BÀI 1: CÁC THAO TÁC CƠ BẢN TRONG NUÔI CẤY MÔ

1. Mục đích: Giúp cho học viên làm quen với các thao tác và các thiết bị trong phòng nuôi cấy mô.
2. Nội dung:
 Làm quen với các dụng cụ và thiết bị của phòng nuôi cấy mô
- Chuẩn bị khử trùng dụng cụ:
Kẹp, dao, giấy được gói bằng giấy và khử trùng khô bằng nhiệt ở 2500C trong 2 giờ
- Chuẩn bị hoá chất khử trùng:
Cồn 700C được đo bằng cồn kế, dung dịch HgCl2 0.1%
Chuẩn bị nước khử trùng
Chuẩn bị keo lọ khử trùng
 Chuẩn bị dung dịch gốc của môi trường nuôi cấy MS
Pha dung dịch gốc: Dung dịch gốc gồm các loại khoáng đa lượng và vi lượng, FeEDTA, vitamin, chất
điều hoà sinh trưởng thực vật
 BÀI 2: VI NHÂN GIỐNG (Giai đoạn 1)
1. Mở đầu
Kỹ thuật vi nhân giống được Morel phát hiện vào năm 1960. Vi nhân giống là một phương pháp nhân
nhanh số lượng cây trồng bằng cách sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô.Quá trình vi nhân giống đã được
Debergh và Zimmerman (1991) chia ra làm 4 giai đoạn khác nhau, mỗi một giai đoạn có một chức năng
riêng. Sự thành công của công tác vi nhân giống tuỳ thuộc vào tất cả các giai đoạn.
In vivo: Giai đoạn 0. Giai đoạn chuẩn bị cây mẹ.
In vitro: Giai đoạn 1. Giai đoạn thanh trùng mẫu
Giai đoạn 2. Giai đoạn nhân số lượng cây con
Giai đoạn 3. Giai đoạn tạo rễ tiền thuần dưỡng
In vivo: Giai đoạn 4. Giai đoạn tiền thuần dưỡng
2. Phương tiện, phương pháp
2.1 Phương tiện:Vật liệu, hoá chất, dụng cụ
- Chồi cây lá cảnh có mang nhiều mầm ngũ (cây gì )
- Dung dịch khử trùng mẫu: Chlorox (NaOCl), Clorua thuỷ ngân (HgCl2)
- Dung dịch vệ sinh buồng cấy: Ethanol(70% v/v)
- Môi trường nuôi cấy: Môi trường MS có bổ sung BA (2mg/l), NAA(1mg/l), sucrose(30g/l),
agar(8g/l).
- Dụng cụ: Keo đã khử trùng, beaker 600ml, kẹp giấy, dao nhỏ…
2.2 Phương pháp
Chọn chồi cây lá cảnh mang nhiều mầm ngủ. Quá trình khử trùng mẫu được thực hiện theo các bước sau:

Mẫu cấy được lấy từ
chồi non cao khoảng
10cm mang các mầm
ngũ trên thân nằm
dưới mặt đất.
Dùng kẹp gấp mẫu cấy đưa vào
trong keo chứa môi trường nuôi
cấy MS đã được khử trùng.
Cắt bỏ rễ dài, lột bỏ lá còn dính
bẩn, rửa với nước máy trong 10
phút, ngâm với xà phòng khoảng
30phút. Sau đó rửa mẫu thật
sạch .
Trước khi cấy dùng cồn 700C để
vệ sinh tay, dùng kẹp gấp mẫu
cấy rồi dung dao cắt bỏ 2 phần
đầu của mẫu cấy vì đã bị tổn
thương trong quá trình rửa mẫu.
Sau đó cắt mẫu ra thành những
khoanh mang mầm ngũ.
Mẫu được đưa vào buồng cấy và
cho vào trong keo khử trùng bằng
Clorox 10-20%, với 20ml Clorox
+ 80ml nước cất lắc đều trong 20
phút. Sau đó rửa lại 4-5 lần với
nước cất đã khử trùng.
Mẫu được ngâm với Clorua thuỷ
ngân (HgCl2) 1% trong 10 phút,
rửa mẫu 4-5 lần với nước cất khử
trùng. Chuyển mẫu sang 2 keo
khác để tiến hành cấy.

