22 DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL INFECTIILOR CLOSTRIDIENE 22.1. DATE GENERALE 22.1.1, O minidefinitie Closiridiile sunt bacili grampozitivi, cel putin in culturile tinere, Majoritatea speciilor sunt mobile cu flagelt peritrichi, Produc endospori, ovali sferici, care uzual deformeaza celula. Catalazoncgativi. Anaerobi. Unele specii atac& zaharurile fermentativ, altele sunt azaharolitice 22.1.2. Repere taxonomice Genul Clostridium apartine, impreuna cu genul Bacillus, familiet Bacitlaceae, Dintre numeroasele clostridii numai céteva specii sunt patogene pentru om, Sub raport medical clostridiile sunt divizate in = Clostridii histotoxice si invazive: C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. his tolyticum etc. 1 Clostridii toxigene noninvazive: C. tetani si C. botulinum. = Clostridii saprofite, nepatogene, unele dintre ele implicate in degradarea alimen 22.1.3. Habitat Principalul habitat al clostridiilor este solul. Uncle specii sunt gazduite si in intestinul omului sau animalelor. C. perfringens este constituent constant al microbiocenozelor colonului yi vaginului, Din cele 5 serotipuri de C. perfringens, serotipul Aceste gazduit de om; scrotipurile B—E sunt gazduite de animale, dar serotipul C are si tulpini umane (fostul serotip F, nerecunoscut in prezent). C. difficile este freevent in colonul sugarilor hranifi la san, dar la adulji apare sporadic; C. rerani si C. sporogenes apar frecvent in fecalele animalelor, iar C. histolyticum ocazional. Rezistenta sporilor le asigura supraviejuirea gi vebicularea prin variate elemente de mediu; vegelale, praf, apa etc. Ca agenti de putrefacjie, clostridiile joaca un rol important in ciclul azotului si car~ bonului in natura, 20922.1.4. Factori de patogenitate Factorii dominanji de patogenitate ai clostridiilor sunt exotoxinele puternice cw actiune specifica si, suplimentar acestora, enzimele proteolitice, care asigura invazivitatea unor specii C. perfringens produce 14 factori de virulen{a, cu efecte toxice, marcati cu literele alfabetului grec de la a (alfa) pana la v (ni), hemolizinele non-ad6 si enterotoxina, Dintre acestia retinem: = Toxina a, produs de toate cele 5 serotipuri dg C. perfringens (A, B,C, D, E), este cea mai importanta si actioneaza ca lecitinaz’ Ca** dependenta cu efect hemolit necrotic 51 etal. « Toxina B, produsi de serotipurile B si C, este un pol tripsind, Cauzeaz’ enterite la of, capre, miet, manji, purcei si, ac a om. = Enterotoxina, produst de unele tulpini ale serotipuritor A si D, cand acestea sporuleaz in colon, este 0 proteind din inveligurile sporale, care cauzeaz diaree prin pierdere hidroclectrolitica intestinala. C. novyi produce factori toxici foarte activi care determina un masiv edem muscular gelatinos, necroza, hemoliza si efect letal. Filtratul culturii de C. septicum este necrotic, hemolitic i letal. La locul injectarii intramusculare tesutul devine intens rosu si apare edem hemoragic. C. Histolyticum este mai slab toxigen, in schimb produce proteaze si colagenaze foarte active, care pot determina chiar autoamputarea membrelor atacate, C. tetani produce dowa toxine: una hemolitica (letanolizina) si una neurotropa (tetanospasmina). Tetanospasmina este 0 proteind, antigenic unica, termolabild, care mu se absoarbe din intestin si este distrusa de sucurile digestive. Se fixeaza pe gangliozide din centrii motori ai sistemului nervos central si sinapscle neuromusculare. Asifel fixata, suprima inhibitia sinaptica, cu acumulare de acetilcolina si determina crize de contractura spastic generalizata Toxina botulinicd este cea mai puternicd otrava. Dupti specificitatea antigenica a toxinei se cunose 7 tipuri antigenice de C. botulinum, numite de la A la G. Este rezistenta la sucurile digestive si se absoarbe din intestin in forma activa. Termorezistenta este relativa si variabila cu tipul: dupa 2 minute de incalzire toxina tip A este distrusa la 60°C, tipurile B si E