I.

II. Thieát bò leân men vaø vieäc söû duïng tia töû ngoaïi:
1.Thieát bò leân men lieân tuïc:

- Thieát bò leân men lieân tuïc (CMF) coù caáu taïo laø moät baêng taûi
chuyeån ñoäng lieân tuïc vôí toác ñoä ñöôïc ñieàu chænh phuø hôïp. Khoái
traø sau khi voø ñöôïc traûi ñeàu treân khay hoaëc treân löôùi baêng taûi (coù
ñuïc loã) vôí beà daøy nhaát ñònh.
- Khoâng khí ñöôïc daãn qua ñöôøng oáng vaøo thieát bò leân men baèng
quaït coù ñieàu chænh toác ñoä, ñoä aåm vaø nhieät ñoä. Löu löôïng khoâng
khí coù theå ñieàu chænh ñöôïc nhôø taám chaén ngay cöûa vaøo cuûa doøng
khí.
- CMF coù nhieàu öu ñieåm hôn haún so vôí caùch leân men truyeàn
thoáng ôû treân saøn: coù theå ñieàu khieån kieåm soaùt caùc thoâng soá kyõ
thuaät deã daøng hôn, coù theå töï ñoäng hoùa, tieát kieäm dieän tích, giaûm
thôøi gian leân men, oån ñònh chaát löôïng vaø saûn löôïng… maø vaãn coù
theå taïo ñöôïc traø coù chaát löôïng nhö leân men treân saøn. Tuy nhieân seõ
toán keùm chi phí thieát bò vaø naêng löôïng.
 2. Thieát bò troáng leân men:

- Thieát bò troáng leân men laø loaïi thieát bò hình truï, ñaàu nhaäp lieäu
vaø ñaàu ra hình noùn. Thoâng thöôøng, tieâu chuaån chung ñoái vôùi thieát bò
naøy laø:
Chieàu daøi: 4,8 – 6,1 m (16 – 20 feet)
Ñöôøng kính: 1,5 m (5 feet).
- Kích thöôùc ñöôïc thieát keá vaø toác ñoä quay cuï theå ñöôïc ñieàu
chænh tuyø coâng ngheä, thôøi gian leân men khoaûng 60 – 90 phuùt. Ñieàu
kieän khoâng khí trong khoang troáng cuõng ñöôïc ñieàu chænh phuø hôïp vaø
coù theå ñöôïc laøm môí lieân tuïc.
- Quaù trình leân men khaù linh ñoäng, khoái cheø ñöôïc xaùo troän lieân
tuïc, laù cheø ñuôïc chaø xaùt vaøo nhau laøm taêng khaû naêng tieáp xuùc
cuûa enzyme vôí cô chaát, keùo theo taêng khaû naêng haáp thuï O 2, taêng
cöôøng ñoä leân men, nhôø ñoù giaûm thôøi gian leân men, möùc ñoä leân
men saâu saéc hôn leân men treân saøn neân maøu saéc nöôùc traø ñaäm hôn.
Tuy nhieân, caùnh traø seõ gioøn hôn do ñoä thoaùng khí toát hôn.
- Thieát bò troáng leân men coù beà maët beân trong ñöôïc thieát keá theo
daïng oáng xoaén taêng khaû naêng xaùo troän ñeå traø tieáp xuùc vôùi doøng
khí toát hôn vaø khoâí traø coù löïc ñaåy ra khoûi troáng.
- Thieát bò troáng leân men ñöôïc söû duïng raát phoå bieán ñoái vôùi loaïi
traø CTC, ñaëc bieät laø ôû Nam AÁn Ñoä.
3. Söû duïng tia töû ngoaïi:
- Moät bieän phaùp môùi hoã trôï cho quaù trình leân men ñaõ ñöôïc aùp
duïng laø duøng böùc xaï töû ngoaïi.
- Tia töû ngoaïi coù 2 taùc duïng chính trong quaù trình leân men:
 Tieâu dieät caùc vi sinh vaät bò nhieãm vaøo khoái traø khi leân men.
 Kích thích, taêng cöôøng hoaït tính cuûa enzyme polyphenoloxidase, vì
vaäy thuùc ñaåy caùc phaûn öùng sinh hoaù.
- Thieát bò troáng leân men thöôøng khoâng söû duïng tia töû ngoaïi do
khoâng theå gaén ñeøn töû ngoaïi vaøo buoàng troáng nhöng coù theå laép deã
daøng ñoái vôùi thieát bò leân men lieân tuïc.
II. Nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa enzyme “naám traø”
 ñeán chaát löôïng traø ñen:
1. Giôùi thieäu:
- Traø laø loaïi ñoà uoáng coù chaát kích thích ñöôïc söû duïng roäng raõi
nhaát treân theá giôí vaø ñöôïc cheá bieán töø buùp non 2 hoaëc 3 laù cuûa
caây cheø coù teân khoa hoïc laø Camellia sinensis .
- Chaát löôïng cuûa traø phuï thuoäc raát nhieàu vaøo nhöõng bieán ñoåi
xaûy ra trong quaù trình cheá bieán. Caùc enzyme polyphenoloxidase vaø caùc
polyphenol coù saün trong laù cheø laø yeáu toá chính taïo neân thaønh phaàn
cuoâí cuøng cuûa saûn phaåm traø ñen. Polyphenoloxidase coù maët trong caùc
teá baøo bieåu bì vaø caùc boù maïch mao daãn, coøn catechin coù trong caùc
khoâng baøo cuûa teá baøo dinh döôõng.
- Quaù trình voø traø, ñaëc bieät laø trong quy trình cheá bieán traø CTC,
ñaõ laøm giaûm ñi moät löôïng enzyme peroxidase vaø polyphenoloxidase so
vôí laù cheø ban ñaàu, do ñoù coù theå aûnh höôûng tôùi söï bieán ñoåi vaø
taïo thaønh caùc hôïp chaát trong traø ñen. Ngoaøi ra, thaønh phaàn
polysaccharide ôû thaønh teá baøo gioáng nhö moät vaät caûn ñoái vôùi söï
töông taùc giöõa enzyme vaø cô chaát. Ñeå khaéc phuïc vaán ñeà naøy, hieän
nay ngöôøi ta ñaõ nghieân cöùu ñeå chieát xuaát enzyme cellulase, pectinase
vaø xylanase töø “naám traø”; enzyme laccase – moät loaïi enzyme
polyphenoloxidase – töø Trametes versicolour ñeå boå sung vaøo quaù trình
leân men nhaèm caûi tieán chaát löôïng traø.
 Ngöôøi ta ñaõ tieán haønh nghieân cöùu söï aûnh höôûng cuûa chuùng
treân caùc yeáu toá, thoâng soá sau: Theaflavin, Thearubigen, hôïp chaát cao
phaân töû, hôïp chaát maøu, toång caùc chaát raén hoaø tan, caffeine vaø
thaønh phaàn chaát khoâ.
2. Enzyme” naám traø”ø &ø phöông phaùp nghieân cöùu :
 Naám traø (Tea fungus):
Naám traø laø nhoùm vi sinh vaät coäng sinh goàm coù 2 loaøi naám
men: Pichia sp. NRRL Y – 4810 ; Zygosaccharomyces sp. NRRL Y – 4882
vaø moät loaøi vi khuaån Acetobacter sp. NRRL B – 2357 . Nhoùm ngöôøi
boä toäc treân ñoài Kolli ôû Tamil Nadu ñaõ laáy ñöôïc loaïi naám naøy.
Chuùng phaùt trieån trong moâi tröôøng cuûa traø (Hesseltine, 1965).
 Saûn xuaát enzyme:
- Tea fungus (1g mat) ñöôïc phaân laäp vaø nuoâi caáy vôí moät ít moâi
tröôøng trong maùy laéc voøng (120rpm) trong voøng 8 ngaøy.
- Ñeå taïo ra cellulase, pectinase, vaø xylanase thì caàn phaûi cung caáp
cô chaát töông öùng laø carboxymethylcellulose, pectin vaø xylan .
- Ñeå taïo ra laccase, Trametes versicolour ñöôïc nuoâi trong moâi
tröôøng boå sung Guaiacol trong 4 ngaøy.
- Sau khi nuoâi caáy, toaøn boä sinh khoái+moâi tröôøng ñöôïc loïc, dòch
loïc ñöôïc goïi laø enzyme thoâ.
 Phaân tích vaø tinh cheá enzyme:
- Cellulase: dòch loïc ñöôïc troän vôí 3 laàn theå tích cuûa Ethanol laïnh
vaø giöõ qua ñeâm ôû 40C. Taùch caën laéng, saáy chaân khoâng, hoaø tan vôí
10ml ñeäm citrate 0,1M, pH = 5.0. Sau ñoù daãn qua coät Sephadex G – 100
(1,5 x 45 cm). Pha ñoäng söû duïng laø ñeäm citrate 0,1M, pH=5.0.
