Methoden des mykologischen Laboratoriums Von Hanns Kreisel und Frieder Schauer Mit 26 Abbildungen GUSTAV FISCHER VERLAG - STUTTGART - NEW YORK - 1987Anschrift der Autoren: Prof. Dr. rer. nat. habil. Hanns Kreisel Wissenschaftsbereich Aligemeine Mikrobiologie und Virologie ‘Sektion Biologie der Ernst-Moritz-Amndt-Universitht Greifswald Dr. rer. nat, Frieder Schauer ‘Wissenschaftsbereich Technische Mikrobiologie ‘Scktion Biologie der Ernst-Moritz-Arndt-Universitit Greifswald CIP-Kurztitelaufnahme der Deutschen Bibliothek Kreisel, Hanns: ‘Methoden des mykologischen Laboratoriums) ‘yon Hanns Kreisel u, Frieder Schauer. — ‘Stutigart; New York: Fischer, 1987 ISBN 3-437-20382-7 [NE: Schauer, Frieder: Lizenzausgabe fr Gustav Fischer Verlag Stuttgart - New York Alle Rechte vorbehalten (© VEB Gustav Fischer Verlag Jena, 1987 Printed in the German Democratic Republic (Gesamtherstellung VEB Druckerei,,Thomas Miintzer", $820 Bad Langensalza ISBN 3-437-20382-7 Vorwort Mit der hier vorgelegten Sammlung einfacher Arbeitsvorschriften fiir mykologische Laboratorien soll Studenten, jungen Wissenschaftlern und technischen Kriiften die Ein- arbeitung in grundlegende Techniken, wie sie in mykologischen Laboratorien mikrobio- logischer, botanischer und phytopathologischer Institute gebriuchlich sind oder nitzlich sein kénnen, ermdglichen. Auch soll den auf Grenzgebieten tatigen Biologen, welche nur geleeatich mit Pilzen zu un haben, der Ugang mit disen Organise erlichtert wer. «Swohl die Vi der experimentell-mykologischen Arbeitsrichtungen gebihrend bertcksichtigt werden sollte — die haufig praktizierte Spaltung in cine ,,mikrobiologische und eine ,,botanische Mykologie sowie mehrere angewandte Facher ist unseres Erachtens cin wesentliches Hemmnis fir die Entwicklung dee Disziptin —, war es nicht unsere Ab- sich, cin umfassendes und kostspicliges Handbuch zu schreiben. Die Auswahl der vor- sgestellten Methoden ist daher auf Grundsitziches und wenige weiterftihrende Beispiele begrenzt und wahrscheinlich auch etwas subjektiv, bedingt durch die persénlichen Er- fahrungen der Verfasser; das Inhaltsverzeichnis weist die Schwerpunkte aus. Methoden det Genetik, der Biochemie, der medizinischen und phytopathologischen Mykologic bleiben hier’ weitgehend ausgeklammert und miissen stirker spezialiserten Handbi- cchern entnommen werden, die schon einige Grundkenntnisse voraussetzen. Einige der- artige Werke sind im Literaturverzeichnis mit aufgefthrt. Einzeine Methoden und Re- zepturen sind auch in mikrobiologischen Arbeitsbichern enthalten; diese sind jedoch vorwiegend suf bakteriologische Techniken orientiert und bericksichtigen spezifisch ‘mykologische Arbeitsmethoden nur in geringem Umfange. ‘Herbartechnik und morphologische Bestimmungsmethoden haben wir nicht aufgenom- ‘men. Hier sei auf das Handbuch fir Pilzfreunde, Band II (3. Aufl. 1985) und IIT (4, Aufl 1986), aus dem VEB Gustav Fischer Verlag Jena und auf andere Bestimmungsbiicher verwiesen, Die Methoden werden in der Reihenfolge der Arbeitsgiinge so beschrieben, da® sie von ‘Anflingern leicht nachvollzogen werden kénnen. Varianten und andere erginzende Hin- ‘weise sind jeweils unter ,,Anmerkungen™ aufgefihrt, Die Arbeitsvorschriften werden ‘unter Bericksichtigung sparsamen Material- und Energieverbrauchs sowie der Arbeits- schutzbestimmungen ausgearbeitet. Die Mehrzahl der Methoden wurde von den Verfassern oder deren Schiilern und Mit- arbeiter selbst exprobt. Weitere Arbeitsvorschriften wurden aus der zitierjen Literatur ‘ibernommen, um ein einigermaBen abgerundetes Bild zu geben. Fiir cine Anzahl von Hinweisen und Rezepturen, die uns von Kollegen und ehemaligen Schiilern freundlicherweise zur Kenntnis gegeben oder demonstriert wurden, bedanken wir uns bei Dr. Dietrich AMELUNG, Rostock, Dr. sc. Ginter R. W. ARNOLD, Weimar, Prof. Dr. sc. Hannelore BexnwaKbr, Greifswald, Lektor Erik Brus HANSEN, Kopenha- ‘gen, Dipl.-Biol. Wolfgang Grexex, Born (Dar), Dr. Jurgen Gotz, GroB Liisewitz, Dr. 5Harald Granzow, Insel Riems, Prof. Dr. sc. Wolfgang Hime, Kicinmachnow, Dr. ‘Veronika KaRTHEuseR-Wiene, Quediinburg, Dr. Eberhard Kuuce, Eberswalde-Finow/ Kleinmachnow, Dr. se. Anna KockovA-KraTocuvitova, Bratislava, Prof. Dr. sc. Man- fred Konan, Greifswald, Prof, Dr. Denise Lawoure, Lyon, und Dipl.-Agraring. Selmar Perzowwr, Artem. Es ist unser Wunsch, da® dieses Buch helfen mége, der Mykologie dea dringend be- nétigten Nachwuchs mfblhren und diesem den Zugang zu experimentellen Arbeiten za cerleichtern. Greifswald, im November 1986 Hanns Kreisel Frieder Schauer Inhaltsiibersicht Vorwort. 5 A B c D E Fruktifkation und Sporulation. ©... 22.22 eee ee ee F _Physiologisch-biochemische Testung. ; G H 1 kK ‘Anhang Rezepturen fiir Reagenzien, Farb- und Fixerlisungen. 2... 2... 152 Gesundheits- und Arbeitsschutz im mikrobiologischen Labor... . .. . . . . 163 Verzeichnis der im Text genannten giftigen Substanzen........... . 165 Angloamerikanische MaBeinbeiten und Abkirzungen. .. 2.2... . - 167 Literaturverselcnis ee 168 Sachregister eee en)Al Herstellung von Nahrmedien Fast jede mykologische Laborarbeit beginnt mit der Herstellung eines Naht- ‘mediums sowie seiner Abflllung in Vorrats- oder Kulturgefae (Kolben, Roht- chen, Petrischalen) vor oder nach der Sterilisation. Die Nahrmedien konnen als. fldssiges Nahrmedium oder, unter Verwendung von Agar-Agar, als fester Nahr- ‘boden bereitgestellt werden; praktisch kann jedes Rezept flir Agamahrbdden durch Weglassen des Agar-Agars auch als ein Rezept fir lissiges Nahrmedium denen. ‘Hunderte von Rezepturen fir Nihrbden fir die unterschiedtichsten Zwecke der Mykologie sind publiziert worden (eine bedeutende Auswahl ist bei BooTH. 1971 kompiliert). Wir bringen hier Rezepte flr 61 in der Praxis bewahrte und meist hiufig verwendete Nahrmedien, die folgendermaSen goordnet sind: ‘A 1bis A 18 Nahrbéden fir de Stammhaltung und fir universelle Zwecke 19 bis A 32 Medien zur Erzielung von Sporulation, Fruktifikation und anderen morphologischen Strukturen A33 bis A 43 Sclektivmedien zur Isolation und Keimzahlbestimmung ‘A 44 bis A 55 Medien flr physiologische Untersuchungen A .56>is A 68 Weitere flissige Nahrmedica, Spurenlemente-, Vitaminlé- sungen u. dgl. (vgl. auch A 22) Die Vorschrifien A 69 bis A 72 betreffen die Aufbewahrung sterilsierter Nahr- ‘medien sowie das Abflllen von Nahrbdden in Kulturrdirchen und Petrischs- len, Allle Rezepte sind auf 1 1 Wasser bezogen. Die angegebene Menge Agar- ‘Agar (meist 20 g) ist cin Richtwert, welcber je nach Qualitit des Agar-Agars ‘von 15 bis 30 g variert werden muB; von Markenerzeugnissen wie Difeo-Agar geniigen meist 15 g/. Die Einstellung des gewiinschten pH-Wertes erfolgt mit 1 'w KOH oder 1 N NaOH baw. 0,1 x HCI (Rezepte im Anhang). Fir die ‘Behandlung stark saurer Nahrbdden — pH 4 und darunter — beachte man die Einfihrung zum Kapitel B, S. 46. Die hinter der Bezrichnung des Nahrbodens in Kiammem angegebenen Buchstaben (MEA usw.) sind die in der anglo-amerikanischen Literatur ge- brduchlichen Kilreel fr Standardashrbéden. Malz-Agar 2,5% (MEA) zur Stammhaltung filamentdser Pilze und heterobasidialer Hefen (ALEXOPOULOS & Benexe 1952) 25g Malzextrakt (getrocknet und pulversirt) oder 30 g Biomalz 208 Agar-Agar 1000 mi Aqua dest.A2 10 1. Agar-Agar abwiegen und 5 min in flieBendem Wasser waschen; danach Wasser weggieten. 2. 1000 ml Aqua dest. zugeben und im Becherglas im Wasserbad erhitzen, bis sich das Agar-Agar auflést. 3. Malzextrakt (bzw. Biomalz) abwiegen und der Lasung zuflgen. 4. pH-Wert priifen und gegebenenfalls einige Tropfen HCI zugeben, bis sich cin pH etwa 5,5 einstellt. Der pH-Wert kann mit Indikatorpapier gemessen werden, ‘5. Losung durch weichen Papierfiter fitrieren und das Filtrat in einem Er- Jenmeyerkolben im Kiihischrank aufbewahren. 6. In Rohrchen fallen nach Vorschrift A 70. 7. 15 min bei 121 °C im Autoklaven steriisieren nach Vorschrift B 3 oder B 4. 8. Vor dem Festwerden des Agars sind die Rahrchen nach Vorschrift A 71 schrig za legen. Aumerkungen: Far schwachwichsige Pilze sind $0 g Biomalz auf 11 Wasser 2u empfehlen. Die Verwendung von Biomalz ist weniger glinstig, da ihm 2. T. CaCO, oder andere Substanzen beigemischt sind, welche das Wachstum mancher Pilze unginstig beeinflussen, Zor Bestimmung und Stammhaltung von Zenicillion wird der Nahrboden mit 20 g pulverisiertem Malzextrakt, 20 g Glucose und 1 g Pepton angesetzt (Prrr 1979). Malz-Agar (MEA) zur Kultivierung, Stammbaltung und morphologischen Charakterisierung von askomyzetalen Hefen (Looper & Knucer-van Ru 1952) 1000 ml Malzextrakt (verdGint) 20g Agar-Agar 1, Malzextrakt (Herstellung nach Vorschrift A 59) auf eine spezifische Dichte ‘von 1,04 g/cm? (entsprechend 10 Balling-Grad) mit Leitungswasser verdiin- 2. Zu 1000 mi verdiinntem Malzextrakt 20 g Agar-Agar zufligen und im Dampftopf erhitzen, bis Agar-Agar sich list. . In Rohrchen oder in Nahrbodenflaschen abfiilen, . 15 min bei 110 °C im Autoklaven sterilsieren. . Vor dem Erstarren des Agars Robrchen schrig legen oder in sterilsierte Petrischalen ausgiefien. ‘Ammerimgen: Das Medium kann auch mit 100 g Malzextrakt (getrocknetes und pulverisirtes Hiandelopriparat) pro Liter Medium hergestelt werden. ‘Anstelle det unter Punkt 4 angogebenen Steiisicrung ist es auch mdglich, an 3 aufeinanderfolgenden Tagen je cine Stunde im Dampftopf (100°C) zu sterl- sietea. (ft wird zur Stammbaltung von Hefen generell Malzagar verwendet, der aus Malz- cxtrakt, verdant auf 7 Balling-Grad (bew. mit 70 g getrocknetem Malzextrakt pro Lite), hergestelt wurde. (Balling-Grad: s, FuBnote 8. 4) A3 A4 AS Supplementierter Malz-Agar zur Stammhaltung von Hefen (SreL1GER 1978) 15g Malzextrakt 12,5 Maltowe 0,78 g Pepton 275% Dentin 2358 Sheet |(=Glycerin) 41000 a» Agua det. 1. Bestandteile abwiegen und in Aqua dest. im Dampftopf bei 100 °C lésen. 2. Agarfiltrieren, 3. pH-Wert auf 6,5 bis 7,0 einstellen. 4, Abfillen za 7 bis 10 ml in Rébrchen. 5. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. 6. Vor dem Erstarren des Agars Rohrchen schrig legen. Bierwiirze-Glucose-Agar ‘zur Stammbaltung von Hefen (KockovA-KRraTocHviLovA 1970, mind » 1000 mt Bierwirae 2g DO ‘2g Agar-Agar 1. Bierwiirze (belle Vorderwiirze, aus Brauereien beziehbar) mit Leitungswasser ‘auf 7 Balling-Grad (bzw. Masse-%, an ldslichen Extraktstoffen) verdiinnen und Glucose sowie Agar-Agar zufiigen. 