekspresi gen pada spesies lain, termasuk manusia telah dibuktikan.
Setiap miR mampu mengganggu ekspresi gen beberapa target dan sering terlibat
pada jalur yang sama. Oleh karena itu telah dihitung bahwa sekitar 30% dari gen
manusia diatur oleh miRs. Sebaliknya, gen masing-masing dapat menjadi target
beberapa miRs. Lebih dari 50% kasus terorganisir dalam transkripsi polisistronik.
Mereka sering terlokalisasi antara urutan intronik atau intergenik region.
Transkripsi mereka berada di bawah kendali faktor transkripsi klasik dan
dioperasikan oleh RNA polimerase II atau III. Transkrip primer (mir primer)
sampai dengan 1000 nukleotida panjang, dengan struktur hair pin pendek di
tengah dan mengalami pembelahan endonucleolitic oleh enzim ribonuklease III
yaitu Drosha, dan bertindak sebagai kofaktor yaitu DGCRG8/Pasha. Kemudian
diekspor ke sitoplasma oleh Exportin 5/RanGTP. Di dalam sitoplasma pra-mir
mengalami perpecahan endonukleolitik kedua oleh Dicer dengan produksi matur
double stranded mir. Salah satu filamen dari mir matur (untai pemandu)
dimasukkan ke dalam RNA Silencing Interfering Complex (RISC) melalui
interaksi dengan protein Argonaute dan diarahkan ke urutan komplementer lokal
di wilayah 3 UTR dari mRNA target. Aturan susunan tidak diperlukan antara mir
dan mRNA. 2,7,10

840
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

Gambar 1 : Mekanisme biogenesis dan maturasi miRNA 7

Patogenesis Infark Miokardium

Semua manifestasi klinis fenomena infark miokardium sama, yaitu
ketidakseimbangan antara kebutuhan oksigen miokard dan suplai darah.
Patogenesis bentuk infark miokardium merupakan hasil dari kombinasi variabel
tingkat penyumbatan arteri koroner dengan konsekuensi pengurangan cadangan
pembuluh darah koroner dan peningkatan konsumsi oksigen miokard. Saat ini
ditetapkan bahwa penyumbatan arteri koroner adalah salah satu hasil dari lesi
aterosklerotik di pembuluh koroner konduktansi epikardial dengan atau tanpa
vasokonstriksi (angina stabil kronis) atau vasokonstriksi akibat resistensi
pembuluh koroner (penyakit jantung sindrom X).
Bentuk unstable dari Ischemia Heart Disease, secara umum diindikasikan
sebagai acute coronary syndromes (ACS), termasuk unstable angina, non-ST-
elevation myocardial infarction (NSTEMI) dan ST-elevation myocardial
infarction (STEMI). Dalam banyak kasus ACS, terdapat gangguan dari plak
aterosklerotik koroner atau oklusi trombus. Konsekuensi berkepanjangan oklusi
arteri koroner di ACS diwakili oleh nekrosis miokard, yaitu infark miokardium.
Iskemia miokard akut atau kronis dapat dipengaruhi oleh berbagai mekanisme
seperti myocardial stunning, myocardial hibernation, preconditioning dan
postconditioning. Istilah myocardial stunning mengacu pada keadaan gangguan
fungsi miokard setelah iskemia berkepanjangan bahkan setelah pemulihkan aliran
koroner normal. Myocardial hibernation adalah kondisi ketenangan metabolik
tanpa aktivitas kontraktil dari segmen miokard hipo-perfusi kronis. Setelah

841
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

periode iskemia miokard, ventrikel lebih tahan terhadap iskemia berkepanjangan:

fenomena ini disebut preconditioning. Postconditioning mengacu pada
perlindungan terhadap cedera reperfusi iskemia, terjadi modulasi munculnya
kembali aliran darah normal setelah oklusi arteri koroner berkepanjangan di infark
miokardium. Iskemik kronis merupakan disfungsi ventrikel kiri, menunjuk sebuah
kondisi yang dicirikan dengan pembesaran ventrikel kiri dengan penurunan fungsi
sistolik dan diastolik ventrikel kiri akibat luka akinetik infark miokardium
sebelumnya dan atau dengan tingkat myocardial stunning, myocardial
hibernation, untuk iskemia berulang atau kronis.
Faktor risiko untuk penyakit jantung iskemik dapat dibagi menjadi faktor
resiko "konvensional" : merokok, hipertensi, hiperlipidemia, resistensi insulin dan
diabetes, penurunan aktivitas obesitas, fisik dan faktor risiko "novel" termasuk
high sensitivity C-reaktive protein (hsCRP), homosistein dan lipoprotein.
Pencegahan primer dan sekunder penyakit jantung iskemik terdiri dari
pengendalian faktor risiko. Salah satu yang paling penting dari mereka diwakili
oleh hiperkolesterolemia. Baru-baru ini dikembangkan obat: statin dan ezetimibe
telah dibuktikan untuk dapat memperoleh penurunan yang signifikan tingkat
kolesterol dan banyak uji klinis baru-baru ini bermanfaat menurunkan kadar
kolesterol bahkan pada subyek dengan tingkat basal normal. Namun obat ini dapat
memiliki efek samping yang tidak diinginkan. Penelitian obat anti-kolesterol baru,
lebih mujarab dan ditoleransi dengan menggunakan senjata yang berasal dari studi
mir dan teknologi antisense oligonukleotida. Hal ini dimungkinkan untuk
menggunakan terapi mir berbasis menargetkan target Sterol Regulatory Element
Binding Protein 1 (SREBP1), sebuah protein yang terlibat dalam pengembangan
dan pemeliharaan hiperlipidemia dan hiperkolesterolemia. 7
Tabel 2 : miRNA yang terlibat dalam patogenesis Penyakit Jantung Koroner dan
aplikasi klinis potensial lainnya 7
Yea
MiR Targets Pathogenetic Pathway First Author Journal
r

