‫استنسال الجين ‪-: Gene cloning‬‬

‫عملية تكوين اتحادات جديدة عن طريق غرس قطعة ‪ DNA‬منتجة خارج الخاليا في بالزمي د او‬
‫فايروس او اي ناقل استنسال اخر مناسب ليتسنى ادخاله ا الى ك ائن اخ ر ال يحت وي اص ال مث ل ه ذه‬
‫الجزيئات بحيث يمكنها التكاثر المستمر في المضيف الجديد ‪.‬‬
‫*النقاط التي يؤكدها التعريف ‪-:‬‬
‫‪-1‬امكانية ادخال قطعة ‪ DNA‬غريبة الى الكائن ال يحتويها اصال وهذا يع ني امكاني ة تج اوز ح اجز‬
‫النوع (اي يمكن نقل جينات من كائن معين الى كائن اخر حتى لو كان عائدا الى النوع االخر)‪.‬‬
‫‪-2‬امكانية اكثار الجين المستنسل في المضيف الجديد والحصول على ماليين النس خ من ه حيث س وف‬
‫تحوي كل خلية من خاليا المضيف على نسخة او اكثر من الجين المستنسل ‪.‬‬

‫*الغرض من اكثار الجين ‪:‬‬

‫‪-1‬تجديد تتابع القواعد النيتروجينية لذلك الجين ‪.‬‬
‫‪-2‬اجراء عملية تطفير خارج الخاليا ‪.‬‬
‫‪-3‬تالعب في تتابع الجين للحصول على جين ذو مواصفات افضل من الجين االصلي ‪.‬‬
‫‪-4‬إلغراض اخرى مفيدة في تقنيات الهندسة الوراثية ‪.‬‬

‫‪-: Genetic Recombination‬عملي ة حيوي ة اساس ية لتب ادل المعلوم ات الوراثي ة بين‬
‫الكروموسومات المختلفة ‪.‬‬

‫اوالً‪ :‬اح داث اع ادة تواف ق عام ة او عادي ة ‪:‬بش كل ع ام تش ترك في تب ادل ‪ reciprocal‬من الم ادة‬
‫الوراثية و تحتاج تتابع ‪ DNA homology‬في مناطق التبادل ‪.‬‬
‫ثانيا ً ‪ :‬اح داث اع ادة التواف ق غ ير متب ادل ‪ non-reciprocal‬تش ترك في ادخ ال او حش ر قط ع من‬
‫‪ DNA‬عند مواقع كروموسومية التي تظهر القليل او ال تظهر ‪ homologous‬في التتابع ‪.‬‬

‫خطوات تجارب االستنسال ‪-:‬‬

‫‪ -1‬تكوين قط ع ‪ DNA‬مناس بة لالستنس ال وذل ك بمعامل ة نم وذج ‪ DNA‬ب أنزيم االن دونيوكليز‬
‫الخاص بالموقع مما يولد قطع ‪DNA‬ذات نهاية مناسبة الموقع ‪.‬‬
‫‪ -2‬ربط القطعة بناقل بالزميدي او فايروسي بمعاملتها مع أنزيم ‪. DNA ligase‬‬
‫‪ -3‬تقديم جزيئة ‪ DNA‬المنتجة من ‪ ligation‬الى نظام مض يف مناس ب مث ل ‪ E.coli‬بواس طة‬
‫‪ transformation‬او ‪ transduction‬او ‪. transfection‬‬
‫‪ -4‬حذف النسيلة المتحولة يحتاج انواع ‪ DNA‬هجينة ‪.‬‬
‫‪ -5‬عزل وتوصيف انواع ‪ DNA‬الهجينة في هذه النسائل ‪.‬‬

‫االحتياجات االساسية الستنسال الجين ‪-:‬‬

‫‪-1‬توفر طريقة مناسبة لعزل وتنقية جزيئه ‪ DNA‬المرغوب استنسالها ‪.‬‬
‫‪-2‬توفر ناقل استنسال مناسب يتم الحصول عليه بصورة نقية لربط قطعة ‪ DNA‬الغريبة بهذا الناقل ‪.‬‬
‫‪-3‬يجب توفر وسيلة مناسبة لتقطيع جزيئة ‪ DNA‬الغريبة للحصول على قطعة ‪ DNA‬ص غيرة قابل ة‬
‫لالستنسال تحوي على الجين المرغوب وكذلك قطع ناقل االستنسال مرة واحدة لجعله مناسبا الستقبال‬
‫قطعة ‪ DNA‬الغريبة ‪(.‬اص بحت ه ذه العملي ة س هلة بع د اكتش اف االنزيم ات القاطع ة ‪restriction‬‬
‫‪.) enzymes‬‬
‫‪-4‬توفر طريق ة مناس بة لرب ط قطع ة ‪ DNA‬الغريب ة م ع ناق ل االستنس ال لتك وين الجزيئ ة الهجين ة‬
‫(اصبحت هذه العملية ممكنة بعد اكتشاف انزيم ‪. DNA ligase‬‬
‫‪-5‬توفر الوسيلة المناسبة لمراقب ة عملي ات التقطي ع والرب ط لمعرف ة كف اءة االنزيم ات المس تعملة في‬
‫التجربة ومعرفة عدد قطع ‪ DNA‬الناتج ة من عملي ة التقطي ع وتق دير حجومه ا ولمعرف ة ص الحيتها‬
‫لالستنسال وكذلك تأكد من عملية الربط‪.‬‬
‫‪-6‬يجب توفر وسيلة التي يمكن من خاللها ادخال جزيئات الهجين ة الى خالي ا الك ائن المض يف بحيث‬
‫يمكن له ا ان ت ديم نفس ها في المض يف الجدي د وت وارث بثب ات بين االجي ال المتعاقب ة (اك ثر الط رق‬
‫المستعملة هي ‪ transformation‬و التحول بالعاثي ‪. transfection‬‬
‫‪-7‬بعد عملية االدخال ‪ ،‬يجب ت وفر وس يلة النتق اء الخالي ا المس تقبلة للجزيئ ة الهجين ة الحامل ة للجين‬
‫المطلوب وتمييزها عن االعداد الهائلة من الخاليا المستقبلة للجزيئات الهجينة االخرى ‪.‬‬