2. 1b bei 100 °C in Dampftopf stellen, anschlieBend filtrieren. 3. Abfillen in ROhrchen nach Vorschrift A 70. a 4, An 3 aufeinanderfolgenden Tagen je 1 h im Dampftopf (100 °C) sterilisieren. Maismehl-Agar (CMA) fir Dauerkulturen und Sporulation vieler imperfekter Pilze 1, 1000 ml Wasser mit 30 g Maismehl im Bechergias bis zum Sieden erhitzen. ‘Vorher Standhihe des Becherglases mit Fettstift markieren. 2. Eine Stunde kochen lassen, dabei hin und wieder umrilhren. 3. Wilhrenddeseen Ager-Agar abwiegen und 5 min in flieBendem Wasser waschen; danach Wasser abgicBen. 4, Den Maismehlbrei durch ein Tuch fitrieren. 5. Das Agar-Agar dem heiden Fitrat zuffigen. 6. Im Wasserbad erwirmen (evtl. im Dampftopf), bis sich das Agar-Agar eet.7. Das verdampfte Wasser bis zur Markierung (s. oben) auffillen. 8, pH-Wert prifen und ndtigenfalls einige Tropfen HCl zuffigen, bis sich ein PH zwischen 5,0 und 6,0 einstellt. Der pH-Wert kann mit Indikatorpapier ‘gemessen werden. 9. Die heife Lasung durch Papierfiltr filtrieren; das Filtrat in Erlenmeyer- kolben im Kiihlschrank aufbewahren. 10. Nach Vorschrift A 70 in Rahrchen fillen. 11. Nach Vorschrift B 4 20 min im Autoklaven sterilisieren. 12, Vor dem Abkihlen Rohrchen nach Vorschrit A 71 schrig legen bzw. nach Vorschrift A 72 in Petrischalen gieBen. Hafermehl-Agar (OA) zur Stammhaltung von Phytophthora, Pythium u,v. a. Pilzen 30g Hafermeht x 20g Agar-Agar 1000 ml Aqua det. 1. Hafermedt 20 min in dest. Wasser kochen, 2. Meblbrei durch ein Tuch filtrieren. 3. Aqua dest. bis 1000 ml auffullen. 4, Gewaschenes Agar-Agar hinzufligen, im Wasserbad oder Dampftopf er- hitzen und zur Lésung bringen. 5. Nahrboden 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. Hafer-Erbsen-Agar (OPA) ‘zur Stammhaltung phytoparasitischer und anderer Pilze 10g. Erbsenmeht x 10g Hafermeh! 205 Apr-Agr 1000 mi Letungswasser 1. Gelbe Speiseerbsen mit einem Mixer zu Mehl zerkleinern. 2. Haferflocken mit einem Mixer zu Mehl zerkleinern. 3. Agar-Agar abwiegen und in cin Becherglas Allen, mit 1000 ml Wasser ‘ibergieen. Erbsenmehl und Hafermeh! zufiigen und alles gut umrihren. Das Becherglas mit Inhalt im Dampftopf oder Wasserbad erhitzen; mehr- mals umrahren, bis das Agar-Agar geldst ist. Losung durch ein Tuch oder Verbandmullfltrieren. pH-Wert etwa 6,0 einstellen. ‘Nabrboden nach Vorschrift A 70 in Réhrchen filllen. Sterilisieren 20 min bei 121 °C im Autoklaven. Kartoffel-Agar (PA) flr Dauerkulturen velr Pilze 240 mt Kartoffeletrakt AQ Al0 Herstelhang des Kartoffelextrakts: 1. 100 g geschalte Kartoffein reiben und den Brei mit 300 ml Wasser anrihren. 2. Diese Lasung 24 h im Kalten stehen lassen. 3. Losung durch ein Tuch filtrieren und danach 1 h im Wasserbad kochen las- sen, Herstellung des Nairbodens: 4, Agar-Agar abwiegen und 5 min in flieBendem Wasser waschen; danach ‘Wasser abgicBen. 5. 760 ml Wasser zigeben und in einem Becherglas im Wasserbad erwarmen, bis sich das Agar-Agar list. 6. 240 ml Kartoffelextrakt hinzuftigen, 7. Die Lésung durch Papierfilterfiltrieren; das Filtrat in Erlenmeyerkolben im Kiihlschrank aufbewahren, 8. Nach Vorschrift A 70 in Rohrchen fillen. 9. Nach Vorschrift B 4 20 min im Autoklaven sterilisieren. 10. Vor dem Abkilen Rabrcher nach Vorschrift A 71 schrag legen. Kartoffel-Méhren-Agar (PCA) zur Stammhaltung und Sporulation von filamentdsen Pilzen 20g Kartoffela, geachit 205 Mobren,seputzt 20g Agar-Agar 1000 ml Letungswaser 1. Geschiilte Kartoffeln in Sticke schneiden und mit 250 ml Wasser 45 bis 60 rin kochen. 5 2. Kartoffeln durch ein Tuch oder Sieb pressen. 3. Extrakt mit Wasser auf 500 ml auffiillen. 4. Geputzte Méhren in Sticke schneiden und mit 250 ml Wasser 45 bis 60 min kochen. 5. Mobren durch ein Tuch oder Sieb pressen. 6 Extrakt mit Wasser auf $00 ml aufilln 7. Kartoffel- und Mohrenextrakt zusammengieBen. 8. Agar-Agar abwiegen, 5 min unter flielendem Wasser waschen, dann dem Extrakt zufiigen. 9. Nach Vorschrift B 4 20 min im Autoklaven sterilisieren. Ammerknagen: Dieser nihstofarme Nahrboden ist hervoragend zur Stammbaltung der meiten Pilae peignet, Das Wachstum int zwar ziemlich spiich, aber gesund; die Laft- amyzebildung ist bert. “ine andere Rezpturempfichit 150 g Kartoffela und 150 g Mhren aut | Wamer Kartoffel-Glucose-Agar (PDA) (CCM Bmo 1982) 200g Kartoffeln, geuchtlt und gechnites 158 D-Gluoote(=Dextrowe) 20g Agar-Agar 4000 mi Aaa det. 13All 4 1. Kartoffeln schilen, in Sticke schneiden und mit 330 ml Wasser 60 min kochen, 2. Kartoffelbrei durch ein Tuch oder feines Sieb pressen. Rckstand verwerfen. 3. Den Extrakt mit dest. Wasser auf 1000 ml aufTillen. 4. Agar-Agar abwiegen, 5 min in flieBendem Wasser waschen, dann dem Ex- trakt hinzuffigen. 5. Glucose hinzufgen, dabei umrihren. 6. Lésung im Dampftopf oder Wasserbad erhitzen, bis das Agar-Agar sich sgeldst hat. 17. Sterilisieren im Autoklaven 20 min bei 121 °C. ‘Ammertommg: Es wird auch folgendes Rezept empfohlen (vAN Dex WALT 1970): 100g Kartoffeln, geschilt und fein geschnitten 20g D-Glucose 205 Agr-Agar 1000 ml Wasser 1. Kartoffeln schile, fein schneider, in 300 ml Wasser (ber Nacht in einen Kahl ‘schrank stellen. 2. Durch ein Tuch filtrierea. 3, Das Firat im Autoklaven 1 h bei 121 °C sterilsieren, 44, 230ml von diesem Extrakt mit 770 ml Wasser, 20 g Glucose und 20 g Agar-Agar tmischen, bis zur Losung des Agar-Agars erhitzen. 5. Sterlisioren im Autoklaven 15 min bei 121 °C. Dieses Medium wird von mehreren Firmen als Fertigpriparat angeboten, Kirechen-Agar (ChA) ‘nach Boor (1971), Von ARx (1976), SraLaRs (1978) 20g Agar-Agar 20 tl Dekokt von Sanerinschen £00 ml Leiongrwasser 1. 1 kg entsteinte Sauerkirscben in 1 | Wasser zum Kochen bringen, 2 h leicht kochen lassen, dann durch ein Tuch filtrieren. 2. Dekokt in trockensteriisierte Kolben flilen, 30 min bei 110 °C im Autokla- 3 in 80m Leinmgowmer ie, 30min bei 10°C Autor 4. 5. Nairboden auf pH 3,8 bis 4,6 cinstcllon und in Rabechon fallen. 6. Nahrbdden in den Rdbrchen 30 min im Dampftopf oder Wasserbad (oder 5 min bei 102 °C im Autoklaven) steriliseren. Ammortomgen: ‘Nrboden zur Isolierung, Kultur und Charakterisiorung von Pilzen, 2. ‘Bestimmung der Myzelien holzbewohnender Basidlomyoetes. Das Kinechdckokt kann in trockensteriliserten Kofben oder Flaschen vorritig ‘sehalten werden. Ald Sterilisioren des Nahrbodens bei Temperaturen oberhalb 102 °C ist zu vermeiden, dda das saure Medium dann nicht mete fest wid. Tn analoger Weise kann aus sauren Pflaumen baw. Zwetschgen ein Pflaumen-Agar bergestellt werden. Sabouraud-Agar (SA) fir keratinophile und humanpathogene Pilze 10g Pepton 4g D-Glucose 205 Agar-Agar 1000 mi Aqua des. 1. Agar-Agar abwiegen und 5 min unter fieBendem Wasser waschen, danach das Wasser 2, 1000 ml Aqua dest. zuffigen und im Dampftopf baw. Waseerbed erhitzen, bis das Agar-Agar sich lést. 3.-Pepton und Glucose abwiegen und der Lasung zugeben. 4, Lésung durch Papierfilter filtrieren; das Filtrat in Erlenmeyerkolben im Kablschrank aufbewahren. '5. Nach Vorschrift A 70 in Robrcken fallen. 6. Nach Vorschrift B 4 15 min bei 110 °C im Autoklaven sterilisieren. 7. Vor dem Abkilhlen, Rélrchen nach Vorschrift A 71 schrig legen. Vorgefertigter Sabourand-Ghacose-Ager 1. 45,2 g des Pulvers abwicgen und in 250 ml kaltem Aqua dest. suspendicren. 2. 750 ml Aqua dest. im Wasserbed bis zum Sieden erhitzen. 3. Die Suspension unter stindigem Umriihren in das siedende Wasser giefen. 4. 5 min kochen lassen, bis sich das im Pulver enthaltene Agar-Agar Wt. 5. In Rébrchen oder Erfeameyerkotben fille. 6. Im Autoklaven 15 min bei 121 °C sterilisieren. Schoureed Aga ist ls Trostenpeperat im Handa ‘Nach Smauican (1978) kann der Agar flr die Kultivierung anspruchsvoller Pilze ‘mit 10 mg Thiamin und $0 mg Inositol pro Liter supplementiert werden. ‘Zar Isolierung von Pilzea sollte der pH-Wert des Agars nach der Sterilisirung und Abkihiung auf 50 bie 60°C auf 5,0 bis 5,5 cingestelt werden, 2 B. mit steriler 10 ger Weinsiure, ‘Zur Unterdrickung der Begleitflora ist cin Zusatz von Antibiotika vortcilhaf, 2, B. 40 ppm Streptomycin und 40 ppm Ponicilin. Bei lsolierung pathogencr fils- ‘meniSeer Pilze aus stark verunrenigiom Material hat sich cin Zasatz von $0 ppm ‘und 400 ppm Cycloheximid bewihrt. Die Zugabe der Antibiotika cerfolgt in der Regel als steril fltriente Stammidsung nach Steriisierung des Agars (vg). auch Vorachrift A 43). ‘Nach anderen Vorechriften wird anstelle von 4% Glucose auch 2% Ghucove, 4% Maltone, 2% Maltose oder 1% Glucose + 17% Maltose verwendet. Auch diese valierten Sabourand-Medien sind tilweise als Trockenpriparate im Handel For Anreicherungszwecke konnen Sabouraud-Medien auch ohne Agarzusatz als Fits- 1sA13 Hefe-Pepton-Glucose-Agar (YPD = YEP-G) Al4 Als 16 Nahrmedium flir schwachwiichsige Hefen (E. Bie HANSEN briefl., WeBer 1982) Hefeextrakt Pepton D.Ghucose Agar-Agar 1000 ml Wasser 1, Substanzen in Wasser lésen, im Dampftopf bzw. Wasserbad erhitzen, bis das Agar-Agar gelést ist. 2, pH-Wert 5,5 bis 6,0 einstellen. 3. Lésung in Rdhrchen fiillen. 4, Sterilisieren 15 min im Autoklaven bei 121 °C. ‘Anmerkungen: Bei Bedarf kann Glucose durch andere C-Quellen ensetst werden. Durch Weg- lassen des Agar-Agars kana das Medium auch Msg verwendet werden ‘Van pex WALT (1970) gibt folgende Rezeptur fir das Mlssige Medium an: Se Hefecxtrakt 10g Pepton 205 D.Ghucose 1000 ml Wasser Einstellung des pH-Werts ist i diesem Fall nicht erforderich. Al6 Glucose-Pepton-Hefeautolysat-Agar (GPY) ‘zur Stammbaltung von Hefekulturen (von Anx & SCHIPPER, 1978) ME D-Gincose SE Pepton 20g Agar-Agar 500 ml Hefeautolysat 500 ml Agu det 1. Glucose und Pepton in $00 mi Aqua dest. sen. 2, 500 ml Hefeautolysat (Vorschrift A 61) und 20 g Agar-Agar zufligen. 3. Im Dampftopf bei 100 °C erhitzen, bis Agar-Agar sich lt. 4. Abfillen 2u 7 ml in Rohrchen. 5. 15 min bei 121 °C im Autoklaven steriisoren. 6. Vor dem Erstarren des Agars Rohrchen schrig legen. Ammerkamg:* Auf diesem Agar soll wihrend der Stammbaltung von Hefen Sher einen lngeren Zeitraum das Risiko ciner Selektion von mutatv verinderten Stlmmen in der “Hefepopulation geringer sein als bei anderen Hefemedicn. Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar (YM) zur Stammbaltung von Hefen (WICKERHAM 1951) 1000 mi Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium (Vorschrift A 62) ‘20g Agar-Agar 1. Zu 1 1 Glucose-Pepton-Hefeextrakt-Malzextrakt-Medium vor dessen Steri- lisation 20 g Agar-Agar 2ufigen. 2, Medium im Dampftopf bei 100 °C ethitzen, bis das Agar-Agar sich lost; filtrieren. Abfllen zu 10 mi in ROhrchen. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilsieren. 5. Bei Herstellung von Schrigagarrdhrchen: Rébrchen vor dem Erstarren des Agars schrg legen. Anmerkungen: ‘Zar Isolierung von Hefen wird YM-Agar mit 30% (w/v) Glucose verwendet. Falls ‘osmotolerante baw. osmophile Hefen isoliert werden sollen, kann der Glucosegehalt bis auf 50% (w/v) exhoht werden. Das Medium ist als Trockenpriperat erhiltich (Difeo Lab., Detroit, USA). Calciumcarbonat-Agar zur Stammhaltung und morphologischen Charakterisierung von Hefen der Gattungen Bretianomyces und Dekkera (VAN Der WALT 1970) 100g Malzextrakt (getrocknet und pulverisert) 1, Malzagar nach Vorschrift A 2 erstellen und in Rébrchen zu 9 ml abfillen. 2. Nach der Sterilisation zu dem verflissigten, auf ca. 55°C temperierten ‘Agar (pro 9 ml) unter sterilen Bedingungen zupipettieren: — I ml einer Calciumcarbonat-Suspension (20 g CaCO, pro 100 ml Aqua dest), die vorher 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilsiert wurde Beim Pipetticren — mit ciner Pipette mit etwas weiterer Offnung aan der Spitze — ist auf méglichst homogene Verteilung des unldslichen Calciumcarbonats zi achten. — 0,1 ml einer sterilfiltrierten Vitamin-Stammissung 3. Vor dem Erstarren des Agars das Calciumcarbonat nochmals aufschiitteln und Rohrchen schriig legen. ‘Anmerkongee: ‘Auf anderen ‘blichen Medien zur Stammhaltung sterben Hefen der Gattungen Brettmomyces und Dekkera sufgrand der fir dee Hefen typischen starken Essig- sdure-Produktion schnell ab, falls ncht cine (mindestens) monatlche Uberimpfung exfolgt. Falls Caliumcarbonat-Agar — in Petrischalen gegossen — fir den Nachweis einer starien Siureausscheidung durch Pilze (Authellung um jewelige Kolonien) ver- ‘wendet werden soll, empficit es sich, nur 0.5% Caleiumcarbonat dem Agar 2izi- ‘agen. In diesem Fall ist als C-Quelle5% D-Giucose in Mineralalz- oder Hefewasser- ‘Agar zu empfehlen. 2 Krein, Methoden 7A17 Hagem-Agar zur Isolierung und Kultur von ektomykorthizabildenden Pilzen; auch fiir saprophytische Basidiomyzeten geeignet (Lamo 1970). 05g KH,PO, K 0S NHC O5— MgSO, -7 1,0 055ml FeCl, (1 %ige Lisung) 5g D-Ghucose 5g Malzextrakt 15g Agr-Agr 1000 ml Aqua dest Herstellung des Nihrbodens analog Vorschrift A 1. Sterilisieren 25 min bei 115 °C im Autoklaven (LaMouRE miindl,) A18 Hefe-Stirke-Agar (YpSs) zur Kultur von Allomyces, Bastocladiella (EMERSON 1958) 4g Hefocrtrai, puverisirt, 15 aliche Surke 1g KHPO, ‘5 MgSO, *7H,0 20g Agar-Agar 240 mt Teichwaoer, iter (660 mi Aqua dest, 1. Agar-Agar abwiegen und 5.min unter flieBendem Wasser waschen; danach Wasser 2. Teich- und destilliertes Wasser mischen, Agar-Agar hinzufigen iind im Wasserbad oder Dampftopf exhitzen, bis das Agar-Agar sich ldst. 3. Die dbrigen Substanzen hinzuftigen und gut umrhren. 4, Die Lésung durch Papierflterfiltrieren. 5. Nach Vorschrift B 3/4 30 min bei 110 °C im Autoklaven sterilisieren. A19 Hefe-Stirke-Agar (SSY) zur Isolierung von limnisch-aquatischen Pilzen (BANDON & al. 1975) 2g Hefeerakt 105 Voaliche Stirke 20g Agar-Agar 1000 ml Agu det. Herstellung analog Vorschrift A 18, 18 Czapek-Dox-Agar (CzA) Chemisch definierter (,,synthetischer“*) Nahrboden fiir die Bestimmung von Kulturen von Aspergillus, Penicillium w. a. 38 NaNO, 1g K,HPO, 058 Ka 03g MgSO,-7H,0 0.01 g FeSO," 71,0 30g Saocharose (oder 30 g D-Glucote), frei von SO; 205 Agar-Agr 1000 mi Aqua dest 1. Agar-Agar abwiegen und 5 min unter flieBendem Wasser waschen, danach das Wasser weggieBien. 2, 1000 ml Aqua dest. zugeben und im Wasserbad erhitzen, bis das Agar- ‘Agar sich Ist. 3. Die dbrigen Substanzen (6. oben) hinzuflgen und gut umrihren. 4, Die Lasung durch Papierfilter fltrieren. 5. Nach Vorschrift A 70 in Robreben fllen. 6. Nach Vorschrift B 3/4 15 min im Autoklaven sterilisieren. 7. Nach Vorschrift A 72 in vorbereitete sterile Petrischalen gieSen. Anmeriomg Zur Bestimmung osmopbiler Aspergillus Arten wird cin Czapek-Dox-Agar mit 200 g ‘Saccharose auf 1000 ml Aqua dest. verwendet (Aspergilhurglaucia-Gruppe). Zur Bestimmung und Stammbaltung von Penicillium wird dem Nihrboden 5 g Hefeautolysat oder Hefeentrakt ragesetzt (Czapek-Hefeautolysat-Agar, CYA, PITT 1979), Maltose-Agar zur Fruchtkérperbildung von Basidiomycetes, z. B. Coprinus (E. Bue Hansen, mindlich) 05g KNO, 0255 K,HPO, 05g MgSO, °7H,0 011 mg Thiamiahyérochlosid 1.0m Spurenelementclieung (Fe, Za, Cu...) vgl. A 63 10g. Mahose 15g Agar-Agsr 1000 m1 Wasser Vereinfachte Rezeptur: 10g Maltose Zubereitung wie Czapek-Dox-Agar (Vorschrift A 20). 9A22 A23 ‘Synthetisches Nahrmedium fiir Phytophthora zur Oosporenbildung und -keimung (Risemo, Enwin & Zenraver 1975) 458 D-Ghucose Og L-Asparagin 0158 KNO,, 108 KH,PO, 056 Mg80,°71,0 O1g CaCl, 30me_ fSitosterol, gest in 30 ml Dichloromethan 1,0 ml Spurenelementelésung (s. unten) 1,0 ml Fe?*-Stammldsung (s. unten) 1000'm! Aqua dest. Spurenelementelésung (nach CocumaNe 1958) 41,1 mg__Na,Mo0, 2,0 878mg 7280, -71,0 785 mg CuSO, -5H,0 154mg" MnSO,-#,0 05mg Na,B,0, 100m! Aquadest. Fe*-Stammlésung ‘44ah ag FeCl, -6H,0 26g Na,-Ethylendiamintetracetat (EDTA) 25— KOH 100m! Aqua dest 1. Lésung (chné Thiamin) nach den oben angegebenen Rezepten zusammen- stellen, 2. pH-Wert mittels 6 x KOH auf 6,2 cinstelen. 3. 20g Agar-Agar (baw. 14 g Difeo Noble Agar) zusetzen. 4. Im Autoklaven strilisieren. 5. 1 ml einer durch Bakterienfilterfiltrierten Stammlésung von Thiamin-HC1 ‘zusetzen, $0 daB eine Endkonzentration von 1 ppm Thiamin erreicht wird. 6. Nahrmedium in Petrischalen ausgieBen. Gemiisesaft-Agar zur Sporulation von Hefen (Max & al. 1942) 1, Gemisesaftherstellang: Zu ciner abgewogenen Menge cines Gemisches von fein geschnittenem baw. gehacktem Gemilse, das zu gleichen Teilen ‘aus gewaschenen, ungeschilten Mohren, Riben, Gurken und Kartoffeln bestcht, wird die gleiche Menge Leitungswasser zugefiigt und die Mischung 10 min bei 110 °C autoklaviert. AnschlieBend wird das Gemisch durch ein Tuch filtriert, Das Filtrat soll dann einen pH-Wert von etwa 5,7 bis 6,0 haben. 2, In 11 Gemitsesaft 20 g PreBhefe suspendicren, anschlieflend Agar-Agar zu- ‘igen. 3. Im Dampftopf bei 100 °C erhitzen, bis Agar-Agar sich Ist. anschlioend in Robrchen zu 10 mi abfillen (Vorschrift A 70). 4. 15 min bei 121 °C im Autoklaven steriliseren (Vorschrif B 4) 5. Vor dem Erstarren des Agars Robrchen schrig legen. Aw A2s ‘Anmerkungen Hiufig wird als Gemiscsaft V8 — vegetable juice" (Campbell Soup Comp, ‘Camden, USA) verwendet, der aus einem Gemisch von Tomaten, M@hren, Selle, Rien, Kopfsalat, Petensle und Brunnenkresse beeitet wird. Zur Hersteliung von V8-Agar werden nach Wickens & al. (1946) 380 ml des V8-Gemisesafis mit 5g in 10mi Aqua dest. suspendierter PreBhefe gemischt und nach Erhitzen fOr 10 min im Dampftopf (pH-Wert: 68) mit 340 ml geschmolzenem, heiSem 4igem ‘Wasser-Agar (in Aqua dest) gemischt, FFir manche Hefen (2. B. Metschvkowi-Arten) ist zur Anregung einer Sporulation die Verwendung von verdlnntem Gemtsesaft (1:1 bis 1:10 mit Aqua dest. verdtinnt, PH 5,5) ohne Zusatz von PreGhefe beser gecignet (Prt & Mitten 1968). Bei eventuell ndtigem emeutem Aufschmelzen von Gemisesat-Agar sole unndtiges Erhitzen vermieden werden, Gorodkowa-Agar zur Sporulation von askogenen Hefen (GORODKOW: 1908) 10g. Pepton 10g DShuowe Se NaCl 20g Agar-Agar 1000 mt Laituagswaser 1. Bestandteile in Wasser lésen. 2, Im Dampftopf bei 100 °C ethitzen, bis Agar-Agar sich lést. 3. Agar filtrieren und in Rdhrchen zu 7 ml abfiillen. 4. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. 5. Vor dem Erstaren des Agars Réhroben schrlg legen. ‘Anmerkang: Nach einer modifizierten Rezeptur wird nur 1 g D-Glucose pro Liter Medium einge- setat (Looper & Knsom-van Rus 1952), Acetat-Agar zur Sporulation von askogenen Hefen (KLEYN 1954) Sg Natriumacetat -3 H,0 25.6 Bacto-Tryptove 0,62 D-Giucose 062 § NaCl 20g Agar-Agar 1000 rat Aqua dex. 1. Bestandteile in Aqua dest. bei 100 °C im Dampftopf losen. 2. In Rohrchen abfillen zu 7 ml (Vorschrift A 70). 3. 15 min bei 121 °C im Autoklave sterilsieren (Vorschrift B 4). 4. Vor dem Erstarren des Agars Rahrehen schrig legen. ‘Anmerkmg: | Der Ausgangs-pH-Wert soll nach der Sterilisation 69 bis 7,1 betragen. 21Aw A27 AB Acetat-Agar zur Sporulation von askogenen Hefen (Fowatt. 1969) 5g Natriumacctat (wassrfrei) log KC 20g Agar-Agar 1000 mi Aqua dest. 1. Bestandteile in Aqua dest. bei 100 °C im Dampfopf lésen. 2. In Rohrchen abfillen zu 10 ml (Vorschrift A 70). 3. 15 min, bei 121 °C im Autoklaven sterlisieren, 4. Vor dem Erstarren des Agars Robrchen schrag legen. ‘Anmerkngen: Vielfach wird auch der Fowell-Acctat-Agar ohne KCl-Zusatz verwendet (FowELt 1952) Der Acctat-Agar nach Fowsut (1969) soll besonders bei sich anschlieBenden ‘Hybridierungsversuchen von Hefen geeignet sein und zielt nicht nur auf die hochst erreichbare Sporenzahil pro Zellpopulation, sondern auch auf die fir Hybridiserungen ‘oft ginstige hohe Sporenzahl pro Askus (2. B. bei Saccharomyces cerevisiae mOg- lichst vile Aszi mit 4 Sporen). A229 Acetat-Medium ‘zur Sporulation von askogenen Hefen (McCLaRy & al. 1959) 8,2.g Natriumacetat (wasserfrei) 2,5 g Hefeextrakt (getrocknet) 'g D-Glucose 8g KCL 0,7 g MgSO, -7H,0 1000 ml Aqua dest. 1. Bestandteile in Aqua dest. losen. 2. In Rébrehen zu 10 ml abfiilen. 3. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. ‘Anmerkangen: Zur Beimpfung wird 2 10ml des Mediums cine gewaschene Hefesuspension ‘zupipettiert. Dabei wird ein Titer von 3% 10F Zellen/ml eingestellt. Vielfach wird das Medium mit 3% Agar-Agar verfestigt und als Schragagar ver- wendet. ‘Nach einer varierten Vorschrift werden anstelle von 8,2. Natriumacetat und 18 g KCI auch 9,8 g Kaliumacetat und 1,2 g NaCl verwendet Verdiinnter Malz-Agar ‘zur Sporulation von askogenen Hefen 40g Malzextrakt (getrocknet und pulveris 30g Agar-Agar 1000 mi Aqua dest. 1, Agar-Agar abwiegen und 5 min mit Aqua dest. waschen, danach Wasser ‘weggieBen. 2. 1000 ml Aqua dest. zufigen und im Dampftopf bei 100 °C erhitzen, bis ‘Agar-Agar sich lost. 3. Zuvder noch heifen Agarldsung Malzextrakt zugeben und unter Rthren aus. lesen, 4, Abfillen zu 7 ml in Rohrchen. 