Thu phaân ñoaïn 5ml/h. Öôùc tính thaønh phaàn protein vaø hoaït tính
cuûa cellulase trong moãi phaân ñoaïn. Hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc tính
baèng löôïng enzyme giaûi phoùng 1mol ñöôøng khöû glucose trong 1 phuùt.
- Pectinase: ñoái vôùi pectinase, caën laéng ñöôïc taùch khoûi ethanol vaø
ñöôïc hoaø tan trong ñeäm citrate 0,1M, pH=5. Röûa giaûi qua coät Sephadex
G – 100, duøng dung dòch röûa giaûi cuõng laø ñeäm citrate 0,1M, pH=5 vôùi
vaän toác doøng 5ml/h. Vôùi moãi phaân ñoaïn, xaùc ñònh hoaït tính cuûa
pectinase.
- Xylanase: khi tinh cheá Xylanase, caën laéng töø ethanol ñöôïc hoaø tan
trong ñeäm natri phosphate 0,01M (pH=8.0) vaø cuõng thu phaân ñoaïn qua
coät saéc kyù Sephadex G – 100, duøng dung dòch röûa giaûi cuøng loaïi vôùi
vaän toác doøng 5ml/h. Xaùc ñònh hoaït tính cuûa xylanase baèng löôïng
enzyme giaûi phoùng ra 1mol ñöôøng khöû xylose trong 1 phuùt.
 Ñaëc tính cuûa enzymes:
Caùc ñaëc tính veà pH, nhieät ñoä vaø noàng ñoä cô chaát toái thích cho
hoaït tính cuûa enzyme ñöôïc xaùc ñònh theo moät phöông phaùp rieâng.
Khoái löôïng phaân töû cuûa enzyme ñöôïc tính theo SDS –PAGE
(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis ) cuûa Laemmli,
1970.
 Söû duïng enzyme ñeå hoã trôï leân men:
- Thöû nghieäm ñöôïc thöïc hieän vôùi gioáng traø ‘Asam’ (UPASI-3):
Buùp non 2 laù ñöôïc laøm heùo trong 18h. Sau khi laøm heùo, tieán haønh
caét voø theo CTC.
- Enzyme thoâ vaø enzyme tinh cheá : cellulase, pectinase, xylanase vaø
biopectinase ñöôïc pha loaõng vôùi dung dòch ñeäm acetate 0,1M (pH=5.0) vôí
tyû leä theå tích 1:25, sau ñoù xòt leân lôùp traø CTC. Theå tích xòt vaøo laø
25ml/750g laù traø. Vôùi theå tích naøy, thì hoaït tính cuûa enzyme cellulase,
pectinase, xylanase töông öùng laø 0.8, 0.96, 0.83 IU/ml.
- Khoái traø ñöôïc leân men trong 45 phuùt ôû nhieät ñoä thöôøng. Sau
ñoù ñöôïc saáy khoâ ôû 1200C trong 20 phuùt, tieáp ñeán saøng vaø phaân
loaïi.
- Haøm löôïng cuûa caùc hôïp chaát : TF, TR, hôïp chaát cao phaân töû,
caffeine, thaønh phaàn chaát khoâ, toång caùc chaát maøu ñöôïc phaân tích
theo phöông phaùp chieát baèng dung moâi.
- Toång haøm löôïng chaát khoâ ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp ISS
(1973).
- Soá lieäu sau ñoù ñöôïc phaân tích thoáng keâ baèng phöông phaùp
DMRT (Duncan, 1955). Töø ñoù xaùc ñònh ñöôïc ñieàu kieän toát nhaát caûi
tieán chaát löôïng traø.
- Ngöôøi ta cuõng thöû nghieäm troän enzyme “naám traø” vôí enzyme
polyphenoloxidase laø laccase (töø Trametes versicolor , moät loaïi naám phaùt
trieån treân goã muïc) vôùi caùc tyû leä khaùc nhau ñeå tìm ra tyû leä toâí öu.