‫*االنزيمات القاطعة ‪-: Restriction enzymes‬‬

‫هي االنزيم ات ال تي له ا القابلي ة على التع رف على تت ابع معين في ‪ DNA‬ثم تق وم بقط ع ش ريطي‬
‫‪ DNA‬في ذلك الموقع ‪ ،‬توجد في ‪ prokaryotes‬تكون مسؤولة عن تحلل جزيئات ‪ DNA‬الغريبة ‪.‬‬

‫اكتشاف االنزيمات القاطعة ‪:‬‬

‫تم اكتش افها عن دما ح اول بعض العلم اء نق ل ‪ DNA‬من مض يف بكت يري الى اخ ر بواس طة‬
‫‪ conjugation of phage infection uptake of free DNA‬فأن ‪: DNA‬‬
‫‪-1‬يبقى بحالة جيدة داخل مضيف الجديد ويتضاعف ذاتيا ‪.‬‬
‫‪-2‬يندمج مع الكروموسوم البكتيريا المضيف ‪.‬‬
‫‪-3‬يتجزء ويهضم بعملية ‪. restriction‬‬

‫بقاء وتجزئة ‪ DNA‬في المضيف الجديد يعتمد على ‪:‬‬

‫‪-1‬الخاصية المانعة لذلك المضيف ‪.‬‬
‫‪-2‬الص فات غ ير المتوارث ة ال تي تض فيها خالي ا الواهب ة على ‪ ، DNA‬ت دعى ه ذه الص فات ‪host‬‬
‫‪. control restriction modification‬‬

‫تجربة خاصية المنع في الخاليا ‪-:‬‬

‫لوحظ في الخمسينات عند محاولة نق ل ‪ bacterio phage λ‬من مض يف بكت يري ألخ ر ان ه عن د‬
‫اكثار فايروس في مضيف معين فرضا ‪ E.coli strain K‬واستخدام الناتج في اصابة ساللة اخ رى‬
‫‪ E.coli strain B‬فأن مستوى االصابة واطئ (معناه حصول منع) ‪ ،‬اما عن د اس تعمال الف ايروس‬
‫المكثر في ساللة ‪ B‬إلصابة كلتا س اللتين ‪ K‬و ‪ B‬ف أن الف ايروس يتك اثر بكف اءة عالي ة في س اللة ‪B‬‬
‫(عدم حصول منع) بينما لم يتكاثر فايروس بنفس كفاءة في ساللة ‪( K‬حصول منع)‪.‬‬

‫االستنتاج ‪:‬‬
‫قابلية الفايروس على اصابة المضيف تعتمد‬
‫على الساللة التي تم اكثاره منها ‪ ،‬وهذه الصفة‬
‫غير الوراثية التي يضفيها المضيف الثاني‬
‫للفايروس تسمح له اصابة المضيف مرة ثانية‬
‫تدعى ‪. modification‬‬
 ‫انواع انزيمات التقييد ‪-:‬‬
‫‪ : hsd s‬يسيطر على تخصص النظام ‪. specificity the system‬‬
‫‪ : Hsd m‬هي انزيمات التحوير وايضا تتداخل مع الناتج ‪. product‬‬
‫‪ : Hsd r‬انزيمات التقييد تستخدم في عملية التقطيع ‪.‬‬

‫*ان ظاهرة ‪ .h.c.r.m‬تحدث كلما اعيد نق ل ‪ DNA‬من بكتري ا الى اخ رى وب أي طريق ة ك انت وان‬
‫الجينات التي تنظم عمل ه ذا النظ ام ام ا تك ون محمول ة على كروموس وم بكت يري المض يف او على‬
‫بالزميد معين او على ‪ prophage‬مثل ‪. p1‬‬

‫تجربة الكشف عن فعالية االنزيم المنتج بواسطة ساللة ‪-: E.coli K‬‬
‫خض مس تخلص خالي ا ‪ E.coli K‬م ع ‪ λ DNA‬بنوعي ه الع ادي والمح ور بع د وس مه (تعليم ه)‬
‫احدهما بالتريتيوم ‪ H3‬واالخر بالفسفور المشع ‪ P32‬لكي يمكن التمي يز بينهم ا وبع د حض ن الم زيج‬
‫بفترة معينة لوحظ تجزء ‪ DNA‬العادي وبقاء ‪ DNA‬المحور ‪.‬‬

