CÁC PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT

GÂY BỆNH NHIỄM TRÙNG

Mục tiêu học tập
1. Mô tả được các phương pháp chẩn đoán vi sinh vật bằng nhuộm soi, nuôi cấy vi
sinh vật từ bệnh phẩm lâm sàng.
2. Trình bày được các phương pháp huyết thanh học dùng để xác định kháng nguyên
–kháng thể dùng trong chẩn đoán bệnh nhiễm trùng vi sinh vật.
3. Trình bày được các phương pháp kỹ thuật phân tử trong xác định vi sinh vật gây
nhiễm trùng.

I. PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH VI SINH VẬT BẰNG NHUỘM SOI BỆNH PHẨM
1. 1. Nhuộm mô bệnh học
Nhuộm mô bệnh học không phải là một kỹ thuật của phòng thí nghiệm vi sinh vật,
kỹ thuật này được thực hiện ở phòng xét nghiệm bệnh học tế bào. Nhiều vi khuẩn gây
bệnh có thể phát hiện khi nhuộm mô học với phương pháp nhuộm đặc hiệu, như vi khuẩn
Hansen ở các tổn thương ngoài da của bệnh nhân phong với phương pháp nhuộm Ziehl-
Neelsen, vi khuẩn Helicobacter pylori trong mẫu mô bệnh học loét dạ dày-tá tràng.
Nhiều nhiễm trùng virus ở các cơ quan tạo nên các tổn thương phá hủy tế bào với sự xuất
hiện các hợp bào, các tiểu thể hay hạt vùi đặc thù ở trong nguyên tương hay trong nhân tế
bào như nhiễm trùng các virus herpes, cytomegalovirus, tiểu thể Negri trong nhiễm trùng
virus dại. Dựa vào hình ảnh của mô bệnh học có thể gián tiếp gợi ý nguyên nhân các
virus gây nhiễm trùng.
1. 2. Nhuộm soi vi sinh vật dưới kính hiển vi
- Soi tươi bệnh phẩm: Các bệnh phẩm lâm sàng như phân, mủ khi làm tiêu bản soi
tươi, không cố định và không nhuộm màu, có thể xác định các vi khuẩn di động mạnh
như vi khuẩn tả (Vibrio cholerae O1, V. cholarae O139) và các ký sinh trùng như amip,
trùng roi. Soi tươi bệnh phẩm có giá trị hạn chế và cho kết quả nghi ngờ vì các đặc điểm
về hình thể và bắt màu của vi khuẩn chỉ được mô tả khi nhuộm màu và quan sát dưới
kính hiển vi vật kính dầu.
- Nhuộm màu vi khuẩn và soi dưới kính hiển vi: Là một trong những phương pháp
xác định vi khuẩn trực tiếp từ các mẫu nghiệm lâm sàng. Nhiều phương pháp nhuộm
phân biệt như nhuộm Gram, nhuộm Ziehl- Neelsen, nhuộm vi khuẩn với chất màu huỳnh
quang cho phép xác định hình thái và tính chất bắt màu của vi khuẩn hiện diện trong
bệnh phẩm.
- Phương pháp nhuộm Gram đơn giản có thể cho biết vi khuẩn hình cầu, hình que
hay hình dấu phẩy như các vibrio. Cách sắp xếp của nhiều vi khuẩn khá đặc trưng có thể
nhận biết được trên tiêu bản nhuộm trực tiếp như tụ cầu xếp thành đám, liên cầu xếp
thành từng chuỗi, phế cầu, hay não mô cầu thường xếp thành từng cặp. Tính chất bắt màu
78
khi nhuộm Gram cho phép biết được các vi khuẩn là gram dương hay vi khuẩn gram âm.
Nhuộm gram mẫu nghiệm lấy một cách vô trùng từ tổn thương, người ta có thể xác định
được tác nhân nhiễm trùng như ổ nung mủ kín, dịch màng phổi, dịch ổ bụng, dịch não
tủy…Kết quả nhuộm gram bệnh phẩm chỉ có giá trị gợi ý, để định loài vi khuẩn gây
nhiễm trùng cần phải phân lập và định danh vi khuẩn.
- Nhuộm Ziehl - Neelsen cho phép xác đinh được vi khuẩn mycobacteria và các vi
sinh vật kháng axit cồn (Norcardia, Rhodococcus, Crytosporodium..). Nhuộm Ziehl-
Neelsen thường dùng để tìm vi khuẩn mycobacteria gây nhiễm trùng trong mẫu nghiệm
đàm, dịch não tủy. Vi khuẩn kháng axit cồn sẽ bắt màu thuốc nhuộm đỏ fuchsin, dễ dàng
nhận biết khi soi dưới kính hiển vi, trong lúc các vi khuẩn và các tế bào khác sẽ bắt màu
của thuốc nhuộm tương phản.
- Nhuộm huỳnh quang: Phương pháp nhuộm vi khuẩn với chất màu huỳnh quang
auramin –rhodamin thường dùng trong chẩn đoán trực tiếp vi khuẩn lao ở trong đàm. Với
phương pháp nhuộm này, phòng thí nghiệm cần có kính hiển vi huỳnh quang. Phương
pháp nhuộm với chất màu huỳnh quang trong đó kháng thể gắn với chất màu huỳnh
quang thường dùng để nhuộm các xoắn khuẩn, vi khuẩn tả. Đặc biệt phương pháp này
dùng khá phổ biến trong chẩn đoán trực tiếp nhiễm trùng do virus (xem thêm ở mục
3.3.4. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang).