Collagents type 1α1, 200

miR-29 type 1α2 and Post-MI fibrosis Van Rooij E 8 PNAS
  type 3α1, Fibrillin-1        
Fibroblast-driven 200
miR-21 Spry 1 myocardial Thum T 8 Nature
    Fibrosis      
200
miR-208 THRAP-1 Post-MI heart failure Van Rooij E 7 Science
Post-MI cardiac 200
miR-1 Connexin 43, kir 2.1 arrhythmias Yang B 7 Nat Med
Post-angioplasty 200
miR-21 PTEN, Bel-2 restenosis Ji R 7 Circ Res
200
let-7 Thrombospondin-1 Angiogenesis Kuebacker A 7 Circ Res
200
miR-27 Thrombospondin-1 Angiogenesis Kuebacker A 7 Circ Res

842
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

200
miR-126 Spred-1 Angiogenesis Wang S 8 Dev Cell
200
miR-210 Ephrin A-3 Angiogenesis Fasanaro P 8 J Biol Chem
Stem cell fate 200
miR-1 Delta-like-1 determination Ivey KN 8 Cell Stem Cell
Stem cell fate 200
miR-133 Delta-like-1 determination Ivey KN 8 Cell Stem Cell

Spry 1 Sprouty homologue 1.

Thyroid Hormone
Receptor Assosiated
THRAP-1 Protein 1.

PTEN Phosphatase and Tensin homologue.

mir-29 disajikan dalam fibroblas jantung dan ekspresinya berada di bawah

kontrol Transformasi Growth Factor Beta (TGF-β). TGF- β adalah salah satu
penentu utama fibrosis jantung yang bertindak sebagai pengatur utama produksi
kolagen di miokardium. Para penulis menemukan bahwa TGF- β menginduksi
downregulation mir-29. Banyak ECM protein seperti Fibrillin-1, tipe Kolagen
1α1, Kolagen tipe 1α2 dan tipe Kolagen 3α1 telah diidentifikasi sebagai target
mir-29, menyebabkan pengurangan mir-29 melalui antagomiRs dan menemukan
peningkatan mRNA kolagen. Selain itu memicu penurunan tingkat mRNA kolase
dalam kultur fibroblas melalui over-ekspresi mir-29. Studi ini menggarisbawahi
kemungkinan peluang terapi baru untuk mengurangi reaksi fibrosis setelah infark
miokardium dan konsekuensi patofisiologis yang tidak diinginkan. Hasil Van
Rooij's baru-baru ini dikonfirmasi oleh Wang dkk. dalam sebuah penelitian
bertujuan untuk mengungkap aspek molekul reverse remodeling pada tikus.
Para penulis juga menemukan bahwa, dalam suatu model tikus dengan
gagal jantung, ada upregulation mir-21 tapi mir ini terlokalisir terutama di
fibroblast dengan tingkat yang rendah hanya di kardiomiosit. Target mir-21 adalah
Spry-1 (sprouty homolog 1), penghambat jalur ERK / MAP kinase signaling.
ERK / MAP kinase jalur memberikan peranan penting dalam mengatur
kelangsungan hidup fibroblas dan sekresi faktor pertumbuhan, mengendalikan
tingkat fibrosis miokard. 7

MicroRNAs dan Infark Miokard

Setelah oklusi tiba-tiba arteri koroner, terjadi nekrosis miokard.
Perpanjangan cedera otot jantung tidak hanya penyumbatan untuk daerah yang
disediakan oleh arteri koroner saja, tetapi juga oleh karena lama iskemia dan
besarnya jaminan sirkulasi. Saat ini diyakini bahwa sebagian kecil dari
kardiomiosit mati pada saat reperfusi, melalui beberapa mekanisme termasuk
cepat pulihnya pH fisiologis, kelebihan kalsium intraseluler, generasi spesies
oksigen reaktif, reenergization mithocondrial dan afflux sel-sel inflamasi. Secara
global jenis ini disebut cedera reperfusi miokard, dan apoptosis seharusnya
menjadi mekanisme terkemuka sekarang. Adalah mungkin untuk mengurangi
843
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

cedera reperfusi miokard, di tingkat eksperimental, untuk target (dengan sirnas)