‫تصنيف االنزيمات القاطعة ‪-:‬‬

‫‪-1‬النوع االول ‪ -:‬يتفاعل مع ‪ DNA‬في مواقع معينة اال ان تقطيع ه يك ون عش وائيا ويحت اج التفاع ل‬
‫الى المغنيسيوم و (‪ S-adenosine methionine )SAM‬والـ ‪ ATP‬كعوامل مساعدة (ال يستخدم‬
‫ه ذا الن وع من االنزيم ات في الهندس ة الوراثي ة ألن تقطيع ه عش وائي) ومن امثلته ا ‪ E.coli K‬و‬
‫‪ ، E.coli B‬وهذا النوع من االنزيمات عندما يقطع يس تمر ب القطع على ط ول جزيئ ة ‪ DNA‬ح تى‬
‫مسافة بين ‪ bp 1000-500‬يبدأ االنزيم بالتأثير على الشريط الثاني ‪.‬‬
‫‪-2‬النوع الثاني ‪ -:‬يحصل القطع مباشرة في المواقع التي يتع رف عليه ا االن زيم ويحت اج التفاع ل الى‬
‫المغنيسيوم فقط كعامل مساعد اض افة ك ون ه ذه االنزيم ات مركب ات بس يطة ل ذا تس تعمل بك ثرة في‬
‫تجارب الهندسة الوراثية ‪.‬‬
‫‪-3‬النوع الثالث ‪ -:‬تم اكتشاف مجموعة من االنزيم ات القاطع ة تش به الن وع االول في ك ون تقطيعه ا‬
‫عشوائيا وتشبه نوع الثاني كونها تحتاج المغنيسيوم كعامل مساعد فقط ‪.‬‬

‫تسمية االنزيمات القاطعة ‪-:‬‬

‫‪-1‬الحرف االول من الجنس ويكتب ‪. capital‬‬
‫‪-2‬الحرمين االولين من ‪ species‬وتكتب ‪. small‬‬
‫‪-3‬يوضع حرف صغير داللة على ‪ strain‬أو ‪. type‬‬
‫‪-4‬ثم يوضع رقم االنزيم مثل ‪. Eco R1 ، Eco P1 ، Hind 1 ، Hind Ш‬‬
‫‪ -5‬يوضع حرف )‪ R(restriction‬أو (‪ M)modification‬دليل على نوع االنزيم ‪. R Eco R1 :‬‬
‫‪ )10/5(-6‬دليل على انه يحتاج الى ‪ 5bp‬من الشريط االول و ‪ 10bp‬من الشريط الثاني ‪.‬‬
‫‪ -7‬السهم دليل موقع القطع ‪.‬‬
‫‪-8‬النجمة دليل على ‪. modification‬‬
‫‪-9‬القوس ( ) يعني ان االنزيم داخل القوس يعمل على نفس القواعد النيتروجينية‬
‫‪-10‬السهم ويعني نقطة النقطة القطع وعدم وجود السهم معناه ان نقطة القطع لم يستدل عليها لحد االن‬
‫‪.‬‬
‫‪-11‬وجود نجمة داللة على حدوث تحوير في القاعدة بسبب االنزيم ‪.‬‬
 ‫االنزيمات المتناظرة ‪-: Isoschizomers enzymes‬‬
‫هي االنزيم ات المعزول ة من مص ادر مختلف ة وتتع رف على وتقط ع نفس التت ابع ‪ ،‬ق د تك ون تام ة‬
‫التن اظر ‪ perfect schizomers‬مث ل االن زيمين ‪ Hind Ш‬و ‪ Hsu Ґ‬ال ذان يتعرف ان على نفس‬
‫التت ابع ويقطع ان في نفس الموق ع النت اج قط ع ‪ DNA‬متماثل ة ‪ ،‬او ق د تك ون غ ير تام ة التن اظر‬
‫‪ inperfect schizomers‬مث ل االنزيم ات ‪ Sma Ґ‬و ‪ Xma Ґ‬الل ذان يتعرف ان على نفس التت ابع‬
‫لكنهما يقطعان في مواقع مختلفة مما يؤدي الى انتاج قطع ‪ DNA‬غير متماثلة ‪.‬‬
‫↓‬
‫‪Hind Ш A AGCCTT‬‬ ‫‪Hsu Ґ A↓AGCCTT‬‬
‫‪Sma Ґ CCC↓GGG‬‬ ‫‪Xma Ґ C↓CCGGG‬‬

‫‪-: Target sites of type ∏ restriction enzymes‬‬

‫انواع تتابعات القطع لألنزيمات ‪-:‬‬
‫تتعرف انزيمات النوع الثاني على مواق ع معين ة في جزيئ ة ‪ DNA‬لتقط ع خالل او ب القرب من ه ذه‬
‫المواق ع (بعض االنزيم ات تحت اج مس افة لتقط ع) ‪ ،‬تختل ف االنزيم ات في التع رف على المواق ع‬
‫الحساسة فقد تكون رباعية او خماسية او سداسية او سباعية وتكون ‪:‬‬
‫‪-1‬ذات محاور متناظرة ‪ :‬مثل ‪ Eco R1‬الذي يتعرف على تتابع سداسي ذو محاور متناظرة‬
‫'‪5'-G↓AATTC-3‬‬ ‫‪5'-G‬‬ ‫'‪ AATTC-3‬بعد القطع‬
‫'‪3'-CTTAA↑G-5‬‬ ‫‪3'-CTTAA‬‬ ‫‪+‬‬ ‫'‪G-5‬‬