la 70°C, iar tipurile C si D ta 90°C. Toxina tip F este termolabila. Toxina botulinica blocheaza transmiterea influxului neryos prin inhibarea secrefici de acetilcolina Ja nivelul sinapselor si jonctiunilor mioneurale, rezultand paralizii flasce. tid foarte sensibil jemial, enterite necrotice ifectiile clostridiene 22.1.5. Receptivitatea Ia i Bolile clostridiene apar numai in anumite circumstante: 1 Infectii de inoeulare. Presupun pligi contaminate in care sporii clostridieni gisese conditii favorabile germinarii, multipliciri si elaborarii toxinelor: plagi profunde cu necroze tisulare, plagi in condifii de tulburari circulatorii (e. g. endarterite trombozante), infectii mixte cu bacterii aerobe sau facultativ anaerobe. Aga sunt: gangrena gazoasa, tetanosul, botulismul plagilor. = Boli cu poarté de intrare digestive: toxiinfecfii alimentare prin tulpini enterotoxigene de C. perfringens ingerate in doze de cel putin 10° organisme vii; intoxicatii 210alimentare dupa ingestia de toxina botulinica preformata tn alimente; colonizarea intes- tinului cu tuipini de C. perfringens producatoare de toxina determina la indivizi cu secretie de tripsind (animale foarte tinere, persoane denutrite) enterita necrozanta, iar colonizarea intestinului sugarilor (plind la varsta de 6 luni) cu C. botulinum determina botulismul infantil. « Boli ecologice ca enterocolita pseudomembranoasi postantibiotica determinata de C. alfficile. 22.1.6. Bolile clostridiale 22.1.6.1. Gangrena gazoasa Gangrena gazoasa este 0 toxiinfectie grava care complica plagi cu conditii de anaerobioza (traumatisme care intereseaza planul musculoaponevrotic cu devitalizari tisulare, plagi la pacienti cu endarterita obliteranta, injectare septica de adrenalina etc.) contaminate cu floré microbiana mixta gi spori de clostridit invazive vehiculati prin sol, praf, fecale, corpuri straine, Trei specii de clostridit invazive sunt agenji etiologici ai gangrenei gazoase: C. perfringens, specia cea mai frecvent implicata, C. nowy si C. septicum. Alte clostridii (e. g. C. hstolticum, C. sporogenes 9. a.) contamineaza\ i infecteaza ocazional plagi, dar in lipsa uneia din cele trei speci majore nu produc gangrena gazoasa Clinic infectia se manifesta ca un flegmon gazos, crepitant, cu mionecroza, fasciita, invazie rapida, scurgeri fetide din plaga, febra si intoxicatie generala. In lipsa tratamentului precoce, evolutia spre soc si moarie este rapida. 22.1.6.2. Tetanosul Este o toxiinfectie grava care complica evolujia unei plaigi contaminate cu spori de ©. tetani. Tetanolizina elaborati la poarta de intrare difuzeaza spre sistemul nervos pe calea axonilor si sangvind, determinand manifestarile clinice ale boli, contractit tonicoclonice si spasme paroxistice generalizate repetate. Moartea survine la cca 50% din pacienti. 22.1.6.3. Botulismul Usual este determinat de alimente conservate casnic, in care sporii de C. botulinum (cu termorezistent’ remarcabili) gisese conditii de anaerobiozs favorabile germinarii si elaborarii toxinei: carne si derivate (carnayi, jambon, sunc’), peste sdrat si afumat, con- serve vegetale cu pH alcalin (mazAire, sparanghel, spanac). Boala debuteazi dupa cateva ore pana la 1—3 zile de la consumul alimentului contaminat cu toxina. Simptoamele tipice ale botulismului apar pe fond afebril si traduc afectarea predominant a nervilor cranieni: diplopie, ptoza palpebrala, disfagie, disartrie, amimie, astenie, senzatie de sete, greturi, varsaturi, constipatie, insuficienfa si paralizie respiratorie, stop cardiac. Paralizii ale membrelor sunt posibile. Mortalitatea este ridicata. Cauzi mai frecvent& a intoxicatiei umane sunt serotipurile A, B, E de C. botulinum; rar serotipul F. Aparitia de paralizii in sfera nervilor cranieni la un pacient cu plaga orienteaza diagnosticul catre botulismul plagilor. Botulismul infantil este o cauzd de moarte subita a sugarilor pana la 6 luni. 2122.2. INVESTIGATIA ETIOLOGICA A GANGRENEI GAZOASE Diagnosticul etiologic al gangrenei gazoase este o urgen{a in care singurele utile sunt metodele directe. 