3. Thảo luận
BÀI 3: VI NHÂN GIỐNG (giai đoạn 2)
1. Mở đầu
Quá trình vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai đoạn khác nhau,
mỗi giai đoạn có một chức năng riêng. Giai đoạn 2 là giai đoạn nhân số lượng cây con. Có hai cách
để nhân nhanh số lượng cây con. Cách 1 là kích thích sự phát sinh các chồi chính, chồi bên(mầm
ngũ). Cách 2 là sử dụng cytokinin như là chất kích thích sự phát sinh nhiều chồi.
2. Phương tiện, phương pháp
2.1 Phương tiện: Vật liệu, hoá chất, dụng cụ
- Chồi của các cây in vitro.
- Môi trường nuôi cấy đã được chuẩn bị từ bài thực tập 2.
- Kẹp giấy, dao nhỏ, kéo.
2.2 Phương pháp
 Khảo sát khả năng tạo chồi của các vị trí trên mẫu cấy
Trước khi cấy phải vệ sinh tay bằng cồn 700C, lau, chùi buồng cấy bằng bông gòn có thấm
ethanol 70% (v/v). Cây con in vitro được cắt bỏ rễ và lá, sau đó chia ra thành 3 phần: gốc, đoạn chứa
mắt và chồi ngọn. Cấy mẫu vào môi trường 1 là môi trường MS không có chất điều hoà sinh
trưởng(mẫu đối chứng).
 Khảo sát hiệu quả của BA lên sự tạo chồi.
Mẫu cấy là phần gốc chứa mắt, nguyên cây hoặc chồi ngọn. Mẫu được cấy vào môi trường 2 là môi
trường MS có bổ sung BA và NAA.
 Pha môi trường cho bài thực tập 4 bao gồm 2 loại môi trường:
+ Môi trường 1 (Đối chứng): Môi trường MS được bổ sung sucrose (30g/l), agar (8g/l) và than
hoạt tính (2g/l).
+ Môi trường 2: Môi trường MS có bổ sung NAA(1mg/l), sucrose(30g/l), agar (8g/l) và than hoạt
tính(2g/l).
3. Thảo luận
BÀI 4: TẠO RỄ VÀ THUẦN DƯỠNG CÂY CON TRONG VI NHÂN GIỐNG (giai đoạn 3 và 4)
1. Mở đầu
Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành 4 giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn
có 1 chức năng riêng. Giai đoạn 0,1,2,3,4, ở giai đoạn 3 là giai đoạn tạo rễ giúp tạo thành cây hoàn chỉnh
và chuẩn bị thích nghi với môi trường bên ngoài. Giai đoạn 4 giúp cây thích nghi với môi trường bên
ngoài.Đây là giai đoạn quan trọng trong nuôi cấy mô, vì giai đoạn này là thành quả của một qui trình nuôi
cấy. Môi trường nuôi cấy trong giai đoạn này thường không có chất điều hoà sinh trưởng. Nếu có chất
điều hoà sinh trưởng được cho vào chủ yếu là auxin. Sự khác nhau giữa điều kiện ngoại cảnh của chai
nuôi cấy với điều kiện ngoại cảnh tự nhiên là rất lớn.Các cây con cần giai đoạn chuyển tiếp để thích nghi.
Việc thích nghi này sẽ giúp gia tăng tỉ lệ sống của cây là rất lớn.

