Pruebas Bioquimicas para la Identificacion . 7 ~v. de Bacterias de Importancia ClinicaTitulo del original en ingles BIOCHEMICAL TESTS FOR IDENTIFICATION OF MEDICAL BACTERIA 3th edition, © 2000 Lippincott Williams & Wilkins, Inc. Estados Unides. Published by arrangement with Lippincott Willians & Wilkins, Ine © Libermed Verlag S.A. - Montevideo, Uruguay Traduccion de EDITORIAL MEDICA PANAMERICANA S.A. por los doctres Silvia Rondinene y Octavio Giovanniello Los editores han hecho todos fos esfuvezos para ocalzar a los poseedores del copyright del material fuente utilizao. Si inadvertida mente hubseran omitido alguno, con gusto hanin Ice arreglos nevesrios en la primera opontinidad que se les presente par tal fin ‘La medicina es una ciencia en permanente cambio. A medida que las nuevas invesigaciones y la experiencia clinica amplian nues- ‘w comcimienty, se requieren madicacione as tnexaldatesterayeuticas yen los tratamentosfarmnacoleyicus. Los autores de es- ca obra han verifcado tox a informacion con fuentes confizbles para asegurarse de. sea completa y acorde con los estindares taobrahi do tox fa ara asequrars de que és sea completa y acode con los etn aceptales en el momento de la publicacidn. Sin embaryo, tars wiser de a pen talc ator eo cakgier ora peor ia ; ; thos cbtenidos del uso de esta informacion. Se aconsejaa los letoreseoninmarla con ora fuentes Por Gjemplo, yen particule, ‘Srvc lor lectore revine el prespecto de cada Farmaco que en este lbrosea correcta y que no seayan proucido cambios en ror hurnano o-de cambios en las clencias en la preparacigin o la publieactin de este trabajo, garanti confirmarla eon otras fuentes. Por ejemplo, yen particub sn adrministrar para cerciorarse de que [a snformacion conten sis sugeridas o en las convraindicaciones pats st amiisteacion, [Eres recomendacign cobra epectal imponanci con relacin a fimacos nuvos 0 de uso infrocuents Gracias escudiante, EDITORIAL MEDICA, C panamericana ) ‘Visite nuestra pigina web: hhup://vww.medicapanamericana.com ARGENTINA Marcelo T. de Alvear 2145 (C1122AAG) - Buenos Aires, Tal: 20 | 2066 | Fax (54-11) 4821-1214 e-mail: info@medicapanamericana.com COLOMBIA. Garrera 7a A N® 69-19 » Santa Fe de Bogor DC. Tela (57-1) 235-4068 / Fax: (57-1) 345-0019 e-mail: info@medicapanamertcana.com.co ISBN 950-06-1572-X 84-7903-189-X IMPRESO EN LA ARGENTINA, Hecho el depésto que dispone la ley 11.723, Fetes os ec ep ‘ te libro o cualquiera de sus partes no podin ser reprochicidos ni archivados en ni transmitidos en ninguna forma o por ningsin medio, Jem mecinic oclecronkos,frosopitort saciones o cualquier otro, sin el permiso previo SeEdiorial Melica Panamericana SA. ©2003. EDITORIAL MEDICA PANAMERICANA S.A. or comprar el original. Est libro es proxlucto del esfuerzo de profesionales como usted, o de sus profesores, si usted es fenga en cuenta que forocopiarle es una fata Ge respeto hacia elles ¥ un r0b0 de sus derechos intelectusles. ESPANA Allberto Alcocer 24 (28036) - Madrid, Espaiia Tels (34)91 1317800 / Fax: (34)91 1317805 ‘e-mail: info@medicapanamericana.es MEXICO. Calzada de Tlalpan N° 5022 entre Tesoquipa y Michoacin Colonia Le Joya - Delegacidn Tlalpan - 14090 - México D.E “Tels (52-55) 5573-2300 / Fax: (52-55) 655-0381 e-mail: infomp@medicapanamericana.com.ms VENEZUELA Edificio Polar, Torre Oeste, Piso 6, Of 6-C Plaza Venesucla, Urbanizacién Los Caobos, Parroquia El Recreo, Municipio Libertador - Caracas Depto. Capital Tel ( 3-285716906/5985/ 1666 85 email: info@medicapanamericana.com.ve Marcelo T. de Alvear 2145 - Buenos Aires - Argentina EDITORIAL MEDICA PANAMERICANA S.A. Alberto Alcocer 24 - Madrid - Espaita Esta edicidn se terminé de imprimir enel mes de enero de 2003 cn los talletes de Compaiia Grafica Internacional S.A. ‘Av. Amancio Alcorta 1695, Buenos Aires. ArgentinaContenido Prefacio vii Laminas color 805 SECCION 1. PRUEBAS BIOQUIMICAS INDIVIDUALES 1. Pruebas de hacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 3 2. Pruebas de hidrilisis de bilis y esculina 8 3-Pruebas de solubilidad en bilis 25 4, Pruebas (reacciones) de CAMP/ CAMP inversa y prueba de_inhibicién CAMP. (produccién de fosfolipasa D) 33 5. Prucha cid e carbono 54 6. Pruebas de catalasa y peroxidasa B TL Preba de citraio oa 8. Prueba _de coagulasa 98 9, Pruebas _de descarboxilasa Tisina-omitina-arginina) y prueba de dihidrolasa (arginina) 113 10. Prucbas de desoxirribonucleasa (DNasa) y termonucleasa (TNasa) 128 11, Pruebas de -galactosidasa (ONPG v PNPG) 151 12, Pruebas de licuefaccién de la gelatina 160 13, Prueba de oxidacion del gluconato 172 14, Prueba de hidrdlisis del hipurato 15. Prueba de dicido sulfhidrico Lo, Prueba de indol 18. Pruebas en agar con hierro de Kligler/ triple azticar y hierto 19, Prueba de B-lactamasa 20 Prucha de lecitinasa 21, Prucba de leucina aminopeptidasa (leucina arilamidasa) (LAP) 263 22. Prueba de lipasa 267 23. Prueba de leche tomasolada 275 (25 Prucha de malonat 26. Prueba de reduceién de la leche del azul de metileno para enterococos 27. Prueba de rojo de metilo 28. Prueba de movilidad 29. Pruchas de utilizacién de hidratos de carbono para Neisseria 30. Pruebas de reduccidn de nitratos /nitritos 31. Prueba del disco de optoquina 32. Prucha de oxidas 33, Prueba de oxidacién-fermentacién 34, Prueba de fenilalanina desaminasa 35, Prueba de fosfatasa 36. Prueba de porfirina- écido 8-aminolewulinico (ALA) 37, Prueba de hidrdlisis de pirrolidonil-B-naftilamida (PYR) 38. Prueba de hidrdlisis del almidon 239, Prueba de ureasa 40. Prueba de Voges-Proskauier 1. Factores X y V Copyrighted materialXindice 42. Sistemas de pruebas multiples 427 SECCION Ill, ESQUEMAS DE IDENTIFICACION 43, Bacterias grampositivas 44, Bacterias gramnegativas 45, Familia Enterobacteriaceae grammegativas y otras bacterias