5. 15 min bei 110 °C im Autoklaven steriisieren. 6. Vor dem Erstarren des Agars Rohrchen schrig legen. 7, Aufbewahrung der Schrigagarrdhrchen im Kablschrank. Falls erneutes ‘Aufschmelzen des Agars nétig sein sollte, ist auf minimales Ethitern zu achten. ‘Ammerkungen: Anstelle des getrockneten Malzextraktes kann auch selbst hergestellter Malzextrakt (Vorschrift A 59) oder ungehopfte Bierwiirze verwendet werden, wobei vor Zugabe des ‘Agars mit Letungswasser auf 4 Ballng-Gmad zu verdOnnen is ‘Statt der unter Punkt 5 angegebenen Sterilsicrung ist es auch moglich, an drei aufeinanderfolgenden Tagen je Ih im Dampopf (100°C) za steriliiren, Reis-Agar zur Bildung von Chlamydosporen und Pscudomyzel bei Hefen nach TASCHDRAN (Lopper 1971) 2g Reis 205 Agar-Agar 1000 mt Leitungswasser 1, Reis (geschilt) in Leitungswasser geben. 2. Mischung aufkochen und bei bedecktem GeffiB 45 min auf kleiner Flamme weiterkochen, . Filtration durch Mull bzw. Gaze; Reis verwerfen. . Filtrat mit Agar-Agar versetzen und auf | 1 auffillen. Erhitzen im Dampftopf, bis Ayar-Agar gelOst ist Abfiillen in Réhrchen zu 10 ml oder in Flaschen. . 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren, Bei Bedarf Agar in Petrischalen mit diinnem Glasboden ausgielien. ‘Aumerimngen: Nach einem varieten Rezept wird das Reiswawer nur durch cine ca. Iéstindige ‘Aufichwemmung von Reis (20 gi?) bei Zimmertemperatur und anschiedende Firs tion gewonnen. Nach Liven des Agar-Agar bei cinem pH-Wert des Reiswasscrs von 72 (ga. 10%4ige NaOH muffigen) wird nach Filtration der pH-Wert mit 10%iger Milchsiure auf 60 eingestelt und an 3 aufeinanderfolgenden Tagen je 20 min im Dampfopf sterilsert (emvaanor 1983, mind). Von Sasoex (1978) werden 10 ml Flat einer 0 cigen (wv) ReismehinufSchwemmung pro Liter Medium cingesez. Zur Herteliang von Reis-Tween-Agar wird der Reis Agar mit 1%, (vi) Tween 80 kompletiert. KocrovieKaarocuviiovA (mind Mitt) bereitet Reis Twoen-Agar durch Extrak- tion von 100 g Reis pro Liter Wasser bei 100 °C (10 min), anscblieende Filtration und Zusatz von 0,2% (v/v) Tween 80, Steriisation: dreimal Dampftopf. 2BAW A3L A322 Taurocholat-Agar zum Nachweis der Chlamydosporenbildung bei Hefen (H. BERNHARDT) 25g NacTawocholt 45g Agar-Agar 250ml Aqua de. 1. Nahrboden 2 1/2 h kochen, nicht antokaviren 2. Danach sofort in Schalen gieBen. ‘Anmerkang: [Der Nahrboden ist nur 8 bis 10 Tage haltbar, daher nur kleine Mengen ansetzen! Zwiebel-Agar zum Nachweis einer Pseudomyzelbildung bei Hefen (Kocxovi-KraTocs- vivovA, miindl, 1970) 00g Zwiebetn 2g D-Glucose 20g Agar-Agar 1000 mi Leitungswasser 1. Zwiebetn schilen und zerschneiden; $00 g in 1 1 Leitungswasser geben und aufkochen lassen, ‘Wasrigen Extrakt abdekantieren und filtrieren. . 0,2% D-Glucose sowie Agar-Agar zufligen. 4, In Erleameyerkalbchen zu je 30 mi abfillen. 5. An 3 aufeinanderfolgenden Tagen je 1h in Dampftopf (100 °C) strilsieren. 6. Vor Gebrauch in Petrischalen giefien. HAM 1951, modifiziert nach VAN DER WALT 1970) 10g D-Ghucose 13 L-Asparagin 356 (NH,),SO, 0855 KH,PO, 015 K,HPO, 05g. MgS0,"71,0 o1g NC O1g CaCl, -6H,0 Omi Spureaclementeldsung (Vorsctrit A 63) 10m. Vitaminldaung (Vorscrift A 66) 10ml” Aminosiurelasung (Vorschrift A 67) 205° Agr-Apr ad 1000 ml Aqua dest. 1. Bestandteile (auBer Vitaminlésung und Aminosiurelésung) in 980 ml Aqua dest. im Dampftopf lsen bei 100 °C. 2. Abfilllen des Mediums in Rdbrchen zu 9,8 ml oder in Nahrbodenflaschen. A33 Ax 3. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterlisieren, 4, Vor dem Erstarren des Agars unter sterilen Bedingungen pro R@hrchen (0.8 ml) zupipettieren: = 0,1 ml Vitaminlosung, sterilfitriert — 0,1 ml Aminosiurelésung, sterilfiltriert AnschlieBend Robrchen schrag legen oder in Petrischalen ausgieBen. ‘Anmerkangea: Dieses Medium wird auch als Fertigpriparat (in getrockneter Form) angeboten (ifeo Laboratories Detroit, USA), Zur Herstellung des Agars werden 25 g des getrockneten Hefe-Morphologie-Agars in 1 | kaltem destiliertem Wasser suspendiert und die Bestandteile durch Erhitzen im Dampfopf geldst. Nach Abflllung in Robrchen oder Flaschen erfolgt — unge- fachiet des Gehalis an Vitaminen und Aminosiuren — die Sterisation durch ‘5Smindtiges Autoklavieren bei 121 °C (vaN Den Wat & Yannow 1984). Heu-Agar zur Isolierung und Kultur phytopethogener Pilze, ferner fiir Gymnoascaceae, Chytridiomycetes und Acrasiales. 508 trockenes Hew 205 Agar-Agar 1000 mat Wasser 1, 50 g Heu (Blatter von verschiedenen Pflanzen, gemischt und getrocknet) al . a, 1000 al Wasser nufgen ind 30 min im Autoklavensteriiseren nach Vor schrift B 4. Durch ein Tuch filtrieren. Das verdampfte Wasser auf 1000 ml auffillen. 5. Agar-Agar abwiegen und 5 min in flieBendem Wasser waschen; danach Wasser weggieBien. 6, Das Agar-Agar der heifen Filssigkeit zufigen; im Wasserbad kochen lassen, bis sich das Agar-Agar lost. Durch Papierfilterfiltrieren. ‘Nach Vorschrift A 70 in Robrehen fullen, ‘Nach Vorschrift B 3/4 20 min im Autoklaven sterlisieren. Vor dem Abkiihlen Rahrchen nach Vorschrift A 71 schrig legen. Bodenextrakt-Agar (SEA) zur Isolicrung von Bodenpilzen (S. Perzoupt brief.) 1000 g gut humoser Boden (z. B. Gartenerde) 10 mg Chloramphenicol 10 mg Streptomycinslst 15g Agar-Agar 1000 mt WasserAS Ax |. Boden abwiegen und mit gleichen Volumteilen Wasser mischen. ‘Bodensuspension sedimentieren lassen, danach Flissigkeit dekantieren und aufbewahren. . Agar-Agar abwiegen und 5 min unter flieBendem Wasser waschen, Die dekantierte Flissigkeit mit dem Agar-Agar versetzen. ‘Lésung im Autoklaven sterilsieren. Antibiotika abwiegen und hinzufiigen. Bodenextrakt-Agar in vorher sterlisierte Robrchen abfillen. Rohrchen schrg legen oder (20 ml) in Petrischalen ausgiefien. Carboxymethyl-Cellulose-Agar (CMC) zur lolierung von Bodenpilzen (Gams 1960) 10g Tapetenleim, handelsiblich 3g NaNO, 1g KH,PO, 05g MS0,°7H,0 058 KCl 0.01 g FeSO, -7H,0 05g Hefeextrakt 10mg CuSO, ‘Smg_MnSO, Img Z280,’ Omg CaC, 15g Agsr-Agar 1000 mi Aqua dest. 1, Tapetenieim in 500 m! Wasser 24 h quellen lassen, dann in geldstem Zustand auf pH 7,0 einstellen ‘Agar-Agar Smin unter flieBendem Wasser waschen und der Lésung zuftigen, ‘ibrige Substanzen zufiigen. }. Wasser auf 1000 ml auffillen. . Lésung fltrieren und nach Vorschrift A 70 in Réhrchen fillen. Im Autoklaven sterilisieren. Rohrchen schrg legen oder (20 ml) in Petrischalen ausgicSen. Wasser-Agar 205 Agar-Agar 1000 ml Wasser (oder Aqua dest.) 1, Agar-Agar abwiegen und in 1000 ml Wasser einweichen. 2. Im Wasserbad erwirmen, bis das Agar-Agar sich ldst. 3. Lésung durch Papierfilterfiltrieren. 4. Nach Vorschrift A 70 in Rahreben fallen. 5. Nach Vorschrift B 3/4 20 min im Autoklaven sterilisieren. 6. Nach Vorschrift A 72 in Petrischalen giefen. A37 AB A39 Haferflockenagar Zur Isolierung und Kultur mancher Schleimpilze (Myxomycetes) ist nach dem GieBen in Petrischalen, bevor der Wasseragar fest wird, in jede Schale eine kleine ‘Menge Haferflocken 2 streuen. Armer Malz-Agar zur Isolierung von niederen Pilzen mit Zoosporen (Oomycetes, Chytridiomyce- tes) 2g Malzestrakt oder Biomale 20g Agar-Agar 1000 Wasser 1. Agar-Agar abwiegen und 5 min in lieBendem Wasser waschen ;danach Was- ser weggieflen, 2, 1000 ml Wasser zugeben; im Dampftopf oder Wasserbad erhitzen, bis sich das Agar-Agar auflést. 3. Malzextrakt (bzw. Biomalz) abwiegen und der Lésung zufiigen. 4, pH-Wert priifen und gegebenenfalls einige Tropfen HC! zugeben, bis sich ein pH von etwa 5,5 einstelit. Der pH-Wert kann mit Indikatorpapier gemessen ‘werden. 5. Die Lésung durch Papierfilter filtrieren und das Filtrat in einem Erlenmeyer- kolben im Kiihlschrank aufbewahren. 6. In Réhrchen fillen nach Vorshrift A 70. 7. 20min im Autoklaven sterilsieren nach Vorschrift B 3/4, 8. Vor dem Festwerden des Agus sind die Rabrchen nach Vorschrift A 71 schrigzu legen. Malz-Hefe-Pepton-Agar (MYP) zur Isolierung von limnisch-aquatischen Pilzen (BANDON! & al. 1975) 7g Malzextrakt 1g Sojabohnen-Pepton (2. B. Difco soytone) 03 ¢ Hefeenraxt 15g Agar-Agar 1000 ma Aqua dest. ‘Nach dem Autoklavieren wird dem Medium Tetracyclin-Hydrochlorid (100mg in 1 ml Ethanol 95%) zugesetzt. Y-Agar zr Isolierung von Hefepilzen ausSuspensionen und Wasserproben (Bucx 1975) 20 D-Glucose 2g Malzextrakt 1g Hefeextrakt 20g. Agar-Agar (bzw. 23 g Difco-Nutrient-Agar) 1000 ml Aqua dest.A4 A4l 1. Medium auf pH 6,0 einstellen. 2. Nach dem Autoklavieren werden 200 bis $00 ppm Chloramphenicol zuge- seta Candida-Selektivagar zur Kultivierung potentiell pathogener Candida-Arten (NICKERSON, modifiziert nach SeELIGER 1978) 10g D-Giucose 10g Giyein Sg Wiamutslnt 1g. Hefeextakt 206 AgrAgar sd 1000 ml Aqua det. 1. Bestandtei Aqua dest. geben. 2. Mischung aufkochen und $ min im Dampftopf bei 100 °C stehen lassen. 3. Agar auf 50 °C abkilhlen und Platten gieBen. ‘Anmericangen: Potentill pathogene Candida-Arten bilden auf diesem Agar mittelgroBe, runde, braun bis schwarz gefirbte Kok Der Agar ist auch als Trockenpriparat im Handel (2. B. Merck), Dopa-Agar zur Melaninbildung bei Cryptococcus neoformans (CHasxes & TYNDALL 1975, ‘modifiziert nach VAN Dax WALT & YARROW 1984) 1. 0,04. Dihydroxyphenylalanin (DOPA) 1g Asparagin 1g L-Glutamin 1g Glycin ad 200m! Aqua dest IL 05g D-Ghucose 4g. KH,PO, 25g MgS0,°7H,0 10mg Thiamin-HCt 208 Biotin 25g Agar-Agar a4 800ml Aqua dest. 1, Zur Herstetlung der als Substrat fr die Pigmentbildung ndtigen DOPA- ‘Aminosurelsung (I) di oben genannten 4Bestandciein 200ml Aqua dex sen, 2. pH-Wert der Lésung mit 1 M K,HPO,-Lésung (ca. 7 ml) auf 5,5 einstellen, 3, Losung sterilfiltrieren. 4, Zar Herstellung des Grund-Agar-Mediums (II) Bestandteile (ohne Agar) {in 800 ml Aqua dest. geben. 5. pH-Wert des Grund-Agar-Mediums mit 1 M K,HPO,-Lésung (ca. 7 ml) auf 5,5 einstellen. 6, Agar zufigen und 15 min bei 121 °C autoklavieren. Ada AB 7. 