22.2.1. Diagnosticul microbiologic 2.2.1.1. Prelevate patologice Se recolteazt: serozitate din profunzimea plagii, probe bioptice din leziune, singe; probe necroptice din leziune si organe. In toxiinfectii alimentare se preleva probe de fecale si din alimentele suspecte 22.2.1.2. Microscopia directa Microscopia direct furnizeaza informatii valoroase pentru tratamentul de urgenta al gangrenei gazoase: chirurgical (stabilirea nivelului exciziilor tisulare), antimicrobian si antitoxic specific. Examenul histopatologie intraoperator (extemporaneu) al probelor _bioptice delimiteaza fesutul afectat de cel sanatos prin depistarea leziunilor de celulita. fasciita si mionecrozi. Pe sectiunile histopatologice, pe amprentele tisulare sau pe frotiurile serozitagii din plaga, C. perfringens apare ca bacili grampozitivi, uneori capsulayi, sporulati sau nesporulati. De regula, se observa si alte clostridii sporulate, dar necapsulate, gi diverse bacterii de asociafie. Uzual in serozitatea din plags reactia inflamatorie este moderata sau minima. 22.2.1.3. Izolarea si identificarea Etapa I. Se epuizeaza cate o ans din proba pe o plach cu geloza-sange glucozata si pe una cu gelord-galbenus de ou lactozata. Daca frotiul direct a atestat prezenta bacteriilor sporulatc gi numeroasc alte baetcrii neaporulatc, sc procedcazd la imbogatirca clostridiilor dupa cum urmeaz’: se insimdnjeaz4 restul probei in mai multe tuburi cu bulion Kitt-Tar- rozzi regenerat. Se incalzeste cate un tub in baic de apa la fierbere timp de 5; 10, respectiv, 20 minute (1ermorezistenta sporilor closiridiali este diferita). Se incubeaza anaerob la 37°C si se urmareste zilnic mediile insamantate. C. perfringens, specie care sporuleaza rar, este imbogatit prin incubarea anaeroba a tuburilor cu bulion la 45—46°C sau prin incubare in bulion cu 100 4g neomicina/ml. Etapa I. Se urmareste aspectul coloniilor dezvoltate, caracterele hemolizei si, pe placa cu geloza-galbenus de ou lactozata, producerea de lecitinaza sau lipaza si fermentarca lactozei. Daca mediile de izolare directa sunt acoperite de bacterit invazive, se face repicarea din mediul de imbogatire pe medit de izolare cu 5% agar pentru a inhiba vatul invaziv. Se repica colonii sugestive pe geloz-singe, pentru acumulare de cultura pura, Etapa IM. Se identificd izolatele pe baza urmatoarclor caractere: = Microscopice: precenta, forma si pozitia sporului. 1 Aspectul coloniilor: colonii S sau R hemolitice. C. perfringens produce hemoliza de tip «cald—reces: © prima zon de hemoliza completa apairuta 1a 37°C. se inconjoara cu a doua zona, mai putin clara, dupa mentinerea culturii la frigider. Coloniile unor specii 212mobile tind s8 invadeze suprafata mediului (e. g. C. septicum, C. sporogenes, dar mai ales €. nowy’). In coloana de gelozd moale specia imobila, C. perfringens, formeaza colonii compacte biconvexe (lenticulare), iar speciile mobile colonii arborescente sau pufoase (cu aspectul pufului de papadie) = Biochimice. Pe gelozi-gilbenus de ou se urmareste producerea de lecitinaza si lipaza (opacifiere si, respectiv, strat perlat in jurul coloniilor). Proteoliza se evidentiaza prin digerarea plasmei, a serului coagulat sau lizarea fragmentelor de organe (ficat, carne focata), din bulionul Kitt-Tarrozzi. Insamanfarea in lapte degresat si turnesolat permite urmarirea coagulari st digestiel cheagului, Activitatea zaharolitica se studiaza prin insamanjare in baterie de mediu Hiss regenerat si incubat sub ulei de parafina steril (tabelele 22.1 si 22.2) Tata 22.1¢aratre rail ne coil prodstows de concer c ¢ ¢ F e apetowon| wooiipn | noSiipn | pebigas | wri Spun eat pie | 0s os os os os nexeiin pew | eb € > xa © Lavo, mae | — z = —s = pear So 2 i = = = ek pera |, = 7 = : Protcolizs intensa + = — Esculind, hiroliza = = é Simboluci: «+» — 290% din tulpinl ponte; «—» 290% din