2. Phương tiện, phương pháp

2.1 Phương tiện: Vật liệu, hoá chất, dụng cụ
- Cây lan hồ điệp
- Hoá chất khử trùng, thuốc bảo vệ thực vật
- Đất, tro trấu, mụn dừa, phân rơm, bọc nylon lớn.
- Khay trồng cây, thau nhựa
- Kẹp dài
2.2 Phương pháp
 Tạo rễ cây con
Xác định môi trường ra rễ cho cây con. Chồi cây in vitro được tách ra từ cụm chồi và cấy vào môi
trường đã được chuẩn bị trước. Môi trường không có auxin và môi trường có axin.
 Thuần dưỡng cây cấy mô.
Lấy cây…….từ trong keo ra, tách rời từng cây rửa sạch môi trường bám xung quanh cây. Khử trùng
cây với hoá chất bảo vệ thực vật hoặc nước vôi. Đặt cây vào trong chậu, khay có chất nền. Sau đó trùm
kín chậu hoặc khay lại, để chậu hoặc khay vào nơi mát (cường độ ánh sang 2000-4000 lux) ẩm độ >80%.
Sau 7-10 ngày mở miệng bao ra để có sự thích nghi với ẩm độ không khí tự nhiên, sau 15 ngày có thể lấy
bao plastic ra và để cây thích nghi trong điều kiện ánh sang thấp. Sau đó tăng dần cường độ ánh sáng lên.
3.Thảo luận
 BÀI 5: GHI NHẬN SỰ PHÁT SINH CÁC DẠNG CẤU TRÚC (CALLUS, CHỒI, CỤM CHỒI, PHÔI
VÔ TÍNH)
1. Mở đầu.
Trong quá trình nuôi cấy mô có rất nhiều dạng cấu trúc thực vật được hình thành. Các cấu trúc có thể
biến đổi lẫn nhau tuỳ theo môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của các chất điều hoà sinh trưởng
khác nhau. Callus là cấu trúc vô định hình được sử dụng cho nhiều mục đích khác nhau. Chồi bình
thường thường được áp dụng trong vi nhân giống. Cụm chồi là nhiều chồi phát sinh từ một chồi ban
đầu hoặc từ callus. Phôi vô tính thường được phát sinh từ callus.

2. Phương tiện, phương pháp

2.1 Phương tiện: Vật liệu, dụng cụ
- Callus cây họ cam quýt
- Phôi vô tính của các cây họ cam quýt
- Chồi cây cảnh
- Cụm chồi cây lan
- Kính lúp(100X)
2.2 Phương pháp
 Quan sát callus
Callus là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hoá dưới
những điều kiện đặc biệt (vết thương, xử lý các chất điều hoà sinh trưởng thực vật).
 BÀI 6: NUÔI CẤY ĐỈNH SINH TRƯỞNG
1. Mở đầu.
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng nhằm phục hồi cácgiống cây trồng nhiễm virus. Kỹ thuật nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng đã được ứng dụng đầu tiên bởi Holmes (1948,1955). Sau đó Morel và Martin (1955) đã
thành công trong việc phục chế cây khoai tây nhiễm virus. Kể từ đó cho đến nay các nhà vius học
thường áp dụng công nghệ này để phục hồi các giống cây trồng đã nhiễm virus.
2. Phương tiện, phương pháp
2.1 Phương tiện: Vật liệu, hoá chất, dụng cụ
- Cây Huệ( Polianthes tuberose).
- Dung dịch khử trùng Clorox (NaOCl) 10% (v/v), Clorua thuỷ ngân (HgCl2 1%)
- Ethanol(70%v/v) để vệ sinh buồng cấy
- Nước cất vô trùng
- Kính lúp (100X)
- Chai đã khử trùng
- Beaker 600ml
- Kẹp giấy
2.2 Phương páp
Chọn các chồi cây huệ. Quá trình khử trùng mẫu được thực hiện theo các bước sau:

Cắt bỏ bớt những lá không cần Mẫu được ngâm với Clorua
Mẫu được đưa vào buồng cấy và
thiết, rửa với nước máy trong 10 thuỷ ngân (HgCl2) 1% trong
cho vào trong keo khử trùng bằng
phút, ngâm với xà phòng khoảng 10 phút, rửa mẫu 3 lần với
Clorox tỉ lệ 1:1 trong 30 phút,
30phút. Sau đó rửa mẫu dưới vòi nước cất khử trùng. Chuyển
sau đó rửa lại 3 lần với nước cất
nước chảy thật mạnh trong 15-30 mẫu sang 2 keo khác để tiến
đã khử trùng.
phút thật sạch . hành tách lấy đỉnh sinh
trưởng.

Khi đỉnh sinh trưởng chỉ còn mang 1-2 phác thể lá thì Dùng cồn 700C để vệ sinh tay, dùng kẹp để gấp và
dùng dao mũi nhọn để tách đỉnh sinh trưởng ra và đưa giữ mẫu vật sau đó dùng dao để tách bỏ các lá dưới
ngay vào trong keo chứa môi trường nuôi cấy MS đã kính phóng đại. Đầu dao phải được khử trùng
được khử trùng. thường xuyên trong quá trình thao tác.

3. Thảo luận