II. NUÔI CẤY VÀ PHÂN LẬP VI SINH VẬT TỪ BỆNH PHẨM

Nuôi cấy và phân lập vi sinh vật từ tổn thương nhiễm trùng là một phương pháp
chuẩn vàng để chẩn đoán nhiễm trùng vi sinh vật.
2.1. Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn:
Trong phòng thí nghiệm vi khuẩn có thể phát triển trên các môi trường nuôi cấy ở
dạng lỏng (môi trường canh thang) và môi trường đặc (môi trường chứa 2% thạch), nhiều
vi khuẩn có thể phát triển trên các môi trường có chất dinh dưỡng thông thường, tuy
nhiên nhiều loại vi khuẩn chỉ có thể phát triển trên các môi trường có chất dinh dưỡng
phong phú như môi trường có máu, có huyết thanh. Đối với các nhiễm trùng xảy ra ở các
hệ thống kín của cơ thể như máu, dịch não tủy ở những bệnh nhân chưa sử dụng kháng
sinh, nếu phân lập và nuôi cấy có vi khuẩn phát triển, thì đây chính là tác nhân gây nhiễm
trùng. Các bệnh phẩm lâm sàng ở nhiều cơ quan hay hệ thống mở như đường tiêu hóa, hô
hấp, sinh dục-tiết niệu, ngoài vi khuẩn gây nhiễm trùng, những vị trí này thường có nhiều
vi khuẩn hoại sinh cư trú. Do vậy để có thể phân lập chọn lọc một vi khuẩn gây bệnh
nghi ngờ, người ta thường dùng các môi trường có chất chọn lọc, nó chỉ phép vi khuẩn
cần tìm phát triển như môi trường MacConkey để phân lập các vi khuẩn hiếu khí gram
âm, môi trường trường Chapman để phân lập tụ cầu trong phân, môi trường Columbia
kháng sinh để phân lập vi khuẩn Helicobacter pylori, môi trường Thayer Martin để phân
lập não mô cầu, lậu cầu. Ngoài môi trường cấy, điều kiện ủ đóng vai trò quan trọng để vi
khuẩn có thể phát triển được, các vi khuẩn hiếu khí có thể nuôi cấy trong điều kiện ủ hiếu