tulpini negative; <2» — 61—89% din tul- pink positive; d — 40—60% din tulpini pozhive: «2» — 11 —39% din tupini poiive; O — oval; S— subterminal; C — coagulat; CD — coagulats digrat: D — digerat; CRA — cheag retract, alveolar # De patogenitate si toxigenezd. Injectarea intramusculara la cobai a culturii pure si 25 mg ClCa (pentru a crea condifii anaerobe) reproduce gangrena monomicrobiani specifica (vezi 22.1.4).. Pe un alt animal se efectueaza reactia de neutralizare a toxinelor din cultura cu seruri imune antitoxice de specie: anti-C. perfringens, anti-C. novyi etc. = Antibiograma poate fi realizata difuzimetric pe placi incubate anaerob. Tabelu! 22.2. Caractere diforentiale inte closrieii nonpreducstoore de lecitinaz’ Caractere & ©. a ©, ¢. fae. [6% botulinum | botulinum | botelinum | his | novyt tp | ‘efani ip A. BLE TpC.D. | tobyticum |"? | sewn | ‘genes (Grotolie) | “Gabarvie te Sporut: forma, os 0s os os | os | os | os | er [pose React i ane D cy D = [cal po |-c Mobitae + + = + ‘Acid din 213Tabelul 22.2 (continusre} amet" |-rere losin | ae -| =| ecligta| Zebfa ae | Poa ete [oe | Ba Mee | 2 | 2] ofl) cyaycye eco | |e cae SSS SSS eomen = ees |e les et ate i ee ee a Ses ah alias ee neces Soe Se a anes asp ae Toxina a de C. perfringens poate fi identificata in vitro, daca pe 1/2 a unci placi cu geloza-galbenus de ou se epuizeazé 5 picaturi de antitoxina a, Dupa absorbtia serului in mediu, Se epuizeaza cultura suspect peste ambele sectoare ale placii. C. perfringens va forma in jumatatea acoperita cu antitoxina c colonii lipsite de halou opac. 22.2.2. Metoda rapida de depistare a C. perfringens Se insimanteaza proba de examinat in c&te dowd tuburi cu urmatoarele trei medii de cultura: bulion Kitt-Tarrozzi, lapte degresat i turnesolat, bulion VF cu sulfit. Se inctlzeste cate un tub cu fiecare mediu la 80°C timp de 20 minute pentru omordrea formelor vegetative, apoi se incubeazi toate tuburile anaerob la 37°C. La intervale de 36 ore se urmairese rezultatele sugestive: sm crestere de bacili grampozitivi = innegrire in bulionul cu sulfit 1 producere de cheag alveolar In laptele turnesolat, 22.2.3. Biopreparate utilizate in diagnosticul, tratamentul si profilaxia gangrenei gazoase: = Ser imun polivalent antitoxic antigangrenos. 1 Seruri imune antitoxice monospecifice anti-C. perfringens, anti-C. novyi, an septicum etc. = Anatoxina polivalenta antigangrenoass. 21422.3. INVESTIGATIA ETIOLOGICA A TOXIINFECTIHLOR ALIMENTARE CAUZATE DE C. PERFRINGENS Se examineazi probe de materii fecale, voma, alimemte suspecte pentru izolarea cantitativa a C. perfringens sau/si depistarca enterotoxinei; probe de ser sangvin pentru titrarea antienterotoxinei prin contraimunoelectroforeza sau, mai bine, prin hemaglutinare indirect’. Criteriile de confirmare a toxiinfectici alimentare prin C. perfringens sunt: 1. Precumtive: izolarca C. perfringens = 105 UPC/g aliment si = 106 UPC/g fecale. 2, De certitudine: = Izolarea aceluiasi serotip de C. perfringens din aliment si fecale de la bolnavi, dar ‘nu de la martori (persoane din colectivitate fara semne de boala). ‘= Depistarea prin testul ansei ileale de iepure ligaturald a enterotoxinei in fecale. inant reste Ae cel putin 4 or a titrulul antenterotoxine! in probe de ser recolate in finamica. 22.4. INVESTIGATIA ETIOLOGICA IN TETANOS, Tetanosul trebuie, in primul rand, diferentiat de intoxicatia cu stricnina. Accasta se face obisnuit pe baza anamnezei si tabloului clinic (simptomatologie sugestiva dupa o plaga sau administrarea unui implant medicamentos in antecedentele apropiate). Oricum rezul- tatele examenelor bacteriologice sunt prea tardive pentru decizia terapeutica, Se preleva si se examineaza: puroi, secretii din plaga,pansamente, medicamente etc. Microcsopia directa ramane orientativa: frecvent este negativa din cauza numarului redus de bacili tetanici din prelevate; nu diferenfiaza C. tetani de bacili tetanimorfi, nepatogeni Izolarea si identificarea