第 42 卷 分析化学 (FENXI HUAXUE)　 研究报告 第9 期

　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
2014 年 9 月 Chinese Journal of Analytical Chemistry 1348 ~ 1353

DOI: 10. 11895 / j. issn. 0253-3820. 140103

污染土壤中主要石油降解基因 AlkB 和
Nah 定量检测方法的建立和应用

刘庆龙　 唐景春 ∗ 　 万晓彤

( 南开大学环境科学与工程学院, 环境污染过程与基准教育部重点实验室,
天津市城市生态环境修复与污染防治重点实验室, 天津 300071)

摘　 要　 建立了 SYBR Green I 实时荧光定量聚合酶链式反应( Real Time-qPCR) 检测油田污染土壤中烷烃降

解基因 AlkB 和萘降解基因 Nah 的方法。 比对相关降解石油菌株的 GenBank 序列,设计合成针对烷烃和萘降
解基因扩增引物 AlkBf / AlkBr 和 Nahf / Nahr。 将纯化的常规 PCR 胶回收产物与 pEASY-T1 载体连接,转化到感
受态细胞培养。 提取并梯度稀释阳性克隆质粒,构建 Real Time-qPCR 标准测定曲线。 25 μL 扩增体系最佳反
应条件: 前后引物终浓度为 0. 2 μmol / L,12. 5 μL 2×TransStart Top Green qPCR SuperMix,AlkB 和 Nah 基因最
适退火温度分别为 50 ℃ 和 57 ℃ 。 Real Time-qPCR 技术显示出很高的灵敏性和重复性,比传统 PCR 技术灵
敏度高 100 倍。 对采集于某油田 3 个功能区的 14 土壤样品中 AlkB 定量检测显示,石油污染严重的采油区含
有最高的 AlkB 拷贝数,污染较轻的生活区 AlkB 拷贝数最少;Nah 基因分布均匀。

关键词　 石油烃降解基因; 荧光; 聚合酶链式反应; SYBR Green I; 烷烃降解基因; 萘降解基因

1　 引　 言
石油污染是世界性公害之一,全世界每年排入到环境中的石油污染物约为 8 × 10 6 t。 我国每年约有
6 ×10 5 t 原油汇入环境,造成 3. 3 × 10 6 hm2 的土壤面积受到石油污染 [1,2] 。 石油污染物主要为烷烃和芳
香烃,具有很强的生物毒性和环境破坏性 [3 ~ 5] 。 烷烃单加氧酶和芳香烃末端双加氧酶分别由烷烃和芳
香烃降解基因编码,是微生物代谢石油组分的主要酶系。 运用分子生物技术实时定量聚合酶链反应
( Real Time-qPCR) 对石油降解基因的定量分析可以反映微生物修复石油污染土壤的潜力 [6,7] 。
目前,运用荧光探针和荧光引物的定量 PCR 检测石油降解基因技术虽然特异性高,但操作复杂、成
本高。 Real Time-qPCR 技术利用荧光信号积累对未知模板进行定量分析,具有高效率、高通量、高敏感
性、易操作等优点,在治理油田污染土壤中具有重要应用价值 [8 ~ 10] 。
针对石油组分复杂性,本研究采用 SYBR Green I 荧光染料 Real Time-qPCR 技术,建立一种对油田
污染土壤中烷烃降解基因 AlkB 及萘降解基因 Nah 的综合检测,确定最佳的引物和 SYBR Green I 浓度
反应体系及最适的 PCR 升温程序。 同时,对建立的 Real Time-qPCR 技术的灵敏性和重复性进行检验,
并应用于某油田土壤中烷烃和萘降解基因的定量测定,对在环境中追踪石油污染物及评价生物降解潜
力具有重要意义。

