Table of Contents

No. Title Page

1 The Influence of Carbofuran Exposure Toward White Pulp Diameter of Spleen of 100 - 105
Mice (Mus musculus)
2 Antibacterial Activity of the Supernatant of Soil Isolate Bacillus Subtilis Against 106 - 113
Aeromonas Hydrophila and Staphylococcus Aureus (In Vitro)
3 The Potential of Giving Synbiotic in Different Ages of Female Broilers on 114 - 119
Histological of Ileum
4 Evaluation Toluidine Blue Staining to Identify Connective Tissue Mast Cells 120 - 125
(CTMS) in Paraffin Block Thin Skin of Dog
5 Effect Using a Combination of MPA (Medroxy Progesterone Acetate) and 126 - 133
Prostaglandin (PGF2α) Injection on the Percentage of Estrous and Pregnant on
Sheeps
6 Spesifisity test with Dot Blotting of Epidermal Growth Factor (EGF) Isolated 134 - 139
from Cumulus Oocyte Complex After in Vitro Maturation
7 Analysis of Immunogenicity on Inactivated Dengue Virus (DENV-1, DENV-2, 140 - 145
DENV-3, DENV-4) in Mices (Mus musculus) as A Candidate Dengue Coctail
Vaccine
8 Detection Antibody of Brucella on Cattle Slaughtered in Krian Slaughter House 146 - 151
Sidoarjo Regency by Rose Bengal Test (RBT)
9 The Effect of Didecyldimethylammonium Chloride Disinfectants on Liver 152 - 157
Histophatolologycal of Duck Hybrid (Anas Platyrhynchos Domesticus)
10 The Effect of Cosmos Caudatus Leaf Ethanol Extract on Paracetamol Induced in 158 - 165
Histopathologic Liver of (Mus musculus) Balb / C Male
11 Antibacterial Test of Rumbia Root (Metroxylon sagu Rottb.) Decoction Against 166 - 171
Bacteria Salmonella pullorum
12 Effect of Sambiloto Leaf Extract (Andrographis paniculata Ness) to 172 - 177
Histopathological Pancreatic Langerhans Islet Cells on Rats (Rattus norvegicus)
with Cystic Ovary Model
13 Effect of Mangosteen (Garcinia mangostana L.) Pericarp Extract on TLR5 and 178 - 183
CD14 Expression in Immunized Mice Against Newcastle Disease Vaccine
14 Cloning Gene Fragments Non-Structural 1 (NS1) of Dengue Virus Subtype 1 184 - 193
(DENV-1) as A Material Candidate of Vaccine Chimera
15 Effect of vitamin E (α–tocopherol) on the Number of Leydig Cell in Mice Treated 194 - 199
with 2,3,7,8–tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)
 Vol. 7 - No. 2 / 2014-07
TOC : 6, and page : 134 - 139

Spesifisity test with Dot Blotting of Epidermal Growth Factor (EGF) Isolated from Cumulus Oocyte Complex After in Vitro
Maturation

Uji Spesifisitas dengan Dot Blotting terhadap Epidermal Growth Factor (EGF) yang Diisolasi dari Oosit Kumulus Komplek
Sapi Setelah Dimaturasi Secara In Vitro

Author :
Widjiati | widjiati@yahoo.com
Fakultas Kedokteran Hewan
Aulia Reza Pradipta | .
Fakultas Kedokteran Hewan
Dady Soegianto Nazar | .
Fakultas Kedokteran Hewan
A.T. Soelih Estoepangestie | .
Fakultas Kedokteran Hewan

Abstract

The aim of this study was to know the character of epidermal growth factor (EGF) protein isolated from bovine oocyte.
Bovine ovary was collected from slaughter house washed with NaCl. An aspiration technique was used to collect oocyte.
Those oocytes were maturated by in vitro condition then the EGF protein was isolated after running in SDS PAGE.
Polyclonal antibody was produced by sub cutaneous injected of crude protein oocytes containing EGF in rabbit, then
followed by dot blotting examination. Booster was done twice after 3rd and 7th bleeding then continued until 10 times
every week. The antibody anti EGF from rabbits sera was reacted with EGF antigen. The dot blot showed, the intensity of
dot color increased significantly from 4th bleeding and reaches the highest concentration of antibody at 9th bleeding. It
meant, bovine oocyte EGF protein could be characterized by dot blotting, of which the highest antibody titer detected at
eleventh week after sub cutaneous injection of crude protein oocytes containing EGF.