‫يمكن ان تعود القطع ترتبط مع نهايات ناتئة المكملة لها كما يمكن للقطعة الواحدة ان تتدور ح ول‬
‫نفسها خالل ارتباط نهايتيها المتك املتين ل ذا توص ف ه ذه القط ع باحتوائه ا على نهاي ات الص قة‬
‫‪Cohesive end‬‬
‫يعرف هذا نوع من التتابع بأنه بلندرومي كونه يشبه كلم ات ال تي اذا ق رأت من االم ام او الخل ف‬
‫تعطي نفس المعنى ‪.‬‬
‫‪-2‬ذات محاور غير متناظرة ‪ :‬قد تكون بلندرومية على شريط واحد لكن غير متناظرة مثال التتابع‬
‫'‪5'-AGCCGA-3‬‬
‫'‪3'-TCGGCT-5‬‬
‫طريقة القطع ‪-:‬‬
‫أ‪-‬قطع ‪ DNA‬يكون الطرف الناتئ '‪ : 5‬تم ذكرها في االمثلة سابقة ‪.‬‬
‫ب‪ -‬قطع ‪ DNA‬يكون الطرف الناتئ '‪ : 3‬مثال االنزيم ‪ Pst Ґ‬ينتج قطع ‪DNA‬ذات نهايات الص قة‬
‫يكون الطرف الناتئ '‪. 3‬‬
‫'‪5'-CTGCA G-3‬‬ ‫↓‬
‫‪5'-CTGCA‬‬ ‫القطع‬ ‫بعد‬ ‫'‪G-3‬‬
‫'‪3'-G↑ACGTC-5‬‬ ‫‪3'-G‬‬ ‫'‪+ ACGTC-5‬‬

‫‪-3‬ذات النهايات المستوية ‪ FLUSH BLUNT END :‬وتنتجها انزيم ات مث ل ‪ Sma Ґ‬و ‪Hae‬‬
‫‪.Ш‬‬
‫↓‬
‫‪CCC GGG‬‬
‫‪Sma Ґ‬‬ ‫‪GGG↑CCC‬‬ ‫يعطيان نهاية عمياء‬
‫‪GG↑CC‬‬
‫‪Hae Ш‬‬ ‫‪CC↓GG‬‬
‫*يالح ظ ان بعض االنزيم ات تتع رف على تتابع ات خماس ية مث ل ‪ ∏Eco R‬عالوة على تتابع ات‬
‫سداسية التي تتعرف عليها مجموعة اخرى من االنزيمات ‪.‬‬
‫*انزيم ‪ Hga Ґ‬يتعرف على تتابع خماسي غير متناظر المحاور ‪ GACGC‬لكنه ال يقطع خالل ه ذا‬
‫التت ابع ب ل يتح رك مس افة ‪ 5‬نيوكلي و تي د على جزيئ ة ‪ DNA‬ألح د الخيطين ثم ‪ 10‬نيوكليوتي د على‬
‫الخيط االخر (‪ )5/10‬ثم يقطعان الحلزون ‪.‬‬
‫↓‬
‫‪5'-GACGCNNNNN‬‬
‫↑‪3'-CTGCGNNNNNNNNNN‬‬
‫تردد المواضع الحساسة ‪-:‬‬
‫عند معاملة جزيئة ‪ DNA‬كبيرة الحجم بعدة انزيمات قط ع ك ل واح د على ح دة يالح ظ ع دد م رات‬
‫القطع تختلف باختالف المواقع الحساسة لكل انزيم ‪ ،‬ان تردد المواضع الحساسة لألنزيمات الرباعي ة‬
‫اكثر من تردد المواضع الحساسة لألنزيمات السداسية التتابع ‪ ،‬وبصورة عامة تحسب من المعادلة ‪:‬‬
‫‪F= 1/4N‬‬
‫‪ : N‬عدد النيوكليو تيدات المكونة للموضع الحساس‬
‫‪ : 4‬عدد القواعد النيتروجينية االربعة‬
‫‪4‬‬
‫استنادا للمعادلة فان تتابع الرباعي هو ‪256= 4‬‬
‫السداسي هو ‪4096 = 46‬‬
‫*التردد الحقيقي ألنزيم ات التقيي د ال يتط ابق دائم ا فمثال الع اثي ‪ T7‬يبل غ طول ه ‪ Kbp 40‬يجب ان‬
‫يحتوي استنادا للمعادلة ‪ 10‬مواضع حساسة لالنزيمات ‪ Bam HҐ‬و ‪ Hind Ш‬و ‪Eco RҐ‬‬
‫‪40 Kbp = 40000 bp ÷ 4096 = 9.765 ~ 9‬‬
‫اال ان التحلي ل العملي له ذا الكروموس وم اظه ر ان ه ال يحت وي على اي موض ع حس اس ألي من‬
‫االنزيمات الثالث ‪.‬‬
‫*اوضحت دراسات ان المواضع الحساسة ألنزيمات تقييد تتجمع حول او داخل الجينات البنائية ‪.‬‬
‫فعالية انزيمات التقييد المتناظرة ‪-:‬‬
‫وجد انزيم ان االنزيم ‪ ∏ Hga‬ال يقطع الموض الحساس الخاص به عند تحويره بإضافة مجموعة‬
‫مثيل للسايتوسين المؤشرة بالنجمة ‪ C↓C*GG‬في حين ال يت أثر االن زيم ‪ Msp Ґ‬ال ذي يتع رف على‬
‫نفس التتابع ويكون قادر على القطع سواء محور او ال ‪.‬‬