3. Caùc keát luaän vaø khaû naêng öùng duïng:
  Ñoä tinh khieát vaø tính chaát cuûa enzyme “naám traø:
- Keát quaû thu ñöôïc töø coät saéc kyù Sephadex G – 100:
Enzymes Cellulase Pectinase Xylanase
Soá phaân ñoaïn(PÑ) 3 1 1
Hoat tính (IU/mg protein) PÑ 1: 32,5 PÑ 1: 32,0 PÑ 1: 28
PÑ 2: 38,5
PÑ 3: 41,0
Yield (%) 2,95 – 3,73 3,69 3,18

- Tính chaát cuûa enzyme ‘naám traø ‘:

Tính chaát Cellulase Pectinase Xylanase
pH optimum 7.0 6.0 6.0
Nhieät ñoä 50 40 50
optimum(0C)
Khoái löôïng phaân töû
(KDa) 35, 40 & 42 20 45
(SDS-PAGE)

 ÖÙng duïng trong leân men traø:

- Söï bieán ñoåi cuûa cô chaát vaø söï taïo thaønh caùc hôïp chaát maøu
phenolic laø moät yeâu caàu quan troïng trong saûn xuaát traø. Enzyme
peroxidase (PO) vaø polyphenoloxidase (PPO) ñoùng vai troø quan troïng
trong caùc phaûn öùng oxi hoaù taïo nhöõng hôïp chaát quan troïng quyeát
ñònh chaát löôïng traø.
- Polyphenoloxidase oxi hoaù Polyphenol thaønh orthoquinon. Theaflavin
(TF) coù maøu vaøng bò oxi hoaù thaønh Thearubigen (TR) coù maøu naâu
ñoû. Quaù trình leân men lyù töôûng laø khi ñaït ñöôïc söï caân ñoái giöõa TF
vaø TR
- TF goàm coù Theaflavin, Theaflavin -3 –gallate, Theaflavin -3’-gallate
vaø Theaflavin -3 -3’-digallate  quyeát ñònh ñeán maøu saéc vaø höông vò
cuûa traø; chuùng chieám 2 – 6% chaát khoâ trong nöôùc traø ñen.
- TR bao goàm TR – 1, TR – 2, TR – 3 ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình
saûn xuaát traø ñen, ñoùng vai troø lôùn trong vieäc taïo maøu. TR ñöôïc taïo
thaønh ngay töø giai ñoaïn ngaét haùi laù cheø vaø tieáp tuïc tôí giai ñoaïn
saáy. TR taêng nhieàu trong giai ñoaïn leân men vaø ñaït cöïc ñaïi khi traø bò
leân men quaù möùc.
- Vai troø cuûa TF : aûnh höôûng tôùi maøu saéc, vò, ñoä saùng, ñoä
doøn.
Vai troø cuûa TR : aûnh höôûng tôùi maøu saéc, möùc ñoä kích thích
cuûa caffeine.
- Theo moät soá baùo caùo, Cathechin, TF, caffeine coù theå ngaên ngöøa
ñöôïc ung thö. Rieâng TF trong traø ñen coù theå ngaên ngöøa ñöôïc ung thö
phoåi vaø thöïc quaûn (Morse – 1997; Yang – 1997)… Chính vì vaäy, vieäc gia
taêng caùc hôïp chaát phenolic trong traø seõ laøm taêng taùc duïng chöõa
beänh cuûa traø.
- Theo nghieân cöùu hieän nay, enzyme “naám traø” (thuyû phaân
polysaccharide) coù khaû naêng phaù vôõ moâ laù vaø thaønh teá baøo, nhôø
vaäy caùc hôïp chaát phenolic, catechin vaø caùc enzyme oxi hoaù ñöôïc giaûi
phoùng, tieáp xuùc maïnh hôn laøm taêng söï taïo thaønh saûn phaåm. Ngoaøi
ra, enzyme laccase ñöôïc boå sung caøng thuùc ñaåy quaù trình oxi hoaù caùc
hôïp chaát phenolic.
- Keát quaû cho thaáy, vieäc boå sung cellulase, pectinase, xylanase laøm
taêng haøm löôïng caùc thaønh phaàn cuûa traø ñen: TF, TR, caffeine (CAF),
HPS (high polymerised substances), TLC (total liquor colour), TSS (total
soluble solids), vaø toång chaát khoâ DMC (dry matter contents).
So saùnh haøm löôïng caùc chaát khi boå sung enzyme:
 Traø ñen ñöôïc laøm theo phöông thöùc thoâng thöôøng coù thaønh
phaàn cuï theå nhö sau:
Thaønh phaàn TF TR HPS TLC CAF TSS
Haøm löôïng 1,05 9,0 10,3 3,12 2,56 37,35
(%)
 Traø leân men coù boå sung biopectinase thì haøm löôïng caùc thaønh
phaàn ña soá coù hôi cao hôn traø leân men thoâng thöôøng, ngoaïi tröø
HPS thì hôi giaûm ñi.