2　 实验部分
2. 1　 仪器与试剂
CFX96 实时荧光定量 PCR 仪( 美国 Bio-Rad 公司) ;TC-5000 梯度型 PCR 仪( 英国 Techne 公司) ;
Genova 微量核酸蛋白质分析仪( 英国 Jenway 公司) 。
土壤细菌基因 组 DNA 提 取 试 剂 盒 ( 美 国 Zymo Research 公 司) ; 离 心 柱 型-质 粒 小 提 试 剂 盒 ( 美
国 Omega 公司) ;凝胶回收试剂盒( 美国 Axygen 公司) ;荧光定量 PCR 试剂盒、pEASY-T1 克隆试剂盒、
Trans-T1 感受态细胞( 北京全式金生物技术有限公司) 。
　 2014-01-30 收稿; 2014-05-30 接受
本文系 国 家 自 然 科 学 基 金 项 目 ( No. 31270544 ) , 博 士 点 基 金 项 目 ( 博 导 类 ) ( No. 20120031110015 ) , 863 重 大 项 目
( No. 2013AA06A205) ,天津市自然科学基金项目( No. 10JCYBJC05600) 资助
∗E-mail: tangjch@ nankai. edu. cn
 第9 期 刘庆龙等: 污染土壤中主要石油降解基因 AlkB 和 Nah 定量检测方法的建立和应用 　13　49

2. 2　 实验方法
2. 2. 1　 土壤样品的采集　 土壤样品采集于某油田采油区( S1 ~ S5) 、生活区( S6 ~ S9) 、石油加工运输区
( S10 ~ S14) 14 个代表性的点位。 采用无菌铲采集 0 ~ 20 cm 耕层土样,装到盛有冰袋的采样箱中,迅
速带回实验室,放入-20 ℃ 冰箱保存备用。
2. 2. 2　 引物的设计和合成　 应用 Primer express 软件,分别设计扩增降解烷烃和芳香烃土壤微生物基
因保守区的引物 AlkBf / AlkBr 和 Nahf / Nahr。 引物序列、扩增产物片段长度、理论 PCR 退火温度见表 1。
表 1　 AlkB 和 Nah 降解基因引物设计
Table 1　 Primer sets designed for the amplification of degradation gene alkanes monooxygenase degradation gene ( AlkB) and
naphthalene dioxygenase degradation gene ( Nah)
PCR 退火温度
扩增尺寸
编码蛋白 引物 引物序列(5′-3′) PCR annealing 参考文献
Amplicon size
Proteins targeted Primers Sequence(5′-3′) temperature Reference
( bp)
(℃ )
烷烃单加氧酶 AlkBf AACTACMTCGARCAYTACGG
100 50 [11]
Alkane monooxygenases AlkBr TGAMGATGTGGTYRCTGTTCC
萘双加氧酶 Nahf ACTTGGTTCCGGAGTTGATG
136 57 [12]
Naphthalene dioxygenase Nahr CAGGTCAGCATGCTGTTGTT

2. 3　 DNA 的提取及降解基因阳性模板制备
土壤微生物总 DNA 的提取按试剂盒操作,1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。 AlkB 和 Nah 特异性 PCR,
升温程序为:94 ℃ 预变性 4 min;94 ℃ 变性 20 s,退火温度为表 1 中各引物的理论 PCR 退火温度,保持
30 s,72 ℃ 保持 2 min,设 35 个循环;72 ℃ 延伸 7 min。 扩增产物的特异性经 1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检
测。 目的基因经胶回收试剂盒回收,克隆于 pEASY-T1 载体,转化到 Trans-T1 感受态细胞。 经蓝白斑筛
选的白色菌落,摇菌培养,提取质粒进行酶切和 M13F / M13R 引物测序。
2. 4　 实时荧光定量 PCR 技术对降解石油烃基因测定
2. 4. 1　 反应条件优化　 用微量核酸蛋白质分析仪测定质粒 DNA 拷贝数和纯度 [13] 。 将已知浓度的质
粒依次进行 9 次 10 倍梯度稀释,作为定量 PCR 的阳性模板。
为得到最佳引物和荧光染料浓度及引物退火温度,在 25 μL 反应体系中分别设计 3 个引物终浓度
0. 08、0. 2 和 0. 4 μmol / L,10、12. 5 和 15 μL 的 2 ×TransStart Top Green qPCR SuperMix,AlkBf / AlkBr 引物
退火温度设两组对照分别为 47 和 50 ℃ ,Nahf / Nahr 引物退火温度分别设为 55 和 57 ℃ ,加 1 μL 梯度稀
释的重组质粒模板,0. 5 μL Passive Reference Dye,ddH2 O 补足到 25 μL,同时设立无 DNA 阴性控制。 反
应条件为:94 ℃ 预变性 30 s;94 ℃ 变性 5 s, 引物退火保持 15 s,72 ℃ 延伸 10 s,共设 40 个循环。 每一
循环延伸后读取荧光信号,设定熔解曲线程序。
2. 4. 2　 标准曲线的建立　 每微升初始重组质粒中的基因绝对拷贝数( CN) : CN = [ ( X / (3928 + b) ×
660) ] ×10 -9 ×6. 02 ×10 23 [11] 。 其中 X 为阳性质粒浓度;pEASY-T1 载体长 3928 bp; b 为 AlkB 和 Nah 片
断,分别长 100 和 136 bp;每对碱基的平均分子量是 660 Da;阿佛加德罗常数为 6. 02 × 10 23 mol -1 。 利用
循环阈值( C t ) 与起始模板拷贝数的对数存在反比例线性关系建立标准曲线,作为土壤样品中 AlkB 和
Nah 降解基因定量的依据。