‫ربط قطع ‪-: DNA‬‬

‫لربط قط ع ‪ DNA‬ذات نهاي ات الص قة يجب ان تك ون منتج ة بنفس االن زيم لكي تك ون نهاياته ا‬
‫الالصقة متكاملة ‪ ،‬وحاالت اخرى ربط قطع ‪ DNA‬منتجة بأنزيمين مختلفين مثال االنزيم ان ‪Mbo‬‬
‫‪ Ґ‬و ‪ Sau 3A‬انزيمان متناظران على التتابع رب اعي نيوكليوتي د يق ع ض من تت ابع الحس اس ألن زيم‬
‫‪ Bam HҐ‬الذي هو سداسي‬
‫↓‬ ‫↓‬
‫'‪Mbo Ґ 5'- GATC-3‬‬ ‫'‪Bam HҐ 5'-G GATCC-3‬‬
‫‪Sau 3A‬‬
‫*يمكن ربط قطعة ‪ DNA‬منتج ة من االن زيمين بجزيئ ة ‪ DNA‬مث ل بالزمي د ‪ pBR322‬او الع اثي‬
‫المبدا ‪ λ‬مقطوع باألنزيم ‪ ، Bam HҐ‬ان الموضع الهجين الناتج يك ون حس اس لألن زيمين لكن ه‬
‫غير حساس لألنزيم ثالث اعتمادا على نوع النيوكليوتيدات المجاورة للموضع الحساس لألنزيمين ‪.‬‬
‫*ان عملي ة بن اء البن وك او مكتب ات الجين ات لكائن ات بدائي ة او حقيقي ة الن واة تتم عن طري ق هض م‬
‫الجينوم هضم جزئي بواسطة احد االنزيمين ‪ Mbo Ґ‬و ‪ Sau 3A‬ثم رب ط قط ع ‪ DNA‬الناتج ة في‬
‫موضع ‪ Bam HҐ‬لناقل استنسال مناسب ‪.‬‬

‫*يمكن ربط قطع ‪ DNA‬مقطوعة بأنزيمين مختلفين بحيث يكون الموضع الهجين الناتج غير حساس‬
‫ألي من االنزيمين ‪.‬‬
‫↓‬ ‫↓‬
‫‪Sal Ґ G TCGAC‬‬ ‫‪Xho Ґ‬‬ ‫‪C TCGAG‬‬
‫‪CAGGT↑G‬‬ ‫‪GAGCT↑C‬‬
‫*ان توفر اع داد كب يرة من ه ذه االنزيم ات م ع وج ود نواق ل استنس ال حاوي ة مواض ع مف ردة له ذه‬
‫االنزيمات وفر خيارات كثيرة إلجراء تجارب االستنسال ‪.‬‬

‫نواقل االستنسال ‪-: cloning vectors‬‬

‫عند ادخال قطع ‪ DNA‬غريبة الى خاليا بدائي ة او حقيقي ة الن واة ب التحول فال تس تطيع ديمومته ا في‬
‫خالي ا المض يف لع دم احتواءه ا على منش أ التك رار (اي ع دم تك رار قطع ة ‪ DNA‬وفق دانها خالل‬
‫االنقسامات المتتالية) او ان منشأ التكرار يكون غير فعال ‪.‬‬
‫ان مش كلة ديموم ة هي مع وق نج اح تج ارب االستنس ال ل ذا تم التغلب علي ه برب ط قطع ة ‪DNA‬‬
‫الغريب ة الى مك رر مناس ب (ل ه قابلي ة تك رار وح دة) قب ل ادخاله ا للمض يف بحيث يمكنه ا التك رار‬
‫والتوارث ‪.‬‬

‫*تقسم نواقل االستنسال المستخدمة في البكتريا الى اربعة انواع ‪:‬‬

‫‪-4‬الكوزميدات‬ ‫‪-2‬العاثيات ‪-3‬عاثيات ذات خيط ‪ DNA‬منفرد‬ ‫‪-1‬البالزميدات‬

‫البالزميدات ‪-:‬‬
‫عبارة عن قطع ‪ DNA‬لها القابلية على التك رار المس تقل عن كروموس وم المض يف وهي تت وارث‬
‫بثبات بشكل قطع منفصلة عن الكروموسوم ‪.‬‬
‫‪6‬‬ ‫‪6‬‬
‫تنتشر البالزميدات في خاليا البكتريا وهي تختل ف احجامه ا ‪ 10 ×200‬دالت ون الى ‪ 10 ×1‬دلت ون‬
‫وهي غ ير ض رورية لحي اة المض يف لكنه ا تعطي ه ص فات اض افية تمكن ه من العيش تحت ظ روف‬
‫استثنائية ‪.‬‬
‫*اهم صفات هي مقاومة لمضادات الحياة وإنتاج الهيمواليسين وتخمير الس كريات ومقاوم ة المع ادن‬
‫الثقيلة وتكوين السرطانات في النباتات وغيرها من الصفات ‪.‬‬

‫تقسيم البالزميدات حسب قابليتها لالنتقال ‪-:‬‬

‫‪-1‬بالزمي دات اقتراني ة ‪ -: conjugative plasmid‬هي تح وي على مجموع ة من الجين ات الناقل ة‬
‫‪ transfer gene‬وتسمى جينات ‪ tra‬المحفزة لعملية االقتران في البكتريا ‪.‬‬
‫‪-2‬بالزميدات غير االقتراني ة ‪-: non- conjugative plasmid‬ال تح وي على جين ات ‪ tra‬وبه ذا‬
‫تكون البكتريا الحاوية على مثل هذه البالزميدات غير قادرة على البدء بعملية االقتران ‪.‬‬