intestinales gramnegativas /SECCION IV. APENDICES 1, Resultados forograficos 745, 3. Indicadores de pH 159 4. Correcciones de pH 760 6. Preparaciones de reactivos 766 7, Sindnimos comunes en la terminologfa de los medios de cultivo 780 ‘8. Tamaio estdndar de los tubos de prueba para bacteriologia 781 9. Conversiones de temperatura 782 10. Colecciones de cultivos: cultives de referencia 783 11, Direcciones de proveedores comerciales 789 12. Glosario 01 SECCION V. INDICES ANALITICOS L General 827 2. Microorganismos 839ww @ SECCION + tm, @ 2. Pruebas bioqui individualesfr @ « CAPITULO , Pruebas de bacitracina/ sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 1. PRINCIPIO Determinar la sensibilidad de un microorganismo a la ba metoprima (SXT) aacina o@ bacitracina y sulfametoxazol-tri- I, OBJETIVO: (Véase también cap. 43) A. Diferenciacién presuntiva de estreptococos B-hemoliticos del grupo A de oiros estreptococos B-hemoliticos B. Ayudar a descartar los estreptococos no A y no B que pueden ser susceptibles a la bacitracina (5). La precisiGn de la prueba de la bacitracina se mejora por el uso de la sensibilidad a un disco de SXT en combinacién con la bacitracina. El agregado de SXT junto con la bacitracina aumenta la sensibilidad y e| valor predictivo de la prueba de la bacitracina. Las sensibilidades de bacitracina/SXT todavia se emplean en los laboratorios donde no se dispone de pruebas confiables para la agrupacién serolégica. Una prueba mas especifica para identificar los estreptococos del grupo A es la prueba PYR (hidrlisis de la pirrolido- nil-B-nattilamida): es mejor para la produccién de la enzima piroglutamil amidasa (véase cap. 38). I, BIOQUIMICA Bacitracina La bacitracina, un antibistico aislado por primera vez a partir de Bacillus licheniformis (antes B. sub filis), pertenece a una clase de antibisticos que inhiben la sintesis de la pared celular bacteriana. La baci tracina es un antibictico peptidico compuesto por aminosicidos unidos por enlaces peptidicos. cs 5 \ PSs co At I Cy NH, N- cH—co— Lev D-Asp | Phe — fenilalanina | Sai his — histigina é am fep a espana D-Phe-L-His-L-Asp i lys — lisina | Leu — leucina Llleu-D-Orn-L-Lys Om = ornitina Bacitracina A Residuo de isoleucina y de cisteina, condensado para formar un anillo de tiazal (A) en lugar de la unibn peptidica habitual de un polipeptido4 Pruebas bioquimicas individuales La bacitracina inhibe la sintesis de la pared celular, una estructura rigida que encierra la célula micro- biana. EI esqueleto fundamental consiste en una estructura tridimensional compleja que contiene pepti doglucano, una macromolécula (mucopéptido 0 glucopéptido o mureina), y otros polimeros (p. ej. poli- sacaridos, lipoproteinas) que difieren en los distintos tipos de bacterias (7). La rigidez final de la pared celular es impartida por entrecruzamientos de las cadens peptidicas y la capa del peptidoglucano es mu- cho més gruesa en la pared celular de las bacterias grampositivas. La bacitracina inhibe una fase tempra- nan la biosintesis del peptidoglucano; inhibe la desfosforilacién de un pirofosfato lipidico, un paso esen- cial para la sintesis de la pared bacteriana (10), ¢ inhibe el reciclado de ciertos metabolitos requeridos para mantener la sintesis del peptidoglucano (7). Los peptidoglucanos consisten en filamentos de polisacdridos Iargos interconectadas por cuatro ami- nopéptidos en los que el tercer aminodcido es variable. La forma de interconexién entre las cadenas pep- tidicas difiere entre fas especies bacterianas. Existen dos clases de inhibidores de la sintesis de la pared celular: los inhibidores de la sintesis del pepti- doglucano (p. ¢j.. bacitracina) y los inhibidores de la sintesis o ensamblado de otros components de la pared. La bacitracina es a) bactericida, b) inactiva contra las células en reposo, y c) inactiva contra bacterias que carecen de pared celular. La bacitracina es bactericida durante el crecimiento, ya que las enzimas Ii- ticas ubicadas cn la parte interna de la pared celular abren Jas cadenas de! peptidoglucano para formar “extremos libres”. La pared celular luega se rompe y el citoplasma fluye hacia el exterior (7). La bacitracina es inactiva contra las células en reposo. Las enzimas Iiticas asociadas con la sintesis de Ja pared celular son activas sélo cuando las células estén en fa etapa de crecimiento, no cuando esti reposo (7); por lo tanto, los inhibidores de la sintesis de la pared celular son inactives contra las bacte- rias en la fase estacionaria (7). La bacitracina A bloquea la fosforilasa que libera uno de los dos fosfatos terminales de! lipido trans. portador, el cual no puede funcionar entonces como un aceptor del muramilpentapéptido. La bacitracina no es especifica, también puede inhibir otras reacciones de la fosforilasa (7). Trimetoprima (TMP) La TMP (3.4,5-trimetoxibeneil pirimidina) inhibe la reductasa del 4 estructural de la pirimidina de la fraccién pteridina del écido dihidrof6lico que inhibe la enzima reducta- sa, lo que en consecuencia interfiere con el metabolismo del dcido fético, la posterior sintesis de pirimi- dina y cl metabolismo del fragmento de un carbono en la bacteria (10), wa Ny TO ns ~ CH, Trimetoprima Slico, Ex un andloge La TMP inhibe la enzima bacteriana pero no la enzima de los mamiferos. Sulfonamidas. Las sulfonamidas derivan de la sulfanilamida S0,NH— Estructura del anilio basico de las sulfonamicasPruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 5 Sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) La SXT inhibe de manera competitiva la modificacién bacteriana del écido p-aminobenzoico en dihi- drofolato, La inhibicién secuencial del metabolismo del folato impide por Gltimo la sintesis del DNA bac- teriano (3). Dado que el sulfametoxazol (SX) y la TMP