apoptosis protein terkait seperti Fas.7 Salah satu faktor penentu utama kurangnya
kontraktilitas dan perbaikan negatif setelah infark miokardium adalah fibrosis
peningkatan matriks ekstraseluler (ECM). Meningkatnya kekakuan fibrosis
miokard menyebabkan disfungsi diastolik, memberikan kontribusi pada hilangnya
fungsi pompa dan mencegah perbaikan miokard. Ini juga merupakan faktor
predisposisi untuk aritmia jantung melalui kelainan pada jantung konduktansi.
Fibrosis setelah infark miokardium merupakan hasil dari transformasi fenotipik
fibroblas miokard ke myofibroblasts mensekresi molekul ECM. Rooij et al Van.
menguraikan peran microRNAs dalam reaksi fibrosis untuk MI dalam sebuah
karya. 4
Infark miokardium merupakan penyebab terkemuka di dunia morbiditas
dan kematian. Sebuah diagnosis dini dan benar mungkin memerlukan inisiasi
segera terapi reperfusi yang berpotensi mengurangi tingkat kematian. Biomarker
yang digunakan untuk menegakkan diagnosa pada pasien dengan infark
miokardium, sebagian besar adalah analisa protein miokard dan penting untuk
diagnosis infark miokardium. Biomarker seperti isoenzim creatine kinase-MB,
mioglobin jantung, dan troponin telah banyak diterapkan dalam diagnosis klinis.
Di antaranya, troponin jantung saat ini dianggap sebagai gold standard untuk
diagnosis infark miokardium. Namun, eksplorasi biomarker baru dengan
sensitivitas tinggi dan spesifisitas dalam diagnosis awal infark miokardium tidak
pernah berhenti.
microRNAs (miRNAs) adalah kelas dari RNA noncoding 19-25-
nukleotida yang telah terlibat dalam mengatur proses diversecellular, seperti
proliferasi, diferensiasi, pengembangan, dan kematian sel. Meskipun fungsi
biologis miRNAs tidak sepenuhnya dipahami, jelas bahwa beberapa miRNAs
hadir secara jaringan atau sel-spesifik. Beberapa cardiacspecific miRNAs,
termasuk mir-1, mir-133a, dan mir-208, memainkan peran penting dalam
mempertahankan pembangunan dan fungsi. mir-499 dan-mir 208 secara khusus
dipresentasikan dalam jantung, sedangkan mir-1 dan mir-133a dipresentasikan
jantung dan otot rangka. mir-1, mir-133a, mir-499, dan mir-208 tinggi dalam
darah dari pasien dengan infark miokardium dibandingkan dengan mereka yang
berasal dari pasien tanpa infark miokardium. Penerima analisis karakteristik lebih
lanjut menunjukkan bahwa keempat miRNAs mungkin biomarker baik untuk
diagnosis infark miokardium. Hasil ini sebagian didukung oleh laporan yang
sangat baru yang mir-1 secara signifikan lebih tinggi dalam plasma dari pasien
infark miokardium dibandingkan dengan subyek non- infark miokardium. Namun,
hasil ekspresi profil sebelumnya mengungkapkan adanya mir-1, mir-133a, dan
mir-499 dalam otot rangka sehingga mir-1 dan mir-133a pada otot rangka yang
bahkan lebih tinggi daripada yang di dalam jantung. Hasil dari percobaan hewan
menunjukkan bahwa peningkatan kadar plasma ketiga miRNAs mungkin karena
cedera otot rangka, menunjukkan bahwa mir-1, mir-133a, dan mir-499 juga bisa
dilepaskan dari otot rangka injured selama prosedur operasi dan dengan demikian
844
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

kurang kekhususan-mutlak. Iskemia miokard adalah suatu kondisi di mana aliran

darah ke jantung koroner berkurang, yang menyebabkan kekurangan oksigen dan
pasokan nutrisi ke jantung. Dalam pengaturan klinis, reperfusi jantung iskemik
dicapai dengan angioplasti primer, sebuah proses yang, jika diinduksi awal,
menyelamatkan sebagian besar dari infark miokardium. Namun, hal ini sering
dikaburkan oleh proses yang merugikan seperti cedera yang menakjubkan
miokard dan remodeling jantung, hipertrofi ventrikel yaitu, fibrosis interstisial,
disfungsi kontraktil, peradangan, dan dilatasi ruang.
Baik kardiomiosit dan non-miosit yang terkena, dan pada tingkat
molekuler, beberapa sistem sinyal ekstra dan intraselular yang terlibat, merancang
banyak faktor yang menentukan manifestasi fenotipik akhir dari cedera dan
prognosis penyakit. Pada fase akut miokard-reperfusi iskemia (I/R), aktivasi
metaloproteinase matriks (MMPs) memungkinkan degradasi kolagen sehubungan
dengan urat saraf dan pembelahan membrane sekitar miosit nekrotik merupakan
prasyarat untuk invasi dan proliferasi sel, misalnya fibroblast, inflamasi, dan sel-
sel vaskular untuk memastikan perbaikan jaringan dan pembentukan parut. Hal ini
untuk kepentingan klinis dalam memahami proses mengidentifikasi terapi baru
untuk mencegah cedera ventrikel dan remodeling maladaptif dan disfungsi dalam
menanggapi I/R. Dalam hal ini, studi oleh Roy et al. membuka aspek novel
dengan menunjukkan bahwa-microRNA 21 (mir-21) meningkatkan susunan
dalam fibroblas jantung setelah I/ R injured dan ada yang berpotensi memainkan
peran penting dalam mengatur jalur sinyal utama dan efektor hilir mereka. Roy
dkk., menggunakan laser microdiseksi menangkap, melaporkan induksi mir -21
khusus di zona infark jantung dikenakan ke I/R. Sebagai target langsung mir-21 di
fibroblas, penulis mengidentifikasi homolog phosphatase and tension homologue
(PTEN), dan protein fosfatase, yang secara negatif mengatur PI3K-Akt signaling
serta jalur sinyal lain dan mempengaruhi fitur seluler seperti kelangsungan hidup,
pertumbuhan, metabolisme, sintesis protein, dan aktivitas sekresi. Represi mir-21-
dependent PTEN menyebabkan induksi signifikan PI3K dan aktivitas Akt
ditinggikan. Down regulated mir-21 di daerah infark dihambat oleh
preconditioning iskemik, cara perlindungan jantung. Ekspresi mir-21 melalui
adenovirus mengekspresikan mir-21 (Ad-mir-21) menurunkan ukuran infark
miokard sebesar 29% pada 24 jam dan menurunkan dimensi ventrikel kiri di 2
minggu sesudah infark miokardium. Menggunakan kedua pendekatan gain-of
function” dan “loss-of-function” di jantung kultur miosit, kami mengidentifikasi
bahwa mir-21 memiliki efek perlindungan terhadap iskemia-apoptosis sel yang
dikaitkan dengan kematian sel gen target dan protein aktivator jalur 1. Dampak
perlindungan mir-21 terhadap kerusakan miosit akibat iskemia jantung selanjutnya
dikonfirmasikan in vivo dengan apoptosis di perbatasan dan daerah infark dari
jantung tikus setelah pengobatan dengan Ad-mir-21. Jaringan elemen laser
ditangkap dari tempat infark menunjukkan induksi mir-21. Dalam penelitian
hibridisasi in situ menggunakan probe mir-21-spesifik diidentifikasi daerah infark
jantung. Imunohistokimia data menunjukkan bahwa fibroblas jantung (CF) adalah
845
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