‫تقسيم البالزميدات حسب عدد النسخ الموجودة بالمضيف ‪-:‬‬

‫‪-1‬البالزميدات المسترخية ‪ -: relaxed plasmid‬توجد في الخلي ة المض يف بع دد كب ير من النس خ‬
‫وتشمل البالزميدات غير االقترانية ‪.‬‬
‫‪-2‬البالزميدات المتشددة ‪ -: stringent plasmid‬وهي توجد بع دد مح دد من النس خ وتك ون كب يرة‬
‫الحجم وتشمل البالزميدات االقترانية ‪.‬‬
‫اسباب استخدام البالزميدات غير االقترانية كنواقل استنسال ‪-:‬‬
‫‪-1‬الس يطرة على االنتق ال البالزمي دي من بكتري ا ألخ رى بالت الي الس يطرة على انتق ال الجين ات‬
‫المستنسلة ضمن هذه البالزميدات ‪.‬‬
‫‪-2‬الخوف من انتقال الجينات ذات الخط ورة العالي ة الى ان واع عدي دة من بكتري ا عن استنس الها على‬
‫بالزميدات اقترانية ‪.‬‬
‫‪-3‬البالزميدات االقترانية لها القدرة على نقل صفات كروموس ومية وه ذا يح دث عن حص ول ادغ ام‬
‫‪ integration‬للبالزميد مع الكروموسوم‪.‬‬
‫‪-4‬البالزميدات االقترانية لها القدرة على تحريك البالزميدات االقترانية ‪.‬‬
‫‪-5‬حورت بالزميدات غير االقترانية بشكل تصبح اكثر كفاءة كنواقل استنسال وال تنتقل باالقتران‪.‬‬
‫خصائص البالزميد كناقل استنسال ‪-:‬‬
‫‪-1‬صغر حجمه وذلك ‪:‬‬
‫أ)سهولة تعامل معه اذ تكون الصغيرة مقاومة ألضرار التجزئة اثناء تحضير فيسهل ذلك تحضيرها ‪.‬‬
‫ب)توجد صغيرة بشكل مسترخي مما يزيد كفاءة عزلها وعدد نسخ الجين المستنسل بها ‪.‬‬
‫جـ)تكون الصغيرة اك ثر كف اءة في تحوي ل البكتري ا ‪ transformation‬مم ا يزي د من كف اءة تج ارب‬
‫االستنسال‪.‬‬
‫د)صغر الحجم يقلل فرص وجود مواضع حساسة متعددة ألنزيم تقييد الواحد‪.‬‬
‫‪-2‬تكون خصائصه معروف ة بالنس بة لمواق ع الجين ات ومواق ع المواض ع الحساس ة النزيم ات التقيي د‬
‫ويفضل معروف تتابع نيوكليوتيداته ‪.‬‬
‫‪-3‬قابلي ة تك اثره في مض يف المرغ وب س ريعة بحيث يمكن الحص ول على كمي ات كب يرة من ناق ل‬
‫االستنسال والجزيئات الهجينة الناتجة من عملية االستنسال ‪.‬‬
‫‪-4‬يحتوي صفة انتقائي ة يمكن على اساس ها انتق اء الخالي ا المتحول ة ‪ ،‬اذ يمكن خالله ا انتق اء الخالي ا‬
‫المستلمة للجزيئة الهجينة ‪ clone‬وتمييزها عن العدد الهائ ل من بقي ة خالي ا المزرع ة ال تي لم تس تلم‬
‫جزيئة ‪.‬‬
‫*اذا كان الناقل يحمل صفة المقاومة ألحد مضادات الحياة فممكن انتقاء الخالي ا المتحول ة عن طري ق‬
‫زرعها في وسط يحتوي على ذلك المضاد الذي يمنع نم و ك ل خالي ا ع دا تل ك ال تي تح وي الجزيئ ة‬
‫الهجينة ‪.‬‬
‫‪-5‬ان يحتوي على ص فة انتقائي ة ثاني ة يمكن تثبي ط فعاليته ا من غ رس قطع ة ‪ DNA‬المستنس لة في‬
‫وس ط الجين المس ؤول عن ه ذه ص فة وتس مى ه ذه العملي ة بالتثبي ط ب الغرس ‪insertional‬‬
‫‪. inactivation‬‬
 ‫في الشكل ‪-:‬‬
‫يحوي بالزميد ناقل صفتين (مقاومة للتتراسايكلين‬
‫واالمبسيلين كما يحوي موضع حساس مفرد‬
‫لألنزيم ‪ Bam H1‬يقع داخل تتابع جين مقاومة‬
‫للتتراسايكلين الجراء عملية االستنسال ‪.‬‬
‫الجراء عملية االستنسال بالثبيط بالغرس تقطع‬
‫قطعة ‪ DNA‬الغريبة والبالزميد بأنزيم ‪Bam H1‬‬
‫ثم تخلط القطع مع بعضها بوجود انزيم ‪DNA‬‬
‫‪Ligase‬للربط ‪ ،‬جزيئات ناتجة تكون بشكلين ‪:‬‬
‫‪-1‬بالزميدات هجينة ناتجة من غرس قطعة ‪DNA‬‬
‫الغريبة في وسط جين المقاومة للتتراسايكلين‬
‫(ستكون جزيئات حساسة للتتراسايكلين ومقاومة‬
‫لالمبسيلين) ‪.‬‬
‫‪-2‬تدور بالزميد دون ارتباطه بقطعه ‪ DNA‬غريبة‬
‫وهنا يصبح بالزميد مقاوم لالمبسيلين‬
‫والتتراسايكلين ‪.‬‬
‫*ثم بعض خاليا ستستقبل البالزميدات الهجينة‬
‫وتستقبل خاليا اخرى البالزميدات المدورة ‪.‬‬
‫*ثم يجب انتقاء الخاليا المستقبلة للجزيئات الهجينة‬
‫وعزلها عن االخرى كونها المطلوبة (تكون عملية‬
‫االنتقاء سهلة كون جزيئات هجينة حساسة‬
‫للتتراسايكلين ومقاومة لالمبسيلين عكس بالزميدات‬
‫مدورة تكون مقاومة لكال المضادين ‪.‬‬
‫‪-6‬ان يحتوي مواضع حساسة مفردة لعدد كبير من انزيمات التقييد مما يوفر حرية في استنسال ان واع‬
‫مختلفة من جزيئات ‪ DNA‬المقطوعة بنفس االنزيمات (يفضل ان تكون هذه مواضع الحساسة واقع ة‬
‫في تتابع جينات‬
‫مسؤولة عن صفة انتقائية لغرض التثبيط بالغرس)‪.‬‬
 ‫نواقل االستنسال في ‪-: E.coli‬‬
‫اشتقت معظم نواقل االستنس ال البالزميدي ة في ال وقت الحاض ر من بالزمي دات ‪ E.coli‬اي له ا‬
‫قابلية التكرار في البكتريا وهي اكثر االحياء المجهرية استخداما في البحوث العلمية ‪.‬‬