Keyword : Epidermal, Growth, Factor, In, vitro, Maturation, Dot, Blotting,

Daftar Pustaka :
1. Kobayashi, K., S.Yamashita and H. Hoshi, (1994). Influence of Epidermal Growth Factor And Transforming Growth
Factor on In Vitro Maturation of Cumulus Cell-Enclosed Bovine Oocytes in a Defined Medium. . : J. Reprod. Fertil. 100:
439-446
2. Lorenzo, P.L., I.K.M. Liu, J.C.Illera, R.A.Picazo, G.F.Carneiro, M.J. Illera, A.C. Conley, A.J.Ender, (2001).
Influence of Epidermal Growth Factor on Mammalian Oocyte Maturation via Tyrosine-Kinase Pathway. . : J. Physiol.
Biochem., 57 (1): 15-22
3. Baratawidjaja, K.G, (2006). Imunologi Dasar. Jakarta : Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia

Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Veterinaria Medika Vol 7, No. 2, Juli 2014

Uji Spesifisitas dengan Dot Blotting terhadap Epidermal Growth Factor (EGF)
yang Diisolasi dari Oosit Kumulus Komplek Sapi Setelah Dimaturasi
Secara In Vitro

Spesifisity test with Dot Blotting of Epidermal Growth Factor (EGF) Isolated
from Cumulus Oocyte Complex After in Vitro Maturation
1
Widjiati, 2Aulia Reza Pradipta, 1Dady Soegianto Nazar,
1
A.T. Soelih Estoepangestie
1
Fakultas Kedokteran Hewan Unair
2
PPDHFakultas Kedokteran Hewan Unair

Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo Surabaya-60115.

Telp. 031-5992785. Fax. 031-5993015
Korespondensi : Email: widjiati@yahoo.com

Abstract

The aim of this study was to know the character of epidermal growth factor (EGF)
protein isolated from bovine oocyte. Bovine ovary was collected from slaughter house
washed with NaCl. An aspiration technique was used to collect oocyte. Those oocytes
were maturated by in vitro condition then the EGF protein was isolated after running in
SDS PAGE. Polyclonal antibody was produced by sub cutaneous injected of crude
protein oocytes containing EGF in rabbit, then followed by dot blotting examination.
Booster was done twice after 3rd and 7th bleeding then continued until 10 times every
week. The antibody anti EGF from rabbits sera was reacted with EGF antigen. The dot
blot showed, the intensity of dot color increased significantly from 4th bleeding and
reaches the highest concentration of antibody at 9 th bleeding. It meant, bovine oocyte
EGF protein could be characterized by dot blotting, of which the highest antibody titer
detected at eleventh week after sub cutaneous injection of crude protein oocytes
containing EGF.

Keywords: epidermal growth factor, in vitro maturation, dot blotting

–––––––––––––––––––––––––––––––––––––

Pendahuluan Kualitas embrio yang diproduksi

Program pengembangan ternak dila-
kukan dengan peningkatan produktivitas
ternak sapi yang memiliki peran utama
sebagai penghasil pedet dengan salah
satu tujuan akhir untuk memenuhi
permintaan daging yang terus meningkat
(Hayati dan Choliq, 2009). Salah satu
alternatif pengembangan bidang teknologi
reproduksi untuk meningkatkan kualitas
reproduksi ternak adalah transfer embrio
(TE).
secara in vitro yang dihasilkan tersebut
salah satunya ditentukan dari faktor
oosit. Pertumbuhan dan perkembangan
oosit dipengaruhi oleh beberapa faktor
dalam folikulogenesis dan oogenesis
diantaranya hormon dan growth factor.
Growth factor merupakan faktor yang
berperan dalam peningkatan proliferasi
dan differensiasi sel granulosa, sehingga
menyebabkan terjadinya ekspansi kumulus
(Widjiati dkk., 2008). Frandson (1992)