800 ml des sterilisierten Grund-Agar-Mediums (Il) bei 55 °C mit 200 ml der steril filtrierten DOPA-Aminosdureldsung (1) mischen und sofort in Petrischalen ausgiefien oder in R&brchen abfllen. Anmerknagen: Der Agar wird zur Schnelldifferenzierung von Cryplococcus neoformans cingesetzt Die Kolonien firben sich durch die Wirkung der Phenoloxidase dunkelbraun bis schwarz (28 °C, 1 bis 3 Tage). Die DOPA-Aminosfureldsung darf nicht mehr als unbedingt natig einer erhohten Temperatur (55 °C) ausgesetzt werden ‘Das fertige Medium ist im Kahichrank aufrubewahren und nur ca. eine Woche ‘verwendungsfihig. ‘Anstelle der DOPA-Aminosdurelisung kénnen auch verschiedene andere Verbin- dungen als Farbstoff:Prakursoren verwendet werden, 2. B. Samen von Guizoria ‘abyssinica, Catechol, Protokatechusture, Norepinephrin, Dopamin u. a. Glycerol-Pepton-Agar zur Keimzahlbestimmung von Bakterien und Hefen (HinTe 1965) 20g Glycerol (Glycerin) 25 Pepton Tr K,HPO, 35 NCL 0.35 MgSO, -7 H,0 000g FeS0,°7 4,0 0045 Cacd, 205 AgarAgar 1000 ml Leitungswasser pH-Wert cinstellen auf 6,9. ‘Anmerkong: Geaiht wird in den Verddnnungsstafen 10, 10°*, 10-*, vgl. Vorschrift K 1. ‘Zasatz von Antibiotika m Nahrbiden (0. nach Som. & Asa.uNc 1981) 4) anchbakterielle Antbiotica und Wirkstoffe (Cleramphenicol 250 bis 300 ppm ‘erst in etwas Ethanol lisen, da schlecht wasserl6slich; kann mit autoklaviert werden. ‘Bengalross 0,5 bis 60 ppm nach dem Autoklavieren zugeben (Chlortetracyciia 4 bis 100 ppm nach dem Autoklavieren zugeben ‘Natrlamtaurocholat 500 ppm nach dem Autoklavieren zugeben ‘Ochsengalle 500—1000 ppm nach dem Autoklavieren zugeben ‘Oxytetracyetin 100 ppm nach dem Autokiavieren zugeben Peaicllia 50 ppm nach dem Autoklavieren zugeben ‘Streptomycin 10 bis 300 ppm nach dem Autoklavieren zugebenAda 1) andfangale Antibiot und Antinykotika AM Beno 100 ppm Nptati 10 bis 50 ppm zac in Glycerol een, da nicht waserdich; ‘orwiegen gegen Hefepilze wirksam, Pimariein 10 bis 100 ppm Anmeriong: Die angegsbenen Mengen varcren je nich der Empfindlichtit der kulivirten Pitzart. Wenig Biozide vertragen 2.B. Phytophthora, Python, Rhizoctonia, Cera: tocyst. pee = 1 mg Antibiotika-Selektivmedium (MPVM) ‘zar Isolicrung und quantitativen Bestimmung von Phythiun-Arten aus Boden- _suspensionen nach Mincerice (1971) Be, Setar ‘mg Pentachlomitrobenzen (PCNB), techn eae (PCNB), tome wa, 74,0 ome Aas Oot mg CaS, +5 150 0,02 mg MoO; 0,02 mg MoCl, 0,02 mg FeSO, -71H,0 100g Thiamin-Hydrochlorid 17g Maismehl-Agar, vorgefertigt 2g Apar-Agar 1000 mi Aqua dest. 1, Antimykotika (PCNB, Bengalrosa, Vancomycin und Pimaricin,s. auch un- ten) unmittélbar vor Gebrauch in sterilem Wasser Isen baw. suspendieren. 2. Oben angegebene Substanzen und gewaschenes Agar-Agar in dest. Wasset Ween, 3. Lésung 30 min bei 121 °C im Autoklaven sterlisieren, dann auf etwa 50 °C abkiihlen lassen. Nunmehr zugeben: 300 mg. Vancomycin-Hydrochlorid ‘Simg Pimaricin 10 mg CaCl, sterilisiort 4. Agarplatten giefen, im Dunkeln aufbewahren und am gleichen Tag ver- wenden (vgl. Vorschrift C 27). “ Glucose-Alanin-Agar ffir physiologische Untersuchungen (Trnvit Taw Kurt 1974) 20g D-Glucose 2g Alanin 1g KH,PO, 05g K,HPO, 05¢ CaCh 1g MnS0,-7H,0 0,5 mg Aneurin-Hydrochlorid 2'iml » Spurenelementeldsung (z.B. A 63, A 64) 2ml _Eisen-EDTA (s. unten) 30g Agar-Agar 1000 mi Aqua dest. pH-Wert nach dem Sterilisieren: 4,9. Eisen-EDTA: 0,695 g FeSO, -7H,0 0.93 g Na,-Ethylendiamintetrascetat (EDTA, Handelsname ,,Chelaplex 111") 100m! Aquadest. Malz-Hefeextrakt-Agar zur Bestimmung der Wachstumsrate von Pilzen (BRACANTO& GouDEN 1953 und ‘OcunpeRo 1980) 2g Malzextrakt Hlfeextrakt Die Kulturen werden 5 Tage bei 10,18, 20, 45 und 50 °C bebrtet in einfacheres Renept flr Malz-Hefeextrakt-Agar (CCM Bro 1962) sicht vor: 50g Mabecnkt Sterlisieren im Dampftopt, e 30 min an 3 aufeinanderfolgenden Tagen. 3A46 ‘Nahrbéden fiir Cellulasenachweis mittels Clearing-Test nach RAUTELA & CowL!NG (1966) 8) Nihrboden 1 58 Cellulosepulver (Schleicher & Schill 123 a) 25 NH,H,PO, 1g KH-PO, 1g Hefeextrakt 05g MgSO, -7H,0 sSmg CaCl, ‘Smg Fe-Citrat 444mg Za80, 71,0 Sm MnSO,-4H,0 Img CuCl, °6H,6 20g AgurAgar 1000 ml Leitungswasser pH-Wert: 5,6. ) Narboden 2 25 NH,H,PO, 06g KH,PO, 04g K,HPO, 09g MgSO, "7,0 015 g Hefeextrakt 4img Adenin 8 mg Adenosin 100 ug) Ancurin-Hydrochlorid ©) Herstellung der siureaufgeschlossenen Cellulose (W. Hirte brief.) 1. 10g Cellulosepuiver (@. oben) mit $00 ml cisgekihiter Phosphorsdure (60%) versetzen 2. 2h bei 4 °C riihren, 3. Die viskose Lrung mit einer cisgektlten 5%gen Na,CO,-Lésung.in Aqua dest. suspendieren und teilweise neutralisieren. 4. Uber cine Porzellannutsche abfiltrierert 5. Sdure Cellulose mit eigekiter Na,CO,-Losung 0 lange waschen, bis das Filtrat neutral ist. 4) Herseng des Nibrbosens 2 fir den Clearing-Test 1. Agar-Agar abwiegen, S min unter MieBendem Wasser waschen, danach Wasser weggieBen. 2. Die Gbrigen Substanzen (auBer Aneurin-Hydrochlorid) zusammen mit dem Agar-Agar in 1000 ml Aqua dest. ldsen. 3, Kure autoklavieren, 4 Durch Papierfiterfitieren. 5. Ca. 2 g siureaufgeschlossene Cellulose (s. oben) zugeben. Berechnung der Zugabemenge: Gewichtszunahme der durch Phosphorsdure aufgeschlos- ‘senen 10 g Cellulose wird gravimetrisch ermittelt ;entsprechend der Zunahme A47 AB wird */, der aufgeschlossenen Cellulose den 1000 ml Nahrboden 2 zuge- setzt, 6. Dem autoklavierten und filtrieten Medium vor dem AusgieBen Aneurin- Hydrochlorid zugeben. 7. pH-Wert auf 5,0 einstellen. 8, Nahrboden in Rohrchen gieSen, diese senkrecht stellen. ‘Anmerkung: Durchfuhrung und Auswertung des Tests s. Vorschrift F 24 Tanninsiure-Agar zum Nachweis von Polyphenoloxidasen (Nostis 1965) 15g Malzextrakt 20g Agar-Agar 5g Tanninsiure (oder Gallussiure) 1000 ml Aqua dest. Herstelhing wie Malz-Agar (MEA, s. Vorschrift A 1). Der pH-Wert muB jedoch zwischen 5,6 und 6,5 liegen. ‘Anmerkang: Hovupovi-Jecnova (1971) gibt nur 08 g Tanninsiure auf 1 | an. Nahrbéden zur Bestimmung der pektolytischen Akti 5 Pektin Citrus oder Apfel) 1g. Hefeestrekt 15g Agar-Agar 500 mi Mineralsallésung (. unten) 1500 ml Agua dest. Mineralsalziioung: 2g (NH,),SO, 4g KH,PO, 6g Na,HPO, 02.5 FeSO, -7H,0 Timg CaCl, 10g HBO, 104g MnSO, Ong 2080, 50 ug CuSO, 10g MoO, 1000 mi Aqua des. Einstetlung des pH-Wertes: flir Pektatlyase-Bestimmung pH 7,0 direkt einstellbar; flr Polygalakturonase- Bestimmung pH 5,0: Medium ohne Agar-Agar doppelt konzentriertherstellen, ‘Agar-Agar und Basalmedium getrennt auf ca. 48 °C abkiihlen, mischen und sofort Platten giefen. 3) Kei, Methoden 33A49 Arbutin-Agar ASO zum Nachweis von f-Glucosidase bei Pilzen ‘ad 1000 ml Hefewasser (Vorschrift A 60) 1, Bestandteile unter Eshitzen im Dampftopf bei 100 °C in Hefewasser lésen, filtrieren. 2. Zu 5 bis 7 ml in Rohrchen abfilien. 3. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. 4. Sofort nach der Sterilisation in verflissigten Agar 2 bis 3 Tropfen 1 %ige waBrige, sterilfiltrerte Eisen-Ammonium-Citrat-Lésung pro Rohrchen ‘zuffigen und gut durchmischen. 5. Rohrehen vor dem Erstarren des Agars schrig legen. Anmericangen: Anstelle von Hefewasser kann auch 1:10 verdGnntes Hefe-Autolysat verwendet werden, Es kann auch Eisen(lII}chlorid zugeftgt werden (KockovA-KRATOCHVILOVA, ‘mindl.). Harnstoff-Agar zum Nachweis einer Ammoniakbildung aus Harnstoff (CHRISTENSEN 1946) 20g Harnstoft 1g D-Glucose 1g Pepton Se Nac 2g KH,PO, 12mg Phenolrot 20g Agar-Agar ad 1000 ml Aqua dest 1. Bestandteile abwiegen und (aufer Harnstoff und Phenotrot) in 900 ml Aqua dest. im Dampftopf lésen, anschlieSend filtrieren 2. pH-Wert auf 6,7 bis 6,9 einstellen. . 12mg Phenolrot oder 1 ml einer 1,2%igen Phenolrotstammldsung zufiigen. 4. In Rohrchen zu 4,5 mi abfillen und im Autoklaven bei 121 °C sterli- sieren, 5. Hamstoff in 100 ml Aqua dest. l6sen und Lésung sterilfitrieren. 6. Zu dem auf 50°C abgekiihiten flissigen Agar pro Rébrchen 0,5 ml sterile Harnstofflésung zuftigen und Rohrchen mit kurzer Schrigfliche cerstarren lassen, Anmerkeng: Das flr Bakterien entwickelte Medium hat sich nach SemioeR (1978) sowie nach ccigenen Erfalrungen auch fir Hefen u. a. Pilze bewihrt. Eine starke Harasioff. stoffspaltung (positive Urease-Reaktion) dufert sich in cine Farbumschlag des Indikators nach Rosarot. Eine schwache Nutzung von Harnstoff als N-Quelle, die ‘den meisten Hefen eigen ist, wird dabei nicht erfaBt (vaN Den WaLt & Yarrow 1984), A5I A52 Synthetisches Medium fir C-Quellen-Assimilationstests (N-base) bei Hefen (VAN Dex Watt 1970) Se (NH,),SO, 085 g KH,PO, 01155 K,HPO, MgSO, "7,0 Nac CaCl, 61,0 Spordnlemén bn teldsung (Vorschrift A 63) Vitaminlung (Vorschit A 65) Aminosiurelésung (Vorschrift A 67) Aqua dest. pH-Wert: 5.6. 1, Mineralsatze in 890 ml Aqua dest. ldsen, Spurenclementeldsung zufligen. 2. Abfillen in Rdbrchen zu 9 mi. 3. 15min bei 121 °C im Autoklaven steriliseren, 4, Unter sterilen Bedingungen pro R&hrchen (9 ml) zupipettieren: — 0,1 ml Vitaminlésung, tert fltiert = 0,1 ml Aminosiurelésung, ster filtriert Das Medium kann auch, um cine besere Beliftung 2 gewihrleisten, in S-ml- “Mengea (Gesamtvolumen) in die R&hrchen abgefbilt werden. In Vorschrift F 6ist dann ‘entsprechend anders zu dosieren ; ; Das Medium wird als Fertigpriparat (getrocknet) angeboten (Difco Lab. Detroit, USA), ‘Vor der Beimpfung ist noch die mu tsstende C-Quelle (. Vorschrift F 6) zuzu- faigen. ‘Bei Zusatz von 2% (w/v) Agar-Agar (im Arbeitsschrtt 1 und anschlieBendem ‘Lésen im Dampftopf) kann das Medium als Festmedium verwendet werden. Die unter Punkt 4 genannten sterilen Losungen werden dann beim Ausgiefen der Robrohen in die Petrischalen zugefUgt (val. Vorschrift F 7). Synthetisches Medium fiir N-Quellen-Assimilationstests (C-base) bei Hefen (VAN DER WALT 1970) 10g D-Glucose 0.85 g KH,PO, 0.15 g K,HPO, 05g Mg80,"7H,0 ote MC Olg CaCl, “6H, 10ml Spurenelementeldsung (Vorschrift A 63) 1Oml _Vitaminlosung (Vorschrif A 66) ml Aminostureldsung (Vorschrift A 67) ad 1000 ml Aqua dest. pH-Wert 5,6. 35A53 |, Mineralsalze in 890 ml Aqua dest. ldsen, Spurenelemente-Lésung zufligen. 2. Abfillien in Rohrchen zu 9 ml 3. 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. 4. Unter sterilen Bedingungen pro Rohrchen (9 ml) zupipettieren: 0,1 ml _Vitaminidsung, sterlfitriert 0,01 mi Aminosureldsung, steril itriert 0.4 ml Glucoselésung (257%ig in Aqua dest), stril filtriert AS4 Aart Das Medium kano such, um ie bewereBelng 7 pwd, in Sn Meagen (Graves a Roden st ween fam wid al Frigpparat tock) im Handel angeoten (i Lab. Detroit, USA). ‘peipant (eu netoten ito ‘Vor der Beimpfung ist noch die zu testende N-Quelle zuzufigen (Vorschrift F 8). Bei Zuate veo 2% (wh) ApneAgr (in Arbatscht fwd ancien Lien im Dapp) Anan Medi als Fesinetiom vrweoda werden Vor: seit F 9), Bal guter Agwgsat ane Newalaerng Ges Medias at Scordeich Die wer Punt «genannten, sien LOsungen werden Gan en Rs Bten der RObehen in di Pot scaen ge, Synthetisches Medium zur Bestimmung des Vitaminbedarfs (vitamin-free base) bei Hefen (VAN DER Watt 1970) log D-Ghucose Spurenelementeldsung (Vorschrift A 63) ‘Aminostureldsung (Vorsehrift A 67) ‘Aqua dest 1. Synthetisches Medium fir C-Quellen-Assimilationstests bei Hefen nach Vor- ee schrift A 51 bis cinschlieSlich Arbeitsschritt 3 ansetzen. 