‫استخدام بكتريا ‪ E.coli‬كأفضل مضيف الستقبال قطع ‪ DNA‬لالستنسال ‪-:‬‬

‫‪-1‬توفر معلومات حول خصائص البكتريا الفسلجية والبايوكيمياوية والوراثية ‪.‬‬
‫‪-2‬توفر الكثير من المعلومات في الوراثة الجزيئية من التجارب التي اجريت على هذه البكتريا ‪.‬‬

‫*من االمثلة على نواقل البالزميدية في بكتريا ‪ E.coli‬هي ‪:‬‬

‫‪-: col E1‬‬

‫ه و اح د بالزمي دات ‪ E.coli‬ال تي اس تخدمت في تج ارب االستنس ال المبك رة ‪،‬يح وي على الجين‬
‫المسؤول عن انتاج مادة كوليسين )‪، EI (colicin EI‬والجين المسؤول عن اعط اء خلي ة المض يف‬
‫مناعة لهذه المادة ‪ ،‬يوجد‬
‫*يوجد بأع داد كب يرة في النس خ في الخلي ة الواح دة (‪ 20‬نس خة تقريب ا) ويمكن زي ادة ه ذا الع دد الى‬
‫‪ 1000‬أو ‪ 3000‬نسخة في كل خلية وذلك بإضافة المضاد كلورومفينيكول الى المزارع في طور نمو‬
‫اللوغارتمي ‪.‬‬
‫(في ه ذه ظ روف يتوق ف ‪ DNA‬الكروموس ومي ويس تمر تض اعف ‪ DNA‬البالزمي دي الى ان‬
‫يصبح مساوي الى ‪ %50‬من ‪ DNA‬الكلي في الخلية) ‪.‬‬

‫هذا البالزميد واحد من بالزميدات تحمل جينات المسؤولة عن انتاج بروتين ات مض ادة للحي اة ت دعى‬
‫الكوليسينات ‪.‬‬

‫وضائف كل كوليسين ‪-:‬‬

‫‪Col E1 + K‬‬ ‫يثبط النقل الفعال ‪inhibit active transport‬‬
‫‪Col E3‬‬ ‫يثبط تخليق البروتين ‪inhibit protein synthesis by cleaving 16S rRNA‬‬
‫‪Col E2‬‬ ‫يحفز تحطيم ‪promote the degradation of DNA‬‬

‫في جميع هذه الحاالت تؤدي الى م وت الخلي ة اال في حال ة تك ون حاوي ة للبالزمي د الحامل ة لجين ات‬
‫الكولسين (‪ )colicinogenic plasmids‬اذ تكون هذه الخلية محصنة ضد تأثير القاتل للكولسينات ‪.‬‬

‫*يملك هذا بالزميد موضع حساس مفرد لألنزيم ‪ Eco R1‬يقع ض من الجين المس ؤول إلنت اج ‪Col‬‬
‫‪ ، E1‬ان غ رس قطع ة ‪ DNA‬غريب ة في ه ذا الموق ع س وف يثب ط فع ل الجين لكن ه ال ي ؤثر على‬
‫تضاعف البالزميد او على صفة المناعة التي يضفيها للخلية ‪.‬‬

‫)‪-: PSC 101 (9kb‬‬

‫مش تق من البالزمي د ‪ R6-5‬يحم ل ص فة مقاوم ة للتتراس ايكلين يك ون حس اس لع دد من االنزيم ات‬
‫القاطعة مثل ‪ Bam H1 ، Hind Ш ، Sal 1‬وهذه المواضع تقع ضمن الجين المقاوم للتتراسايكلين‬
‫لذا ال يمكن استخدام هذه االنزيمات لالستنسال في هذا البالزميد الن غ رس قطع ة ‪ DNA‬غريب ة في‬
‫هذه مواقع يثبط صفة المقاومة وفقدان صفة االنتقاء الخاليا المستقبلة للبالزميدات الهجينة ‪.‬‬
‫(لذا تستعمل انزيمات مف ردة اخ رى مث ل ‪ Eco R1‬ال تي تقط ع البالزمي د في مك ان اخ ر غ ير جين‬
‫المقاومة للتتراسايكلين) ‪.‬‬
‫*من صفاته يوجد بأعداد قليلة من النسخ في الخلية الواحدة وعليه فان ناتج ‪ DNA‬يكون قليل ‪.‬‬

‫مشتقات البالزميد ‪ Col E1‬التي تحتوي على صفة المقاومة لمضادات الحياة ‪-:‬‬
‫ألجل تحسين طرق االنتخاب الخاليا المحولة ادخلت جينات مقاوم ة لمض ادات الحي اة في البالزمي د‬
‫‪ Col E1‬ومشتقاته ويحدث هذا اما بربط قطع ‪ DNA‬حاملة لمثل هذه الجينات او انتخاب بالزميدات‬
‫اكتسبت صفة المقاومة لمضادات الحياة بعد تعرضها للجين ات الق افزة ‪ transposons‬وتحص ل ه ذه‬
‫العملية ‪. in vivo‬‬