bloquean Ia via metabélica del Acido félico bacteriano en sitios diferentes, juntos producen e! bloqueo secuencial, lo que determina un marcado incremento (siner- gismo) de la actividad (3, 4), Acido para-aminobenzoico inhibido por el sulfametoxazol Dihidroptorcato — |<-- sintelasa, ¥ DinisFofolato | Dinidrofotato reductasa - inhivido por la timetoprima Tetrahidrotolato Sintesis de Acido nucleico Mecanismo de accion de SMX-TMP (9). Via metabolica det acido félico bacteriano Cuando una poblacisn bacteriana homogénea es tratada de manera simulténea con dos antibiotic pueden ocurrir tres tipos de resultados: a) sinergismo, b) suma y c) antagonismo. En el sinergismo, el efec- 10 antibiético de la combinacién es mayor que la suma de los efectos de cada antibistico individual. El yergismo se debe al denominado bloqueo metabslico doble. REACTIVOS EMPLEADOS A. Discos diferenciales de bacitracina 1. Discos comerciales Taxo A (BD Biosciences: véase Apéndice 11), 2. 0,04 unidades; los estreptococos del grupo A son susceptibles a una concentracién baja de bacitracin, 3. Inhibe Ja mayoria de las bacterias orales. B. SXT (cotrimoxazol) es una combinacién de dos antibi 1. Discos comerciales disponibles a, SX: 23,75 ig b. TMP: 1,25 ne 2. Suprime el crecimiento de la mayor parte de la flora normal en los cultivos de fauces que incluyen los estreptococes viridans jicos V. PROCEDIMIENTOS. A, Procedimiento 1 Medios de cultivo: places de agar con sangre de carnero (SBA) no selectivas Con una aguja de inoculacién, seleccionar y tomar 3-4 colonias puras de estreptococos B-hemolitices. Estriar el inéculo hacia abajo en el centro de una mitad de una placa de Petri y sembrar por pun- ci6n en la profundidad del medio unas pocas veces para observar la hemdlisis por debajo de la su- perficie (subsuperficial). 4. Con un hisopo oun ansa bacteriolégica estériles, diseminar el inéculo sobre la totalidad de la mi- tad de la placa. eee6 Pruebas bioquimicas individuales De manera aséptica, colocar e! disco de bacitracina Taxo y un disco de SXT en el drea inoculada; colocar los discos equidistantes. Con una pinza flameada, presionar con suavidad los discos para que se adhieran al agar. Incubar las placas de modo invertido (Jas tapas hacia abajo), 18-24 h, 35°C, 5-10% CO. si los re- sultados son negativos, reincubar otras 24 h, B, Procedimiento 2 1 2 3 Kurzynski y col. ( Medios de cultivo: selectives, placas de triptica (SB). Férmulas de Gunn, Ohashi, Gaydos y Holt (2). Soluciones stock a. Solucién T: 0,125 g de TMP en unos pocos mililitros de HCI 0,1 N, Hevar a 50 mL con agua destilada, b. Solucién $X: 2,375 g de SX en unos pocos mil destilada, ¢. Solucién SXT: Mezelar partes iguales de soluciones SX y T: concentraciones combinadas fina- sa Soja agar (TSA) (TSA-SXT) con sangre de camnero itros de NaOH 1,0N, levar a 50 mL. con agua les. 25 g/mL. Guardar de manera no estéril en alicuotas de 6 mL; congelar a 20°C. Medio completo TSA 1.000 mt Soluci6n de SXT tink después de la esterilizacién (121°C, 15 Ib, 15 min) agregar Sangre de camnero, 7%, estéril, desfibrinada, 70 mi Almacenar en bolsas de plistico en el refrigerador, 10-15°C hasta una semana. . 6), establecieron que el medio TSA-SXT es superior al medio no selectivo conver cional para la recuperacion de estreptococos del grupo A dentro de fas 18-24 h: es aceptable para la recu- peracin de los estreptococos del grupo A. 6. Distribuir en placas de Pet ) mL/placa (15 x 100 mm) 7. Seleccionar 3-4 colonias puras de estreptococos f-hemoliticos 4. Con ansa bacteriolégica o hisopo estéril, estriar pars obtener un desarrolio confluente: sembrar va rias veces por puncign en kt profundidad de! medio parc la observacion de hemdlisis subsuperticial b. Colocar de manera aséptica un disco de bucitracina Taxo sobre el area inoculada, cc. Con una pinza flameada, presionar con suavidad los discos para que se adhies agar 8. Incubar las placas de modo invertido (las tapas hacia abajo), 18-24 b, 35°C, 510% CO,; si los re- sultados son negativos, reincubar 24 h adicionales, Vi. MICROORGANISMOS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE CALIDAD A. Bacitracina sensible (S): Sepiococeus pyoeenes ATCC 12344. B. Bacitracina resistente (R): Streptococcus agalactiae grupo B ATCC 13813. Vil. RESULTADOS, ‘Véanse figuras 1-1 y 1-2 (Apéndice 1) para los resultados fotograicos en color. |. INTERPRETACION Discos de Bacitra t cina/SXT 0 hacitracina en e! medio de cultive TSA-S Sensible (S, Sen, sensible), 2. Cualquier zona alrededor del disco; crecimiento inhibido. b. Informar: estreptococos B-hemoliticos presuntivamente del 2 tracina, spo A por la prueba de Ia baci-Pruebas de bacitracina/sulfametoxazol-trimetoprima (SXT) 7 a, Ninguna zona alrededor del disco: crecimiento hasta el disco y alrededor de él b. Informer: estreptococos -hemoliticos que presuntivamente no son del grupo A por la prueba de la bacitracina. Cuadro 1-1. interpretaciones de! disco bacitracina/SXT Bacitracina__SXT Identifcacion presuntva Estreplococes i-hemolitica del grupo A Estrepiococos [3-hemoliticos del grupo 8 Estreptococos [i-hemoliticos que no pertenecen a los grupos Ao B Descartar grupo A 0 B con las pruebas serol6gcas onnn oonn (Nota: La interpresacién de la sensibilidad del SXT puede ser dificil ya que el microorganismo puede presentar un leve crecimiento antes de que ocurra la inhibici6n total (4).) La incubacién en anaerol aumenta 1a deleccion de cepas de estreplococos del grupo A que sélo producen esireptolisina O oxigeno ibil e inhiben gran parte de la flora normal (8). Ne deben medirse las zonas de inhibicion. Las colonias B-hemoliticas en el medio de TSA/SXT y las zonas de hemilisis son mas pequefias que cuando desarro- lan en el medio no selectivo SBA. IX. PRECAUCIONES A. Algunos estreptococos