 Traø leân men coù boå sung cellulase tinh khieát: haøm löôïng caùc
chaát coù taêng leân:
Thaønh TF TR HPS TLC CAF TSS DMC
phaàn
Ñoä taêng 52,4 8,89 24,8 20,2 13,3 1,31 0,001
(%)
 Theo nhö keát quaû thì thöû nghieäm söû duïng enzyme cellulase coù
hieäu quaû nhaát trong vieäc caûi tieán chaát löôïng traø.
- Ñoái vôùi enzyme laccase: coù taùc duïng hoã trôï oxi hoaù polyphenol
ngoaøi caùc enzyme coù saün trong traø. Ngöôøi ta ñaõ thöû nghieäm taùc
duïng cuûa noù khi troän chung vôùi cellulase cuûa ‘naám traø’ theo caùc tyû
leä khaùc nhau.
 Keát quaû cho thaáy, cellulase : laccase vôùi tyû leä 3:2 (v/v) cho chaát
löôïng traø coøn hôn caû khi söû duïng cellulase tinh khieát.
 Keát quaû haøm löôïng caùc chaát khi cheá bieán traø theo phöông
thöùc naøy nhö sau:
Thaønh TF TR HPS TLC CAF TSS DMC
phaàn
Ñoä taêng 57,1 9,44 25,7 22,8 16,4 0,02 0,002
(%)

Lôøi keát:
 Nghieân cöùu naøy cho thaáy vieäc söû duïng enzyme cellulase tinh khieát
töø naám traø vôí laccase theo tyû leä 3:2 (v/v) coù theå caûi tieán chaát löôïng
cuûa traø ñen, vì vaäy noù cuõng coù giaù trò thöông maïi. Ngoaøi ra, tra leân
men baèng enzyme coøn coù taùc duïng chöõa beänh coøn hôn caû traø leân
men thoâng thöôøng.
III. Caûi tieán leân men traø baèng Enzyme Pectinase
cuûa Aspergillus spp.
1. Giôùi thieäu:
- Enzyme Pectinase ñaõ ñöôïc chieát taùch töø Aspergillus spp., Asp.
indicus, Asp. flavus, Asp. niveus , ñeå söû duïng trong quaù trình leân men traø.
Ngöôøi ta ñaõ nghieân cöùu aûnh höôûng cuûa enzyme thoâ vaø enzyme tinh
khieát trong quaù trình leân men qua caùc thoâng soá haøm löôïng TF, TR,
HPS, TLC, DMC, TSS cuûa traø thaønh phaåm. Enzyme thoâ keát laéng baèng
ethanol coù hieäu quaû hôn laø enzyme tinh khieát trong vieäc caûi thieän
chaát löôïng traø ñen.
- Trong quaù trình leân men, catechin bò oxi hoaù thaønh ortho-quinone
ngöng tuï taïo thaønh TF, TF hoaït ñoäng nhö moät taùc nhaân oxi hoaù caùc
hôïp chaát nhö acid gallic . Acid Epitheaflavic ñöôïc taïo thaønh do oxi hoaù
acid gallic. Noù ngöng tuï vôùi TF taïo thaønh poly-meric
- khi ñaït ñöôïc caân baèng giöõa thaønh phaàn TF vaø TR. Trong soá
caùc thaønh phaàn ñeå ñaùnh giaù chaát löôïng traø ñen thì TF ñoùng vai troø
chuû yeáu.
- Ngöôøi ta ñaõ nghieân cöuù vaø thaáy raèng Catechin, TR, caffeine coù
khaû naêng ngaên chaën söï hình thaønh ung thö ôû maãu ñoäng vaät. TF cuûa
traø ñen coù theå ngaên chaën ung thö phoåi vaø thöïc quaûn.
Vì vaäy, neáu laøm taêng haøm löôïng caùc hôïp chaát phenolic trong
traø coù theå caûi tieán chaát löôïng traø vaø taêng taùc duïng phoøng chöõa
beänh. Ñieàu ñoù phuï thuoäc vaøo möùc ñoä leân men, möùc ñoä tieáp xuùc
giöõa cô chaát vaø enzyme.
- Taát caû caùc chaát tham gia phaûn öùng ngoaïi tröø O 2 ñeàu xuaát phaùt
töø beân trong caùc moâ teá baøo cuûa laù traø nhöng chuùng thöôøng taùch
bieät nhau vì bò ngaên caùch bôæ maøng teá baøo.