tipe sel utama di zona infark. Studi dengan CF isolasi menunjukkan bahwa
fosfatase dan homolog tensin (PTEN) adalah target langsung mir-21. Modulasi
ekspresi mir-21 diatur metalloprotease matriks-2 (MMP-2) melalui jalur PTEN.
Terdapat penurunan tajam dalam ekspresi PTEN di zona infark. Penurunan ini
dikaitkan dengan peningkatan ekspresi MMP-2 di daerah infark. Dapat
disimpulkan bahwa mir-21 mengatur ekspresi MMP-2 di CF dari zona infark
melalui jalur PTEN. 7

Lokalisasi mir-21 di bagian jantung dicapai dengan menggunakan analisa hibridisasi in

situ. (A) mir-21 (biru) terbukti di wilayah infark (i). Fibroblast mewakili tipe sel utama di
wilayah ini diidentifikasi menggunakan analisis imunohistokimia dengan antibodi anti-
vimentin (coklat) (ii,) mir-21 (i)] tidak jelas di bagian serial ketika LNA probe miRNA ini
digunakan (iii). (B) gambar dari daerah non-infark tidak menunjukkan atau sinyal lemah
(biru) untuk (i) mir-21. Distribusi fibroblas dan miosit dalam infark non-(kontrol)
ditunjukkan dengan menggunakan anti-vimentin (ii, coklat, fibroblas), atau aktin anti-otot
(iii coklat, miosit) antibodi pewarnaan imunohistokimia.11

miRNAs dan Apoptosis Kardiomiosit

Kehilangan miosit jantung akibat kematian sel apoptosis adalah umum
untuk iskemi miokard, hipertrofi jantung, dan kegagalan jantung. Semakin banyak
bukti menunjukkan bahwa regulator apoptosis miRNAs juga terlibat dalam
penyakit jantung. Baru-baru ini ditunjukkan bahwa level mir-1meningkat pada
infark miokardium dimana apoptosis memainkan peran penting dalam perubahan
yang merugikan jantung. Selain miRNAs merangsang hipertrofi; -mir 1, mir-133,
dan mir-21, dikenal sebagai regulator apoptosis. miRNAs lain seperti mir-195,
mir-18b, dan mir-208 yang mengatur hipertrofi, juga memiliki potensi untuk
846
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

mengatur apoptosis, meskipun data percobaan masih kurang. Menurut prediksi

bioinformatika, mir-195 bisa menekan beberapa gen kelangsungan hidup termasuk
gen Bcl-2, gen E2F, Akt, dan NF2, sebagai regulator proapoptosis. Demikian
pula, mir-18b juga memiliki potensial untuk mengatur beberapa gen antiapoptosis,
termasuk Akt, Sp1 Bcl-2, E2F, dan IGF1. 10