134
Widjiati, dkk. Uji Spesifisitas dengan Dot Blotting....
menyatakan bahwa growth factor juga
mempunyai pengaruh penting dalam
menigkatkan sekresi protein pada cairan
folikel. Hal ini disebabkan growth
factor berperan dalam meningkatkan
transportasi asam amino melintasi membran
sel serta meningkatkan pengikatan asam-
asam amino sehingga membentuk
protein.
Epidermal growth factor (EGF)
adalah salah satu growth factor yang
ikut berperan penting dalam proses
folikulogenesis dan maturasi oosit.
Melalui penelitian yang telah dilakukan
diketahui epidermal growth factor mem-
berikan efek berupa stimulasi proliferasi
sel granulosa, modulasi steroidogenesis
pada sel granulosa, dan menstimulasi
pertumbuhan folikel (Lorenzo et al.,
2001). Growth factor ini disekresi oleh
sel teka yang bertindak sebagai faktor
parakrin untuk mengatur pertumbuhan
dan diferensiasi sel granulosa pada oosit
(Skinner et al., 1987). Kobayashi et al.,
(1994), Lonergan et al., (1996), dan
Wang et al., (2007) menyebutkan
penambahan EGF beserta beberapa
hormon dan growth factor lain dalam
media maturasi dapat meningkatkan
ekspansi sel kumulus, keberhasilan
fertilisasi dan perkembangan embrio.
Tujuan akhir diadakannya penelitian
ini adalah untuk modifikasi pada media
maturasi pada skala riset dengan
penambahan growth factor yang diisolasi
dari limbah ovarium sapi. Mengingat
epidermal growth factor memiliki peran
penting selama tahap folikulogenesis
yang merupakan rangkaian proses
maturasi in vitro, maka diperlukan suatu
penelitian untuk mengetahui keberadaan
protein EGF setelah di maturasi secara
in vitro. Penelitian ini bertujuan untuk
melihat karakter protein EGF melalui
uji spesifitas dengan menggunakan
metode dot blotting.
135
Materi dan Metode Penelitian
Sampel penelitian ini berupa oosit
kumulus komplek di aspirasi dari
ovarium. Ovarium diperoleh dari rumah
potong hewan dibersihkan dari organ
yang melekat, lemak dan darah
kemudian dibawa ke laboratorium in
vitro Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga dengan botol yang
berisi NaCl fisiologis dan gentamisin
sulfat lalu dimasukkan dibawa pada
suhu 30-35oC. Koleksi oosit dilakukan
dengan cara aspirasi menggunakan
jarum 18 G yang dihubungkan dengan
spuit 5 ml dan berisi 1 ml media TCM
199. Kemudian oosit dicuci berturut-
turut dalam media TCM 199 sebanyak
dua kali dengan pipet modifikasi.
Proses maturasi oosit menggunakan
medium TCM-199 yang ditambah 0,01
µg/ml FSH (Folligon®), 0,01 µg/ml LH
(Chorulon®), 3% BSA dan 50 µg/ml
gentamisin sulfat. Oosit dikultur dalam
50 µl medium tetes (tiap 50 µl berisi 8-
10 oosit) yang sebelumnya telah ditutup
dengan mineral oil. Pematangan oosit
dilakukan pada suhu 38,5 ºC di dalam
inkubator CO2 selama 20 jam. Oosit yang
telah dimaturasi kemudian dimasukkan
ke dalam tabung ependorff dan disimpan
ke dalam freezer sambil menunggu
untuk di lakukan isolasi protein EGF.
Oosit kumulus komplek yang
telah dimaturasi secara in vitro diambil
sebanyak 200 µl atau kurang lebih 300
oosit lalu diberi PBS Tween dan PMSF
sebanyak 1000 µl. Kemudian semua
sampel disonikasi menggunakan sonikator
selama 10 menit kemudian disentrifus
dengan kecepatan 10.000 rpm pada
suhu 4oC selama 15 menit untuk
memisahkan endapan (pelet) dengan
supernatan. Supernatan hasil sentrifus
diambil dan diberi penambahan etanol
absolut dengan perbandingan volume 1:1
atau sebanyak 500 µl agar proteinnya
mengendap yang kemudian diendapkan
dalam freezer dalam semalam agar
Veterinaria Medika Vol 7, No. 2, Juli 2014