que no son del grupo A tambign pueden ser inhihidos por la bacitracina; por to tanto, con frecuencia se realiza una prucba junto con la prucba de sensibilidad al SXT. B. La prueba de la bacitracina es bastante exacta como una prueba presuntiva pero no es altamente es pecifica (5). Mas de 10% de los estreptococos de los grupos C y G y 5% de las cepas del grupo B tam- bien son sensibles a ta bacitracina (5). C. Sélo deben ser investigados los estreptococos B-hemoliticos ya que muchos estreptococos B-hemoli- ticas (incluso $. prewmoniae) son sensibles a concentraciones bajas de bacitracina (5). Streptococcus cricenus, S. downei, S. ferus y 8. macacae también son sensibies a la bacitracina pero raras veces son aislados a partir de infecciones humat D. El crecimiento del inécuto bacteriano debe ser confluente: un inGculo demasiado eseaso produc los estreptococos que no son del grupo A parezcan sensibles a la bacitracina (1), E. Nose recomienda un cultivo de fauces para la ineculaciéa ya que fa flora norma} puede inhibir en par- te el desarrollo de los estreptococos del grupo A. sobre todo en las areas de crecimiento mais confluen- te (5). F, No utilizar positivo (+) y negative (~) para indicar Jos resultados: utilizar ka denominacién $ (sen ble. susceptible) y R (resistente). Los términos positive y negative podrian denotar crecimiento 0 au- sencia de crecimiento en la placa pero no necesariamente alrededor del disco REFERENCIAS 1, Facklam RR, Thacker LG, Fox B. sumplive identification of streptococci with test system, J Clin Microbiol 1982:15(6»: 9 . Gunn BA, Ohashi DK. Gaydos CA, Holt Eriquer |. Pre- 6. Kurzynskif, Meise C, Van Holten C, Evaluation of techmiques for isolation of group A streplocecet from throat cultures, J Clin Microbiol 198]:13(5) 891-894 tive and of group Aan B strep- 7, Lancini G, Parenti. Antibiotics An Integrated View tococci from throat cultures with sheep blood agar New York: Springer-Verlag, 1982:39, 46, 48 containing sulfamethoxazole and trimethoprim. 8. Lauer BA. Reller LLB, Mirett 8. Eifect of atmosp- J Clin Microbiol 1977556750685 here and duration of incubation on primary isolation Mechanismofactionof of group A streptococe from throat cultures, J Clin 3, Hitchings' hoxazole, Int J Infect Dis 1973; 128isuppl) Microbiol 1983:17(2):338-340, 8433-8436. 9, Nagarajan R. Antibacterial activities and modes 4 Melnick JL, Adelberg BA. Review of M of aciion of sancomycin and related glycopepti- dos, Antimicrob Agents Chemother 199135: 605: 12 609, 5. Kurzynski TA, Meise CK. Evaluation of sullamet 10, Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA, et al. Manuat hoxazae-trimethoprim blood agar plates for revo: of Clinical Microbiology, ed 6 Washington. DC very of group A streptococci from throat cultures, 1 American Society for Microbiology, 1995:1294, Clin Microbiol 1979:912): 189-19 1296,, @ CAPITULO Pruebas de hidrolisis de bilis y esculina |. PRINCIPIO Determinar la capacidad de un microorganismo de hidrolizar el glucdsido esculina a esculetina y glu- cosa en presencia de bilis; una prueba aglucona Ul, OBJETIVO (Véanse caps. 43-45) A. Ayudar en la identificacidn y diferenciacién de las especies de Enterococcus del grupo D (+) (antes Sireptococeus faecalis, 5. faecium y S. durans, més especies nuevas) y las especies de Streptococcus del grupo D no enterocécico (+) (p. ej. 5. equinus, S. bovis y variantes de S. bovis) de otros estrepto- cocos que no son del grupo D (-). Es una prueba presuntiva (cuadro 2-1). El género Streptococcus fue dividido en tres géneros: Enterococcus, Lactococcus y Streptococcus. (68) Antes se aceptaba que el crecimiento en NaCl junto con bilis y esculina brindaba una identifica- cion presuntiva de las especies de Enterococcus (29). Sin embargo, en la actualidad con el aislamien- to de especies de Pediococeus y de Leuconostoc a partir de infecciones humanas, esta identificacién presuntiva podrfa ser errénea (29). Tanto las especies de Pediococcus como de Leuconostoc brindan resultados positivos con NaCl y bilis-esculina (29), B. Ayudar en la diferenciaciGn de los iniembros de la familia Enterobacteriaceae, en especial la division Klebsiella-Enterobacter Serratia (todos V+) (K-E-S). Kluyvera (+), Leclercia (+) y especies de Cede- cea (+) (21, 47) y servir como una herramienta taxonémica para la clasificacién de le familia Entero- bacteriaceae (22). C. Ayudar en la diferenciacién de especies de Lisieria (+) de otros bacilos grampositives anacrobios fa- cultativos no formadores de esporas (—) (71): por ejemplo. Erysipelothrix rhusiopathiae con una simi~ litud morfolégica y algunos difteroides (64). D. Identificaci6n presuntiva del grupo Bacteroides fragilis (véase Agar con bilis y esculina para Bacte- roides (BBE) (52) y medio con kanamicine-bilis-eseulina (KEB) (11)). . Ayudar en la identificacién de Vibrio vulnificus (81) (véase Precauciones). ", Ayudar en la identificacién de Aeromonas eucrenophila mévil (+); diferenciacién de especies de Ae~ romonas: A. caviae (+), A. veronti (+) y A. hydrophilia (+) de A. sobria (~) (34). Sin embargo, las es- pecies de Aeromonas no erecen a 10-45°C, una caracteristica que puede utilizarse para diferenciarlas de los enterococos. G. Los estudios epidemioligicos y la identificacidn presuntiva de Cryptococcus neoformans de otras es- pecies de Cryptococcus por la produccién de pigmento. Esto no se relaciona con el color castafio-ne~ oliado por la reaccién de los iones férricos con la esculina (19). (Véase Medio de agar con base de esculina y estreptomicina-cloranfenicol). H. Diferenciacién de especies de Fusobacterium, sobre todo F. mortiferum (+) y F. necrogenes (+) de oiras especies de Fusobacterium (-) (2. 47). 