- Giai ñoaïn voø traø coù taùc duïng phaù vôõ teá baøo taïo ñieàu kieän
cho caùc cô chaát, enzyme, O2 tieáp xuùc nhau nhöng möùc ñoä daäp vaø phaù
vôõ teá baøo khoâng cao vaø khoâng trieät ñeå  Möùc ñoä oxi hoaù khoâng
hoaøn toaøn ñoái vôùi caùc chaát coù theå oxi hoaù ñöôïc.
Vieäc öùng duïng caùc enzyme töø beân ngoaøi boå sung vaøo coù theå
khaéc phuïc ñöôïc vaán ñeà ñoù. Enzyme Pectinase thuyû phaân phaù vôõ
thaønh teá baøo giaûi phoùng cô chaát, caùc chaát phaûn öùng, enzyme taêng
hieäu quaû leân men.
- Enzyme Pectinase töø naám moác, ñaëc bieät laø Aspergillus niger ñöôïc
saûn xuaát trong coâng nghieäp vaø ñöôïc söû duïng cho caùc muïc ñích chieát
taùch, tinh cheá, thuyû phaân… Hieän taïi, trong nghieân cöùu, E. pectinase
cuõng ñaõ ñöôïc thu nhaän töø Asp. inducus, Asp. flavus, Asp. niveus ñeå söû
duïng trong quaù trình leân men traø, caûi thieän chaát löôïng traø.
2. E. pectinase & phöông phaùp nghieân cöùu:
 Thu nhaän E. pectin:
Moâi tröôøng chöùa baøo töû naám moác (10%) ñöôïc nuoâi trong thieát
bò laéc voøng 125 rpm ôû 27  20C. Cuoái giai ñoaïn nuoâi caáy, caû moâi
tröôøng sinh khoái ñöôïc loïc qua giaáy loïc Whatman no. 1.
Dòch loïc ñöôïc ly taâm vôí toác ñoä 10000 rpm trong 20 phuùt ôû 4 0C.
Phaàn dòch loûng ñöôïc thaåm taùch vaø hoaït tính cuûa Pectinase trong dòch
ñaõ thaåm taùch ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp cuûa Sherwood.
 Tinh cheá enzyme:
Dòch loïc sau thaåm taùch (200ml) ñöôïc troän vôùi 3 laàn theå tích
ethanol laïnh ñoàng thôøi khuaáy lieân tuïc vaø ñeå yeân qua ñeâm ôû 4 0C. Ly
taâm 30 phuùt ôû 40C ñeå thu phaàn tuûa keát laéng. Phaàn tuûa laéng hoaø tan
trong ñeäm Mcllvaine (0,2M vaø pH=5.0), thaåm taùch qua ñeâm vôùi nöôùc
caát vaø coù theå söû duïng ñeå leân men traø.
Coù theå tinh cheá theâm nhö sau: maãu thaåm taùch ñöôïc coâ ñaëc laïnh
chaân khoâng tôùi 5ml vaø daãn qua coät saéc kyù Sephadex G-100, röûa giaûi
baèng ñeäm citrate (0,1M ; pH=5.0). Thu phaân ñoaïn 10ml/h. Phaân tích
thaønh phaàn protein vaø hoaït tính cuûa pectinase trong moãi phaân ñoaïn.
Caùc phaân ñoaïn ñöôïc troän chung vaø xaùc ñònh caùc tính chaát cuûa
enzyme nhö pH, nhieät ñoä optimum, noàng ñoä cô chaát optimum (V max vaø
Km) vaø khoái löôïng phaân töû.
 Leân men traø:
Thöû nghieäm vôùi gioáng traø ‘Assam’, buùp 2 laù, laøm heùo 18h, voø
CTC.
Enzyme ñöôïc pha trong ñeäm Mcllvaine (25ml; 0.2M; pH 5.0):
- Enzyme thoâ chuaån bò trong ñeäm 25ml; hoaït tính enzyme 0.1 IU/ml
- Enzyme tinh khieát chuaån bò trong ñeäm 25ml; hoaït tính enzyme 1.0
IU/m.
- Enzyme cheá phaåm thöông maïi biopectinase: 1ml pha loaõng tôùi 25ml
vôùi ñeäm Mcllvaine nhö treân. Cheá phaåm naøy ñöôïc mua töø Biocon Pvt.