miRNA dan AntimiRNA

Peran miRNAs dalam patogenesis jantung dan pembuluh bertujuan kepada
kemungkinan miRNAs sebagai target untuk pengobatan penyakit jantung. Untuk
mencapai itu, strategi untuk memanipulasi miRNAs dengan mempengaruhi
ekspresi mereka, stabilitas, dan fungsi diperlukan. Strategi melibatkan pendekatan
“gain-of function” dan “loss-of-function”. Beberapa teknologi yang inovatif telah
dikembangkan untuk tujuan ini selama beberapa tahun terakhir. Pengadaan
miRNAs buatan Beberapa miRNAs menurun ekspresinya dalam jaringan
kardiovaskular dan koreksi ekspresi miRNAs ini dengan "terapi penggantian"
mungkin merupakan pendekatan yang efisien.
Pengenalan miRNAs sintetis ke dalam sel sebagai “gain-of function” telah
terbukti layak dalam banyak kondisi. AntimiRNA oligonukleotida antisense
inhibitor merupakan artifisial komplementer oligonukleotida dirancang untuk
menargetkan miRNAs. Dengan cara ini, AntimiRNA oligonukleotida
menghapuskan target miRNAs. Hal ini mengakibatkan inhibisi spesifik mirna,
memperkuat strategi “loss-of-function” untuk mengganggu ekspresi. Ketika
miRNA terpasang dengan gugus kolesterol dan dapat memsuki sel, AntimiRNA
oligonukleotida itu disebut "antagomirs".
Antagomirs dapat digunakan untuk mengikat miRNAs yang tidak
diinginkan dan telah terbukti mampu membungkam miRNAs di jantung tikus.
Saat ini, AntimiRNA oligonukleotida telah menjadi alat yang diperlukan untuk
penelitian miRNAdan juga telah diusulkan untuk menjadi agen terapi yang
potensial. Ebert et al. menemukan pendekatan inovatif dengan fakta bahwa
interaksi antara miRNA dan target tergantung pada pasangan basa di posisi 2-8
dari miRNA. Para penulis mengikatkan miRNA ke 3'UTR didorong oleh
promotor sitomegalovirus, yang dapat menghasilkan ekspresi berlimpah transkrip
inhibitor kompetitif dan hal ini mencegah pembelahan RNA jenis gangguan dan
degradasi RNA. Gen masing-masing mungkin beregulasi oleh beberapa miRNAs.
Hal ini menunjukkan bahwa tindakan miRNAs adalah mengikat urutan tertentu
tetapi tidak spesifik sama, demikian juga, AntimiRNA oligonukleotida. Hal ini
merupakan kendala bagi pengembangan sebagai obat karena mereka mungkin
menimbulkan efek samping yang tidak diinginkan dan toksisitas. Untuk mengatasi
masalah ini, dikembangkan mir-Mask yang dirancang untuk menjadi persis
antisense ke miRNA endogen pada 3'UTR dari mRNA target. Setelah
diperkenalkan ke dalam sel, mir-mask dapat membentuk dupleks dengan mRNA
target dengan afinitas yang lebih tinggi dari miRNA endogen. Dengan cara ini,

847
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

tindakan mir-Mask sebagai pelindung target memblokir miRNA akibat dari efek
represif yang dihasilkan oleh miRNA itu. 10

Rancang Studi microRNA

Untuk menguji peran miRs dalam patologi manusia, kebanyakan studi
menggunakan metode high through put untuk menganalisis ekspresi mir dalam
sampel klinis. Profil miRs merupakan tantangan bagi beberapa alasan. Pertama,
teknik konvensional digunakan untuk profiling mRNA harus disesuaikan dengan
molekul yang sangat pendek (dalam jangkauan primer PCR konvensional),
dengan perbedaan minimal dalam urutan antara satu sama lain (kadang-kadang
hanya satu nukleotida), dengan berbagai temperatur leleh dan tanpa ekor poli A
pada ujung 3’. Namun, banyak metode telah dikembangkan menunjukkan
semakin pentingnya miRs profil dalam penelitian dan dalam aplikasi diagnostik
dan terapi yang potensial.
Secara historis, Northern Blotting metode terlebih dahulu. Northern
Blotting memiliki keunggulan untuk mendapatkan pemisahan molekul yang
berbeda dalam rangka untuk mengidentifikasi mereka dan memberikan beberapa
informasi tentang dimensi yang berguna untuk membedakan antara pra-mir dan
bentuk dewasa.
Metode High trough puts diwakili oleh microarray microRNA dan QRT-
PCR. Sebuah studi microarray adalah teknik untuk mRNA atau mir profiling
berdasarkan beberapa, reaksi hibridisasi simultan, antara amobil probe (biasanya
terlihat di permukaan slide kaca) dan sasaran diberi label. Dalam microarray mir
target adalah miRs diekstraksi dari sampel biologis dan probe yang sintetis,
pendek, oligonukleotida melengkapi. Croce et al. adalah yang pertama untuk
menerapkan teknik untuk mir profil pada tahun 2004. Amplifikasi target sebelum
hibridisasi memberikan kesulitan karena ketidakmungkinan untuk menggunakan
primer PCR konvensional karena mereka berada dalam rentang dimensi yang
sama template. Setting optimal kondisi hibridisasi adalah penting juga, karena
array harus membedakan antara molekul yang terkadang berbeda hanya untuk satu
nukleotida. Selain itu, kelompok bahan kimia tambahan tidak boleh mengganggu
hibridisasi dan harus memberikan sinyal cukup kuat untuk dideteksi. Keuntungan
utama dari microarray mir adalah, dalam sintesis, diwakili oleh kekhususan tinggi
reaksi, sedangkan kelemahannya utama adalah diwakili oleh sensibilitas rendah.
Saat ini dapat diisolasi, label dan mempersiapkan mikroarray microRNA
untuk mengkarakterisasi miRs untuk diagnostik, prognostik dan penatalaksanaan.
Kuantitatif-RT-PCR adalah metode lain high through put yang menyajikan
beberapa kesulitan teknis utama (karena sesak template) bila diterapkan untuk
mempelajari miRs. Kebanyakan makalah penelitian ilmiah menerbitkan
penggunaan microarray mir dikombinasikan dengan analisis statistik sebagai
metode high through put yang disukai. Namun masing-masing metode ini hanya
memberikan bukti bahwa ekspresi diubah atau pemrosesan dari beberapa miRs
terlibat dalam penyakit manusia tertentu. Untuk membangun peran kausal dalam
848
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