1. Ayudar en la diferenciacién de Falvimonas oryzhabitans pigmentado de amarillo (~) (antes VE-2) de Sphingomonas (Pseudomonas) paucimobilis (+) y Chryseomonas luteola (+) (antes VE-1) (47).Pruebas de hidrdlisis de bilis y esculina 9 Cuadro 2-1. Clasificacién de cepa tipo de Enterococcus® y especies de Streptococcus Enterococcus del grupo D: E. avium (13, 57) ATCC 14025 E casselitavus> ‘ATCC 25788, E.columbae E-durans (13, 46) ATCC 19432 E faecalis ATCC 19433 E faecium ATCC 19434 E-flavescens E gallinarum (7, 13) NCDO 2313 ATCC 49573, E hirae (46) NCDO 1258 ATCC 8043. E-malodoratus NCDO 846 ATCC 43197 F mundi (12) NCDO 2975 ATCC 43186 E. psoudoaviuert NCDO 2138 ATCC 49372 F raffinose-vatiable® CDC 1739-79 ATCC 49427 E serioliciga ATCC 49156 E solitarius? DCT 885-78 ATCC 49428 E sultureus Enterococcus que no son del grupo D: E.cecorum NEDO» 2674 ATCC 43198 E dispar E raffinose-variable F saccharolyticus NCDO 2594 ATCC 43076 Stroptococous: S.bovs ATCC 33317 NCDO 597 S.equnus ATCC 9812 4 Antes incluido en el género Streptococcus. ® El anlerior S. faecium subasp. casseliflavus es en a actualcad una especie separada de Enterococcus (13, 83) « Las subespecies anteriores Streptococcus faecalis subesp. liuefaciens, S. faecalis subesp. zymogens y S. faecalis ‘subesp. faecalis ya no se recanocen y 8e agrupan en una eapecie, Enterococcus faecalis (8, 4) Collins y col.,remitido para pubicacion (27). « Colins MO, Facklam RA, Farrow JAE, Willams A, remitide para puoicacion (27). ' Centers for Disease Contra! and Prevention, 4 National Collection of Dairy Organisms. W, BIOQUIMICA Laesculina deriva del castato de Indias y posee actividad de vitamina P (19), La esculina es un glucdsido, tun derivado acetal de un monosacérido simple (50), Cuando tna sustancia que no es un hidrato de carbono se ‘une a un azticar por una unidn acetal, el acetal resultante se denomina glucésido y la porcién no ghicida se de- nomina aglucona (6) (0 genina (33)); ia porcidn esteroide se une aun residuo carbono del azticar. La agluco- na se une al aaicar principal a través de un dtomo de ox{geno (404), una unin glucos{dica) (9), Des partes de Ja molécula (glucosa y 7-hidroxicumarina) se unen juntas por una unidn éster a través del oxigeno (47), ON ou SS Va er Eliminacion \ Aglusona, Union B-alucosidioa Hon H Ok oGlucosa — NOgs.unhidato Esculna ((-2-Glucopiranosa) Glucésido (derivado acetal) Los acetales se hidrolizan con facilidad por accién de los dcidos (9); la base de la prueba de eseulina la hidrilisis en la ligadura B de Ia esculina a esculetina por una B-glucosidasa constitutiva (la enzima esculinasa), la cual libera la molécuta de glucosa (33). La esculina, un derivado de la cumarina (6-B-glu c6sido-7-hidroxicumarina) (47), es hidrolizada a 6.1-hidroxicumarina y glucoss10 Pruebas bioquimicas individuales HO. CH0K |—9 H ° H OW HO H HOH Eeculina (CysHy¢0s) Esculetina (aglucona) B-0-Glucosa €-B-Glucosido-7-hidroxicumarina 67-Dihidroxicumarina 5). La hidrélisis de la esculina puede demostrarse por una de tres maneras (14, 21 Habitual En el método més utilizado, la esculetina reacciona con una sal de hierro (II) (férrica; Fe**) para for mat un complejo fenslico de color castaio oscuro 0 negro. El citrato férrico (FeCjH,07) o el citrato Fé rrico y de amonio (una mezela 50/50 de citrato férrico y citrato de amonio) es incorporado en el medio de bilis y esculina a una concentracién de 0,05% como un indicador de la hidrdlisis de la esculina y pro- duce la formacion de escutetina. La hidrélisis habitual de la esculina es un procedimiento que ocurre en dos pasos: la cepa bacteriana debe a) crecer en presenciade una concentracién particular de bilis yb) pro- ducir esculinasa para hidrolizar la esculina ( Complejo fendlico ferrico (color castano oscuro-negro) Esculetina Jones férricos Adin se desconoce el mecanismo exacto, pero la hipstesis es 4 Alternativas A. Determinacién de la produccién de deido a partir de la fermentacién de los productos de hidrdlisis una porcién de glucosa, con formacién de gas © sin ella (COs y Hy$), con una disminucién en el pH. del medio (14, 56), Sin embargo. ta falta relativa de sensibilidad de las determinaciones secundatias del pH con indicadores quimicos limita mucho este método de fermentacion de la glucosa (23). B. Determinaci6n de una pérdida (disminucién) de la fluorescencia (366 nm) a medida que la molécula de esculina intacta es hidrolizada; se rompe la unin B-b-glucosidica (21 IV. MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS (Notas: se requiere rianas deben preceder la a ineubacién prolongada debido a que el crecimiento y la multiplicacién bacte- intesis de la enzima requerida para la hidrolisis de la esculina (63).Pruebas de hidrélisis de bilis yesculina 11 bilis inhibe los estreptococos que no son del grupo D que hidrolizan la esculina (22, 54); Oxgall al 24, una concentracién 10x de bilis, es igual a 20% de sales biliares, y 1-4% de bilis es equivalente a 10 y 40% de sales biliares. La bilis inhibe las bacterias grampositivas distintas de los enterococos. Hierro (III) es la nueva terminologia para el ion férrico (Fe**); el citrato de hierro (III) es un indicador de la hidrélisis de la esculina y ta formacién resultante de esculetina, El crecimiento de los enterococos puede ser optimizado por el agregado de suero de caballo, A. Formulas; medios de cultivo para el crecimiento 1. Medio de bilis y esculina (BEM) agar (BEA); pH 7.1 + 0.2 Peptona de caseina Sg Extracto de carne 3g Oxgall (bilis) 40 Eseulina en polvo. C)sH1)g0, Le Citrato de hierro (IID), FeC,H,0, Os ° Citrato de hierro WUD y amonio. (NH, HCHO; Agar (s6lo para medio sélido) 15g ‘Agua desionicada 1.000 mL, Después de la esterilizaciéa, agregar Suero de caballo, 5%, est 50 mL. 2. Medio de bilis y esculina modificado (MBEM): sin suero de caballo. 