2. Unter sterilen Bedingungen pro Rohrchen (9 mil) zupipettieren: 0,1 ml AminosdurelGsung, steril filtriert 0,4 ml Glucoselosung (25%ig in Aqua dest.), ster fltriert ‘Anmerkungen: ‘Das Medium wird als Fertigpriparat (getrocknet) im Handel angeboten (Difco Lab. Detroit, USA). ‘Vor der Beimpfung sind noch alle Vitamine auBler demjenigen, dessen Bedarf be- stimmt werden soll, zuzuflgen (Vorschrift F 13) Saccharose-Pepton-Agar zur Pulcherrimin-Bildung bei Metschnikowia pulcherrima (BEUERINCK, modi- fiziert nach VAN per Watt 1952) 40g Saccharose 20g Pepton 2g KH,PO, 05 g MgSO, °7H,0 0.5 g Ferriammoniumcitrat 10 ml Hefeautolysat (Vorschrift A 61) 20g Agar-Agar ‘ad 1000 ml Wasser 1. Bestandteile abwiegen, aufer Eisenammoniumeitrat in Leitungswasser ‘geben und bei 100 °C im Dampftopf losen. 2, Filtration durch weiches Faltenfilter. 3. Abfiillen zu 7 bis 10 ml in Rohrchen. 4, 15 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren. 5. Pro Rébrchen 0,1 ml einer 5%igen (w/v) waBrigen sterifiltrierten Losung von Eisenammoniumeitrat zuflgen 6. Vor dem Erstarren des Agars Rohrchen schrig legen oder Agar in sterile Petrischalen ausgieBen. ‘Anmerkangen: Ex gibt auch Stimme von M. pulcherrima, die zu keiner Farbstoffproduktion befthigt sind (2. T. auch Sektorenbildung in Kolonien), so daB dieses Medium nur als zusitzlicher Test zu anderen Identfizerungsmethoden verwendet werden sot. ‘im Gegensatz zur Bildung von Pulcherrimin bedarf der Nachweis der Synthese carotinoider Farbstoffe bei Hefen (2. B. bei Rhodotorula,, Rhodosporidium- und ‘Sporobolomyces-Arten) einer speziellen Medien. Die Bildung von Carotinoid- Pigmenten kann auf allen Hefemedien, die fir eine Beurteilung anderer Wachstums- cigenschaften Verwendung finden, erfbt werden. Eine Bildung von Farbstoffen aus extern zugefUgten Kiinstlchen Prilkursoren wird 2B. bei Cryptococeus-Arten zur Differenzierung ausgenutzt (vgl. Vorschrit A 41), Weichagar als Traiger der Testkeime (Bakterien, vgl. F 16) zum Nachweis von Antibiotika 14g Nihrbouillon I (Fa Immunpriparate Bertin) 14g Nahragar Il (Fa. Immunpriparate Belin) 4000 mt Aqua dest. 1, Substanzen in dest. Wasser lésen, im Dampftopf oder Wasserbad er- hitzen. 2. Nach Bedarf in Rohrchen (je 3 ml) abfillen. 3. Rohrchen im Autoklaven steril 3”10m! Spurenelementelésung (Varachift A 64) 1d 1000 mi Agua des. pH-Wert fir Fldssigmedium: 5,4; pH-Wert fir Festmedium: 65, ‘Anmerkangen: Das Met ist — mit 2% Agar sowie mit ener sri flviten Viana (865) suppiementer— fr tie Testung der Asmltion venchisente ‘Quellen durch Pilze einsetzbar. Besonders bewahrt hat sich das Medium zur Kultivierung von Hefen auf Koblen- wasserstoffen, A57 Filissiges Nahrmedium fiir phytoparasitische Pilze . nach Weppinc & Keworic (1958) XX 78g D-Glucose 192g Asparagin 237g NH,NO, 13g KH-PO, Vg MgS0,°7H,0 Ole CaCl, 015 ml Spurenelementelisung (s. unten) 0.01 g Fe(NH,XSO,), 02 ug Thiamin 1000 ml Aqua dest. Hoaglands Sporenelementelioung (vereinfacht) 1g H,B0, 7" 028 2080,-7H,0 0,2 02 Co(NO,), 61,0 07, 7 1g. Na,Etiylendainitctraaetat (EDTA) “7 15g MoCl,-4H,0 27, * 02 CuSO, -$H,0 “*' 02g NaMoO, > 000ml Aqua dest. Nahrmedium nach obigen Angaben zusammenstellen. Filtrieren ist nicht erforderlich, pH 68. ASS ASD ge Fliissiges Nahrmedium fir Mykorrhizapilze fiir physiologische Untersuchungen (MikoLa 1948, Lamio 1970) 20% © D-Glucose Sg NH,Tertrat 1g KH,PO, 05 Mg80,°7H,0 015 ml FeCl, (1 %ige Losung) 03g Z080,-71,0 05g MaS0,-4H,0 Sm CaCl, (0,1 mLésung) 50g Thiamin 1000 mi Aqua des. 1. Substanzen in Aqua dest. I0sen. 2; Lésung 20 min bei 121 °C im Autoklaven sterilisieren, 3, Je 25 ml Nabrléeung in sterile Erlenmeyerkolben abfllen. Kulturen von Cenococeum, Paxillus u. werden 26 bis 28 Tage bebritet. Malzextrakt zur Kultivierung und morphologischen Charakterisierung von Hefen (Loppen & Krsain-van Ru 1952) 1000.5 Malz 2600 mil Wasser |. Malz (geschrotetes Darrmalz/Malzschrot, aus Brauereien beziehbar) in 2,61 Wasser geben. 2. Mischung im Wasserbad unter stindigem Riihren bis 45 °C 3 h erwarmen, danach nochmals flr 1 h bei 63 °C. . Mischung durch ein Haarsieb oder Tuch filtrieren, . Filtra 15 min bei 121 °C autokiavieren. . Durch grobes Papierfilterfiltreren 5. Filtrat mit Wasser verdiinnen auf cine spezifische Dichte von 1,06 g/cm? (catspricht 15 Balling-Grad, , FuBnote S. 40). 7. pH-Wert priifen und gegebenenfalls auf ca 5,5 nachstellen. (Far Isolierungs- und Anreicherungsrwecke pH-Wert auf 3,7 einstellen, jedoch nicht, wenn Malzextrakt zur Herstellung von Agarmedicn weiterverwendet werden sol.) 8, Abfillen in Kélbchen oder Rotrchen (Vorschrift A 70). Aumerkmgen: Dieses Medium wird von verschiedenen Firmen als Trockenpriparat angebotea. Es werden dabei 15 g des pulverisieien Malzextrakts in 1 1 Aqua des. im Dampf- {opt geldst und anschlieSend wie oben abgefUll und striiser. Anstelle der unter Punkt 8 angegebenen Sterilisicrung ist es auch méglich, an ‘3 auleinanderfolgenden Tagen je him Dampftopt (100 °C) mu strilisieren ‘Das Medium ist vrpkichbar der aus Bravereien bezchbaren Bicrware (elle Vor- derwitrze), wenn deren Zuckergehalt auf den oben (Punkt 6) angegebenen Wert cinreguler wird, »AO A6l ‘Nach anderen Rezepturen wird die Bierwiirze (2. T. nach Istindiger Behandlung bei 100 °Cim Dampftopf und anschlieBender Filtration) mit Leitungswasser auf 7 Baling Grad) (bzw. Masse-Y, an I8slichen Extraktstoffen) verddant. Hefewasser Grundsubstrat fir verschiedene Tests zur Identifizierung von Hefen (KockovA- KRarocuvitovA, miindl.) 5002 PreBhefe $000 ml Leitungswasser |, PreBhefe in Leitungswasser suspendieren und 1 h bei 100 °C im Dampftopf erhitzen. 2. Absetzen lassen, Uberstand dekantieren und filtrieren. 3. In 14-Kolben zu je 500 ml abfilllen und an 3 aufeinanderfolgenden Tagen Je 1h bei 100 °C im Dampftopf sterilisieren. 4. Aufbewahrung als 10%iges Hefewasser im Kahlschrank. 5. Vor Gebrauch mit sterilem Leitungswasser 1: 1 verdinnen (. ‘wasser), éiges Hefe- Nach einer anderen Vorschrift (Loopen & Knecar-van Rus 1952) wird folgender- ‘mafien verfahren: 200g PreGhefe 1000 ml Leitungswasser 1. Prebhefe in Leitungswasser suspendicren. 2. Etwas Hihnereiweid zusetzen und 15 min bei 121 °C autoklavieren, 3. Noch heife Mischung durch dickes Filterpapierfiltrieren. Hefeautolysat Grundsubstrat zur Kultivierung von Hefen 500g PreGhefe ‘500 mi Leitungswasser 1 ml Toluen (Toluol) 1, PreGhefe (Bickerhefe) in Wasser geben; zur Beschleunigung der Autolyse kann wenig Toluen zugefigt werden. 2, Filssigkeitsstand im Gef'B mit wasserunléslichem Filztift markieren. 3. Mischung 3 Tage in einem Wasserbad bei 50 bis 55 °C unter gelegentlichem Rithreninkubieren 4. Verdunstetes Wasser mit Aqua dest. bis zur Markierung wieder auf- fillen, 5. Kurz aufkochen, danach abkihlen. 6. Binstellen des pH-Wertes auf 6 (mit 1 KOH) *) Balling-Grad — Grad einer nach dem ésterreichischen Chemiker K.J.N. BALLING (1805—1868) benannten Ariometerskala (Saccharimeter) die den Zuckergchalt der waBrigen Lésungen angibt. | Balling-Grad (auch: °B) = | Masseprozent Zucker Ag A63 7. Durch weiches Papierfiter (Faltenfiter) baw. cin Tuch filtrieren oder die nicht lysierten Hefebestandieile durch Zentrifugation abtrennen, 8. Der Oberstand kann — falls er noch trib ist — auch noch mit EiweiB ‘geklirt werden Zugabe des abgetrennten Eiweifes eines Hihnereies zu -7 Tage) 20 ml Nahrboden bendtigt. Im Routinebetrieb vieler Laboratorien wird der Agar direkt von Nahrbodenflaschen in Petrichalen abgefUllt, wobei die Agarmenge je Petrischale zwar nicht genau dosiert werden kann, jedoch viel Zeit gespart wird. Bewahrt haben sich auch automatische Abfilleinrichtungen, ‘Agarmedien lasen sich besser beimpfen, wenn man den Agar nach dem Abkithlen erst einige Stunden stehen IAS. Glycerol-Nitrat-Agar (G25N) zur Bestimmung der Wachstumsrate (Koloniedurchmesser) von Penicillism- Arten (Prrt 1979) 250g Glycerol pa ‘7,5 ml Czapek-Konzentrat (s, unten) 37g. Hae Auolat (A 6) ede Metestrakt O78 K,HPO, 1p AgrAgar 750 fal Aqua dest oder Leitungswaser Anmerkmgen: Czapek-Konzentrat enthilt 30 g NaNOs, 5 g KCI, 5 g MgSO, -7H,0 und 0,1 g FeSO, -7 H,0 auf 100 ml Wasser. Es ist ohne Strilisation unbegrent haltbar. Ein Niederscleg von Fe(OH), kann durch Schétieln vor Gebrauch wieder suspendiert ‘werden. Das Konzentrat wird Medion zu 1% des Wasseranteils zupesctzt PPetrischalea mit G25N milssen beimpft werden, wenn der Agar frisch gegossen ist; der Nahrboden ist vor Austrocknung zu schitzen. 45Bl Sterilisierung und Desinfektion ‘Sterilisierung ist das Abtdten oder Entfernen aller lebensfihigen Vegetativ- und Dauerformen von pathogenen und apathogenen Mikroorganismen in Stoffen, Zubereitungen und an Gegenstinden, Unter Desinfektion versteht man dagegen einen Vorgang, bei dem totes ‘oder lebendes Material in einen Zustand versetzt wird, in welchem es nicht ‘mehr infizieren kann. Im Gegensatz zur Sterilisation werden bei der Desinfek- tion (2. B. des Arbeitsplatzes, Vorschrift B 1) nicht alle Keime vernichtet. Das Ziel der Desinfektion besteht darin, Infektionsquellen auszuschalten und Infektionen durch Verschleppung pathogener Keime zu vermeiden. Gleich- zeitig werden Kontaminationen der Kulturen durch unerwiinschte Keime er- heblich vermindert. Die Sterlisation von Glasgefien und -gerten sowie anderer trockener Ma- terialien erfolgt in der Regel im HeiBluftsterilisator (Vorschrift B 5), die von ‘Nahrmedien in Kolben oder Rahrchen im Autoklaven (Vorschriften B 3, 4). Saure Agarnahrbdden (pH 2 bis um 4,0) verfestigen sich oftmals nicht ‘nach dem Autoklavieren. In diesem Falle kann man sich mit folgenden ‘MaSnahmen helfen: 1, Der saure Bestandteil wird gesondert autoklaviert und erst beim Ab- 2.Der Nahrboden wird nicht autoklaviert, sondern dreimal 30 min im Dampf- topf sterilisiert (diese Methode eignet sich nicht fir sehr saure Nahrbdden mit pH < 40). Quecksilberhaltige Medien kénnen den Autoklaven durch Ablésen der Kupferbeschichtung stark beschiidigen. Mit Hg-Verbindungen Oberschichtete Medien in Rébrchen oder Platten diirfen daher nicht autoklaviert werden. Desinfektion des Arbeitsplatzes 1. Arbeitsraum von allen Gberflissigen Staubffingem (z. B. Blattpflanzen, Blumen, gebrauchte Glasgerite) frei halten. Bucher, Flaschen, Glasgerite usw. in geschloseenen Schriinken aufbewabren, 2, Steriles Arbeiten erfolgt am besten unter einer Laminarbox. Wo eine solche nicht zur Verfigung steht, Raum 30 min vor Beginn der Arbeit mit einem ‘Verstiuber mit Wasser einnebeln, um Kontaminationen aus der Luft stark zavermindern, 3. Tischflichen mit einem geeigneten Desinfektionsmittel (5. Vorschrift B 2) reinigen. 