79
khí bình thường. Tuy nhiên, với các vi khuẩn kỵ khí, sự hiện diện của oxy trong môi
trường ủ là yếu tố độc với vi khuẩn. Loại vi khuẩn này chỉ phát triển khi nuôi cấy và ủ
trong điều kiện kỵ khí.
Khi vi khuẩn phát triển trên môi trường cấy, bước tiếp theo trong phòng thí
nghiệm là định danh loài vi khuẩn gây nhiễm trùng bằng các phương pháp khảo sát hình
thể, tính chất sinh vật và hóa học của khuẩn, tính chất kháng nguyên bằng phản ứng
ngưng kết với kháng thể đặc hiệu. Sự có sẳn vi khuẩn sống thuần khiết khi nuôi cấy, cho
phép xác định tính nhạy cảm hay kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn gây bệnh bằng
các kỹ thuật xác định nhạy cảm của vi khuẩn với thuốc kháng sinh. (xem thêm phần thực
hành phân lập và nuôi cấy vi khuẩn).
2.2. Phân lập và nuôi cấy virus
Nhiều virus gây bệnh cho người có thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm bằng các
phương pháp sau đây:
- Tiêm vào động vật cảm thụ: Đây là phương pháp nuôi cấy virus cổ điển trước khi
kỹ thuật nuôi cấy trên phôi gà và nuôi cấy tế bào động vật được phát minh. Mỗi loài virus
có một vài động vật cảm thụ riêng, do vậy tùy theo loài virus gây bệnh nghi ngờ, người ta
sử dụng các động vật nhạy cảm khác nhau gồm chuột nhắt trắng, thỏ, khỉ…. ví dụ đối với
các virus họ Flaviviridae, Togaviridae, động vật nhạy cảm thường dùng là chuột nhắt
trắng mới đẻ. Ngoài việc sử dụng động vật để tiêm truyền phân lập virus, động vật nhạy
cảm rất hữu ích để sản xuất các vacxin virus.
- Ủ vào bào thai gà: Nhiều virus như virus cúm, virus quai bị, virus sởi có thể phát
triển ở màng niệu đệm và túi ối của bào thai gà. Trứng gà ấp 9-10 ngày tuổi thường được
sử dụng để ủ và phân lập virus trong phòng thí nghiệm.
- Các nuôi cấy tế bào: nhiều hệ thống nuôi cấy tế bào từ lâu được dùng để nuôi cấy
và phân lập virus. Các cơ quan của động vật được xử lý với trypsin hoặc collagenase để
tách rời tế bào, rồi nuôi cấy trong môi trường đặc biệt để phát triển thành một lớp tế bào
hoặc tạo thành dịch treo tế bào (đối với tế bào lympho).
+ Tế bào nguyên phát: có nguồn gốc từ mô động vật hay côn trùng được nuôi cấy
thành một lớp tế bào trong ống nghiệm thường dùng để nuôi cấy phân lập virus. Tế bào
nguyên phát chỉ sử dụng một lần, khi cấy truyền nhiều lần tế bào sẽ bị thoái hóa. Tế bào
nguyên phát thận khỉ dùng để nuôi cấy và phân lập nhiều myxovirus, paramyxovirus,
enterovirus và một số adenovirus.
+ Tế bào thường trực: có nguồn gốc từ mô động vật hay côn trùng đã được cấy
truyền nhiều lần mà không bị thoái hoá. Các tế bào thường trực hiện nay thường dùng
như tế bào Hela, Hep-2, Vero, C6 / 36,...
+ Tế bào lưỡng bội: là dòng tế bào có nguồn gốc bào thai người, dòng tế bào này
có nhiễm sắc thể lưỡng bội và phát triển như tế bào bình thường và có thể cấy truyền
được nhiều lần. Dòng tế bào lưỡng bội được dùng để nuôi cấy nhiều virus như herpes,
adenovirus, picornavirus
80
III. PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN VI SINH VẬT BẰNG CÁC KỸ THUẬT
HUYẾT THANH HỌC
Phản ứng huyết thanh học là loại phản ứng kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể.
Một kháng nguyên chỉ kết hợp với kháng thể do nó kích thích cơ thể tạo thành. Do đó phản
ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể là phản ứng rất đặc hiệu và được sử dụng để xác định
kháng nguyên hoặc kháng thể nếu một trong hai phần tử đã biết.
3.1. Phản ứng huyết thanh học xác định kháng nguyên
Các kháng thể đặc hiệu có sẳn có thể dùng để xác định các kháng nguyên của vi
khuẩn hay của virus tương ứng có trong mẫu nghiệm. Các kháng thể đặc hiệu này có thể
lấy từ người bị bệnh đã hồi phục hoặc được điều chế bằng cách gây miễn dịch cho động
vật. Các kháng thể thu được bằng cách này thường là kháng thể đa dòng, có nghĩa là nó
có thể kết hợp với nhiều nhóm kháng nguyên khác nhau trên một phân tử kháng nguyên.
Kháng thể đơn dòng trái lại chỉ kết hợp được với một quyết định kháng nguyên cụ thể
trên một phân tử kháng nguyên.
Các kháng nguyên vi khuẩn hay virus có trong các dịch cơ thể như máu, trong
dịch não tủy, dịch các khoang của cơ thể; hay chất tiết của các cơ quan như bệnh phẩm
hô hấp, tiết niệu sinh dục; trong mô đặc của cơ thể như tổ chức não, gan...có thể xác định
được bằng các phản ứng huyết thanh học với kháng thể đặc hiệu có sẳn.
3.2. Phản ứng huyết thanh học xác định kháng thể
Khi bị nhiễm trùng hay sau khi tiêm vacxin, sự đáp ứng của cơ thể người bệnh
kèm theo với sự xuất hiện kháng thể trong máu của bệnh nhân. Các kháng thể này có thể
xác định bằng định tính hay định lượng bằng phương tiện các phản ứng huyết thanh học
khi dùng kháng nguyên tương ứng đã biết. Nồng độ kháng thể trong huyết thanh cao hay
thấp được đánh giá qua hiệu giá kháng thể. Thông thường huyết thanh của người bệnh
được pha loãng dần theo cấp số 2 hoặc 4. Đậm độ huyết thanh thấp nhất cho kết quả
dương tính thì đậm độ đó là hiệu giá. Ví dụ huyết thanh người bệnh pha loãng từ 1/2, 1/4,
1/16...đến 1/128, ở độ pha loãng lớn nhất này (lượng kháng thể thấp nhất), phản ứng
huyết thanh vẫn còn cho kết quả dương tính, hiệu giá là 128.
Các phản ứng định lượng cần thiết để theo dõi động lực kháng thể của hai mẫu
huyết thanh lấy cách nhau 7 đến 10 ngày trên cùng người bệnh (gọi là huyết thanh kép).
Động lực kháng thể là đại lượng đặc trưng cho mức độ thay đổi hiệu giá kháng thể theo
thời gian. Đối với bệnh do virus hiệu giá kháng thể tăng lên 4 lần mới có giá trị chắc
chắn.