3. Bilis esculina azida agar/caldo (Pfizer Selective Enterococcus Medium (PSE), medio selectivo pa- ra enterococos (SEM), Enterococcosel (BBL). a. Formula de Isenberg, Goldberg y Sampson (43); concentracién reducida de bilis y agregado de azida s6dica. b. Ingredientes: pH 7.1 0.2 Peptona de caseina Peptona de carne Extracto de levadura Esculina Oxgall (bilis) Cloruro de sodio, NaCI Citrato de sodio. CH,OH(COO),Nay Citrato de hierto (IID) y amonio, (0/50) Azida s6ica, NaN, ‘Agar (s6lo para medio sélido) ‘Agua desionizada B. Inhibidores 1. La bilis inhibe el crecimiento de 1a mayorfa de los cocos grampositivos distintos de las especies de Streptococcus y a una concentraci6n de 20% inhibe las bacterias anaerobias distintas del grupo B, fragilis asi como la mayoria de los anacrobios facultativos. La azida sédica (NaN), 0.25 g/L. inhibe el crecimiento de las bacterias gramnezativas. inhibe los citocromos bacterianos (30) y reduce la actividad de ta catatasa. Permite el desarrollo de cocos grampositivos (p. e}., estreptococes) C. Método de preparacién 1. Pesar la cantidad exacta segtin indica el rétulo del envase: fos productos de los diferentes fabrican- ies pueden presentar leves diferencias. 2. Rehidratar con agua destilada o desionizada: calentar suavemente fa solucion, D, Esterilizacin 1. Medio base: esterilizaci6n en autoclave a 121°C. 15 Ib, 15 mm. 2. Suero de caballo: filtracion (Millipore), E, Fraccionamiento 15-20 mLiplaca (15 < 100 mm); fraccionar después de la esterilizacién rosca: 5,0 mL/tubo (16 x 125 mm), Enlriaren una posicién inelinada para obte- ner mayor superficie de siembra. F. Aspecto del medio terminada y no inoculado: color crema (amarillo pilido), medios de cultivo séli- dos en placa o en tubos,12 Pruebas bioquimicas individuales G. Almacenamiento 1. Refrigerador, 2-8°C; placas invertidas (tapas hacia abajo). 2. El vencimiento es aproximadamente a las 3-4 semanas. H. Método de inoculacién 1. Inéculo a. Comprobacién de estreptococosienterococos (1) Crecimiento de un cultivo puro de 24 h en el caldo de Todd-Hewitt (25). (2) Medio en tubos: agregar 2 gotas a la superficie del pico de flauta con una pipeta Pasteur 0 tun ans de inoculacidn; estriar el pico de flauta con un movimiento en forma de S (4). (3) Medio en placa: agregar 2 gotas a la superficie: utilizar la siembra por estrias en cuatro cua drantes para obtener el méximo aislamiento. b. Comprobacién de la familia Enterobacteriaceae (1) Crecimiento a partir de agar infusiGn de coraz6n (HIA), agar con lisina y hierro (LIA) oagar con hierro de Kligler/agar con azticar triple y hierra (KIA/TSD; cultivo puro. (2) Utilizar un inéculo denso (ansada de 4 mm) excepto cuando se comprueba Escherichia coli (inéculo liviano) (20, 51, 85) (véase Precauciones). 1. Incubacién: en aerobiosis, 35°C. 1. Estreptococas/enteracocos: 48 h. a. Controlar de manera periédica los tubos y si la reacci6n es positiva, informar el resultado, b. Esperar 72h antes de informar un resultado negativo. Enterobacteriaceae: 18-24 h. Una atmésfera con aumento de la concentracién de CO, aumenta la cantidad de estreptococos viri- ans que dan una reacciGn de bilis y esculina positiva: 1os estreptococos del grupo D y los enterococos desarrollan bien cn una atmésfera sin CO, (1). V. RESULTADOS ‘Véanse figuras 2-1 a 2-3 (Apéndice 1) para los resultados fotograficos en color. VI. INTERPRETACION A, Resultado positivo (+) de la prueba BE para la hidrdlisis de la esculina 1. Pico de Mauta (medio en tubo) Un color castaiio oscuro a negro difunde hacia el pico de fl das a blaneas. b. La mitad o mais del medio se tite de negro. Medio en placa rennegrecimiento del medio es significative, colonias estan rodeadas por halos de color negro a castaito oscuro. Placas o picos de flauta: ennegrecimiento en cualquier intervalo de tiempo (55). B. Resultado negativo (-) de la prueba BE para la hidrélisis de la esculina: tres posibles lecturas 1. No existe ennegrecimiento del medi 2. Ennegrecimiento de menos de la mitad del medio en los tubos después de una incubaci6n de 72 h (reacei6n +) (25). El crecimiento puede ocurrir, pero esto no indica ruptura de la esculina:; sélo indica que la concen- tracién de la bilis no inhibi6 el crecimiento habitual de microorganismos distintos de los enteroco- cos del grupo Diestreptococos. as colonias ti VIL PRUEBAS RAPIDAS (Nota: la incubacién durante 4 b o menos determina sobre todo la esculinasa constitutiva (una B-glu- cosidasa) (18). Todos los procedimientos ripidos utilizan medios que no favorecen el creciPruebas de hidrdlisis de bilis y esculina 13 A, Prueba de Ia mancha para esculina (20, 21, 71) 1. Lahidrolisis es determinada por la pérdida de fluorescencia medida con un generador de luz ultra- violeta a 366 nm. La pérdida de fluorescencia indica hidrolisis de la esculina. La esculina es fluo- rescente, pero ni la glucosa ni Ia esculetina producen fluorescencia a esta longitud de onda. Solucidn de esculina: pipetear una solucién de esculina al 0,02% en un papel de filtro sobre un por taobjeto, a, Frotar una colonia bacteriana aislada sobre el papel de prueba. b, Incubar a 35°C durante 30 min, 3. Interpretacion a. Hidrélisis: oscurecimiento; pérdida de Ja fluorescencia. b. Ausencia de hidrélisis: ausencia de oscurecimiento; ausencia de pérdida de la fluorescencia. B. Solucién tamponada de esculina para la prueba rdpida (prueba dela hidrélisis de la esculina con cloruro de sodio) 1. Procedimiento de Qadri, DeSilva y Zubairi (61). 2. Solucién tamponada de esc justar a pH 5,6 40.2 Escufina en polwo. CHO) Se Cirato de hierto (HD) y amonio. (5050) OSs Citrato férvico, FeCH. Citrato de amonio. (NH.),CHs0; Fostato monopotisico, KH;PO, org Foxfato dipotisico, KsHPO. 04g Cloruro de sodio, NaCl 50g ‘Agua desionizada 1.000 mL Fraccionamientofalmacenamiento ‘a. 0,5 mL/ tbo con tapa a rosea (12 x 75 mm). b, Estable por lo menos 8 semanas en refrigerador (4°C). 