Ltd., Bangalore, Karnataka, India. Hoaït tính cuûa enzyme tröôùc khi pha
loaõng laø 1.0 IU/ml.
Caùc maãu enzyme ñöôïc xòt leân caùc maãu traø vaø ñeå leân men ôû
nhieät ñoä thöôøng trong 1h. Sau 1h, caùc maãu traø ñöôïc ñem sao ôû nhieät
ñoä 970C tôùi 1050C ñeå laøm maát hoaït tính cuûa enzyme, vaø giaûm aåm
tôùi 4 – 6%. Traø ñöôïc ñem saøng, sau ñoù xaùc ñònh caùc thaønh phaàn TF,
TR, HPS, TLC theo phöông phaùp chieát taùch baèng dung moâi cuûa Takeo
vaø Ozawa; TSS ñöôïc xaùc ñònh theo phöông phaùp ISS.
3. Keát luaän & khaû naêng öùng duïng:
 Saûn xuaát enzyme:
- Keát quaû cho thaáy: E. pectinase thu nhaän töø caùc loaøi naám moác
coù hoaït tính nhö sau:
Asp. indicus : 0.46 IU/ml.
 Asp. flavus : 0.41 IU/ml
Asp. niveus : 0.43 IU/ml
- Nhìn chung theo caùc nghieân cöùu cho thaáy töø naám moác coù theå
saûn xuaát ra enzyme coù chaát löôïng toát.
 Ñaëc tính E. pectinase:
Tính chaát A. indicus A. flavus A. niveus
pH optimum 6 5 6
T0 optimum (0C) 50 50 50
Khaû naêng oån ñònh
nhieät: 2 3 3
370C (d) 60 60 60
500C (min) 10.02 33.42 12.37
Vmax (IU/mg protein) 10 6.28 9.54
Km (mg/ml) 28.5 22 23
Khoái löôïng phaân töû
(kDa)
 ÖÙng duïng trong cheá bieán traø:
- Caùc nghieân cöùu ñaõ thöïc hieän chuû yeáu chæ laø phaân taùch, tinh
cheá, vaø xaùc ñònh ñaëc tính cuûa caùc enzyme trong laù traø vaø vai troø
cuûa noù trong caùc quaù trình cheá bieán traø. Coøn aûnh höôûng cuûa caùc
enzyme boå sung vaøo ñoái vôùi chaát löôïng traø ñöôïc nghieân cöùu khoâng
nhieàu.
- Theo Marimuthu, vieäc söû duïng biopectinase vaø biocellulase (cheá
phaåm enzyme thöông maïi cuûa haõng Biocon Pvt. Ltd.) vôùi noàng ñoä 0,6%
coù theå caûi thieän ñöôïc chaát löôïng traø ñen, laøm taêng haøm löôïng caùc
chaát trong traø thaønh phaåm nhö sau:
Thaønh TF TR HPS TLC TSS
phaàn
Ñoä taêng 24.77 21.52 21.54 23.33 17.49
(%)
- Theo moät nghieân cöùu khaùc, khi söû duïng cheá phaåm biopectinase
thöông maïi trong quaù trình leân men traø ñen coù theå gia taêng haøm löôïng
caùc chaát trong traø thaønh phaåm nhö sau:
Thaønh TF TR HPS TSS
phaàn
Ñoä taêng 5.8 5.72 4.96 9.29
(%)
- Ñoái vôùi hoãn hôïp enzyme cuûa A. oryzae, A. wentii, A. tamari, A.
japonicus, A. awamori vaø Trichoderma koningii taêng chaát löôïng traø vôùi
caùc haøm löôïng:
 Thaønh TF TR HPS TLC TSS
phaàn
Ñoä taêng 45 48 33 19 3
(%)
- Caùc keát quaû nghieân cöùu cho thaáy, vieäc öùng duïng caùc enzyme
ngoaïi baøo cuûa naám moác coù theå caûi thieän ñöôïc chaát löôïng cuûa traø
ñen. Ñaëc bieät laø dòch enzyme thoâ coù hieäu quaû hôn caû enzyme tinh
khieát vaø cheá phaåm biopectinase thöông maïi. Dòch chieát enzyme thoâ töø
naám moác bao goàm taát caû caùc enzyme cellulase, hemicellulase (xylanase),
proteinase, pectinase… trong khi enzyme tinh khieát chæ chöùa pectinase.