81
3.3. Các phản ứng huyết thanh học thường dùng trong chẩn đoán VSV
3.3.1. Phản ứng kết tủa:
Về nguyên lý, phản ứng kết tủa là sự kết hợp giữa kháng nguyên hòa tan (protein) lúc gặp
kháng thể tương ứng, tạo thành tủa có thể quan sát trực tiếp bằng mắt thường hoặc nhờ
soi kính lúp. Phản ứng có thể thực hiện ở môi trường lỏng hoặc môi trường gel.
3.3.1.1. Phản ứng kết tủa ở môi trường lỏng
- Phản ứng định tính
Huyết thanh có chứa kháng thể (thường gọi là kháng huyết thanh) và kháng
nguyên được trộn với nhau và quan sát kết tủa tạo thành. Cũng có thể cho kháng huyết
thanh vào một ống nghiệm nhỏ rồi sau đó cho kháng nguyên dần dần vào theo thành ống.
Một vòng kết tủa được quan sát ở mặt phẳng phân cách.
- Phản ứng định lượng
Cho phép xác định lượng kháng thể kết tủa với một lượng kháng nguyên đã biết.
Cho một lượng kháng nguyên tăng dần vào một lượng kháng huyết thanh không đổi, lấy
kết tủa bằng ly tâm và định lượng protein bằng những phương pháp thông thường để xác
định lượng kháng thể đã phản ứng.
3.3.1.2. Phản ứng kết tủa ở môi trường gel
- Phản ứng khuếch tán đôi Ouchterlony
Kháng nguyên và kháng thể được đặt vào những lỗ đục ở trong thạch. Chúng
khuếch tán và gặp nhau ở các nồng độ tương thích sẽ tạo nên những đường kết tủa ở trên
mặt thạch. Một phẩm vật chứa nhiều kháng nguyên gặp các kháng thể tương ứng sẽ tạo
thành nhiều đường kết tủa. Những liên hệ miễn dịch giữa hai kháng nguyên có thể khảo
sát bằng phản ứng khuếch tán đôi. Những dải kết tủa tạo thành có thể cho biết sự tương
đồng miễn dịch, sự đồng nhất từng phần hoặc không liên hệ.
- Phản ứng khuếch tán đơn
Có thể làm cho sự khuếch tán ở môi trường gel nhạy hơn bằng cách trộn kháng thể
vào thạch. Kháng nguyên được cho khuếch tán từ một lỗ đục ở trên môi trường thạch
chứa kháng thể. Khi nồng độ kháng nguyên đạt đến một trị số tương ứng ở đó vòng kết
tủa được tạo thành. Phương pháp này không những có thể ứng dụng để nhận mặt kháng
nguyên mà còn có thể cho phép định lượng IgG ở trong huyết thanh.
3.3.2. Phản ứng ngưng kết
Phản ứng ngưng kết là sự kết hợp giữa kháng nguyên hữu hình (vi khuẩn, hồng
cầu, bạch cầu...) với kháng thể tương ứng tạo thành các hạt ngưng kết có thể quan sát
được bằng mắt thường. Phản ứng ngưng kết chi xảy ra nếu có chất điện giải, rõ nhất,
nhanh nhất ở pH từ 7 đến 7,2 và ở nhiệt độ 370C.
3.3.2.1. Phản ứng ngưng kết trực tiếp
Vi sinh vật sống và chết đều có khả năng ngưng kết với kháng thể. Thực hiện phản
ứng trên một phiến kính với vi sinh vật sống thường được sử dụng để nhận mặt vi khuẩn.
82
Với kháng nguyên vi sinh vật chết, thực hiện phản ứng trong ống nghiệm để xác định
hiệu giá kháng thể ở trong huyết thanh trong chẩn đoán bệnh như phản ứng Widal trong
chẩn đoán bệnh thương hàn.
3.3.2.2. Phản ứng ngưng kết thụ động
Kháng nguyên hòa tan được hấp phụ lên bề mặt những nền mượn như hạt
bentonit, hạt latex, hồng cầu cừu. Những hạt mang kháng nguyên này sẽ ngưng kết khi
trộn với huyết thanh chứa kháng thể, phản ứng dương tính có thể thấy được bằng mắt
thường. Khi hồng cầu được dùng làm giá mang kháng nguyên thì phản ứng được gọi là
phản ứng ngưng kết hồng cầu thụ động.
Để phát hiện kháng nguyên, người ta gắn kháng thể lên nền mượn. Khi kháng thể
gặp kháng nguyên đặc hiệu, hiện tượng ngưng kết sẽ xuất hiện. Loại này được gọi là
phản ứng ngưng kết thụ động ngược.
Phản ứng ngưng kết thụ động nhạy hơn phản ứng ngưng kết trực tiếp nhờ hình thể
tương đối lớn của những hạt mang kháng nguyên và độ đặc hiệu cao hơn phản ứng ngưng
kết trực tiếp vì có thể làm thuần khiết các kháng nguyên hoặc kháng thể trước khi gắn lên
nền mượn. Loại phản ứng này được dùng trong chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng như
dịch hạch, Whitmore, viêm màng não mủ...
3.3.2.3. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu
Một số virus có khả năng làm ngưng kết hồng cầu của một số động vật và phản
ứng đó bị ức chế bởi kháng huyết thanh của virus. Đó là phản ứng ngăn ngưng kết hồng
cầu. Phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu được sử dụng để chẩn đoán nhiều bệnh virus như
cúm, quai bị, sốt xuất huyết, đậu mùa.v.v...
3.3.3. Phản ứng kết hợp bổ thể
Về nguyên lý kháng thể đặc hiệu với sự tham gia của bổ thể sẽ gây ly giải tế bào vi
khuẩn hoặc một số tế bào động vật khác. Trong phòng thí nghiệm người ta thực hiện
phản ứng kết hợp bổ thể bằng cách ghép 2 hệ thống phản ứng:
- Trong hệ thống 1, kháng nguyên được cho tác dụng với kháng thể (một yếu tố
biết, một yếu tố chưa biết). Nếu kháng nguyên và kháng thể phản ứng đặc hiệu thì tất cả
lượng bổ thể kết hợp vào phức hợp kháng nguyên - kháng thể.
- Hệ thống thứ hai dùng để nhận mặt bổ thể tự do (không kết hợp). Thêm vào hệ
thống thứ nhất những hồng cầu cừu và huyết thanh kháng hồng cầu cừu (hệ thống tan
máu). Phản ứng dương tính lúc không có tan máu và phản ứng âm tính khi tan máu xảy
ra. Phản ứng kết hợp bổ thể được sử dụng để chẩn đoán bệnh giang mai, và nhiều bệnh
do virus.
3.3.4. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang:
Về nguyên lý những thuốc nhuộm huỳnh quang như fluorescein, rhodamin có thể
kết hợp với kháng thể mà không phá hủy tính chất đặc hiệu của kháng thể. Kháng thể liên