3　 结果与讨论
3. 1　 AlkB 和 Nah 降解基因特异性扩增
AlkB 和 Nah 降解基因的 PCR 产物凝胶电泳图( 图 1) 显示出很高的特异性,说明设计的引物和反
应条件适合 AlkB 和 Nah 降解基因的定量检测。
3. 2　 反应体系的优化
引物终浓度为 0. 08 和 0. 4 μmol / L 时, AlkB 基因熔解曲线如图 2 所示, 纵坐标为荧光强度对温度
的负导数。 在 74 ℃ 时均出现引物二聚体的干扰,说明浓度过高或过低均引起扩增的假阳性影响。 但当
加入前后引物终浓度均为 0. 2 μmol / L 时,目的基因扩增显示出很高的特异性。
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图 1　 ( a) AlkB 降解基因扩增产物;( b) Nah 降解基因扩增产物

Fig. 1　 Corresponding amplification products of AlkB gene ( a) and Nah gene ( b)
M:Marker I;1、2、3 为对应的降解基因产物。
M: Marker I; 1, 2, 3: amplification product bands of degradation genes.

引物终浓度设为 0. 2 μmol / L,当引物 AlkBf /

AlkBr 退火温度设定为 47 ℃ 时,如图 3a,出现多
条熔解杂峰,产生假阳性产物;当退火温度设为
50 ℃ 时熔解峰单一,如图 3b,显示出很高的特异
性,说明 50 ℃ 为 AlkB 降解基因扩增最佳的退火
温度。 AlkB 降解基因的熔解温度 M T 由 83 ℃ 变
为 84 ℃ ,这与模板浓度的梯度增加有关。 从 Nah
降解基因的熔解峰上( 图 3c) 可以得出引物 Nahf /
Nahr 的最佳退火温度为 57℃ ,没有引物二聚体的
　 图 2　 不同引物浓度熔解曲线
产生,特异性最高。
Fig. 2　 Melt curve under different primer concentrations
经过多次重复实验,加入 12. 5 μL 2 × Trans- 1. 引物浓度 0. 08 μmol / L; 2. 引物浓度 0. 2 μmol / L; 3. 引物浓
Start Top Green qPCR SuperMix 时,循环阈值( C t ) 度 0. 4 μmol / L。 横线代表无 DNA 模版的阴性对照。
最低、本底反应最小。 相应体系中最佳引物终浓 1, 2,3: the primer concentration is 0. 08, 0. 2 and 0. 4 μmol / L,

度 为 0. 2 μmol / L, 引 物 AlkBf / AlkBr 和 Nahf / respectively. The horizontal line is negative control without DNA
template.
Nahr 最佳退火温度分别为 50 ℃ 和 57 ℃ 。

图 3　 ( a) 引物 AlkBf / AlkBr 退火温度为 47 ℃ 的熔解曲线;( b) 引物 AlkBf / AlkBr 退火温度为 50 ℃ 的熔解曲

线;( c) 引物 Nahf / Nahr 退火温度为 57 ℃ 时的熔解曲线
Fig. 3　 ( a) Melt curve of primer AlkBf / AlkBr at annealing temperature of 47 ℃ , ( b) Melt curve of primer
AlkBf / AlkBr at annealing temperature of 50 ℃ and ( c ) Melt curve of primer Nahf / Nahr at the annealing
temperature of 57 ℃
曲线代表不同的浓度梯度质粒阳性模板;横线代表阴性对照。
Curves are the different template concentration of positive plasmid; Horizontal line is the negative control.