4, Indculo a, Densidad de McFarland esténdar #3 en 0.5 mL de solucién tamponada de esculina (véase Apén- dice 5). b. Un inéculo denso aumenta la rapidez de la prueba y hace innecesario utilizar materiales esté- riles debido a que la densidad de los microorganismos y la falta de carbono y nitrégeno apre- ciable en la soluci6n impide el sobrecrecimiento por contaminantes dentro del marco de tiem- po de la prueba. 5. Incubacién: bao de Maria a 3 6. Interpretacion a. Positivo (+) (1) Cambio de color de la solucién al castafio oscuro a negro. (2) Todos los enterococos muestran una reaeciGn 2+ a 4+ dentio de las 2 h. b, Negative (-): ningin cambio de color: la solucién permanece incolora C. Prueba rapida en un tubo con reactivo para bilis y esculina (Rapid Bile Esculin: RBE) 1. Procedimiento de Edberg, Trepeta, Kontnick y Torres (23). 2. Propdsito dual a. Determinar la produccién de esculinasa en presencia de un equivalente de la bilis, bb, Determinat kx solubilidad de la bilis de Sereprococcus pneumoniae: 3. Principio: la prueba se basa en la determinacién de la B-ghucosidasa constitutiva (esculinasa) con represiGn de la enzima por un equivalente de la bilis (desoxicolato de sodio). 4. Solucién de reactivo, pH 7.5. a. Ingredientes: a un buffer fosfato de Sorensen 0,05 M (pH 7.5) (véase Apéndice 6) agregar con- centraciones finales (peso/volumen) de (1D Desoaicolato de sodio (deoxicolato), 2.5% (un sustituto de las sales biliares). (2) p-Nitrofenil-f-b-glucopirandsido, 0,5% (un sustrato incoloro ¢ hidrolizable de la esculinasa). b. Disolver a 35° Distribuir en alicuotas de 0,25 mL en los tubos de prueba con tapa a rosca (12x 75 mm). Almacenamiento; en la oscuridad; estable por lo menos durante 6 meses. (2) Alicuotas liquidas: refrigerar a 4-10°C. (2) Alicuotas deshidratadas: refrigerar a 4-10°C con desecador. °C durante 4 h, eS14 Pruebas bioquimicas individuales Indculo: concentracién bacteriana suficiente para producit una turbidez final de por lo menos un estandar de 0.5 McFarland (véase Apéndice 5}, a. El reactivo liquide puede gelificarse con el almacenamient JicuefacciGn antes del uso. Inocular las colonias bacterianas. b. Reactivo deshidratado: inocular con la suspensi6n bacteriana en agua destilada. 6. Incubacién: en aerobiosis a 35°C: leer a intervalos de 5 minutos hasta los 30 min. 7. Interpretacién a. Color amarillo (+) (1) Positive para Ta hidrétisis de la esculina en presencia de bilis, (2) Color equivalente a un color castaiio oscuro a negro observado en 40% de la reaccién de bilis, yesculina, cambio de color, aclaramiento de la turbidez. (1) Solubilidad de bilis positiva (sensible, S) (a) Liberacién de enzima autolitica. (b) S. pneumoniae. (2) Hidrslisis de ta esculina negativa (~), c. Sin cambio de color, sin aclaramiento de la turbidez (1) Solubilidad de bilis negativa (-). (2) Hidrdtisis de fa escutina negativa (~). levar a 35°C para producir a re- Edberg y Bell (18) modificaron el provedimiento para diferenciar Bacteroides (+) de Fusobacterium (-) sobre la base de la presencia de B-glucosidasa constitutiva. Las excepciones al procedimiento anterior son |. Distribuir alicuotas de 0,30 mL. 2. Utlizar un indculo esténdar 0,05 de McFarland o anterior (véase Apéndi 3. Incubar en aerobiosis a temperatura ambiente (22-25°C). e5), Vill. PRUEBAS ALTERNATIVAS. A. Caldo con esculina para anaerobios 1. Caldo infusién de corazén (HIB), 1 L, que contiene Eseulina lg a Ig Hemina. 5 mg/ml. (opeional) Tm Vitamina K, (opeional) Tmt en anaerobiosis a 35°C durante 24-48 ho hasta que se obtiene un buen desarrollo, sregat unas golas de solucién de citrato férrico y de amonio al 0,1% a cada tubo, Reaccién po- 2: color negro en el medio 4. De manera alternativa, ef tubo puede observarse bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm); la pérdida de Muorescencia indica un resultado positivo.. B. Agar con bilis y esculina para Bacteroides (BBE) (agar para aislamiento de B. fragilis, agar bi- esculina para B. fragilis) 1. Medio de Livingston, Komiinos y Yee (52). 2. Objetivo: selecci presumtiva del grupo B. fragilis (76) (B. fragitis, B. the- Jaiotaomicron, B. ovatus, B. distasonis, B. uniformis, B. caccae y B. vulgatus (60)) y medio selec- tivo para Bilophila wadswerthia (3) 3. El medio selectivo y diferencial permite distinguir la capacidad de hidrolizar la esculina y produ- cir catalasa, Un estimulante del crecimiento y la hemina proporcionan la posibilidad de compio- bar la produce catalasa (52). BBE puede utilizarse para la reaccién de fa esculina si el mi- croorganismo de prueba es resistente a la bilis y a la gentamicina. Los miembros del grupo B. fragilis casi siempre son resistentes a la penicilina (36-38) y pueden proteger a las bacte sibles ala penicilina que los acompanan en las injecciones mixtas (40), 4. Ingredientes a. Soluci6n stock de hemina: concentracién final, $ g/ manera notable el creci is sen- nL. La hemina es necesaria o estimula de nto (72). Aun frasco de 100 mL. agregarPruebas de hidrdlisis de bilis y esculina 15 Hemina oSe Hidroxido de sodio, NaOH, 1 N i ml. Awa cestilada c.s.p. 100 ml. b. Solucién stock de gentamicina ia; Garamyci in de 40 mg/mL, inyectable. Un antibidtico de amplio es- pectro que junto con ia bilis inhibe les anaerobios facultativos y la mayoria de las bacterias anaerobias gramnegativas, otros microorganismos distintos de Bacteroides positives a la es- culina que pueden tolerar la bilis (60). (2) Concentracién final: 40 (g/mL. c. Medio, pH 7.0 + 0.2 Tripticasa soja agar (TSA) Bilis N% Esculina hidratada Citrato de hierro (IIL) y amonio, (50/50) ‘Agua desionizada No se requiere calentar; agitar para disolver y agregar: ugimL, jon de gemamicina, Hemina, Solu d. Método de esterilizacion (J) Stock de hemina y medio base: esteriliza (2) Gentamicina: filtracién (Millipore). Distribuir en placas de Petri: 12-15 mLiplaca (15 x 100 mm). El medio no inoculado es un medio solido para placa, claro, I Almacenamiento a, Soluciones stock y medios de cultivo: refrigerar a 2-8°C: placas invertidas (tapas hacia abajo). b. El vencimiento es aproximadamente a las 3-6 semanas. 