diperoleh hasil yang maksimal. Setelah
diendapkan semalam dilakukan sentrifus
lagi dengan kecepatan 6.000 rpm selama 10
menit. Pelet hasil sentrifugasi ditambah
dengan Tris HCl dengan perbandingan
volume 1:1 kemudian dimasukkan
dalam ependorf dan disimpan dalam
freezer (Widjiati dkk., 2008).
Protein kasar yang diperoleh
kemudian dilanjutkan dengan elektroforesis
menggunakan SDS PAGE untuk
mengetahui berat molekul protein EGF.
Kemudian pita dengan berat molekul
46-47 kDa hasil SDS PAGE dipotong
kecil-kecil kemudian dimasukkan ke
dalam kantong selofan. Selanjutnya
masukkan kantong selofan tersebut
kedalam buffer fosfat untuk proses elek-
troelusi. Hasil elektroelusi digunakan
sebagai antigen pada tahap imunisasi.
Imunisasi dilakukan pada kelinci
secara sub kutan dan dilakukan dua hari
setelah pengambilan darah pre-imun
dengan 150 µl EGF + 150 µl CFA
sebagai adjuvant. Empat minggu kemudian
semua hewan coba diimunisasi ulang
(booster) dengan 150 µl EGF + 150 µl
IFA untuk meningkatkan respon imun
hewan coba. Booster II dilakukan dua
hari setelah pengambilan darah ke-7
dengan dosis yang sama dengan booster
pertama. Pengambilan darah dilakukan
hingga minggu ke-12.

Pi B B B3 B B5 B B7 B B B1
1 2 4 6 8 9 0

Minggu ke-
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

*I *BST *BST2
1

Gambar 1. Skema Imunisasi Hewan Coba

Keterangan:
Pi : Pengambilan darah pre-imun
I : Imunisasi menggunakan 150 µl EGF + 150 µl CFA
Bst1, Bst2 : Booster 1,2 dengan menggunakan 150 µl EGF + 150 IFA
B1, B2...B10: Pengambilan darah hari ke-
* : selang waktu 2 hari

Pengambilan darah dilakukan dengan menggunakan pipet dan simpan

melalui vena aurikularis sebanyak 3 ml
menggunakan spuit disposable. Masukkan
dalam tabung reaksi, miringkan 30o
kemudian tunggu kurang lebih hingga
satu jam hingga terbentuk endapan
kemudian sentrifus dengan kecepatan
3000 rpm selama 10 menit pada suhu
4oC untuk mendapatkan serum. Serum
dipindahkan kedalam tabung eppendorf
dalam suhu -20°C sampai saat dilakukan
purifikasi serum.
Serum diambil 200 µl dimasukkan
dalam tabung eppendorf kemudian
ditambahkan dengan amonium sulfat 50%
sebanyak 200 µl dan dihomogenasikan
dengan cara divortex. Setelah itu
dilanjutkan dengan sentrifus 10.000 rpm
selama 10 menit pada suhu 4oC. Endapan