patogenesis penyakit tertentu langkah selanjutnya adalah diwakili oleh validasi

hasil yang diperoleh dalam fase pertama melalui metode alternatif sebagai QRT-
PCR (jika kita awalnya digunakan microarray atau sebaliknya) atau Northern
Blotting. Setelah terfokus pada sejumlah calon beberapa miRs maka dimulai "in
silico", target miRs disregulasi diendapkan pada database line dan untuk
menguraikan hipotesis patogenesis. Akhirnya, ada perkembangan in vitro dan in
vivo model overekspresi atau downregulation dari miRs yang dipilih. 7

Tabel 3 : Metode Profilling miRNA 7

High-
Requires
through-
Retro
  Advantages Disadvantages out
Transcript.
       
Supplies both qualitative and
Northern quantitative Laborious No No

Blotting information High specificity Low sensibility    

qRT-PCR High sensibility Requires sample Yes Yes

Requires low starting amount
  of total RNA manipulation (retro    
Allows discrimination
  between miRs that transcription)    

  differ only by few nucleotides Technically challenging    

MicroRNA Specificity      
microarra
y Ease of automation Low sensibility Optional Yes
It is able to study hundred of
  miRs in Requires high starting    

  a single experiment amount of total RNA    

Bead
based Specificity Requires a flow cytometer Yes Yes
Requires high starting
methode amount of total RNA Requires both amplification    

    and hybridization steps    

Allows identification of new
MIRAGE miRs Requires both amplification Yes Yes

    and hybridization steps    

849
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

    Requires sequencing    

RAKE High sensibility Requires an amplification No Yes

Allows discrimination
  between miRs that step to magnify the signal    

  differ only by few nucleotides      

  No sample manipulation      
qRT-PCR : Quantitative Real Time PCR
MIRAGE : MicroRNA serial Analysis of Gene Expression
RAKE : RNA primed-Array-based Klenow Enzyme assay
Kesimpulan dan Saran
Mengingat bahwa banyak penyakit yang ditandai oleh ekspresi mir
abnormal, miRs dapat digunakan sebagai penanda diagnostik dan prognostik baru.
Beberapa cardiacspecific miRNAs, termasuk mir-1, mir-133a, dan mir-208,
memainkan peran penting dalam mempertahankan pembangunan dan fungsi. mir-
499 dan-mir 208 secara khusus dipresentasikan dalam jantung, sedangkan mir-1
dan mir-133a dipresentasikan jantung dan otot rangka. mir-1, mir-133a, mir-499,
dan mir-208 tinggi dalam darah dari pasien dengan infark miokardium
dibandingkan dengan mereka yang berasal dari pasien tanpa infark miokardium.
mir-21 memiliki efek perlindungan terhadap iskemia-apoptosis sel yang dikaitkan
dengan kematian sel gen target dan protein aktivator . Identifikasi miRNA sangat
diperlukan untuk menemukan awal dan diferensial diagnosis penyakit yang
ditandai dengan tingkat abnormal miRs tertentu pada jaringan atau lebih baik,
dalam serum. Untuk menguji peran miRNA dalam patologi manusia, kebanyakan
studi menggunakan metode high through put untuk menganalisis ekspresi mir
dalam sampel klinis. Saat ini juga, AntimiRNA oligonukleotida telah menjadi alat
yang diperlukan untuk penelitian miRNAdan juga telah diusulkan untuk menjadi
agen terapi yang potensial.

DAFTAR PUSTAKA
Ardekani, Ali M, Moslemi, Mozhgan. The Role of MicroRNAs in Human
Diseases. J Med Biotech. 2010; 2: 161-179
BOŠTJANČIČ, E. MicroRNA miR-1 is Up-regulated in Remote Myocardium in
Patients with Myocardial Infarction. Folia Biologica (Praha). 2010; 56: pp.
27-31
Cheng, Yunhui et al. MicroRNA-21 protects against the H2O2-induced injury on
cardiac myocytes via its target gene PDCD4. Journal of Molecular and
Cellular Cardiology. 2009; 47: pp. 5–14