‫من االمثلة على المشتقات البالزميد ‪-: Col E1‬‬

‫‪-1‬البالزمي د ‪ : pML2‬ركب عن طري ق رب ط قط ع ‪ DNA‬حامل ة لجين المقاوم ة للكنامايس ين‬

‫مقطوعة بأنزيم ‪ Eco R1‬من البالزميد ‪ R6-5‬مع البالزميد ‪ Col EI‬بع د قطع ه ب أنزيم ‪Eco R1‬‬
‫وبهذا يحتوي على موضعين لهذا االنزيم ‪.‬‬
‫‪-2‬البالزمي د ‪ : pCRI‬اش تق من البالزمي د ‪ pML2‬وذل ك بح ذف القطع ة ‪ DNA‬المحيط ة بأح د‬
‫الموضعين الحساسين لألنزيم ‪. Eco R1‬‬
‫‪-3‬البالزميد ‪ : pSF 2124‬تم تركيبه عن طريق ادخال الجين القافز ‪ Tn1‬والذي يحمل جين المقاومة‬
‫لالمبيسيلين (‪ )ß-lactamase‬في البالزميد ‪. Col EI‬‬
‫*من صفاته يحمل جين مسؤول عن عن انتاج الكولسين ومقاومة االمبسيلين ان ه يحت وي على مواق ع‬
‫حساسة مفردة لكل من انزيم ‪ Bam H1‬و ‪. Eco R1‬‬
‫*اذ يمكن ادخ ال قطع ة ‪ DNA‬الغريب ة بأح د ه ذين الم وقعين دون الت أثير على ص فة المقاوم ة‬
‫لألمبسيلين ‪.‬‬
‫‪-4‬البالزميد ‪ : pBR322‬هو اكثرها ش هرة واس تعمال يح وي على الجين المق اوم لالمبيس يلين وجين‬
‫مقاومة للتتراسايكلين المشتقة من بالزميدين ‪ pSF2124‬و ‪ pSC101‬على التوالي ‪.‬‬
‫*اما منشأ التكرار لهذا البالزميد فمصدره البالزميد ‪ pMB1‬المشابه للبالزميد ‪. Col E1‬‬
‫**اش تق البالزمي د ‪ pBR322‬خالل سلس لة طويل ة من التج ارب ب ني من خالله ا العدي د من‬
‫البالزميدات التي تتصف بصفات مختلفة ‪.‬‬
‫***يحتوي البالزميد ‪ pBR322‬على كل الصفات المرغوبة في ناقل االستنسال المثالي وهي ‪:‬‬
‫‪)1‬هو من نوع مسترخي حوالي ‪ 15‬نس خة في ك ل خلي ة ويمكن اكث اره الى ح والي ‪ 1000‬أو ‪3000‬‬
‫نسخة بإضافة الكلورومفنيكول ‪.‬‬
‫‪)2‬حجمه صغير يتكون من ‪ bp 4363‬مما يجعله سهل العزل ومناس با لالستنس ال لقطع ة ‪DNA‬‬
‫ممكن ان تكون كبيرة الحجم نسبيا ‪.‬‬
‫‪)3‬تتابع نيوكليوتيداته معروف بشكل كامل وبهذا تك ون القط ع الناتج ة عن معاملت ه بأنزيم ات التقيي د‬
‫ذات اط وال معروف ة بحيث يمكن اس تخدامها ك دالئل حجمي ه يمكن على اساس ها تع يين احج ام قط ع‬
‫‪ DNA‬مجهولة الحجم ‪.‬‬
‫‪)4‬يحتوي على ص فتين مظهري تين هم ا مقاوم ة لالمبس يلين والتتراس ايكلين حيث يمكن اس تعمال اي‬
‫منهما النتقاء الخاليا الحاوية على البالزميد ‪.‬‬
‫‪)5‬وجود ‪ 20‬انزيم تقييد تقطع هذا البالزمي د م رة واح دة مم ا يعطي حري ة كب يرة في استنس ال قط ع‬
‫‪ DNA‬الغريب ة في اي موض ع من ه ذه المواض ع العش رين اي يحص ل ‪insertional‬‬
‫‪. inactivation‬‬

‫*اشتقت العديد من البالزمي دات من البالزمي د ‪ pBR322‬وذل ك للحص ول على البالزمي دات تس تمع‬
‫بمواصفات خاصة تجعلها اكثر فائدة من ‪ pBR322‬ومنها ‪. pBR325‬‬
‫**ادخال جين المقاومة للكلورومفنيكول المشتق من العاثي ‪ P1-cm‬الى البالزميد ‪ pBR322‬وال ذي‬
‫يحت وي على موض وع حس اس واح د لألن زيم ‪ Eco R1‬وبه ذا اص بح بالزمي د ‪ pBR325‬يتم يز‬
‫باحتوائ ه على ثالث ص فات مظهري ة ‪ ،‬اذ ان استنس ال قطع ة ‪ DNA‬الغريب ة وكش ف عن جزيئ ات‬
‫الهجينة بطريقة التثبيط بالغرس ‪ ،‬اذ تكون خاليا الحاوية على هذه الجزيئات حساسة للكلورومف نيكول‬
‫ومقاومة للتتراسايكلين واالمبيسيلين ‪.‬‬