- Laù traø coù chöùa cellulose, hemicellulose, vaø pectin. Do ñoù, khi söû
duïng enzyme thoâ, taát caû caùc hôïp chaát cao phaân töû ñoù ñeàu coù theå
bò thuyû phaân, laøm cho teá baøo bò phaù vôõ nhieàu hôn, khaû naêng leân
men cao hôn. Trong tröôøng hôïp enzyme tinh khieát, chæ coù pectinase bò
thuyû phaân, hieäu quaû leân men seõ keùm hôn.
- Enzyme thoâ töø Asp. indicus, Asp. flavus, Asp. niveus coù theå gia taêng
ñöôïc toái ña thaønh phaàn TF, trong khi enzyme tinh khieát cuõng taêng ham
löôïng TF nhöng ít hôn :
Loaøi naám Asp. indicus Asp. flavus Asp. niveus
Ñoä taêng Enzyme thoâ 43.81 62.86 59.05
haøm (hoãn hôïp enzyme)
löôïng TF Enzyme tinh khieát 38.10 40 34.29
(%) (pectinase)
Coøn cheá phaåm enzyme thöông maïi thì TF chæ taêng 30.48%.
- Ñoái vôùi thaønh phaàn TR cuõng töông töï:
Loaøi naám Asp. indicus Asp. flavus Asp. niveus
Ñoä taêng Enzyme thoâ 12 12.44 11.78
haøm (hoãn hôïp enzyme)
löôïng TR Enzyme tinh khieát 7.11 9.44 6.78
(%) (pectinase)

Coøn cheá phaåm enzyme thöông maïi thì TR chæ taêng 4%.
- Ñoái vôùi HPS thì keát quaû nhö sau:
Loaøi naám Asp. indicus Asp. flavus Asp. niveus
Ñoä taêng Enzyme thoâ 19.93 4.23 37.92
haøm (hoãn hôïp enzyme)
löôïng Enzyme tinh khieát 6.64 12.32 10.15
HPS(%) (pectinase)

Coøn cheá phaåm enzyme thöông maïi thì HPS chæ taêng 3.62%.
- Ñoái vôùi TLC thì keát quaû nhö sau
 Loaøi naám Asp. indicus Asp. flavus Asp. niveus
Ñoä taêng Enzyme thoâ 18.91 14.74 14.10
haøm (hoãn hôïp enzyme)
löôïng TLC Enzyme tinh khieát 12.18 11.54 11.22
(%) (pectinase)

Coøn cheá phaåm enzyme thöông maïi thì TLC chæ taêng 11.54%.
- Ñoái vôùi DMC thì keát quaû giaûm nhö sau:
Loaøi naám Asp. indicus Asp. flavus Asp. niveus
Ñoä giaûm Enzyme thoâ 0.2 0.11 0.13
haøm (hoãn hôïp enzyme)
löôïng Enzyme tinh khieát 0.37 0.42 0.36
DMC (%) (pectinase)

Coøn cheá phaåm enzyme thöông maïi thì DMC giaûm 0.58%.
- Ñoái vôùi TSS thì keát quaû taêng nhö sau:
Loaøi naám Asp. indicus Asp. flavus Asp. niveus
Enzyme thoâ
Ñoä taêng 0.91  6.21
haøm (hoãn hôïp enzyme)
löôïng TSS Enzyme tinh khieát 1.31 1.04 4.02
(%) (pectinase)

Coøn cheá phaåm enzyme thöông maïi thì TSS giaûm 1.39%.
 Caùc keát quaû thoáng keâ ñeàu chæ ra raèng söû duïng enzyme thoâ
laø hieäu quaû nhaát cho quaù trình leân men traø.
Phöông phaùp thoáng keâ phaân tích DMRT (Duncan’s multiple range test)
ñaõ cho thaáy aûnh höôûng cuûa enzyme ngoaïi baøo boå sung vaøo traø ôû
daïng thoâ vaø daïng tinh khieát nhaèm caûi thieän chaát löôïng traø trong quaù
trình leân men.
Maëc duø khoâng coù söï khaùc nhau coù nghóa giöõa caùc enzyme cuûa 3
loaøi naám nhöng coù söï khaùc nhau coù nghóa giöõa söï ñieàu khieån vaø
caùc maãu thöû nghieäm. Noùi caùch khaùc, vieäc boå sung enzyme ngoaïi
baøo ôû daïng thoâ trong quaù trình leân men laøm taêng caùc thoâng soá
haøm löôïng cuûa caùc chaát, töùc laøm taêng chaát löôïng traø ñen ôû möùc
yù nghóa 5%.