83
hợp ấy có khả năng kết hợp với kháng nguyên và phức hợp kháng nguyên- kháng thể có
thể quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang.
3.3.4.1. Phương pháp trực tiếp
Kháng thể được liên hợp với thuốc nhuộm huỳnh quang rồi cho tác dụng với
kháng nguyên. Kỹ thuật huỳnh quang trực tiếp được sử dụng để chẩn đoán vi khuẩn tả, vi
khuẩn giang mai. Đặc biệt đối với nhiều nhiễm trùng virus nhuộm miễn dịch huỳnh
quang trực tiếp với kháng thể đơn dòng đặc hiệu dùng để xác định kháng nguyên virus có
trên tế bào dùng trong chẩn đoán nhiều bệnh nhiễm trùng virus như chẩn đoán kháng
nguyên virus cúm, virus á cúm, virus hợp bào hô hấp (RSV).
3.3.4.2. Phương pháp gián tiếp
Kháng thể được cho tác dụng trực tiếp với kháng nguyên rồi cho kết hợp với
kháng globulin người liên hợp với fluorescein. Trước hết cho kháng nguyên cố định lên
tiêu bản rồi cho tác dụng với huyết thanh bệnh nhân, rửa để loại bỏ kháng thể thừa sau đó
nhỏ một giọt globulin người gắn fluorescein rồi quan sát ở kính hiển vi huỳnh quang.
Phương pháp gián tiếp có nhiều ưu điểm gồm sự phát huỳnh quang mạnh hơn; tiết kiệm
được thời gian nếu nhiều huyết thanh được thử nghiệm cùng một lúc. Phương pháp này
được sử dụng để chẩn đoán bệnh giang mai (phản ứng FTA - Abs), nhiễm trùng
rickettsia, và nhiều nhiềm trùng virus như sốt xuất huyết, viêm não nhật bản.
3.3.5. Phản ứng miễn dịch gắn enzym (Enzyme-linked immunosorbent assay:
ELISA)
Nguyên lý của kỹ thuật này là sử dụng kháng thể hoặc kháng nguyên cố định vào
một tấm polystyren. Sau đó nó được dùng để bắt kháng nguyên hoặc kháng thể tương
ứng ở dung dịch thử nghiệm và phức hợp được phát hiện nhờ enzym gắn với kháng thể
hoặc kháng nguyên tác động lên cơ chất đặc hiệu. Cơ chất của enzym thủy phân đo ở
quang phổ kế, tỷ lệ với nồng độ của kháng thể hoặc kháng nguyên chưa biết có trong
dung dịch thử nghiệm.
Kháng nguyên hoặc kháng thể liên hợp với enzym vẫn giữ hoạt tính miễn dịch.
Enzym được sử dụng có thể là photphatase kiễm hoặc peroxydase. Thử nghiệm cho kết
quả khách quan và rất nhạy. Thử nghiệm miễn dịch liên kết enzyme được áp dụng để
chẩn đoán những vi khuẩn như giang mai, Brucella, Salmonella, vi khuẩn tả..và nhiều
virus như virus viêm gan, virus sởi, virus rota...
3.3.6. Phản ứng miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoassay: RIA)
Nguyên lý của kỹ thuật là dùng đồng vị phóng xạ như Thymidin H3, Cacbon 14, I125...
đánh dấu kháng nguyên hoặc kháng thể để theo dõi phản ứng kết hợp kháng nguyên
kháng thể.
Có thể xác định vị trí của kháng nguyên (hoặc kháng thể) đã đánh dấu đồng vị
phóng xạ bằng cách cho nhũ tương ảnh lên trên tiêu bản tổ chức học, sau đó phát hiện
bằng các phương pháp chụp ảnh thông thường. Để phát hiện và đo lường đồng vị phóng
xạ trong môi trường lỏng, ví dụ các đồng vị phát xạ beta (như thymidin H3, Cacbon C14 ),
84
cần dùng một dung dịch nhấp nháy và đo trong máy đếm tự động. Phương pháp đồng vị
phóng xạ không những có thể khu trú vị trí kết hợp một cách chính xác mà còn làm tăng
độ nhạy cảm phản ứng lên hàng nghìn lần.
3.3.7. Kỹ thuật Western Blot
Đây là một biến thể của kỹ thuật miễn dịch liên kết enzym, có thể phân tích được
các kháng thể đặc hiệu trong một mẫu huyết thanh mà kỹ thuật ELISA không thể phân
tích được, và dùng để khẳng định kết quả của kỹ thuật ELISA. Trong kỹ thuật này các
kháng nguyên protein trong hổn dịch được tách bằng điện di trên gel dựa vào trọng lượng
phân tử của nó, các kháng nguyên protein trên gel sau đó được chuyển lên (blotting) một
màng giấy thấm nitrocellulose, nylon bằng cách đặt trong một dung dịch đệm có dòng
điện. Các kháng nguyên protein đã chuyển lên giấy được cắt thành các giãi dọc theo tấm
giấy và làm khô. Các kháng thể đặc hiệu tương ứng với các kháng nguyên nếu có trong
mẫu huyết thanh sẽ kết hợp đặc hiệu và tạo thành các vạch phức hợp kháng nguyên
kháng thể. Dùng kỹ thuật nhuộm màu để phát hiện các vạch kết hợp kháng nguyên-
kháng thể tạo thành. Kỹ thuật Western Blot rất đặc hiệu dùng để chẩn đoán huyết thanh
học nhiều nhiễm trùng do virus như HCV, HIV.
3.3.8. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch
Nguyên lý của ký thuật là phức hợp kháng kháng thể gắn chất màu được phân bố
đều trên bản giấy sắc ký. Kháng nguyên đặc thù của vi sinh vật được gắn cố định tại
“vạch phản ứng”. Khi nhỏ huyết thanh cần xác định kháng thể lên bản sắc ký, kháng thể
đặc hiệu (nếu có) trong huyết thanh sẽ kết hợp với kháng kháng thể gắn màu, phức hợp
miễn dịch kháng thể-kháng kháng thể gắn màu này di chuyển trên giấy sắc ký sẽ bị giữ
lại tại “vạch phản ứng” do kháng thể kết hợp với kháng nguyên vi sinh vật, kết quả
“vạch phản ứng” hiện màu. Nếu trong huyết thanh không có kháng thể đặc hiệu, ở “vạch
phản ứng” kháng nguyên không thể giữ được kháng kháng thể gắn màu, vì vậy không
hiện màu.