4. Arbeitsgerite mit Ethanol (70%) waschen und dann abflammen, B2 Eine weitere Keimverminderung in geschlossenen Rumen kann durch Bestrablung mit UV-Licht (2. B. Quecksilber-Niederdrucklampe mit einer Wellenlinge des UV-Lichtes von 254 om) oder in hartnickigen Fallen durch Verdampfung bzw. ‘Vernebelung von Chemikalien (2. B. Formaldehyd: 5 g pro m* Raum, 6 bis 8h) er- ‘eicht werden. Personen kénnen dabei nicht im Raum verbleiben, Pilzsporen erweisen sich allerdings als besonders UV-resistent, so daB UV-Licht im ‘mykologischen Labor nur beschrankt wirksam ist. Gebriuchliche Desinfektionsmittel Einige ffir das mykologische Laboratorium gecignete, allgemein gebriuch- liche baw. in der DDR handelsibliche Desinfektionsmittel und deren Anwen- dungsbedingungen sind der Tabelle 1 zu entnehmen. ‘Tabelle 1. Gebrduchliche Desinfektionsmittel WirkstofMyp Name ‘Verwendung, Wirkungsbedingungen Einwirk- _~ —— Alkohol Ethanol Hindedesinfektion 1 bis 5 min s-Propanol _Hiindedesinfektion 1 bis 5 min Formaldehyd Formaldehyd- Wischedesinfektion 5 bis 10h Lésung (30%ig) Formaldchyd- Raumdesinfektion 6 bis 8h Gas Fesia-form * Wischedesinfektion 5S bis 10h Flichendesinfektion 4h Quarternare C4 Hindedesinfektion 2 min NH,-Verbindg. Fesia-mon _Hiindedesinfektion i Phenolderivat, Fesia-sept. halog. Benzyl Konz, phenol Halog. Kresol, Wofasept hhalog. Benzyl phenol Wotasept special Wotasept- Seifengelee Xylenole Kresomeriat —_Wischedesinfektion 2% 5 bis 10h Flichendesinfektion 4 bis 5% 4h Hindedesinfektion Sb 10 ml 4 min Versch. Wirk- Fesiacito bis0, Tis $ 4B3 B4 Fir die Desinfektion von bewachsenen Kulturmedien oder von mit Mikroorganismen in Berihrung gekommenen Kulturgefien, Pipetten, Geritschaften usw. kénnen die ‘oben genannten Bedingungen flr cine Wasche- oder Flichendesinfektion angewendet werden, falls nicht eine Abtotung der Keime im Autoklaven (in speziellen Alu- ‘minjumkessela) durchgefbhirt wird. Sterilisiermng in einfachen Autoklaven 1, Autoklaven 6ffnen, Wasserstand kontrollieren, evil. nachfillen, 2. Gestell mit den zu sterilisierenden Sachen einsetzen. 3. Deckel schlieBen (dabei jeweils gegendlberstehende Schrauben nacheinander festdrehen).. 4, Venti schliefien. 5. Autoklaven heizen, bis der Druck in ihm 1 atm erreicht; bald darauf muB sich eine Temperatur von 121 °C einstellen, 6. Ventil vorsichtig dffenen, so da® sich wahrend der vorgeschriebenen Zeit (5, 20 oder 30 min) ein konstanter Druck von 1 atm halt, 7. Heizung abstellen und Ventil so weit dffnen, daB der Druck sehr langsam auf 0 zurickgeht. 8. Ventil ganz Offnen und Deckel &ffnen (dabei Vorsicht: heifer Dampf entweicht!). 9. Gestell herausnehmen, ‘Anmerkung: ‘ Vorstehende Anleitung bezicht sich auf Kleine Autoklaven alterer Bauart, wie sie ‘besonders in Entwicklungslindern noch angetroffen werden. An derartigen Geriten (und in amerikanischen Publikationen) kann der Druck auch in psi oder in Ibs (Gibra) angegeben sein, wobei folgende Umrechnungsverhiltnisse geten: 7 psi = 7'Ibs = 0,47 at entspricht 110 °C 11 psi = 11 Ibs = 0,73 at entspricht 116 °C 1S psi = 15 Ibs = 1,00 at entspricht 121 °C 20 psi = 20 lbs = 1,33 at eatspricht 126 °C ‘Umrechnung in kPa 5. S. 167. Sterilisierung in elektrischen Autoklaven 1. Deckel Sffnen, Wasserstand prifen und nétigenfalls Aqua dest. nach- fillen bis der erforderliche Stand erreicht ist (Anzeige im Glasrdhrchen). Oberpriifen, daB der Strémungshahn geéffnet ist. . Die zu sterilsierenden Sachen einstellen. ‘Sicherung lésen, Deckel schlieBen und festdrehen Strom cinschalten; warten, bis das Thermometer etwa 100 °C anzeigt und aus dem Strémungshahn Dampf ausstrémt. ‘Strémungshahn schlieBen. Der Druck stcigt danach auf I atm, die Tempe- ratur auf 121 °C und bleibt automatisch so stehen, 7. Sobald diese Werte erreicht sind, Laborwecker cinstellen. Je nach Vor- schrift 15, 20 oder 30 min autoklavieren, 8, Nach Ablauf der Zeit elektrische Heizung ausschalten, BS 9. Stromungshahn sehr langsam (!) 6ffnen, Hahn flir Wasserkihlung Sffnen, Druck allmahlich (in etwa 10 bis 15 min) auf 0 atm absinken lassen. 10. Deckel losdrehen, mit Pedal difnen; Sicherung einschieben. IL, Sachen herausnehmen. 12, Hahn fir Wasserkiihlung schlieSen. Anmerkamgea: LLeere Petrischalen werden gut gerenigt, in Papier (Zeitungspapier) gewickelt und 30 min autoklaviet, Bis zum Gebrauch laBt man die strilisierten Petrischalen cinge- wickelt, Meistens werden Petrischalen jedoch trockensterilsiert. In der Regel autoklaviert man bei 121 °C 15 bis 20 min. Zur Ste sierunggroBe- ionseffektes sollte gelogentlich cine geringe Menge (3 8) ‘etrockneter Gartenerde, in Filterpapier doppelt eingewickelt, mit autoklaviert werden. Die darin enthaltenen relativbitzeresistenten Sporen, 2. B. von Bacillus Arten, irfen nach dem Sterilisationsvorgarg, mit der Erdprobe in Nahrlésung gebracht, nicht mebr lebensfahig sein Trockensterilisierung im HeiBluftsterilisator Im HeiBlufisterlisator werden Gegenstiinde aus Glas, Porzellan und Metall sterilisert. 1. Die gut gewaschenen Petrischalen, Pipetten, Biretten, Kaniilen, Instrumente etc. werden in gecignete Behailter eingebracht. Fiir Petrischalen verwendet ‘man 2. B. zylindrische Petrischalenbiichsen mit enthaltenem Leichtmetall- stander (zur vereinfachten Herausnahme der Petrischalen), flr Pipetten entsprechende Pipettenbiichsen aus Glas mit Leichtmetallkappe oder aus Metall Falls derartige Behilter nicht zur Verflgung stehen, wickelt man die Gegenstinde in Aluminiumfolie oder in Papier (2. B. Zeitungen) cin — ‘wenn méglich, mehrere in kleinen Packchen abgepackt. Bei Pipetten auf dem Papierpackchen Seite des Mundsticks markieren. 2. Behilter oder eingewickelte Gegenstinde in den HeiGtuftsterilisator stellen und Temperatur ansteigen lassen. 3. Bei 180 °C 1h sterilisieren, falls Glas- oder Metallbehiier verwendet wer- den. In Papier cingewickelte Gerdtschaften miissen 2 h. bei 150 bis 160 °C sterlisert werden, um ein Verkohlen des Papiers zu verhindern. 4, Nach Ablauf der Sterilisationszeit Abschalten der Heizung und nach Ab- Kihlen Sterlisationsgut herausnehmen; bis zum definitiven Gebrauch in Behaltern bzw. in Papier eingewickelt lassen. ‘Anmerkamgen:: Rohrchen mit Metallverschlud (Kapsenberg-Kappen) und andere gut verschlossene Gefaie brauchen nicht in Behdlter gestellt oder eingewickelt 7u werden. ‘Anstelle eines HeiBluftsterlisators kann auch ein Trockenschrank brw. Trockenofen zur Sterilisierung verwendet werden. 4 Krei Methden 4”B6 Entkeimung durch Filtration Durch Filtration lassen sich Flissigkeiten mit hitzelabilen Bestandteilen ent- keimen oder Gase keimarm machen. Die ,Sterlfitration" fihrt zur Ent- fernung von Bakterien und Pilzen. Nicht zurickgebalten werden L-Formen von Bakterien, Viren sowie Stoffwechselprodukte von Mikroorganismen, Als Fil- termaterial konnen gesintertes Glas (Jenaer Bakterienfilter nach ScHoTT), lunglasiertes Porzellan (Chamberland-Filter), gepreSte Kieselgur (Berkefeld- Filter, Asbest (Seitz-Filter), dicht gepackte Watte (Watteflter) oder ver. schiedene synthetische Materialien (Membranfilter) cingesetzt werden. Zur ‘mechanischen Abtrennung von Mikroorganismen durch Jenaer Bakterienfilter ‘werden sogenannte RS-Filter verwendet (Porenweite 1,0 bis 1,6 jum). Die Ent- keimung durch Filtration mittels Jenaer Ganzglas-Bakterienfiltr (Filtrations- locke mit aufgeschmotzener Filternutsche) wird in folgenden Schritten durch- efor: 1. In Filtrationsglocke gecignetes Gef&B fiir das Sterilfitrat cinfahren (bei Bakterienfilter 117 R: 100-ml-Stelbrustflasche), das Ganze auf den Metall- boden mit Gummiring stellen und durch Einhiingen des Federverschlusses abdichten. 2, Seitlichen Absaugstutzen mit einem Wattebausch verschlieSen; oft wird zusitalich die Glasfiternutsche mit Aluminium- oder hitzebestindiger Plastfolie abgedeckt, die mit einem kleinen Gummiring befestigt wird 3. Sterilisierung der so vorbereiteten Filtrationsglocke 15 min bei 121 °C im ‘Autoklaven, 4, Sterilisierte Filtrationsglocke fiber Absaugstutzen an. Wasserstrahipumpe oder andere gecignete Pumpe — méglichst Uber AusgleichsgefaS mit Drei- wegchahn — anschlieBen. 5. Zu sterlisierende LOsung in Glasfilternutsche gieBen und Pumpe in Betrieb setzen. 6, Sobald Lésung filtriert ist, Purmpe abstellen (bei Olpumpen Dreiwegehahn am AusgleichsgefB vorsichtig éffnen und Vakuum langsam ablassen), Schlauch von Absaugstutzen entfernen (dabei nochmals Kontrolle des Watteverschiusses), 1. FederverschluB vorsichtig 6ffnen, AuffangefaS (Steilbrustflasche) mit ent- hhaltenem Sterifltrat herausgleiten lassen, Offnung sofort abflammen und mit sterlem Wattestopfen verschlieSen, 8. Reinigung des Ganzglasbakterienfilters sofort nach Benutzung, um cin Trockenwerden des verunreinigten Filters zu vermeiden. Zunichst Ab- spritzen der Filteroberfliche mit scharfem Wasserstrahl, anschlieBend mehr- fach mit destiliertem Wasser und nachfolgend méglichst noch mit heiBem ‘Aqua dest. durchspilen, LaBt die DurchfluBgeschwindigkeit stirker nach, ist cine Behandlung mit Schwefelsiure anzuraten. Dazu wird auf 100 bis 200 °C ethitzte konzentrierte Schwefelsiure, der ca. 1% Kaliumnitrat oder eine Mischung von gleichen Teilen Kaliumnitrat und Natriumperchlorat ‘mugesetzt wurde (Vorsicht, Verdtzungsgefahr'), in etwa S mm hober Schicht auf das Filter gegossen und angesaugt, bis die ersten Tropfen durchgelaufen sind. Nach cinigen Stunden Einwirkzeit (evtl. Ober Nacht) Sure volistindig, ‘Abb. 2 7. Miindung des Schrigagarrohrchens abflammen, Rahrchen verschlieBen. 