este tardiva pentru necesitaile deciziei clinice. Prelevatele ilzite 30 minute la 80°C pentru omorarea florci nesporulate de asociatie, apoi imbogajite prin incubare in bulion Kitt-Tarrozzi. Se epuizcazé proba imbogasita pe doua plici cu geloza-singe Zeissler (agarizata 5% pentru a preveni cresterea invaziva a bacilului tetanic) dintre care una cu ser antitetanic. Dupa incubare anaeroba se urmareste aparitia coloniilor transparente, cu tendin{a invaziva, uzual hemolitice. Pe placa cu ser antitetanic hemoliza este inhibatd. Se repici cAteva colonii tipice ia bulion Kitt-Tarrozzi pentru acumulare de culturé pura necesara. identificari. Identificarea rapida include studiul: = Caracterelor microscopice: bacili gramvariabili cu spor sferic terminal (aspect de bolduri sau befe de tob’) « Caracterelor de cultivare: organism concentratie normala (2%) de agar. 1 Patogenitati. Sc injectcazd, intramuscular, in membrul posterior, cultura plus S mg Cl,Ca la 2 soareci dintre care unul protejat cu ser antitetanic, Dupa cca 4 zile soarcccle neprotejat moare cu semne de tetanos. Biopreparatele folosite pentru diagnosticul, profilaxia si tratamentul tetanosului: ‘8 Ser heterolog hiperimun antitoxina tetanica, = Imunoglobulina umana hiperimuna antitetanica. = Anatoxina tetanica (monovaccin, bivaccin DT, trivaccin ADTP). sunt i jaerob cu crestere invaziva pe mediile cu 21522.5. INVESTIGATIA ETIOLOGICA A BOTULISMULUI Botulismul este o urgenta terapeutica maxima. De aceea ordinea investigatiilor de laborator este: depistarea si identificarea toxinei, tentativa de izolare si identificare a C. botulinum. Prelevatele patologice indicate sunt: vom, spalatura gastrica, fecale, singe, resturi din alimentele suspecte. De la cadavra se examineaza conjinut gastric si intestinal, sange, fragmente de ficat. Daca exist 0 plaga, exsudat si probe bioptice de la acest nivel. Deplstarea 1 Idemtificarea toxine! botulinice. Testu! de neuiralizare. Se pregaresc prelevatele patologice, dup natura lor, prin omogenizare, filtrare sau centrifugare. In eprubete separate, la 1 ml prelevat se adaugs 1 ml ser hiperimun polivalent antibotulinic (200-300 UA), iar la 2,4 ml prelevat cAte 0,6 ml ser hiperimun antibotulinic monospecific anti-A, anti-B, anti-B, anti-F) cu 100—200 UA. Se incubeazd amestecurile 30 minute la 37°C pentru interactiunea toxina—antitoxina, dupa care se injecteaza, subcutan sau in- traperitoneal, cate 2 soareci cu fiecare amestec prelevat—antitoxina botulinica si 2 soareci ‘martor cu prelevatul patologic incubat numai cu solutie salina izotona, Se supravegheaza animalele pand la 4 zile. Supraviefuiesc numai animalele injectate cu amestecul prelevat patologic—ser an- tibotulinic polivalent si cu scrul antibotulinic monospecific corespunzator toxinei din prelevat. Restul animalelor, inclusiv martorii, fac paraliii si mor in 1—4 zile. Metodele rapide pentru depistarea toxinei botulinice sunt: sReactia de hemaglutinare indirecta cu eritrocite tanate si sensibilizate prin anticor- pii din serurile antibotulinice polivalente si monospecifice de tip. = Determinarea indecelui fagocitar. Toxina botulinica are activitate leucotoxica si inhib capacitatea fagocitara. Astfel indicele fagocitar al polimorfonuclearelor din singele bolnavului scade de 3-20 ori. Daca adziugém la proba de sange cu toxin botulinica serul antibotulinic monospecific omolog, activitatea fagocitara a leucocitelor se restabileste, Tzolarea C. botulinum se face pe mediile specificate mai sus, in condisii anaerobe. Cultura pura o identificam prin studiul caracterelor microscopice, biochimice (tabelul 8.2) si reactia de neutralizare a toxinei. Aceste operatii se fac numai de personal vaccinat antibotulinic Biopreparatele folosite pentru diagnosticul, profilaxia si tratamentul borulismutut 1 Ser antibotulinic polivalent. = Seruri antibotulinice monospecifice de tip. # Anatoxind botulinica pentru vaccinare select a personalului de laborator etc.