IV. PHƯƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BẰNG CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ

4.1. Kỹ thuật phân tích và xác định tính đa dạng về hệ gen của vi sinh vật
Vi sinh vật có một cấu trúc đặc trưng về hệ gen cũng như về trật tự sắp xếp của hệ gen
của chúng. Tính đặc trưng này thể hiện ở mức độ loài, type và chủng của vi khuẩn và
virus. Hệ gen của những vi khuẩn và virus khi được cắt bằng các enzym ở những vị trí
xác định (enzym cắt hạn chế) sẽ hình thành nên các sản phẩm cắt là các đoạn gen ngắn
hơn có độ dài khác nhau, các vi khuẩn hay virus giống nhau trong cùng một loài, một
type thì sẽ tạo ra các đoạn gen giống nhau sau khi cắt. Vì vậy một chủng vi khuẩn hay
một virus cụ thể có thể phân biệt và nhận biết được bằng phân tích sự có mặt của các
đoạn gen tạo thành này sau khi cắt. Ngay trong cùng một type hay một loài vi khuẩn hay
virus khi có biến đổi trong hệ gen, sẽ dẫn đến sự thay đổi các điểm cắt và do vậy sẽ tạo ra
những đoạn gen cắt khác biệt với chủng hay type vi sinh vật gốc.