3. 3　 标准曲线的建立
如图 4 所示, AlkB 降解基因标准曲线为 C t = -3. 017 lgC +38. 822, 相关系数 R2 = 0. 996, 扩增效率
E 为 114. 5% ; Nah 降解基因标准曲线为 C t = -2. 705 lgC +35. 675, R2 = 1. 000, E 为 134. 2% 。
 第9 期 刘庆龙等: 污染土壤中主要石油降解基因 AlkB 和 Nah 定量检测方法的建立和应用 　13　51

图 4　 ( a) AlkB 降解基因的标准曲线;( b) Nah 降解基因的标准曲

Fig. 4　 ( a) Standard curve of AlkB gene and ( b) standard curve of Nah gene

3. 4　 重复性检验
图 5 的 AlkB 和 Nah 扩增曲线显示,每个梯度稀释浓度点的 2 条扩增曲线几乎重合,误差不到 1 个
循环。 说明此实验中针对石油降解基因定量测定的 SYBR Green I 荧光染料 Real Time-qPCR 技术呈现
出很高的重复性和稳定性。

图 5　 ( a) AlkB 降解基因的扩增曲线重复性检验;( b) Nah 降解基因的扩增曲线重复性检验

Fig. 5　 ( a) Reproduction test of AlkB gene and ( b) reproduction test of Nah gene
AlkB 基因模板浓度梯度为 10 8 ~ 10 2 拷贝数 / μL;Nah 基因模板浓度梯度为 10 8 ~ 10 5 ;横线为阴性对照。
Template content of AlkB gene is in the range of 10 8 to 10 2 copies / μL; Template content of Nah gene is in the range of 10 8 to 10 5
copies / μL; The horizontal line is the negative control without DNA template.

3. 5　 灵敏性检验
SYBR Green I 荧光定量 PCR 检测到的最低 AlkB 和 Nah 基因模板质粒拷贝数分别为 1. 8 和 3. 59
拷贝 / μL。 将上述梯度稀释的 AlkB 和 Nah 基因模板质粒进行普通 PCR 特异性扩增,1. 5% 的琼脂糖凝
胶电泳检验 [14] ,其能观察到清晰条带的 AlkB 和 Nah 基因最低模板质粒拷贝数分别为 1. 8 × 10 2 和
3. 59 ×10 2 拷贝, 说明 Real Time-qPCR 比普通 PCR 的灵敏性高 100 倍。
3. 6　 对油田土壤中降解基因的测定
某油田 AlkB 和 Nah 定量结果( 表 2) 显示,土壤中 AlkB 降解基因含量平均值从高到低依次为采油
区 1. 83 ×10 7 拷贝 / g,石油加工运输区 8. 75 × 10 6 拷贝 / g,生活区 8. 68 × 10 6 拷贝 / g。 采油区土壤石油污
染最严重,AlkB 含量也最高;烷烃浓度较低生活区土壤中 AlkB 含量最低。 土壤中 Nah 降解基因含量分
布相对均匀,采油区、石油加工运输区和生活区中均具有很高的 Nah 降解基因含量,分别为 4. 62 × 10 7 、
6. 22 ×10 7 和 4. 52 ×10 7 拷贝 / g。 总体上 Nah 降解基因含量比 AlkB 高约 0. 5 ~ 1 个数量级。 Ahn 等 [15] 研
究发现,Nah 降解基因编码的末端双加氧酶是将芳香烃代谢为儿茶酚的主要酶系,对萘、菲、芘及 BTEX
均具有降解 作 用, 而 AlkB 降 解 基 因 编 码 的 末 端 单 加 氧 酶 降 解 对 象 大 都 为 中 短 链 的 烷 烃 ( C6 ~
C15) [16 ~ 21] 。
 1　 35　 2 分析化学 第 42 卷