850
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

D’Alessandra Yuri et al. Circulating microRNAs are new and sensitive

biomarkers of myocardial infarction. European Heart Journal. 2010; 31: pp.
2765–2773
Dong, Shimin et al. MicroRNA Expression Signature and the Role of MicroRNA-
21 in the Early Phase of Acute Myocardial Infarction. THE JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY. 2009 October 23; 284: pp. 29514–29525
Fiedler, S, Gupta, S. K, Thum, T. MicroRNA-Based Theurapetic Approaches in
the Cardiovascular System. Cardiovascular Theurapetics. 2010.
Gerald, Karp. Expression of Genetic Material:From Transcription to translation,
Cell and Molecular Biology,4th Edition, 436-476.
Greco, Simona et al. Common micro-RNA signature in skeletal muscle damage
and regeneration induced by Duchennemuscular dystrophy and acute
ischemia. The FASEB Journal. 2009; 23: pp. 3335–3346
Haghikia, Arash Haghikia, Hilfiker-Kleiner, Denise. MiRNA-21: a key to
controlling the cardiac fibroblast compartment?. 2009; 82
H´ebert, S´ebastien. Putative Role of MicroRNA-Regulated Pathways in
Comorbid Neurological and Cardiovascular Disorders. Hindawi Publishing
Corporation Cardiovascular Psychiatry and Neurology. 2009
Hu, Hailiang, Gatti, Ricahard A. MicroRNA : new players in the DNA damage
response. Journal of Molecular Cell Biology Advance. 2010
Hsieh et all. 123RMicroRNA profiling in ischemic injury of the gracilis muscle in
rats. BMC Musculoskeletal Disorders. 2010; 11: 123
Idikio, Halliday. A Post myocardial Infarct Remodeling and Heart Failure :
Potential Contributions from Pro-and Antiaging Factors. SAGE Hindawi
Accessto Research Cardiology Research and Practice. 2011
Latronico, Michael V G, Condorelli, Gianluigi. microRNAs in hypertrophy and
heart failure. Experimental Biology and Medicine. 2011
Pocock, Roger. Decoding the microRNA response to hypoxia. Pflugers Arch - Eur
J Physiol. 2011; 461: pp. 307–315
Roy, Sashwati et al. MicroRNA expression in response to murine myocardial
infarction: miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase
and tensin homologue. cardiovascres.oxfordjournals.org. 2011 April 10
Silvestri, Pasquale. MicroRNAs and Ischemic Heart Disease: Towards a Better
Comprehension of Pathogenesis, New Diagnostic Tools and New
Therapeutic Targets. Cardiovascular Drug Discovery. 2009; 4: 109-118

851
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

Van Rooij, Eva. Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals

a role of miR-29 in cardiac fibrosis. PNAS. 2008 September 2; 105: pp.
13027–13032
Wang, Guo-Kun. Circulating microRNA: a novel potential biomarker for early
diagnosis of acute myocardial infarction in humans. European Heart
Journal. 2010; 31: pp. 659–666
Wang, Zhiguo et al. miRNAs at the heart of the matter. J Mol Med. 2008; pp.
771–783
Yi, SHI. MicroRNA in cell differentiation and development. Science in China
Series C: Life Sciences. 2009 Mar; 52: 205-211
Yellon, Derek M, Hausenloy, Derek J. Myocardial Reperfusion Injury. Engl J
Med. 2007; 357: pp. 1121-1135
Zhang, Chunxiang. MicroRNA : role in cardiovascular biology and disease.
Clinical Science. 2008; 114: pp. 699-706.

852
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

853
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

1. BOŠTJANČIČ, E et al.MicroRNA miR-1 is Up-regulated in

Remote Myocardium in Patients with Myocardial Infarction.

Folia Biologica (Praha). 2010; 56: pp. 27-31

2. Pocock, Roger. Decoding the microRNA response to hypoxia.

Pflugers Arch - Eur J Physiol. 2011; 461: pp. 307–315

3. Van Rooij, Eva. Dysregulation of microRNAs after myocardial

infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis. PNAS.

2008 September 2; 105: pp. 13027–13032

4. Haghikia, Arash Haghikia, Hilfiker-Kleiner, Denise. MiRNA-

21: a key to controlling the cardiac fibroblast compartment?.

2009; 82

5. Dong, Shimin et al. MicroRNA Expression Signature and the

Role of MicroRNA-21 in the Early Phase of Acute Myocardial

Infarction. THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY.

2009 October 23; 284: pp. 29514–29525

6. Yi, SHI. MicroRNA in cell differentiation and development.

Science in China Series C: Life Sciences. 2009 Mar; 52: 205-

211

7. Silvestri, Pasquale. MicroRNAs and Ischemic Heart Disease:

Towards a Better Comprehension of Pathogenesis, New

854
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

Diagnostic Tools and New Therapeutic Targets. Cardiovascular

Drug Discovery. 2009; 4: 109-118

8. D’Alessandra Yuri et al. Circulating microRNAs are new and

sensitive biomarkers of myocardial infarction. European Heart

Journal. 2010; 31: pp. 2765–2773

9. Ardekani, Ali M, Moslemi, Mozhgan. The Role of MicroRNAs

in Human Diseases. J Med Biotech. 2010; 2: 161-179

10. Wang, Zhiguo et al. miRNAs at the heart of the matter. J Mol

Med. 2008; pp. 771–783

11. Roy, Sashwati et al. MicroRNA expression in response to

murine myocardial infarction: miR-21 regulates fibroblast

metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue.

cardiovascres.oxfordjournals.org. 2011 April 10

12. Wang, Guo-Kun. Circulating microRNA: a novel potential

biomarker for early diagnosis of acute myocardial infarction in

humans. European Heart Journal. 2010; 31: pp. 659–666

13. Gerald, Karp. Expression of Genetic Material:From

Transcription to translation, Cell and Molecular Biology,4th

Edition, 436-476.

855
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

14. Fiedler, S, Gupta, S. K, Thum, T. MicroRNA-Based

Theurapetic Approaches in the Cardiovascular System.

Cardiovascular Theurapetics. 2010.