85
 Các đoạn gen sản phẩm sau khi cắt sẽ được điện di trên thạch agarose hay
polyacrylamide, các đoạn gen có chiều dài ngắn sẽ di chuyển nhanh trên thạch, trái lại
đoạn có chiều dài dài hơn sẽ di chuyển chậm hơn, như vậy cho phép tách các sản phẩm
gen có độ dài ngắn khác nhau, và trong một mẫu có nhiều đoạn sản phẩm có độ dài khác
nhau sẽ hình thành nhiều giãi sản phẩm sau khi điện di, mỗi giãi sẽ tương ứng với một
đoạn sản phẩm. Việc nhận diện các đoạn gen này thực hiện dễ dàng bằng nhuộm màu với
ethidium bromide và đọc dưới bàn đọc tia cực tím và so sánh với ngân hàng dữ liệu về
bản đồ gen của vi sinh vật được lưu trử.
Kỹ thuật này rất hửu ích để xác định biến thể vi sinh vật đột biến và phân loại
genotype của vi sinh vật, phân tích các vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh

Kỹ thuật
Hình 1. Điện di thông thường và điện di bằng điện xung
xung điện
4. 2. Kỹ thuật lai DNA
Điện di kỹ
Trong kỹ thuật này người ta dùng một đoạn gen ngắn DNA hay RNA của một vi
thuật thông
sinh vật đặc hiệu đã biết ở trạng thái chuỗi đơn, đoạn gen này gọi là đoạn gen dò tìm (hay
thường
đoạn gen tìm kiếm: gene probe ). Khi cho gen dò tìm này vào trong dung dịch mẫu
nghiệm nghi ngờ có chứa vật liệu gen của vi khuẩn hay virus tương ứng. Nếu có mặt của
vật liệu DNA của vi sinh vật cần tìm, có nghĩa là có mặt của DNA tương ứng bổ sung
hoàn toàn với chuỗi dò tìm, thì sợi dò tìm sẽ kết hợp theo nguyên tắc bổ sung và hình
thành nên phân tử DNA 2 sợi. Do vậy phương pháp này gọi là phương pháp lai DNA.
Về phương diện kỹ thuật, đoạn gen dò tìm thường được đánh dấu bởi các chất
đồng vị phòng xạ hay các chất màu đánh như biotin hay các chất màu huỳnh quang. Mẫu
nghiệm được xử lý để tách DNA có mặt trong mẫu nghiệm thành chuỗi đơn, và được gắn
vào màng cellulose hay nylon, rồi được xử lý với dung dịch trước lai để ngăn cản các kết
hợp không đặc hiệu với axit nucleic, thêm dung dịch chứa các đoạn gen dò tìm đã đánh
dấu. Phức hợp lai tạo thành sẽ được đọc bằng sự xuất hiện màu hay bằng dụng cụ đọc
ánh sáng huỳnh quang.
Kỹ thuật này được dùng để chẩn đoán nhiều nhiễm trùng do vi khuẩn và virus trên
lâm sàng
4. 3. Phương pháp nhân chuỗi gen ( kỹ thuật khuếch đại chuỗi gen).
Nguyên lý của kỹ thuật này dựa trên tính chất sinh lý cơ bản của phân tử axit
nucleic. Phân tử DNA ở trạng thái chuỗi xoắn kép, khi đun nóng tới gần 1000C, phân tử

86
DNA chuỗi xoắn kép bị bung ra và tách thành DNA chuỗi đơn, chuỗi xoắn sẽ hoàn
nguyên trở lại khi hạ nhiệt độ xuống trạng thái sinh lý ban đầu. Tuy nhiên trong dung
dịch chứa DNA đã bung thành chuỗi đơn, khi cho thêm vào các nguyên liệu để tổng hợp
gồm enzym DNA polymerase, các đoạn gen mồi, các nucleotid tham gia vào cấu tạo của
DNA (dNTP) và các muối đệm thích hợp, đồng thời điều chỉnh nhiệt độ hạ xuống 50-
600C, thì các chuỗi DNA đơn này sẽ làm nền và các gen mồi sẽ bắt cặp với nó ở các vùng
bổ sung khớp và tiếp tục nâng nhiệt độ lên ở 720C thì các gen mồi và enzym Taq DNA
polymerase (enzym DNA polymerase hoạt động ở nhiệt độ cao) sẽ tiến hành tổng hợp
nên đoạn DNA mới theo nguyên tắc bổ sung bằng cách gắn thêm các dNTP vào đầu
3’của đoạn gen mồi để tạo nên chuỗi kép mới. Đun nóng trở lại dung dịch chứa chuỗi
mới tạo thành lên 940C, các chuỗi này sẽ tách thành sợi đơn và sẽ làm DNA cho lần tổng
hợp kế tiếp.

Hình 2: Tách DNA thành sợi đơn và bắt cặp gen mồi
Như vậy nếu điều chỉnh sự thay đổi nhiệt độ một cách có chu kỳ bằng đun nóng
94-95 C để tách DNA thành sợi đơn, hạ nhiệt độ đến 50-600C cho bắt cặp với gen mồi,
0