8. Método de inoculacién a, El medio debe ser reducido inmediatamente antes de I2 inoculacién colocindolo en condi nes anaerobias durante 18-24 h (16) 0. por ejemplo, en un sistema para anaerobiosis de GasPak (69). Sin tomar en consideracién el sistema utilizado, es necesaria el empleo de un indicador de anaerobiosis. b. Muestra directa: utilizar el estriado en cuatro cuadrantes para el méximo aislamiento. La mues- tra debe sembrarse en cuanto se recibe en el laboratorio. 9. Incubacién: en anaerobiosis a 35°C, placas invertidas (tapas hacia abajo); leer los resultados fi- nales después de las 48 h. 10. Interpretacién nen autoclave a 121°C, 15 Ib, 15 min. .eramente amarillo, (Nota: los estudios realizados por Livingston y col. (52) demostraron tres tipos distintos de morfolo- fa de las colonias del grupo B. fragilis, Todas son redondas, sobreelevadas, con bordes completos y de mas de 1 mm de didmetro, pero diferencias especificas permiten distinguir los tres tipos.) a. Hidrétisis de la esculina (1) Positivo (+) (a) Ennege Tipo imiento del medio 31% exhidié colonias romas, opacas, de color gris marengo débil, rodeadas por tuna zona oscura con bilis precipitada (52) Tipo 2: 68% exhibio colonias de color gris claro a oscuro, brillantes, butirosas, semi- transparentes, rodeadas por una zona gris sin precipitado ( (b) Identificacién presuntiva del grupo B. fragilis, (2) Negativo (~) (a) Crecimiento sin cambio en el color del medio. (b) Esculina no hidrolizada. (c} Grupo B. fragilis del tipo 3: 1% exhibi colonias blancas, briltantes, butirosas, sin zona g (a) Raras veces otros microorganisms. b. Produccién de catalasa (1) Exponer el crecimiento en placas de BBE a ta atmésfera dorante 30 min antes de agregar perdxido de hidrégeno (H,O,) al 3% is (52).16 Pruebas bioquimicas individuaies (2) Positivo (+): aparicién de burbujas. (3) Negativo (-): ausencia de burbujas. C. Prueba del disco con kanamicina-bilis, 1. Procedimiento de Draper y Barry (17) modificado por Vargo y col. (82). Prueba de deteccion para el grupo &. fragilis: prueba de estimutacién con bilis y prueba de resis- tencia a la kanamicina (82). 3. Discos de papel de filtro impregnados en bilis y en antibidtico: el grupo B. fragilis es la dnica es- pecie que puede desarrollar en presencia de bilis y exhibe resistene a (82). a. Bilis al 2% (Oxgall), conceniracion de 25 mg. b. Kanamicina, 1,000 (g/mL. 4, Medio de crecimiento: caldo tioglicolato (Thio}; turbidez igual al estandar 0,5 de McFarland (véa- se Apéndice 5), 5. Medio para la prueba del disco: placas de agar sangre para Brucetla, 6. Incubacién: en anaerobiosis a 35°C durante 24-48 h; todos los microorganismos del grupo B. fra- gilis dan resultados positivos después de 24 h. 7. Interpretacién a. Positivo (+) (1) Resistente (R) a la kanamicina: zona de inhibicién < 10 mm de diémetro. (2) Resistente (R) a la bilis: crecimiento en el borde del disco, b. Negative (-) (1) Sensible (susceptible) (S) a la kanamicina: zona de inhibicién > 12 mm de diametro, (2) Sensible (susceptible) (S) a la bilis: inhibicién del crecimiento, halos de inhibicién de 17-30 mm de digmetro, Los discos de bilis estén rodeados en su totalidad por una zona grande de hemélisis y los microorga- ismos que crecen 2 menudo dentro de esta zona producen un precipitado oscuro en el agar: sin embar- g0, este fendmeno acenitia el crecimiento, lo que hace mas facil la interpretaci6n (17). D. Medio con kanamicina-bilis-esculina (KEB) 1. Medio de Chan y Porschen (11), basado en el medio de Swan (79). 2. Deteccidn para el aislamiento y distincién presuntiva del grupo B. fragilis de otros bacilos gram- negativos anaerobios (11, 17, 82) en muestras que contienen flora mixta. 3. Medio de prueba, tripticasa soja agar (TSA) que contiene: Kanamicin, Esculina, 5,0 Cirato de bierro (IID) y amonio, (50/50. citrato férrico y citralo de amonioy Bilis, 20,0 (u Oxgall, 2%) 1.000 pg/ml, agee a después de La kanamicina asegura el aislamiento selectivo de miembros del grupo B. fragilis e inhibe el creci- miento de los bacilos gramnegativos anaerobios fucultativos y aerobios; la bilis al 20% estimula el desa~ rrollo del grupo B. fragilis pero inhibe otras bacterias anaerobias excepto Fusebacterium mortiferum (52) 4. Incubacién: en anaerobiosis (p. ej... GasPak, BBL) a 35°C durante 24 h; se recomienda una incu- baciéa adicional de 24 h cuando las reacciones son negativas. 5. Interpretacién (60): examen de las colonias bajo microscopio con una Limpara de UV de longitud de onda larga para detectar la fluorescencia. a. Las colonias pigmentadas del grupo B. fragilis emiten juz del naranja al rojo ladrillo. La fluo- rescencia es visible antes que la pigmentaciGn b. Bilis-esculina (+): crecimiento con ennegrecimiento en el medio circundante. Muchos investigadores (5, 1, 17, 78. 82) demostraron que el grupo B, fragilis son los wnicos bacilos gramnegativos anaerobios encontrados con mis frecuencia que no son inhibidos por la bilis y tambign son resistentes a alts concentraciones de kanamicina. En el medio de KEB, los estudios de Chan y Pors- chen (11) demostraron que hubo desarrollo en 100% de los microorganismos B. fragilis, con la produe- nde hidrélisis de la esculina en 97-100% de las cepas, mientras se inhibe de manera selectiva el cre- cimiento de otros anaerobios gramnegativos, asf como de la mayorfa de los anaerobios fa producir hidrélisis.