136
Widjiati, dkk. Uji Spesifisitas dengan Dot Blotting....
yang terbentuk ditambah ammonium sulfat
50% sepuluh kali jumlah sampel lalu
dihomogenasikan dengan divortex dan
disentrifus kembali 10.000 rpm selama 10
menit. Endapannya kemudian ditambah
buffer fosfat 0,2 M; pH 8 dan
dimasukkan ke dalam kantong selofan,
kemudian dilakukan dialisis (salting
out) dalam buffer fosfat 0,1 M suhu 4°C
selama satu malam. Supernatan ditambah
etanol dingin dengan perbandingan 1:1 lalu
disimpan semalam dengan suhu 4oC
selanjutnya disentrifus 10.000 rpm
selama 10 menit. Endapan dikeringkan
dan dilarutkan dalam Tris HCl kemudian
disimpan dalam suhu -20oC (Aulanni’am,
2005).
Proses dot blot dilakukan dengan
mengencerkan antigen 20 μL dalam
PBS-sodium azida (NaN3) 1% (1:4) lalu
diteteskan pada membran nitroselulosa
yang telah dibasahi PBS yang telah
terangkai pada alat dot blotter, diegas
selama 30 menit. Membran + antigen
diblocking dengan PBS skim milk 5%
selama 1 jam, PBS skim milk dibuang
Pi 1 2
Kelinci 1
Kelinci 2
Gambar 2. Hasil uji dot blotting
Penilaian terhadap munculnya
warna pada dot blotting dipermudah
dengan menggunakan kategori skor dari
nol sampai dengan enam. Nilai nol
adalah tanda negative dan nilai satu
sampai enam adalah tanda positif. Nilai
satu adalah nilai positif terendah dan
nilai enam adalah nilai positif tertinggi
137
dan dicuci dengan PBS-Tween 20
0.05% selama 3x3 menit lalu diinkubasi
dalam serum/antibodi primer yang telah
diencerkan dalam PBS skim milk 5%
(1:200) selama 2 jam sambil digoyang.
Membran + Ag-Ab 1 20 μL dicuci
dengan PBS-Tween 20 0.05% selama
3x3 menit lalu diinkubasi dalam serum/
antibodi sekunder berlabel alkaline
phofatase (1:2500) yang telah diencerkan
dalam TBS selama 1 jam sambil digoyang.
Membran+Ag-Ab 1-Ab 2 (AP Conjugated)
dicuci dengan PBS-Tween 20 0.05%
selama 3x3 menit lalu diinkubasi dalam
substrat western blue selama 30 menit
sambil digoyang (dalam ruang gelap)
dan ditambahkan akuades lalu membran
dikeringkan.
Hasil dan Pembahasan
Gambaran hasil analisis dengan
uji spesifik dengan dot blotting,
diketahui reaksi spesifitas antara EGF
dengan antibodi poliklonal anti EGF
terlihat jelas warna dot yang terekspresi
pada gambar dibawah ini.
Bleeding ke-
3 4 5 6 7 8 9 10
yang didasarkan oleh semakin gelapnya
warna yang dibentuk. Pembacaan hasil
noda pada membran nitroselulosa diatas
akan lebih mudah dianalisa apabila
dibaca dalam bentuk skor penilaian
yang berdasarkan gradasi kegelapan
warna dot.
Veterinaria Medika
Tabel 1.Pembacaan skor hasil dot blotting
Pi 1 2 3 4
Kelinci 1 0 1 2 1
Kelinci 2 0 2 3 2
Rata-rata 0 1,5 2,5 1,5
Peningkatan konsentrasi antibodi
pada bleeding pertama dan kedua. Skor
yang ditunjukkan tidak terlalu tinggi
karena respon imun yang dihasilkan
masih berupa respon imun primer.
Menurut Tizard (1988), antibodi baru
ditemukan sekitar satu minggu setelah
pemberian antigen pertama dan kadarnya
meningkat dalam serum dan mencapai
puncaknya setelah 10-14 hari sebelum
menurun lagi dengan cepat. Jumlah
antibodi yang terbentuk dan tingkat
daya proteksi selama respon imun
primer relatif kecil sehingga pada
bleeding ketiga terjadi penurunan skor
akibat produksi antibodi yang telah
berkurang.
Pemberian booster pertama dila-
kukan dua hari setelah bleeding ketiga.
Kemudian skor hasil dot blot mengalami
peningkatan pada bleeding keempat dan
kelima yang kemudian menurun secara
perlahan pada bleeding keenam dan
ketujuh. Peningkatan kembali terjadi
setelah pemberian booster kedua.
Booster kedua dilakukan dua hari
setelah bleeding ketujuh. Lalu skor hasil
dot blot kembali menurun pada bleeding
kesepuluh setelah mencapai konsentrasi
tertinggi pada bleeding kesembilan.
Menurut Baratawidjaja (2006), imunisasi
berulang dengan selang waktu tertentu
dapat meningkatkan respon imun suatu
individu. Tizard (1988) juga menyatakan
bahwa penyuntikan antigen kedua
(booster) akan dapat meningkatkan antibodi.
Setelah diberikan booster pertama.