表 2　 某油田污染土壤中 AlkB 和 Nah 降解基因定量结果

Table 2　 Quantitative detection of degradation gene AlkB and Nah in petroleum contaminated soil
AlkB 拷贝数 Nah 拷贝数
样品
AlkB copy numbers ( AlkB CN) Nah copy numbers ( Nah CN)
Samples
( copies / g) ( copies / g)
S1 5. 61×10 7 1. 94×10 7
S2 3. 65×10 6
3. 98×10 7
采油区 S3 8. 48×10 6
5. 70×10 7
Oil-producing zone S4 6. 77×10 6
6. 66×10 7
S5 1. 66×10 7
4. 82×10 7
平均值 Average 1. 83×10 7
4. 62×10 7
S6 8. 07×10 6
5. 90×10 7
S7 7. 93×10 6
3. 68×10 7
生活区
S8 1. 56×10 7
3. 49×10 7
Residential zone
S9 3. 11×10 6
5. 00×10 7
平均值 Average 8. 68×10 6
4. 52×10 7
S10 1. 78×10 6 7. 19×10 7
S11 1. 83×10 7
3. 83×10 7
石油加工运输区
Oil-refinery and S12 5. 14×10 6
1. 85×10 7
transportation zone
S13 1. 33×10 7
7. 14×10 7
S14 5. 22×10 6
1. 11×10 8
平均值 Average 8. 75×10 6
6. 22×10 7

4　 结　 论
利用的 SYBR Green I 荧光染料结合目的 DNA 的 Real Time-qPCR 技术定量检测烷烃降解基因 AlkB
及萘降解基因 Nah,建立了一种油田污染土壤中降解基因检测手段。 对反应体系中引物和 SYBR Green
I 荧光浓度及引物最佳退火温度条件进行优化,本方法具有很高的灵敏度和重复性。 同时,本方法对某
油田不同功能区石油污染土壤降解基因的定量检测揭示了油田土壤的污染程度及土壤微生物降解石油
烃的潜能,对油田污染土壤的治理和监测具有重要意义。

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Establishment of Analysis Method for Detection of Petroleum

Degrading Genes AlkB and Nah in Contaminated
Soil and Its Application

LIU Qing-Long, TANG Jing-Chun ∗ , WAN Xiao-Tong

( College of Environmental Science and Engineering, Nankai University / Key Laboratory of Pollution Processes and
Environmental Criteria, Ministry of Education, Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation
and Pollution Control, Tianjin 300071, China)

Abstract　 SYBR Green I Real Time-qPCR method was developed to quantify the numbers of copyies of AlkB
( alkanes degradation gene) and Nah ( naphthalene dioxygenase degradation gene) functional degradation gene
corresponding to alkanes and aromatic hydrocarbons degradation. Two pairs of primers AlkBf / AlkBr and Nahf /
Nahr were designed for AlkB and Nah amplification respectively, according to the nucleotide sequences of
related degradation microorganisms published in GenBank. The purified recovery products of traditional PCR
were combined with pEASY-T1 vectors and transformed in competent cells to amplify. The recombinant
plasmids were extracted and used as positive templates to create standard curve through gradient dilution. The
conditions for the real time PCR were as the follows: the final concentration of forward and reverse primers
were 0. 2 μmol / L, 2 ×TransStart Top Green qPCR SuperMix, and the annealing temperatures of AlkB and Nah
PCR were 50 ℃ and 57 ℃ , respectively. The method showed a sensitivity of 100 times higher than that of the
traditional PCR method and good repeatability. The numbers of copies of AlkB in three functional regions of an
oilfield indicated that oil producing zone with serious oil pollution had the highest AlkB copy numbers, and
residential zone with lighter oil pollution had the lowest AlkB copy numbers. Nah degradation gene distribution
was more uniform.
Keywords　 Hydrocarbon degrading genes; Fluorescent; Polymerase chain reaction; SYBR Green I; Alkanes
monoxygenase degradation ; Naphthalene dioxygenase degradation
( Received 30 January 2014; accepted 30 May 2014)
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China ( No. 31270544)