15. Zhang, Chunxiang. MicroRNA : role in cardiovascular biology

and disease. Clinical Science. 2008; 114: pp. 699-706.

16. Hu, Hailiang, Gatti, Ricahard A. MicroRNA : new players in

the DNA damage response. Journal of Molecular Cell Biology

Advance. 2010

17. Latronico, Michael V G, Condorelli, Gianluigi. microRNAs in

hypertrophy and heart failure. Experimental Biology and

Medicine. 2011

18. Idikio, Halliday. A Post myocardial Infarct Remodeling and

Heart Failure : Potential Contributions from Pro-and Antiaging

Factors. SAGE Hindawi Accessto Research Cardiology

Research and Practice. 2011

19. Hsieh et all. 123RMicroRNA profiling in ischemic injury of the

gracilis muscle in rats. BMC Musculoskeletal Disorders. 2010;

11: 123

20. H´ebert, S´ebastien. Putative Role of MicroRNA-Regulated

Pathways in Comorbid Neurological and Cardiovascular

856
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

Disorders. Hindawi Publishing Corporation Cardiovascular

Psychiatry and Neurology. 2009

21. Greco, Simona et al. Common micro-RNA signature in skeletal

muscle damage and regeneration induced by

Duchennemuscular dystrophy and acute ischemia. The FASEB

Journal. 2009; 23: pp. 3335–3346

22. Cheng, Yunhui et al. MicroRNA-21 protects against the H2O2-

induced injury on cardiac myocytes via its target gene PDCD4.

Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2009; 47: pp. 5–

14

23. Yellon, Derek M, Hausenloy, Derek J. Myocardial Reperfusion

Injury. Engl J Med. 2007; 357: pp. 1121-1135

Bagaimana Studi microRNA Dirancang?

ABSTRACT

microRNAs (miRNAs) are single strands of non-coding RNA molecules

consisting of 20-24 nucleotides, and a post-transcriptional regulator of gene

857
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

expression by inhibiting translation of mRNA in protein synthesis or causing

mRNA degradation. Many studies have found the function of miRNAs in regulating
various growth and physiological functions and pathological conditions, even when
miRNAs increasingly involved in the regulation of physiological and pathological
conditions of the heart. In the pathophysiology of myocardial infarction, many
subtypes Mirna have an important role, as well as on the state of post-myocardial
infarction. Some cardiacspecific miRNAs, including mir-1, mir-133a, and mir-208,
plays an important role in maintaining growth and cardiac function, and in many
previous studies mir-1, mir-133a, mir-499, and mir-208 high in the blood of
patients with myocardial infarction compared with those from patients without
myocardial infarction. In addition, mir-21 has a protective effect against ischemia-
cell apoptosis. To test miRs role in human pathology, most studies using high-
through put method to analyze the expression of mir in clinical samples. Right now,
AntimiRNA oligonucleotides have become the tools necessary to research
miRNAdan also been suggested to be a potential therapeutic agent.
-------------
Key Words : microRNA, myocardial infarction, cardiacspecific miRNAs,
antimiRNA

ABSTRAK

microRNAs (miRNAs) adalah untaian tunggal molekul RNA non-

coding yang terdiri dari 20-24 nukleotida, dan merupakan regulator ekspresi
gen paska transkripsi dengan cara menghambat translasi mRNA dalam
mensintesis protein atau menyebabkan degradasi mRNA. Banyak penelitian
menemukan fungsi miRNAs dalam pengaturan berbagai fungsi
perkembangan dan fisiologis, dan kondisi patologi, bahkan saat ini miRNAs
semakin terlibat dalam regulasi fisiologis dan kondisi patologis jantung.
Dalam patofisiologi infark miokardium, banyak subtipe miRNA mempunyai
peranan penting, termasuk juga pada keadaan post infark miokardium.
Beberapa cardiacspecific miRNAs, termasuk mir-1, mir-133a, dan mir-208,
memainkan peran penting dalam mempertahankan pertumbuhan dan fungsi
jantung; dan dalam banyak penelitian sebelumnya mir-1, mir-133a, mir-499,
dan mir-208 tinggi dalam darah dari pasien dengan infark miokardium
dibandingkan dengan mereka yang berasal dari pasien tanpa infark
miokardium. Selain itu mir-21 memiliki efek perlindungan terhadap
iskemia-apoptosis sel. Untuk menguji peran miRs dalam patologi manusia,
kebanyakan studi menggunakan metode high through put untuk
menganalisis ekspresi mir dalam sampel klinis. Saat ini juga, AntimiRNA
oligonukleotida telah menjadi alat yang diperlukan untuk penelitian
miRNAdan juga telah diusulkan untuk menjadi agen terapi yang potensial.
----------------
Kata Kunci : microRNA, infark miokardium, cardiacspecific miRNAs,
antimiRNA

858
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

Peranan Subtipe miRNA pada

Keadaan Post Infark

Miokardium

Christine Verawaty Sibuea

Staff Departemen Biokimia

Fakultas Kedokteran Universitas HKBP

Nomensen

Alamat Korespondensi :

Fakultas Kedokteran Universitas HKBP Nomensen

Jl.Sutomo no 4A
859
_____________
ISSN 0853-0203
 VISI (2012) 20 (1) 838-852

Telp : (061) 4533545

860
_____________
ISSN 0853-0203