rồi tiếp theo nâng nhiệt độ đến 720C cho tổng hợp kéo dài chuỗi. Lập lại ba bước trên từ
30 đến 35 chu kỳ, thì từ một vài phân tử DNA cho vào ban đầu sẽ được nhân lên theo
một hàm số lũy thừa và cuối cùng tạo ra hàng triệu bản sao sản phẩm DNA có độ dài nằm
trong khoảng 2 đoạn gen mồi. Dùng enzym Taq DNA polymerase quy trình nhân gen có
thể thực hiện bằng tự động hoá.
Động học của quá trình nhân gen làm tăng sản phẩm DNA đích sẽ cho một đường
cong biểu thị sự tích luỹ của sản phẩm DNA đích tạo thành. Sự gia tăng số lượng bản sao
sản phẩm tạo thành có thể xác định dễ dàng bằng các phương pháp vật lý hay hoá học.
Kỹ thuật nhân gen chỉ được thực hiện với phân tử DNA, để nhân được phân tử
RNA của tế bào sống, hay của các virus chứa RNA thì phân tử RNA cần phải được
chuyển đổi thành cDNA (phân tử DNA bổ sung: complementary DNA). Việc chuyển đổi
này có thể thực hiện được dễ dàng bằng ủ dung dịch chứa RNA thêm vào enzym chuyển
đổi ngược (reverse transcriptase) ở nhiệt độ từ 30-500C trong khoảng 30 phút. Phân tử
cDNA này sẽ được nhân lên với quy trình nhân gen cơ bản. Do vậy quy trình nhân RNA
của tế bào sống gọi là quy nhân gen có bước đầu chuyển đổi ngược (reverse
transcription- polymerase chain reaction: RT-PCR).
Hiện nay có 2 hai loại kỹ thuật nhân gen:
1. Kỹ thuật nhân gen cổ điển (conventional PCR): đây là kỹ thuật được sử dụng từ
lúc mới khám phá ra kỹ thuật nhân gen. Kỹ thuật này xác định sản phẩm DNA tích lũy
cuối cùng sau khi hoàn tất quá trình nhân gen, do vậy chỉ cho kết quả định tính. Hàng
triệu bản sao sản phẩm tạo thành được nhận biết bằng phương pháp vật lý với kỹ thuật

87
tách bằng điện di trên agarose và nhuộm bằng chất màu huỳnh quang, bằng kỹ thuật
ELISA, hay có thể bằng xác định trình tự cấu trúc đoạn gen được nhân.
2. Kỹ thuật nhân gen thời gian thật (realtime-PCR): Kỹ thuật này dựa vào nguyên
lý dùng hoá chất màu để theo dõi sự gia tăng của sản phẩm gen tạo thành sau mỗi chu kỳ
nhân và dựa vào số chu kỳ cần thiết để lượng sản phẩm tạo thành vượt quá đường cơ bản
(chu kỳ ngưỡng) phần mềm của các thiết bị sẽ tính toán được nồng độ phân tử DNA có ở
mẫu nghiệm cần phân tích, do vậy kỹ thuật này có thể định lượng được lượng axit
nucleic co trong mẫu nghiệm.
Kỹ thuật khuếch đại gen hiện nay được sử dụng phổ biến để chẩn đoán nhanh
phần lớn các bệnh nhiễm trùng do vi khuẩn và do virus. Đặc biệt kỹ thuật realtime-PCR
có thể định lượng được lượng virus trong cơ thể người bệnh, nên được dùng để định
lượng virus trong theo dõi điều trị nhiều bệnh nhiễm trùng như HBV, HCV, HIV.
a. Kỹ thuật DNA microarray (còn gọi là kỹ thuật gen chip): Kỹ thuật này đầu tiên
được dùng để khảo sát biểu hiện gen của tế bào sống hay vi sinh vật, hiện nay kỹ thuật
này được dùng khá phổ biến để chẩn đoán các vi sinh vật gây nhiễm trùng ở người. Các
lam kính hay các chip nhỏ ( kích thước 1cm2) được gắn từ hàng trăm đến hàng chục ngàn
điểm đặc trưng (features), mỗi điểm đặc trưng này chứa các oligonucleotide dò tìm (
probe) độ dài từ 20 đến 80bp đặc hiệu với các vùng gen đích của các vi sinh vật cần xác
định. Các đoạn DNA đặc hiệu của vi sinh vật trong mẫu nghiệm (nếu có mặt) sẽ được xử
lý gắn chất màu và tách thành sợi đơn. Các đoạn DNA đích của vi sinh vật có trong mẫu
nghiệm sau khi đã xử lý sẽ lai với các probe đặc hiệu gắn trên chip. Kết quả của kỹ thuật
sẽ được đọc trên máy quét tín hiệu huỳnh quang. Cường độ màu huỳnh quang của các
điểm đặc trưng ở kết quả sẽ tương ứng với hàm lượng DNA đích có trong mẫu nghiệm.
DNA microarray hiện nay được ứng dụng khá phổ biến ở nhiều phòng thí nghiệm của các
nước phát triển để xác định vi khuẩn, virus, xác định typ, xác định đột biến, xác định gen
đề kháng của vi sinh vật trong nhiều nhiễm trùng vi khuẩn và virus ở người, xác định
bệnh nguyên vi sinh vật trong nhiễm trùng thực phẩm Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Vibrio parahaemolyticus, Vibrio cholerae, Campylobacter jejuni,
Clostridium perfringens, Shigella spp. Salmonella spp., và Bacillus cereus.

88