Hasil dot blot tersebut menunjukkan
gambaran bahwa konsentrasi antbodi
tertinggi diperoleh pada bleeding kesembilan
Vol 7, No. 2, Juli 2014
Bleeding ke-
5 6 7 8 9 10
2 4 5 4 3 6 2
4 5 4 3 4 5 2
3 4,5 4,5 3,5 3,5 5,5 2
setelah booster kedua dengan skor rata-
rata 5,5. Konsentrasi antibodi tertinggi
ini mungkin disebabkan karena pada
bleeding kesembilan antibodi yang
terkandung dalam serum berada dalam
konsentrasi yang paling tinggi.
Pemberian imunisasi setelah
pengambilan darah pre-imun hanya
memberikan hasil peningkatan skor
rata-rata dengan nilai 2,5 pada bleeding
kedua. Hasil ini sesuai dengan pernyataan
Abbas dan Litchman (2005) bahwa respon
imun primer mengakibatkan aktivasi pada
sel B sedangkan respon imun sekunder
menstimulasi peningkatan jumlah sel B
memori. Oleh karena itu respon imun
sekunder memiliki kandungan antibodi
yang diproduksi lebih tinggi daripada
respon imun primer.
Menurut Abbas dan Litchman
(2005), antigen merupakan molekul
yang dapat berkombinasi dengan antibodi
spesifik. Walaupun demikian tidak semua
antigen bersifat imunogenik. Imunogenisitas
dan antigenisitas memiliki hubungan yang
terkait, akan tetapi keduanya memiliki
definisi yang berbeda. Imunogenisitas
dinyatakan sebagai kemampuan antigen
untuk menginduksi respon imun humoral
ataupun cell mediated sedangkan antigenisitas
dinyatakan sebagai kemampuan substansi
asing untuk berkombinasi secara spesifik
dengan antibodi ataupun reseptor pada
permukaan sel (Goldsby et al., 2005).
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian ini
dapat disimpulkan bahwa terdapat spesifisitas
antara protein EGF yang diperoleh dari
oosit sapi dengan antibodi poliklonal anti
138
Widjiati, dkk. Uji Spesifisitas dengan Dot Blotting....
EGF yang diperoleh dari kelinci
(Oryctolagus cuniculus) hasil imunisasi
isolat protein EGF.
Daftar Pustaka
Abbas, A.K. and A.H.Litchman. 2005.
Cellular and Molecular Immunology.
Elsevier Saunder. Philadelphia
Aulanni’am. 2005. Protein dan Analisanya.
Citra Mentari Group. Malang
Baratawidjaja, K.G. 2006. Imunologi
Dasar. Fakultas Kedokteran
Universitas Indonesia. Jakarta
Frandson, R.D. 1992. Anatomi dan
Fisiologi Ternak. Edisi IV.
terjemahan B. Srigondo dan K.
Prasno. Gajah Mada University
Press. Yogyakarta
Goldsby, R.A., T.J. Kindt and A
Osborne. 2000. Immunology.
W.H. Freeman and Company.
California
Hayati, R.N. dan A. Choliq. 2009.
Gangguan Reproduksi, Salah
Satu Penghambat Perkembangan
Ternak Sapi (Studi Kasus di Desa
Padomasan Kabupaten Batang).
Seminar Nasional Kebangkitan
Peternakan. Semarang. 177-181
Kobayashi, K., S.Yamashita and H.
Hoshi. 1994. Influence of Epidermal
Growth Factor And Transforming
Growth Factor on In Vitro
Maturation of Cumulus Cell-
Enclosed Bovine Oocytes in a
Defined Medium. J. Reprod. Fertil.
100: 439-446
139
Lonergan, P., C. Carolan, A. Van
Langendonckt, I.Donnay, H.
Khatir and P. Mermilod. 1996.
Role of Epidermal Growth Factor in
Bovine Oocyte Maturation and
Preimplantation Embryo Development
In Vitro. Biology of Reproduction
54: 1420-1429
Lorenzo, P.L., I.K.M. Liu, J.C.Illera,
R.A.Picazo, G.F.Carneiro, M.J.
Illera, A.C. Conley, A.J.Enders
and M.Illera. 2001. Influence of
Epidermal Growth Factor on
Mammalian Oocyte Maturation
via Tyrosine-Kinase Pathway. J.
Physiol. Biochem., 57 (1): 15-22
Skinner, M.K., D. Lobb and J.H.
Dorrington. 1987. Ovarian Thecal/
Interstitial Cells Produce an
Epidermal Growth Factor-Like
Substance. Endocrinology 121
(5): 1892-1899
Tizard, I. 1988. Pengantar Imunologi
Veteriner. Airlangga University
Press. Surabaya
Wang, Z.G., Z.R.Xu, and S.D.Yu. 2007.
Effects of Oocyte Collection
Techniques and Maturation Media
on In Vitro Maturation and
Subsequent Embryo Development
in Boer Goat. Czech J. Anim.
Sci. 52(1): 21-25
Widjiati, N.Z.Hayati, Ismudiono dan
Sukmanadi. 2008. Identifikasi
Protein Growth Differentiation
Factor-9 (GDF) yang Diisolasi
dari Oosit pada Folikel Dominan
Ovarium Sapi. Veterinaria Medika
1(2):39-42