8. 7 bis 10 Tage bei 25 °C inkubieren. Anmerhamgen In nicer Wee Konno sch Plten aus dem Scingeweb dr Fact per vou Gasteromyarten und aus Frichkorper oder Somat groltch ‘Askomyodten gewonnen werden, ne ‘dr ektomykorrhizabildende Pilze empfiehlt sich die Ubertr der Tramawiirfel auf Hagem-Agar (Vorschrift A 17). aang Isolierung von Bodenpilzen, welche keine Zoosporen bilden (Verdtinnungsplattenmethode — vgl. auch Vorschrift K 1) 1. 1000 ral steriles Wasser und mehrere sterile Pipetten bereithalten. 2. Eine Bodenmischprobe von 100 g nehmen, davon 20 g abwiegen, 3, 20g Boden in 200 mi sterilem Wasser suspendieren, gut umrihren und schiitten. Damit wird eine Verdiinnung von 1:10 erreicht. 4. I'l der Bodensuspension mit steriler Pipette aufnehmen und mit 500 ml sterile Wasser verdiinnen, schitteln. Damit ist eine Verdinnung 1:5000 erreicht 5. Iml dieser Suspension mit steriler Pipette aufnehmen und mit 20 ml ‘hoch fiissigem (50°C) Nabrboden (2. B. Malz-Agar, Maismehi-Agar, Fritchte-Agar) mischen und in Petrischalen gieSen, Man kann auch ‘Tropfen der Suspension direkt auf feste Nahrbéden in Petrischalen auf- 6. 4 bis 5 Tage bei 25 °C inkubieren. Um thermophile bei 40 bis 45 °C inkubiert werden. na 1. Myzel oder S| onidien) von jungen Pilzkolonien in : ‘alrchenGhetopias nn)" Sn Psotoin is Schrtenae Aamo: Jem Pletcingcalt dr Badenroe ret man mit Vrdtanunge von 1:25 i 1000 eer oc me: eet it er Art aie Jim Bakteenrcktun 2 terre, Koen den Apa Ane ragart werden (s. Vorschrift A 43). ner cé6 CT Isolierang von Bodenpilzen mit der Bodenplattenmethode nach WarcuP (1950) 1. Kleine Mengen der Bodenmischprobe in trockensteriliserte Petrischalen verteilen (etwa 10 mg Boden je Schale). Trockene oder stark tonhaltige Béden mit einem Tropfen sterilen Wassers vermischen. 2. In jede Petrischale 10 mi des sterilisierten und abgekiihlten Nahrbodens (@.B. Malz-Agar, Bodenextrakt-Agar, Kirschen-Agar) gieBen. Durch vor- sichtiges Schitteln die Bodenteilchen suspendieren, bevor det Nahrboden fest wird 3. Inkubieren bei 22 °C. ee it Diese Methode beginstigt das Auswachsen von sterilen Myzelien und von Pilzen mit sgeringer Sporulationskapazitit, welche mit der Verdinnungsplattenmethode gewohn- lich nicht erfabt werden. ‘Weniger effektiv und durch Férdsrung von Bakterien gefthrdet ist das Auf- iermein von Bodentelchen au festeAgarplatten. Bodenwaschtechnik zum Isolieren von Boden- und Rhizosphirenpilzen nach Petzoupt miindl. ; vgl. Gams & Domscx (1967) 1. Folgendes bereitstellen: a) 10] sterles Leitungswasser in Vorratsflasche mit Hahn und Keimfilter @i. ein Gummistopfen mit Bohrung, darin ein Glasrobr mit Watte). b) Sterile Petrischalen, jede mit 2 bis 3 Blatt Filterpapier ausgelegt. ©) 11 Chloramphenicol-Lasung (50 ppm), oder Oxytetracyclin-Lésung, coder Chlortetracylin-(Aureomyein-)LOsung, in Spitaflaschen, 4) Malz-Pepton-Agar (A. 38), CMC-Agar (A 35) und Bodenextrakt-Agar (A 34), jeweils in Petrischalen gegossen. 2. Apparat (Abb. 3) einige Minuten mit Alkohol (2. B. Methanol) desinfi- zieren. 3, 20g Boden auf das grobere Sieb (1,5 mm Maschenweite) geben. 4, 4 bis 61 Leitungswasser unter stindigem kréftigem Schiitteln durchlaufen lassen; dazu evtl. Schiittelmaschine benutzen. . 5. 1,51 steriles Leitungswasser unter Schitteln des Apparates nachlaufen lassen. 6. Riickstand auf dem feineren = unteren Sieb (0,5 bis 0,65 mm Maschen- weite) mit Chloramphenicol-Lsung aus der Spritiasche abspilen, und ‘war auf das Filterpapier in den sterilen Petrschalen. 7. Ubertragung einzelner Bodenpertikel a) Mineralteile (meist hell) ‘b) Ton-Humus-Komplexe (schwarzlich) ©) organische Reste 2. B. Wurzelfragmente mittels Pinzette oder stumpfer Glasnadel auf die genannten Nahrbdden, und zwar je Platte 4 Partikel 8, Inkubieren 3 Tage a) bei 15 °C, b) bei 20 bis 22°C. 9, Teile des Apparates mit Alkchol desinfizieren und wieder zusammen- schrauben. 7cs Glastenster ‘Austaut I Eintout ‘Sehiauch ‘Abb. 3 Untersuchung des Waschwassers (Arbeitsgang 5): 10. Je 1 ml in Petrischalen mit Malzagar, CMC-Agar und Bodenextrakt- Agar pipettieren. 11, Oberstand dekantieren. 12 Inkubieren 3 Tage a) bei 15 °C, b) bei 20 bis 22 °C. ‘Anmerkang’: Durch die Bodenwaschtcchnik werden vorringig die in Myzeiform exsticrenden, also physiologiach aktiven Bodenpilze erfaS, wibrend die Hefen tnd fungisatisch ge- ‘hemmten Keime (Konidien, Spore) ausgewaschen werden und dana mit den Arbelts- ingen 10 bis 12 aus dem Waschwasser soliert werden Kénnen, Isolierung bodenbiirtiger phytopathogener Pilze mit Kédern nach Semper & AmeLuno (1981) 1. Vorbereitung natiirlicher K dder: Teile gesunder Pflanzen mit Streptomycinsulfat (50 bis 100 ppm in sterilem Wasser) vorbehandein. Je nach Pilzart cignen sich: Kartoffelstiicke, Gurken- stiicke, Apfelstiicke, Wurzelstiicke, Getreidestroh (Internodien), Buchwei- zenstroh. 2, Vorbercitung kinsticher KBder: ‘Schaumgummistiicke mit Nahrlésung trinken und mit einer perforierten Deckachicht (zB, aus Paso) versiegeln. 3. Kéder auf Bodenproben legen und inkubieren. 4. Infizierte Kéder in cine feuchte Kammer bringen und zur. Bestimmung und Abimpfung des Pilzes beobachten oder auf Selektivndhrbdden mit Zusatz von Antibiotika (vgl. A 43) auslegen. Ameriong: Die Methodecignct sch fr Pie mit susreichendem saprophytchem Wachstum (Perthophyten, hemibiotrophe Parasiten). co c10 Isolierung von zoosporenbildenden Bodenpilzen (Chytridiomycetes, Oomycetes) 1, Ein Gefa8 mit sterilem Wasser und mehrere leere, sterile Petrischalen bereit- stellen. 2. Petrischalen mit armem Malz-Agar (Vorschrift A 37) vorbereten (oder Hefe-Stirke-Agar, Vorschrift A 19). 3, Samen von Kohl, Mais, Hanfu, a. kochen und zerdriicken, dann nebenein- ‘ander auf einer Seite einer leeren Petrischale auslegen. 4, Boden der Petrischale 2 bis 3 mm hoch mit sterilem Wasser bedecken. 5. Bine kleine Bodenprobe an den gegeniiberliegenden Rand der Petrischale legen (Abb. 4). Abb. 4 6. Die Kéder (Samen) mehrere Tage lang beobachten, bis sich auf ihnen Myzcirasea bilden. 7. Sporen oder Myzelsticke von den Kdemn in Petrischalen mit armen Malz- ‘Agar dbertragen. 8. Das auf den Agarplatten gewachsene Myzel in Schrigagarrhrchen Gber- impfen. ‘Anmerkungen: Dic Isolationsmethode berubt auf der aktiven Bewegung der Zoosporen von det ‘Bodenprobe zum Kéder. Statt Samen konnen auch tote Insekien als Kéder dienen. Isolierung und quantitative Bestinmung von Pythivn-Arten aus Bodenproben, s. Vorschrift C27, Isolierung von Cellulosezersetzern 1. Filterpapierscheiben entsprechend dem Durchmesser einer Petrischale aus- schneiden. 2. Petrischalen mit inliegenden Filterpapierscheiben autoklavieren. 3. Filterpapierscheiben mit autoklavierter Van-Iterson-Lésung (s. unten) ‘rinken. 9cul cnr 4. Darauf0,1 mi einer Verdiinnungsstufe des suspendierten Substrates (Boden Stroh, Heuprobe oder dg 5. Bei 28 °C inkubieren. ‘Van-Iterson-Lésung: 05g NaNO, 05g KHL, 1000 ml Leitungswasser Isolierung von keratinophilen Pilzen (Haarkédermethode nach VANBREUSEGHEM 1952) 1. Bodenmischprobe entnehmen. 2. Sterile Petrischalen mit leicht angefeuchteten Bodenproben bis zur halben Hohe fiillen. 3. Haarbilschel (Menschen-, Pferdehaar u, a.) in leeren Kulturrdhrchen sterili- sieren: entweder trocken oder im Autoklaven, vgl. Vorschriften B 3, 4, 5. 4. Die sterilen Haarbiischel auf den Béden in den Petrischalen auslegen, leicht andriicken. 5. Mehrere Tage bei 28 °C inkubieren. 6. Die Myzelien keratinophiler baw. keratinolytischer Pilze entwickeln sich auf den Haaren und werden von dort auf Sabouraud-Agar dbergeimpft. Anmerkungen: Je nach Art der verwendeten Haarkéder kOnnen unterschiedliche Pilzarten isolert Vorsicht: einige keratinophile Pilze kOnnen infekti’s fir den Menschen sein Jeder Kontakt der Pitze oder Impfgerte mit offenen Wunden ist zu vermeiden' Hinde Aesinfiieren (vg. B 2)! Isolierung und Kultur nematophiler Pilze 1, Petrischalen mit Maismehl-Agar (A 5) vorbereiten. Nematodenkultur (s. unten) bereithalten, 2. In einen Teil der Schalen werden Nematoden geimpft. 3. Bine Bodensuspension nach Vorschrift C 5 herstellen, Tropfen dieser Sus- pension werden auf den Agar mit den Nematoden aufgebracht. 4, Sobald sich Myzelien ausbreiten, ist mit dem Stereomikroskop zu pritfen, welche Myzelien Nematoden fangen (vel. Anmerkung). 5. Von derartigen Myzelien mit abgeflammter Impfnadel die groBen Konidien entnehmen, die sich an den Spitzen der Konidientriger bilden, und in die nematodenfreien Petrischalen iberimpfen. 6. Nach emeuter Konidienbildung Pilze mittels ihrer Konidien in Schrig- agarrohrchen mit Maismehl-Agar tibertragen. Kultur von Nematoden nach U. Kerstan, Greifswald 1. Einen Brei von 70 g Haferflocken, 4 g Zucker und 250 ml Wasser aufkochen lund abkiihlen lassen, in Gliser flllen (Schichthohe 1 bis 2 cm). ci13 cw 2. Von der Glaswand einer Nematodenkultur (2. B. Panagrellus redivivus) ‘Nematoden mit einem Spatel abnehmen und auf den frischen Brei geben, oder von der Oberflache der vorherigen Kultur mit einer Pipette Brei mit Nema- toden entnehmen und reichlich auf den frischen Brei auftropfen. ‘Anmerkungen: ‘Nematodenfangende Pilze (rduberische Pilz, .predacious fungi“) — es handelt sich _meist um imperfekte Pilze — leben in Kompost, Mist und in den an faulen Blatter rei- ‘chen oberen Bodenschichten. Bei Anwensenheit von Nematoden bilden sie klebrige ‘Hyphennetze, kontraktile Hyphenschlingen oder andere Fangorgane. Diese Pize kén- ren auch obne Nematoden leicht kultiviert werden, aber um ihre Fangorgane zu de- ‘monstrieren, missen sie abermals auf Agarplatten mit Nematoden Obertragen werden. Eine abgewandelte Isolationsmethode (Dowe 1972) besteht darin, Bodenpartikel direkt auf einen Sektor von Wasser-Agar aufzukrimeln, welcher in einer Petrischale sit Maismehlagar umgossen wird; letzterer wird mit Nematoden beimpft. Nemato- phil Pilze dberbricken den Wasseragar, wihrend andere Bodenpilze unterdrickt werden. Isolierung des ,,Kerosinpilzes“ aus Béden nach PaRBERY (1967) 1. Bodenmischprobe nehmen an Orten, wo Dieseltrebstoff u. dgl. versickert: neben Tankstellen, Parkplitzen, Autobahnen. 2. Bodenprobe in Petrischalen vercilen. 3. Streichhdlzer dekapitieren und 24 h mit Kreosot trinken. 4, Je Petrischale 2 getrankte Holzchen auf die Bodenprobe legen und an-

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